Đề tài Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

hiÖt ®é tõ 40-700C, tïy thuéc vµo tØ lÖ vµ sè l­îng tõng lo¹i nucleotit cña ®o¹n måi vµ kÐo dµi kho¶ng 30 gi©y-1 phót. + B­íc 3 -Tæng hîp chuçi ADN- NhiÖt ®é ®­îc t¨ng lªn 720C, gióp cho enzym Taq polimerase ho¹t ®éng tèt nhÊt, ®Ó tæng hîp m¹ch ADN míi bæ sung theo chiÒu 5’-3’ b¾t ®Çu tõ vÞ trÝ g¾n måi, thêi gian tæng hîp tïy thuéc vµo ®é dµi cña tr×nh tù ADN cÇn khuÕch ®¹i, tõ 30 gi©y ®Õn vµi phót. Sè l­îng ADN sau mçi mét chu k× t¨ng lªn gÊp ®«i. VËy sau n chu k× th× sè l­îng chuçi ADN sÏ lµ 2n [7]. 1.4.2. Kü thuËt t¸ch dßng T¸ch dßng thùc chÊt lµ nh»m thu mét gen hay mét tr×nh tù ADN víi sè l­îng lín. §Çu tiªn, lµ g¾n mét gen mong muèn vµo vect¬ t¸ch dßng ®Ó t¹o nªn vect¬ t¸i tæ hîp sau ®ã chuyÓn vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ. Trong c¸c tÕ bµo chñ, c¸c vect¬ t¸ch dßng ®­îc nh©n lªn mét sè l­îng lín b¶n sao cña gen ban ®Çu. Ta sÏ thu ®­îc ADN qua c¸c b­íc t¸ch chiÕt. T¸ch dßng gåm 5 b­íc: + Chän vµ xö lÝ vect¬: Vect¬ t¸ch dßng lµ c¸c ph©n tö ADN cã kÝch th­íc nhá cho phÐp g¾n c¸c gen, cã kh¶ n¨ng t¸i b¶n kh«ng phô thuéc vµo sù ph©n chia cña tÕ bµo. Vect¬ ®­îc xö lÝ b»ng c¸c enzym giíi h¹n, vµ hai ®Çu chç mèi c¾t ®­îc xö lÝ ®Ó kh«ng thÓ nèi l¹i víi nhau. + Xö lÝ ADN cÇn ®­îc t¹o dßng: Chän nh÷ng ®o¹n ADN cã kÝch th­íc gÇn gièng nhau vµ t­¬ng øng víi vect¬ ®· chän, sau ®ã ADN ®­îc xö lÝ ®Ó cã hai ®Çu t­¬ng øng víi vect¬ (b»ng c¸ch xö lÝ víi cïng lo¹i enzym víi vect¬). + T¹o vect¬ t¸i tæ hîp: Trén vect¬ t¸ch dßng vµ c¸c ®o¹n ADN cÇn g¾n víi mét tØ lÖ x¸c ®Þnh, cã sù tham gia cña ADN ligase ®Ó t¹o vect¬ t¸i tæ hîp. ADN sÏ g¾n vµo vect¬ ë hai ®Çu t­¬ng øng. + ChuyÓn vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ: ChuyÓn b»ng ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p, víi môc ®Ých qua tÕ bµo chñ c¸c vect¬ t¸i tæ hîp sÏ ®­îc nh©n lªn víi sè l­îng lín c¸c b¶n sao. C¸c tÕ bµo chñ ®­îc chän phï hîp víi vect¬ t¸i tæ hîp, th­êng lµ tÕ bµo E.coli. + Chän vµ sµng läc ra c¸c thÓ t¸i tæ hîp: Nu«i cÊy vi khuÈn cã vect¬ t¸i tæ hîp trong m«i tr­êng thÝch hîp. Sö dông c¸c gen chØ thÞ ®Ó tiÕn hµnh chän läc c¸c khuÈn mang gen t¸i tæ hîp [4]. 1.4.3. Kü thuËt PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu ph­¬ng ph¸p ®Ó x¸c ®Þnh tÕ bµo vi khuÈn cã plasmit mang gen mong muèn, nh­ ph­¬ng ph¸p colony-PCR, c¾t plasmit b»ng c¸c enzym h¹n chÕ, hoÆc PCR tõ plasmit. Trong ®ã ph­¬ng ph¸p colony-PCR cho phÐp ph¸t hiÖn nhanh khuÈn l¹c mang plasmit t¸i tæ hîp mong muèn. Ph­¬ng ph¸p nµy cã ­u ®iÓm lµ nhanh, Ýt tèn kÐm vµ ®¬n gi¶n. HiÖn nay, kü thuËt nµy ®­îc øng dông rÊt réng r·i trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö. Nguyªn t¾c kü thuËt colony-PCR dùa trªn nguyªn t¾c kü thuËt PCR, chØ kh¸c ë chç mÉu ADN ®­îc thay b»ng ADN plasmit gi¶i phãng tõ khuÈn l¹c. ë nhiÖt ®é cao (94-950C), mµng tÕ bµo vi khuÈn bÞ ph¸ vì, gi¶i phãng plasmit t¸i tæ hîp. Plasmit t¸i tæ hîp nµy sÏ lµm khu«n cho ph¶n øng PCR nh©n gen b»ng cÆp måi ®Æc hiÖu. 1.4.4. Kü thuËt x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN HiÖn nay cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN. Chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p enzym häc cña Sanger vµ céng sù (1977) [32]. Ph­¬ng ph¸p nµy tiÕn hµnh ph¶n øng tæng hîp c¸c ph©n tö ADN, d­íi xóc t¸c cña enzym ADN polymerase, víi khu«n lµ ®o¹n ADN cÇn x¸c ®Þnh tr×nh tù, trong sù cã mÆt cña mét hµm l­îng nhá dÉn xuÊt dideoxy cña c¸c nucleotit (ddNTP). Nhãm 3’OH cña nucleotit ®­îc thay b»ng H. §iÒu nµy khiÕn cho c¸c dideoxynucleotit kh«ng cßn kh¶ n¨ng h×nh thµnh c¸c cÇu nèi phosphodiester vµ do ®ã ngõng qu¸ tr×nh tæng hîp. Trong kü thuËt ®äc tr×nh tù nucleotit tù ®éng, mçi dideoxynucleotit ®­îc ®¸nh dÊu b»ng mét fluochrome cã mµu kh¸c nhau. Nh­ vËy, tÊt c¶ oligonucleotit cïng chÊm døt t¹i mét lo¹i dideoxynucleotit sÏ cã cïng mét mµu. Sau khi ®iÖn di trong èng vi mao qu¶n, t¹o ra mét d·y c¸c ph©n ®o¹n ADN h¬n kÐm nhau mét nucleotit. ThiÕt bÞ ph¸t hiÖn huúnh quang (detector) ph¸t hiÖn c¸c b¨ng theo thêi gian, b¨ng nµo xa nhÊt ®­îc ph¸t hiÖn tr­íc. Detector ph¸t tÝn hiÖu lªn m¸y tÝnh. Detector lµ mét thiÕt bÞ khuÕch ®¹i tÝn hiÖu. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù sÏ ®­îc xö lý b»ng phÇn mÒm m¸y tÝnh chuyªn dông. Ch­¬ng 2. VËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1.VËt liÖu 2.1.1. VËt liÖu thùc vËt C¸c mÉu l¸ cµ chua bÞ nghi nhiÔm bÖnh xo¨n l¸ ®­îc chóng t«i thu thËp t¹i nh÷ng vïng chuyªn canh c©y cµ chua thuéc c¸c c¸c tØnh: Hµ Néi, B¾c Ninh, H­ng Yªn, Th¸i B×nh, H¶i D­¬ng, Qu¶ng Ninh. Do ®iÒu kiÖn thêi gian kh«ng cho phÐp nªn chóng t«i míi chØ tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi 6 tØnh trªn (b¶ng 1). B¶ng 1. Danh s¸ch c¸c mÉu l¸ cµ chua nhiÔm TYLCV ®­îc sö dông trong nghiªn cøu STT Tªn vïng thu mÉu Ký hiÖu 1 Hµ Néi HN 2 B¾c Ninh BN 3 H­ng Yªn HY 4 Th¸i B×nh TB 5 H¶i D­¬ng HD 6 Qu¶ng Ninh QN B¶ng 2. M· sè c¸c tr×nh tù gen CP trong Ng©n hµng gen quèc tÕ ®­îc sö dông trong nghiªn cøu STT M· sè trong NCBI Vïng ph©n lËp ViÕt t¾t 1 AY594174 Ai CËp TLCV-Egy-AY594174 2 U38239 Ên §é TLCV-IND-U38239 3 Z48182 Ên §é TLCV-IND-Z48182 4 AJ865337 Bangladesh TYLCV-BLD-AJ865337 5 AF105975 Bå §µo Nha TLCV-Port-AF105975 6 AJ223505 Cuba TLCV-CUB-AJ223505 7 AF024715 Dominica TLCV-DR-AF024715 8 U88692 §µi Loan TLCV-TW-U88692 9 AJ132711 Iran TLCV-Iran-AJ132711 10 X15656 Israel TLCV-IS-X15656 11 AF195782 Lµo TLCV-LAO-AF195782 12 AF414287 Malaysia PeLCV-MAL-AF414287 13 K02029 Mexico TGMV-MEX-K02029 14 AY044138 Mü TYLCV-USA-AY044138 15 AF206674 Myanma TLCV-MM-AF206674 16 AB116633 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116633 17 AB116635 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116635 18 AB116634 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116634 19 AB116636 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116636 20 AB116632 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116632 21 AB116629 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116629 22 AB116630 NhËt B¶n TLCV-JP-AB116630 23 AB116631 NhËt B¶n TLCV-JP-AB16631 24 AB192965 NhËt B¶n TLCV-JP-AB192965 25 AB192966 NhËt B¶n TLCV-JP-AB192966 26 AB050597 Philippin TLCV-PHL-AB050597 27 AY134494 Puertorico TLCV-PR-AY134494 28 AJ519441 T©y Ban Nha TLCV-SP-AJ519441 29 X61153 T©y Ban Nha TYLCV-X61153 30 NC004569 T©y Ban Nha TYLCV-NC004569 31 AY514630 Th¸i Lan TLCV-THL-AY514630 32 AJ495812 Th¸i Lan TLCV-THL-AJ495812 33 AY514632 Th¸i Lan TLCV-THL-AY514632 34 AY514631 Th¸i Lan TLCV-THL-AY514631 35 NC000869 Th¸i Lan TLCV-THL-NC000869 36 AJ558125 Trung Quèc PLCV-CHN-AJ558125 37 AY602165 Trung Quèc TLCV-CHN-AY602165 38 AY602166 Trung Quèc TLCV-CHN-AY602166 39 AJ566744 Trung Quèc TLCV-CHN-AJ566744 40 AF311734 Trung Quèc TLCV-CHN-AF311734 41 AJ457985 Trung Quèc TLCV-CHN-AJ457985 42 AJ457986 Trung Quèc ToCSV-CHN-AJ457986 43 S53251 óc TLCV-AUS-S53251 2.1.2. Ho¸ chÊt, m«i tr­êng nu«i cÊy vi khuÈn vµ thiÕt bÞ sö dông + Ho¸ chÊt - Thang ADN chuÈn cña h·ng MBI Fermentas (§øc). - Kit th«i gen, Kit t¸ch plasmit cña Qiagen (§øc). - Kit tinh s¹ch ADN plasmit. - Bé ho¸ chÊt sö dông cho ph¶n øng PCR cña Applied Biosystem (Mü). - C¸c ho¸ chÊt th«ng dông kh¸c ®­îc mua cña c¸c h·ng Merck (§øc), Sigma (Mü), Amersham Pharmacia Biotech (Thôy §iÓn). + M«i tr­êng nu«i cÊy vi sinh vËt B¶ng 3. Thµnh phÇn m«i tr­êng nu«i cÊy vi sinh vËt M«i tr­êng Thµnh phÇn LB láng 10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l Yeast extract; 10 g/l NaCl. LB ®Æc LB láng + 15 g/l Bacto- agar. + ThiÕt bÞ M¸y ly t©m, bµn soi gel, bé ®iÖn di, tñ nu«i cÊy vi sinh vËt, m¸y chôp ¶nh, pipet man, m¸y lµm kh« ADN, m¸y PCR, m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit tù ®éng vµ c¸c trang thiÕt bÞ kh¸c cña Phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt vµ Phßng thÝ nghiÖm träng ®iÓm vÒ c«ng nghÖ gen, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Khai th¸c tr×nh tù trong NCBI Thu thËp mÉu TYLCV ThiÕt kÕ måi T¸ch ADN tæng sè Nh©n gen CP b»ng PCR T¸ch dßng gen X¸c ®Þnh vµ so s¸nh tr×nh tù H×nh 7. S¬ ®å thÝ nghiÖm 2.2.1. T¸ch chiÕt ADN tæng sè ADN tæng sè cña l¸ cµ chua nhiÔm bÖnh ®­îc t¸ch chiÕt theo ph­¬ng ph¸p cña Accotto vµ céng sù (2000). - NghiÒn 0,15 g l¸ cµ chua nhiÔm bÖnh trong nit¬ láng. - Bæ sung 500 µl Extraction buffer, ®¶o ®Òu. ñ hçn hîp ë 65oC trong 5 phót. - Bæ sung thªm 500 µl Kaliacetat 5 M. ñ 00C trong 10 phót. Li t©m 13.000 v/p trong 5 phót. - ChuyÓn kho¶ng 500 µl dÞch næi sang èng míi. - Lo¹i protein b»ng c¸ch bæ sung 500 µl Phenol:Chloroform:Isoamin (25:24:1). §¶o ®Òu hçn hîp, li t©m 13.000 v/p trong 15 phót. ChuyÓn 350 µl pha n­íc trªn sang èng míi. - Bæ sung thªm 350 µl Isopropanol l¹nh, ®¶o ®Òu. Li t©m 13.000 v/p trong 5 phót. - Röa ADN b»ng 500 µl ethanol 70%. - §Ó kh« tña vµ hoµ tan trong 100 µl TE (cã bæ sung RNase). Extraction bufer: 100 mM Tris HCL, pH=8 ; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl; 1% SDS; 10 mM b-mercaptoethanol, hoÆc axit xitric 10 mM. 2.2.2. Nh©n gen ®Æc hiÖu b»ng ph­¬ng ph¸p PCR Trªn c¬ së tr×nh tù gen CP ®· ®­îc c«ng bè trong ng©n hµnh gen thÕ giíi, chóng t«i thiÕt kÕ cÆp måi, ®Ó nh©n gen CP cña vi rót th«ng qua ph¶n øng PCR. B¶ng 4. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR Thµnh phÇn ThÓ tÝch (µl) N­íc cÊt hai lÇn Buffer PCR (10X) dNTP MgCl2 prC324N prV889N ADN mÉu Taq ADN polymerase 14 2,5 2 2 1 1 2 0,5 Tæng 25 B¶ng 5. Chu tr×nh thùc hiÖn ph¶n øng PCR stt Ph¶n øng NhiÖt ®é (OC) Thêi gian Chu kú 1 2 3 4 5 6 BiÕn tÝnh BiÕn tÝnh B¾t cÆp KÐo dµi Hoµn tÊt kÐo dµi KÕt thóc ph¶n øng 94 94 58 72 72 4 2 phót 30 gi©y 30 gi©y 45 gi©y 10 phót ∞ 1 x 30 1 2.2.3. §iÖn di ph©n tÝch ADN trªn gel Agarose Nguyªn t¾c: Ph­¬ng ph¸p nµy dùa vµo ®Æc tÝnh cÊu tróc tÝch ®iÖn ©m cña axit nucleic. ADN víi nh÷ng kÝch th­íc vµ khèi l­îng kh¸c nhau, sÏ di chuyÓn víi tèc ®é kh¸c nhau trong ®iÖn tr­êng tõ cùc ©m sang cùc d­¬ng t¹o thµnh c¸c b¨ng kh¸c nhau. Ho¸ chÊt: Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X ®­îc ®un s«i, ®Ó nguéi kho¶ng 50-600C, ®æ dung dÞch vµo khay gel. Khi gel ®«ng ®Æc ®Æt khay gel vµo bÓ ®iÖn di. Tra mÉu ADN trén víi ®Öm tra mÉu (víi tØ lÖ 1V mÉu:1V ®Öm 2X) vµo c¸c giÕng trªn b¶n gel. Ch¹y víi ®iÖn thÕ 80-120V. Quan s¸t c¸c d¶i ADN b»ng c¸ch nhuém gel vµo dung dÞch EtBr 100 µl/l kho¶ng 5 phót trªn m¸y l¾c nhÑ, sau ®ã röa b¶n gel b»ng n­íc vµ soi d­íi ¸nh s¸ng tö ngo¹i 300 nm. 2.2.4. Th«i gel, g¾n ®Çu-A vµ tinh s¹ch s¶n phÈm PCR 2.2.4.1. Th«i gel - C¾t phÇn gel chøa b¨ng ADN quan t©m cho vµo èng Eppendorf 2 ml - Bæ sung 500 µl buffer QG, ñ ë nhiÖt ®é 520C kho¶ng 10 phót cho ®Õn khi gel hßa tan hÕt. Cho dÞch thu ®­îc vµo cét QIAquick 50. Li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. Lo¹i bá dÞch ë phÝa d­íi. - Bæ sung 750 µl buffer PE, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. Lo¹i bá dÞch phÝa d­íi. Li t©m thªm 1 phót ®Ó lo¹i bá hÕt PE. - ChuyÓn cét sang èng Eppendorf 1,5 ml. Bæ sung 30 µl EB. §Ó yªn 5 phót råi li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. 2.2.4.2. Ph¶n øng g¾n ®Çu-A Do vect¬ t¸ch dßng cã ®Çu-T nªn muèn s¶n phÈm PCR g¾n ®uîc vµo vect¬ t¸ch dßng, chóng t«i tiÕn hµnh g¾n ®u«i-A vµo s¶n phÈm PCR sau khi ®· th«i gel. B¶ng 6. Thµnh phÇn ph¶n øng g¾n Thµnh phÇn ThÓ tÝch (µl) N­íc cÊt hai lÇn Buffer PCR (10X) dNTP MgCl2 ADN mÉu Taq ADN polymerase 9 4 3 3 30 1 Tæng 50 ñ hçn hîp trong ë 720C, 15 phót. 2.2.4.3. Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR - Bæ sung buffer PB (theo tØ lÖ 1V mÉu:5V PB ). Cho dÞch qua cét tinh s¹ch QIAquick 50. Li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. - Bæ sung 750 ml buffer NW, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. Li t©m thªm mét phót n÷a ®Ó lo¹i bá hÕt NW. - Hßa tan ADN trong 30 ml EB. 2.2.5. G¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng pGEM-T Sau khi thu ®­îc ADN nh©n b¶n tõ ph¶n øng PCR, chóng t«i tiªn hµnh g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ pGEM-T. B¶ng7. Thµnh phÇn hçn hîp ph¶n øng nèi ghÐp Thµnh phÇn ThÓ tÝch(ml) N­íc cÊt hai lÇn 2 Dung dÞch ®Öm( 2X) 10 S¶n phÈm PCR 7 Vector pGEM-T 0,5 T4 ADN ligase 0,5 Tæng 20 Hçn hîp ®­îc ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 30 phót. 2.2.6. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a b»ng ph¸p sèc nhiÖt Ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p plasmit t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo E.coli DH5a ®­îc tiÕn hµnh theo Cohen vµ céng sù (1972) [14]. Mµng tÕ bµo vi khuÈn d­íi t¸c dông cña ho¸ chÊt, trë nªn xèp, máng h¬n vµ t¹o c¸c lç cho c¸c ph©n tö ADN cã thÓ chui vµo. Sau ®ã, c¸c tÕ bµo ®­îc phôc håi trong m«i tr­êng nu«i cÊy vµ c¸c thÓ biÕn n¹p ®­îc ph¸t hiÖn trªn m«i tr­êng thÝch hîp. + ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn Chän mét khuÈn l¹c E.coli nu«i cÊy trong 10 ml LB láng, l¾c 200 v/p, 370C, qua ®ªm. Hót 0,5 ml dÞch tÕ bµo cho vµo 50 ml LB láng, l¾c 200 v/p, 370C, trong 4 giê. Ly t©m 4000 v/p, 40C, 5 phót, thu tña. Tan tña tÕ bµo trong 5 ml CaCl2 0,1M (®Ó l¹nh s½n ë 00C), ly t©m thu tña. Tan tña tÕ bµo trong 0,85 ml CaCl2 0,1M vµ 0,15 ml glyxerol. Chia nhá 200 µl vµo c¸c èng Eppendorf 1,5 ml, bá nhanh vµo N2 láng, gi÷ ë 800C. + BiÕn n¹p Bæ sung trùc tiÕp vµo èng ®ùng tÕ bµo kh¶ biÕn 10 ml ADN plasmit, ñ 30 phót trong ®¸. Sèc nhiÖt ë 420C trong 1 phót 30 gi©y råi chuyÓn ngay sang gi÷ trong ®¸ 5 phót. Tr¶i 100 ml dÞch tÕ bµo lªn trªn ®Üa LB ®Æc chøa ampicillin nång ®é cuèi cïng 100 mM , IPTG 100 mM vµ X-Gal 0,04% råi ñ ë 370C qua ®ªm. 2.2.7. KiÓm tra sù cã mÆt cña gen CP trong vect¬ t¸ch dßng Hßa tan mét phÇn khuÈn l¹c tr¾ng vµo 16 ml n­íc cÊt 2 lÇn, ñ ë 1000C trong 5 phót ®Ó ph¸ vì tÕ bµo. Bæ sung c¸c thµnh phÇn cña ph¶n øng PCR theo thø tù sau: B¶ng 8. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR Thµnh phÇn ThÓ tÝch (µl) DÞch khuÈn Dung dÞch ®Öm (10X) dNTP MgCl2 pUC-R1 pUC-F1 Taq ADN polymerase 16 2,5 2 2 1 1 0,5 Tæng 25 B¶ng 9. Ch­¬ng tr×nh thùc hiÖn ph¶n øng PCR B­íc Ph¶n øng NhiÖt ®é (OC) Thêi gian Chu kú 1 2 3 4 5 6 BiÕn tÝnh BiÕn tÝnh B¾t cÆp KÐo dµi Hoµn tÊt kÐo dµi KÕt thóc ph¶n øng 94 94 56 72 72 4 2 phót 30 gi©y 30 gi©y 45 gi©y 10 phót ∞ 1 x30 1 2.2.8. T¸ch vect¬ t¸i tæ hîp (ADN plasmit t¸i tæ hîp) tõ E.coli Song song víi PCR kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CP trong vect¬ t¸ch dßng pGEM-T. Chóng t«i nu«i c¸c khuÈn l¹c tr¾ng t­¬ng øng vµo m«i tr­êng LB láng cã bæ sung Amp 100mg/l. Nh÷ng khuÈn l¹c PCR d­¬ng tÝnh th× chung t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmit. - LÊy 2 ml dÞch khuÈn ®· nu«i qua ®ªm vµo èng Eppendorf 2 ml, li t©m 13.000 v/p trong 5 phót, thu tña. - Bæ sung 250 ml P1 (cã bæ sung RNase), ®¶o kÜ cho ®Õn khi khuÈn tan hoµn toµn. - Bæ sung 250 ml P2, ®¶o nhÑ 4-6 lÇn. - Bæ sung ngay 350 ml N3, ®¶o nhÑ, li t©m 13.000 v/p trong 10 phót ë 4oC. - ChuyÓn pha trªn vµo cét QIA prep spin, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. - Bæ sung vµo cét b»ng 500 ml buffer PB, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. - Röa cét b»ng 750 ml buffer PE, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. Li t©m thªm mét phót ®Ó lo¹i hÕt PE. - ChuyÓn cét sang èng Eppendorf 1,5 ml, bæ sung 50 ml EB, ®Ó yªn 5 phót, li t©m 13.000 v/p trong 1 phót. 2.2.9. X¸c ®Þnh tr×nh tù gen b»ng m¸y ph©n tÝch tr×nh tù nucleotid tù ®éng Gen ®­îc x¸c ®Þnh tr×nh tù trªn m¸y tù ®éng ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer, b»ng c¸ch sö dông bé ho¸ chÊt sinh chuÈn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. B¶ng 10. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR cho x¸c ®Þnh tr×nh tù Thµnh phÇn ThÓ tÝch(ml) Dung dÞch ®Öm(5X) Måi xu«i ADN mÉu (~100 ng) BigDye 3 1,275 7,725 3 Tæng 15 B¶ng 11. Ch­¬ng tr×nh ph¶n øng PCR cho x¸c ®Þnh tr×nh tù B­íc Ph¶n øng NhiÖt ®é Thêi gian Chu kú 1 2 3 4 5 6 BiÕn tÝnh BiÕn tÝnh B¾t cÆp KÐo dµi Hoµn tÊt kÐo dµi KÕt thóc ph¶n øng 960C 960C 550C 600C 720C 40C 1 phót 10 gi©y 5 gi©y 4 phót 8 phót 30phót 1 x25 1 S¶n phÈm PCR ®­îc tña b»ng c¸ch bæ sung 5 µl 125mM EDTA, 60 µl 100% EtOH. ñ ë nhiÖt ®é phßng 15 phót. Ly t©m dÞch 12000 v/p trong 15 phót, lo¹i bá EtOH. Röa tña b»ng 70 µl 70% EtOH, ly t©m 12000 v/p trong 5 phót råi ®Ó kh«. Bæ sung 10 ml Hi-DiTM Formamide vµ biÕn tÝnh ë 950C trong 5 phót. C¸c mÉu ®­îc tra vµo c¸c giÕng cña khay ®ùng mÉu vµ ®iÖn di trong èng mao qu¶n (80 cm x 50 ml) víi polymer POP-4TM cña h·ng ABI, Mü. 2.2.10. Ph­¬ng ph¸p xö lý tr×nh tù gen thu ®­îc Sö dông ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm DNAstar ®Ó ph©n tÝch, so s¸nh tr×nh tù gen thu ®­îc. C¸c b­íc tiÕn hµnh nh­ sau: + So s¸nh tr×nh tù gen ®­îc ®äc tõ hai ®Çu xu«i vµ ®Çu ng­îc ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Çy ®ñ vµ ®óng cña gen. + X¸c ®Þnh ®­îc vÞ trÝ, sè l­îng c¸c enzym h¹n chÕ trªn tr×nh tù ADN. + Gi¶i m· tr×nh tù nucleotit sang tr×nh tù axit amin theo mét trong c¸c khung ®äc më, x¸c ®Þnh vÞ trÝ më ®Çu vµ kÕt thóc dÞch m·. + LËp c©y ph©n lo¹i vµ b¶ng hÖ sè ®ång d¹ng so s¸nh møc ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña 6 tr×nh tù nucleotit cña gen CP cña 6 dßng TYLCV nghiªn cøu víi nhau vµ víi tr×nh tù gen CP cña c¸c TYLCV tõ nhiÒu khu vùc kh¸c nhau trªn thÕ giíi ®· ®­îc c«ng bè trong ng©n hµng d÷ liÖu gen (NCBI) (b¶ng 2). Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. T¸ch chiÕt ADN Víi môc ®Ých ph©n lËp ®­îc ®o¹n gen m· ho¸ protein vá (CP), chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN cña vi rót. Genom cña Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) cã b¶n chÊt lµ ADN sîi ®¬n, d¹ng vßng, kÝch th­íc kho¶ng 3 Kb. HiÖn nay cã rÊt nhiÒu ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch ADN cña TYLCV. Tuy nhiªn, c¸c ph­¬ng ph¸p nµy ®ßi hái l­îng l¸ cµ chua nhiÔm vi rót lín, thao t¸c thÝ nghiÖm phøc t¹p vµ tèn nhiÒu thêi gian. §Ó t¸ch chiÕt ADN cña TYLCV, chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p cña Accotto vµ céng sù (2000) [11], víi mét sè thay ®æi cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm. Ph­¬ng ph¸p nµy ®¬n gi¶n, nhanh vµ ®­îc sö dông phæ biÕn. Tuy nhiªn ADN cña vi rót sÏ lÉn nhiÒu t¹p chÊt nh­ ADN cña cµ chua, protein ch­a bÞ lo¹i bá hoµn toµn.… L¸ cµ chua nhiÔm bÖnh ®­îc nghiÒn nhanh trong nit¬ láng ®Ó gi÷ ®­îc ho¹t tÝnh cña ADN. C¸c hãa chÊt ®­îc bæ sung (Extraction buffer) cã t¸c dông ph¸ vì mµng tÕ bµo vµ mµng nh©n, gi¶i phãng ADN ra m«i tr­êng ®ång thêi ph©n hñy c¸c protein liªn kÕt víi ADN, Phenol:Chloroform:Isoamin (25:24:1) cã t¸c dông biÕn tÝnh vµ kÕt tña protein. ADN ®­îc thu b»ng c¸ch tña b»ng Isopropanol vµ röa b»ng ethanol 70%. §é tinh s¹ch cña ADN ®­îc kiÓm tra b»ng c¸ch ®iÖn di trªn gel agarose 0,8%. H×nh 8. ADN tæng sè t¸ch chiÕt tõ l¸ bÞ bÖnh xo¨n l¸ ë 6 tØnh §­êng sè 1 - 6: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh Qua kÕt qu¶ ®iÖn di chóng t«i thÊy, ADN t¸ch ®­îc t­¬ng ®èi s¹ch, kh«ng bÞ g·y ®¸p øng yªu cÇu cho c¸c b­íc thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.2. Nh©n gen b»ng ph­¬ng ph¸p PCR Sau khi t¸ch ®­îc ADN vi rót, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù cã mÆt vµ nh©n b¶n gen CP cña TYLCV b»ng kÜ thuËt PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu prV324N, prC889N. Hai måi nµy ®­îc thiÕt kÕ dùa trªn nh÷ng tr×nh tù gen CP-TYLCV ®· c«ng bè trªn Ng©n hµng gen thÕ giíi (b¶ng 2). §ång thêi, trong qu¸ tr×nh thiÕt kÕ måi, chóng t«i cã tham kh¶o c«ng bè cña Wyatt vµ Brown (1996) [37]. Tr×nh tù vµ c¸c th«ng sè cÇn thiÕt cña hai måi ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 12. B¶ng 12. Tr×nh tù vµ c¸c th«ng sè cña hai måi Stt Tr×nh tù måi Tm %GC prV324N 5’-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAGN -3’ 520C 38,10% prC889N 5’-GGRTTDGARGCATGHGTACATGN -3’ 540C 38,10% Trong ®ã c¸c kÝ hiÖu Y, R, M, D, H, thay cho c¸c lo¹i nucleotit: Y (C hoÆc T), R (A hoÆc G), M (A hoÆc C), D (G hoÆc C hoÆc A), H (A hoÆc C hoÆc T), N (A hoÆc G hoÆc C hoÆc T) PCR cã thÓ t¹o ra s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu nªn ®Ó t¨ng hiÖu qu¶ cña ph¶n øng, ta ph¶i lùa chän chu tr×nh nhiÖt tèi ­u vµ c¸c chÊt trong thµnh phÇn ph¶n øng ph¶i cã nång ®é thÝch hîp. Th«ng th­êng, l­îng ADN khu«n ®­îc ®­a vµo ph¶n øng kho¶ng 5-50 ng. NÕu l­îng ADN khu«n qu¸ nhiÒu cã thÓ g©y ra sù tæng hîp c¸c ®o¹n kh«ng ®Æc tr­ng. Nång ®é måi thÝch hîp lµ kho¶ng 10 pM, nÕu nång ®é qu¸ thÊp th× nã sÏ hÕt tr­íc khi sè chu k× kÕt thóc, cßn nÕu qu¸ cao sÏ dÔ lµm t¨ng s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu. C¸c ®o¹n måi cÇn mang tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng vµ ph¶i ®­îc thiÕt kÕ sao cho nã kh«ng b¾t cÆp ®­îc víi nhau. C¸c måi ph¶i cã kÝch th­íc Ýt kh¸c nhau ®Ó Tm gÇn gièng nhau [31]. C¸c nucleotit (dNTP) th­êng sö dông ë nång ®é 20-200 µM. Dung dÞch ®Öm lµ buffer PCR 10X cã thµnh phÇn quan träng nhÊt lµ ion Mg2+. Mg2+ h×nh thµnh phøc hÖ hoµ tan víi dNTP, ngoµi ra nã cßn xóc t¸c cho enzym, t¨ng kh¶ n¨ng g¾n cña ®o¹n måi vµo ADN khu«n. Nång ®é cña Mg2+ tèi ­u lµ tõ 1-1,5 mM. Nång ®é cña enzym còng ph¶i phï hîp kho¶ng 0,5-2,5 ®¬n vÞ [9]. §Ó ph©n lËp gen CP-TYLCV, qua nhiÒu lÇn thö nghiÖm, chóng t«i thÊy thµnh phÇn cña ph¶n øng PCR vµ chu tr×nh nhiÖt ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 4, b¶ng 5 lµ tèi ­u. Víi nång ®é c¸c chÊt t­¬ng øng lµ: 50 ng ADN, 2,5 mM Mg2+ , 2,5 mM dNTP, 10 pM mçi lo¹i måi, 2 ®¬n vÞ Taq polymerase, buffer PCR 10X. S¶n phÈm cña ph¶n øng PCR ®­îc kiÓm tra b»ng c¸ch ®iÖn di trªn gel agarose. Th­êng c¸c ®o¹n gen cã kÝch th­íc 300 ®Õn 10.000 bp cã thÓ ph©n t¸ch trªn gel agarose 0,8%. §o¹n gen cµng nhá th× nång ®é agarose cµng ph¶i t¨ng lªn, nh­ng nÕu nhá tíi vµi chôc nucleotit th× ph¶i dïng lo¹i gel kh¸c nh­ gel polyacrylamit. Víi gen CP kÝch th­íc kho¶ng 550 nucleotit (theo kÝch th­íc gen CP cña TYLCV ®· ®­îc c«ng bè trong ng©n hµng gen). Chóng t«i sö dông gel agarose 1% ®Ó kiÓm tra. 600bp 500bp H×nh 9. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR gen CP M: Thang ADN 100 bp. Sè 1-6: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh Theo kÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy ®o¹n ADN m· hãa protein CP ®· ®­îc nh©n lªn mét c¸ch ®Æc hiÖu. §èi chiÕu víi thang ADN chuÈn, chóng t«i thÊy kÝch th­íc s¶n phÈm PCR kho¶ng 600 bp. KÝch th­íc nµy hoµn toµn phï hîp víi kÝch th­íc gen CP chóng t«i ®· dù tÝnh khi thiÕt kÕ måi. Tõ kÕt qu¶ trªn, chóng t«i s¬ bé kÕt luËn ®· ph©n lËp ®­îc gen CP cña vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua ë s¸u tØnh: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh. §Ó cã kÕt luËn chÝnh x¸c chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù gen CP. 3.3. T¸ch dßng gen m· hãa protein CP 3.3.1. KÕt qu¶ th«i gel Qu¸ tr×nh t¸ch dßng ®­îc thùc hiÖn b»ng c¸ch g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng pGEMÒ-T cña h·ng Promega. §Ó viÖc g¾n hiÖu qu¶, s¶n phÈm PCR ph¶i ®­îc lµm s¹ch, chØ thu duy nhÊt mét b¨ng ®Æc hiÖu vµ lo¹i bá c¸c thµnh phÇn t¹p chÊt trong s¶n phÈm PCR nh­: måi, ®Öm, enzym.... Qu¸ tr×nh lµm s¹ch ADN (th«i gel) ®­îc thùc hiÖn theo sù h­íng dÉn cña bé kit QIAquick Gel Extraction nh­ ®· m« t¶ ë môc 2.2.4.1. Khi n©ng nhiÖt ®é dÞch ®Öm QG lªn nhiÖt ®é 500C th× l­îng ADN ®­îc hßa vµo dung dÞch vµ t¸ch khái agarose. Sau ®ã, ADN ®­îc g¾n vµo c¸c ph©n tö cã ¸i lùc cao víi ADN cè ®Þnh trªn mµng läc cña cét läc QIAquick spin column, dÞch ®Öm QG ®­îc lo¹i ®i nhê ly t©m nhanh víi tèc ®é cao (13.000 v/p, 1 phót). §Ó lo¹i bá hÕt agarose cßn b¸m trªn mµng läc, dung dÞch QG ®· ®­îc bæ sung vµo cét lÇn 2. Dung dÞch QG ®­îc lµm s¹ch víi ®Öm röa PE chøa 80% ethanol vµ ®­îc lo¹i bá nhê ly t©m. Cuèi cïng ADN n»m l¹i trªn mµng läc ®­îc hoµ tan trong dÞch ®Öm EB hoÆc n­íc. B»ng ph­¬ng ph¸p nµy ADN ®· ®­îc thu l¹i víi hiÖu suÊt tõ 85% trë lªn. KÕt qu¶ ®­îc kiÓm tra trªn gel agarose 1%. 750bp 500bp 600bp H×nh 10. KÕt qu¶ th«i gel s¶n phÈm PCR M: Thang ADN 1 Kb; Sè: 1 - 6: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng vµ B¾c Ninh Tõ kÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 10 cho thÊy chóng t«i ®· thu ®­îc c¸c b¨ng ADN t­¬ng øng cã ®é tinh s¹ch cao vµ cã hµm l­îng ®ñ ®Ó tiÕn hµnh cho thÝ nghiÖm t¸ch dßng tiÕp theo. 3.3.2. KÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a Qu¸ tr×nh t¸ch dßng ®­îc thùc hiÖn b»ng ph¶n øng g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ pGEM-T. Ph¶n øng g¾n dùa vµo sù h×nh thµnh liªn kÕt photphodieste gi÷a s¶n phÈm PCR víi ®Çu A nh« ra vµ vect¬ t¸ch dßng pGEM-T ®­îc cung cÊp ë d¹ng m¹ch th¼ng cã baz¬ Thymine nh« ra ë ®Çu 3. Vect¬ nµy cã c¸c thµnh phÇn chÝnh ®­îc thÓ hiÖn trong h×nh 11. H×nh 11. S¬ ®å vect¬ pGEM-T [22] §Ó t¨ng hiÖu qu¶ cña qu¸ tr×nh t¸ch dßng, chóng t«i tiÕn hµnh th«i phÇn gel chøa ®o¹n gen CP. Tuy nhiªn, trong qu¸ tr×nh th«i gel, ®Çu -A cã thÓ bÞ g·y. Do ®ã, chóng t«i thùc hiÖn ph¶n øng g¾n ®Çu -A vµo s¶n phÈm PCR. Sau khi tinh s¹ch, chóng t«i thùc hiÖn ph¶n øng g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng. Thµnh phÇn cña ph¶n øng g¾n ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 7, hçn hîp ®­îc ñ ë nhiÖt ®é phßng kho¶ng tõ 20-30 phót. S¶n phÈm nèi ghÐp sau ®ã ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo kh¶ biÕn chñng E.coli DH5a vµ ®­îc cÊy tr¶i trªn m«i tr­êng LB ®Æc cã bæ sung Ampicilin (100 µg/l), X-gal (0,04%) vµ chÊt c¶m øng IPTG 0,1 M. KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a ë c¸c mÉu ë s¸u tØnh: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh bao gåm c¶ khuÈn l¹c xanh vµ khuÈn l¹c tr¾ng. H×nh 12 lµ kÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli chñng DH5a víi mÉu thu ®­îc ë Hµ Néi, c¸c mÉu kh¸c còng cho kÕt qu¶ t­¬ng tù. KÕt qu¶ thu ®­îc cã thÓ gi¶i thÝch nh­ sau: toµn bé khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn m«i tr­êng cã ampicillin ®Òu lµ khuÈn l¹c mang plasmit. V× sù cã mÆt cña gen kh¸ng ampicillin trong plasmit mang ®Õn cho vi khuÈn tÝnh kh¸ng ampicillin. C¸c khuÈn l¹c xanh lµ do trong vect¬ pGEM-T cã chøa gen lacZ nÕu ho¹t ®éng b×nh th­êng sÏ tæng hîp enzym b-galactosidase vµ d­íi sù c¶m øng cña IPTG chuyÓn hãa c¬ chÊt X-gal thµnh hîp chÊt cã mµu xanh. C¸c khuÈn l¹c tr¾ng lµ do gen lacZ ®· bÞ mét ®o¹n ADN xen vµo gi÷a dÉn ®Õn kh«ng tæng hîp ®­îc enzym b-galactosidase. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng ®Òu mang plasmit t¸i tæ hîp chøa ®o¹n ADN t­¬ng øng víi gen CP. Còng cã thÓ x¶y ra tr­êng hîp sau khi bi ®øt g·y c¸c plasmit tù ®ãng vßng còng kh«ng cã kh¶ n¨ng tæng hîp enzym b-galactosidase do ®ã c¸c khuÈn l¹c nµy còng cã mµu tr¾ng. Tuy vËy, viÖc chän c¸c khuÈn l¹c tr¾ng ®Ó tiÕn hµnh nghiªn cøu tiÕp ®· lo¹i bá ®­îc phÇn lín c¸c tr­êng hîp kh«ng mong muèn. Chóng t«i tiÕp tôc tiÕn hµnh sµng läc c¸c khuÈn l¹c tr¾ng b»ng kü thuËt colony-PCR ®Ó cã thÓ thu ®­îc c¸c dßng khuÈn l¹c mang plasmit t¸i tæ hîp cã chøa ®o¹n ADN cã kÝch th­íc nh­ mong muèn. H×nh 12. KÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a mÉu Hµ Néi 3.3.3. KÕt qu¶ chän läc plasmit t¸i tæ hîp b»ng PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) §Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CP trong vect¬ t¸ch dßng, chóng t«i tiÕn hµnh PCR tõ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng víi måi pUC-R1vµ pUC-F1. §iÓm b¸m cña hai måi nµy n»m trªn pGEM- T ë vÞ trÝ lÇn l­ît pUC-R1 (161-177) vµ pUC-F1 (2941-2957). NÕu pGEM-T cã chøa gen CP th× s¶n phÈm PCR tõ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng cã kÝch th­íc kho¶ng 850 bp. KÕt qu¶ PCR kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CP-TYLCV ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh 12. §ång thêi chóng t«i còng tiÕn hµnh PCR tõ mét sè khuÈn l¹c xanh lµm ®èi chøng. 850bp 8 300bp H×nh 13. KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CP trong vect¬ t¸i tæ hîp trong c¸c khuÈn l¹c. M: Thang ADN chuÈn 1 Kb; 2, S¶n phÈm PCR tõ khuÈn l¹c xanh. S¶n phÈm PCR tõ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng: 3-7, Hµ Néi; 8-11, Th¸i B×nh; 12-16, H­ng Yªn; 17-20, Qu¶ng Ninh; 21-25, H¶i D­¬ng; 26-30, B¾c Ninh Tõ kÕt qu¶ ®iÖn di chóng t«i chän ra 12 khuÈn l¹c tr¾ng t­¬ng øng cña 6 tØnh: Hµ Néi, Th¸i B×nh, H­ng Yªn, Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh ®Ó tiÕn hµnh t¸ch plasmit phôc vô cho viÖc tiÕn hµnh x¸c ®Þnh tr×nh tù gen. 3.3.4. KÕt qu¶ t¸ch plasmit §Ó phôc vô cho viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù gen, 12 dßng khuÈn l¹c tr¾ng ®· ®­îc kiÓm tra cã s¶n phÈm colony-PCR nh­ mong muèn (®· ®­îc nu«i trong 3ml LB láng) t¸ch plasmit theo bé kit QIAprep Spin Miniprep nh­ ®· tr×nh bµy ë môc 2.2.7. H×nh 14. KÕt qu¶ ®iÖn di ADN plasmit trªn gel agarose 0,8% Sè: 1-2, Hµ Néi; sè: 3-4, Th¸i B×nh; sè: 5-6, H­ng Yªn; sè: 7-8, Qu¶ng Ninh; sè: 9-10, H¶i D­¬ng; sè: 11-12, B¾c Ninh §©y lµ ph­¬ng ph¸p t¸ch plasmit b»ng ly t©m ®¶m b¶o thu ®­îc l­îng plasmit cÇn thiÕt cho c¸c b­íc thÝ nghiÖm tiÕp theo trong thêi gian ng¾n (kho¶ng 30 phót). S¶n phÈm t¸ch plasmit cã nång ®é kho¶ng 100-500 ng/ml sÏ ®¹t yªu cÇu cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë h×nh 14. KÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 14 cho thÊy s¶n phÈm t¸ch plasmit rÊt s¹ch, ®¶m b¶o chÊt l­îng vµ sè l­îng ®Ó tiÕn hµnh x¸c ®Þnh tr×nh tù. 3.4. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit §Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù gen CP, chóng t«i t¸ch vµ tinh s¹ch plasmit tõ 12 dßng khuÈn l¹c tr¾ng. C¸c plasmit nµy lµ nguyªn liÖu cho ph¶n øng PCR x¸c ®Þnh tr×nh tù Tr×nh tù gen ®­îc x¸c ®Þnh trªn m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit tù ®éng ABI PRISM®3100 Advant Genetic Analyzer cña h·ng Applied Biosystems cïng víi bé ho¸ chÊt sinh chuÈn BigDye® Terminator v3.1 cña Perkin- Elmer. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù cho thÊy ®o¹n gen CP cña c¸c dßng TYLCV mµ chóng t«i ®· t¸ch dßng ®­îc cã kÝch th­íc gièng nhau lµ 576 bp (b¶ng 13). B¶ng 13. KÝch th­íc 6 ph©n ®o¹n ADN cÇn t¸ch dßng STT Tªn mÉu KÝch th­íc (nucleotit) M· sè ®¨ng ký trong Ng©n hµng gen 1 BN 576 AJ972379 2 HD 576 AJ972380 3 HN 576 AJ972381 4 HY 576 AJ972382 5 TB 576 AJ972383 6 QN 576 AJ972384 C¸c tr×nh tù thu ®­îc ®­îc tiÕn hµnh so s¸nh sö dông chøc n¨ng Blast víi c¸c tr×nh tù trong ng©n hµng dù liÖu gen (NCBI), kÕt qu¶ cho thÊy cã ®é t­¬ng ®ång cao víi tr×nh tù gen m· ho¸ cho protein vá (CP) cña c¸c TYLCV. §iÒu nµy chøng tá chóng t«i ®· t¸ch dßng thµnh c«ng ®o¹n gen CP cña c¸c dßng TYLCV cña 6 tØnh ë miÒn B¾c ViÖt Nam. C¸c tr×nh tù thu ®­îc ®· ®­îc chóng t«i göi ®ang ký vµo ng©n hµng d÷ liÖu gen vµ cã c¸c sè ®¨ng ký t­¬ng øng ®­îc liÖt kª trong b¶ng 13. 3.5. kÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù 3.5.1. KÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù nucleotit Sö dông ch­¬ng tr×nh Aligment cña phÇn mÒm DNAstar ®Ó so s¸nh tr×nh tù gen CP cña 6 mÉu nghiªn cøu víi nhau vµ víi 43 tr×nh tù gen CP cña TYLCV kh¸c nhau vµ mét sè vi rót kh¸c thuéc chi Begomovirus tõ nhiÒu khu vùc trªn thÕ giíi ®· ®­îc c«ng bè trong ng©n hµng d÷ liÖu gen (NCBI). H×nh 15 tr×nh bµy kÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù nucleotit gen CP cña 6 dßng TYLCV nghiªn cøu. HN GCCCATGTAC AGAAAGCCCA GGATGTACAG AATGTACAAA AGCCCTGATG TTCCACGAGG ATGTGAAGGC CCATGTAAAG 80 HY .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 80 HD .......GT. ........A. .......... .......... .......... ....T..... .......... ........G. 80 QN .......GTG .......... ........C. G......... .......... ....T..T.. T........T ........G. 80 BN .......... ..G.....A. .......... ..C....... .......... ....T..... .......... ........G. 80 TB .........T ..G....... T......... .......... .......... .......... .......... .......... 80 HN TCCAGTCTTA TGAACAGCGT CATGATGTAG CCCATGTAGG GAAGGTAATT TGTGTGTCTG ATGTTACACG TGGTAACGGG 160 HY .A........ ......A... ......A... .......... .......... .......... .......... .......... 160 HD .T.....G.. .......... .......... .G..C..... T..A..C... ........G. .......T.. .......... 160 QN .T.....G.. .......... .......... .G..C..... T..A..C... ........G. .......T.. .......... 160 BN .T.....C.. .......... .......... TG..C..... T..A..C... ........G. .......T.. .......... 160 TB .......... ......A... ......A... .......... .......... .......... .......... .......... 160 HN TTGACTCATC GTGTTGGTAA GAGGTTCTGT ATTAAGTCAG TTTATGTTTT GGGTAAGATC TGGATGGATG AGAACATTAA 240 HY .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240 HD .......... .A..G..A.. ......T... G.......T. .......... ...C.....A ........C. .......... 240 QN .......... .A..G..A.. ......T... G.......T. .......... ...C.....A .......... .......... 240 BN .......... .A..G..A.. ......T... G.......T. .......... ...C.....A .......... .......... 240 TB .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 240 HN GACGAAGAAT CATACTAATA CGGTCATGTT CCTTTTAGTA CGTGATAGAA GACCTTTTGG GACTCCCCAA GATTTTGGTC 320 HY .......... ........C. .......... .T........ .......... .......... A......... .......... 320 HD ...C...... ..C....... .T..G..... TT.......T ........G. ....A..... ......A..G .......... 320 QN ...T...... ..C....... .T..G..... TT.......T ........G. ....A..... ......A..G .......... 320 BN ...C...... .......... .T..G..... TT.......G ........G. ....A..... ......A..G .......... 320 TB .......... .......... .......... .T........ .......... .......... A......... .......... 320 HN AGGTGTTTAA CATGTATGAT AACGAGCCAA GTACAGCAAC CGTGAAGAAC GATAACAGAG ATCGTTTTCA AGTGCTTCGT 400 HY .......... .......... .......... .......C.. G......... .......... .......... ...T...... 400 HD .......... .......... .......... .......C.. A......... ..C....... ....C..... ...T..A..G 400 QN ....T..... T......... ..T.....T. .C..T..T.. T.....A... ..C....... ....C..... ...T..A..G 400 BN .......... .......... .......... .......C.. G......... ..C....... ....C..... ...T..A..G 400 TB .......... .......... .......... .......C.. G......... .G........ .......... ...T...... 400 HN CGATTTCAGG CAACTGTTAC TGGTGGCCAA TATGCGAGCA AGGAGCAAGC AATAGTTAGG AAGTTTATGA AGGTGAACAA 480 HY .......... .......... ......T..G .....A.... .......... .......... ..A....... .......... 480 HD ..T....... .G........ ......T..G .....A..T. .......... .......... .......... .......... 480 QN ..T....... .G........ C.....T..G .....A..T. .......G.. GT.G...... ..A....... .......... 480 BN ..T....... .T........ ......T..G .....A..T. .......... .......... .......... .......... 480 TB .......... .......... ......T..G .....A.... .......... .......... ..A....... .......... 480 HN CCATGTGACG TATAATCATC AAGAGGCTGC GAAGTATGAC AATCACACAG AGAATGCTCT TTTGTTGTAT ATGGCATGTA 560 HY .......... .......... .......... T..A.....T ..C....... .......... G..A...... .......... 560 HD .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... .......... ....A..... 560 QN .........C .....C.... ....A..... .........T .......... .......... .......... ....A..... 560 BN .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... .......... .......... 560 TB .......... .......... .......... T..A.....T ..C....... .......... G..A...... .......... 560 HN CTCATGCTTC TAACCC 576 HY .......... ...... 576 HD .......C.. C..... 576 QN .A.....C.. C..... 576 BN .......C.. ...T.. 576 TB .......... A..... 576 H×nh 15. so s¸nh tr×nh tù gen CP gi÷a c¸c chñng virut ph©n lËp ®­îc ë 6 tØnh DÊu chÊm (.) biÓu thÞ sù gièng nhau, sai kh¸c biÓu thÞ b»ng ch÷ c¸i B¶ng 14. HÖ sè t­¬ng ®ång vµ hÖ sè sai kh¸c ë møc ®é nucleotit cña 6 chñng vi rót ph©n lËp ®­îc Qua kÕt qu¶ cho thÊy c¸c tr×nh tù chóng t«i t¸ch ®­îc cã ®é t­¬ng ®ång kh¸ cao tõ 86,8% (kÕt qu¶ so s¸nh gi÷a hai chñng thu ®­îc ë Qu¶ng Ninh vµ Th¸i B×nh) ®Õn 98,8% (kÕt qu¶ so s¸nh gi÷a hai chñng thu ®­îc ë Th¸i B×nh vµ H­ng Yªn). XÐt vÒ mÆt ®Þa lÝ nh×n chung c¸c tØnh cã vÞ trÝ ®Þa lÝ gÇn nhau th× cã sù t­¬ng ®ång vÒ nucleotit cao h¬n. VÝ dô nh­, chñng virut ph©n lËp tõ Th¸i B×nh cã ®é t­¬ng ®ång cao víi c¸c chñng ë H­ng Yªn (98,8%), Hµ Néi (96,2%), cßn kh¸c nhÊt víi chñng ph©n lËp ë Qu¶ng Ninh (86,8%). 3.5.2. KÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù axit amin HY PMYRKPRMYR MYKSPDVPRG CEGPCKVQSY EQRHDIAHVG KVICVSDVTR GNGLTHRVGK RFCIKSVYVL 70 HD ..V....... .......... .......... .....V.... .......... .......... ...V...... 70 QN ..V....... .......... .......... .....V.... .......... .......... ...V...... 70 BN .......... T......... .......... .....VV... .......... .......... ...V...... 70 TB ......M... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 70 HN .......... .......... .......... .....V.... .......... .......... .......... 70 HY GKIWMDENIK TKNHTNTVMF FLVRDRRPFG TPQDFGQVFN MYDNEPSTAT VKNDNRDRFQ VLRRFQATVT 140 HD .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 140 QN .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 140 BN .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 140 TB .......... .......... .......... .......... .......... ...G...... .......... 140 HN .......... .......... L......... .......... .......... .......... .......... 140 HY GGQYASKEQA IVRKFMKVNN HVTYNHQEAA KYDNHTENAL LLYMACTHAS N 191 HD .......... .......... .......... .......... ....E..... . 191 QN .......... L......... .......... .......... ....E..... . 191 BN .......... .......... .......... .......... .......... . 191 TB .......... .......... .......... .......... .......... . 191 HN .......... .......... .......... .......... .......... . 191 H×nh 16. So s¸nh tr×nh tù axit amin cña c¸c chñng virut ph©n lËp tõ 6 tØnh DÊu chÊm (.) biÓu thÞ sù gièng nhau, sai kh¸c biÓu thÞ b»ng ch÷ c¸i B¶ng 15. HÖ sè t­¬ng ®ång vµ sai kh¸c ë møc ®é axit amin cña protein vá TYLCVcña 6 chñng vi rót ph©n lËp ®­îc Sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù nucleotit dÉn ®Õn sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù axit amin. Nh­ng qua kÕt qu¶ so s¸nh chóng t«i nhËn thÊy: tr×nh tù axit amin cña 6 chñng vi rót ph©n lËp ®­îc cã sù sai kh¸c nhau Ýt h¬n sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù nucleotit. §é t­¬ng ®ång vÒ axit amin cña s¸u chñng vi rót rÊt cao tõ 96,3% ®Õn 99,5%. Nh­ vËy cã thÓ ®i ®Õn kÕt luËn sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù nucleotit ë s¸u chñng vi rót kh«ng ¶nh h­ëng ®Õn tr×nh tù axit amin cña protein vá, ®iÒu nµy cã thÓ gi¶i thÝch lµ do sù biÕn ®æi c¸c nucleotit gi÷a c¸c chñng lµ c¸c nucleotit ë vÞ trÝ thø ba trong bé ba m· hãa. T¹o nªn c¸c bé ba kh¸c nhau nh­ng cïng m· hãa mét lo¹i axit amin. 3.5.3. §¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng cña c¸c dßng TYLCV ViÖt Nam th«ng qua c©y ph¸t sinh chñng lo¹i C©y ph¸t sinh chñng lo¹i ®­îc x©y dùng theo ph­¬ng ph¸p Maximum Parsimony (MP) sö dông kÕt qu¶ so s¸nh ClustalX c¸c tr×nh tù cña gen CP cña s¸u tØnh ph©n lËp ®­îc (B¾c Ninh (BN), Hµ Néi (HN), H­ng Yªn (HY), H¶i D­¬ng (HD), Th¸i B×nh (TB), Qu¶ng Ninh (QN)) vµ 43 tr×nh tù CP ®¹i diÖn cho c¸c dßng virus TYLCV vµ mét sè virus kh¸c thuéc chi Begomovirus kh¸c nhau trªn thÕ giíi cã tr×nh tù ®· ®­îc c«ng bè trong Ng©n hµng gen (NCBI). H×nh 15. C©y ph¸t sinh chñng lo¹i MP (Maximum Parsimony) dùa trªn viÖc so s¸nh tr×nh tù gen CP cña 6 chñng TLCV ViÖt Nam (TYLCV-BN, TYLCV-HD, TYLCV-TB, TYLCV-HY, TYLCV-QN, TYLCV-HN) vµ 43 tr×nh gen CP cña c¸c TLCV vµ mét sè vi rót kh¸cthuéc chi Begomo trªn thÕ giíi.Tªn c¸c dßng TLCV quèc tÕ gåm 2 phÇn: phÇn ®Çu viÕt t¾t cña tªn n­íc (trong ®ã AUS: Australia, BRA: Brazil, BLD: Bangladesh, CHN: Trung Quèc, CUB: Cuba, DR: Dominica, Egy: Ai CËp, IND: Ên §é, IS: Israel, Iran: Iran, JP: NhËt B¶n, LAO: Lµo, MAL: Malaysia, MEX: Mexico, MM: Myanma, PHL: Philippines, Port: Bå §µo Nha, SP: T©y Ban Nha, PR: Puertorico, USA: Mü, THL: Th¸i Lan, TW: Taiwan) vµ phÇn thø hai lµ sè ®¨ng ký GenBank cña dßng vi rót ®ã. PLCV: Papaya leaf curl virus, PeLCV: Peper leaf curl virus, TGMV: Tomato golden mosaic virus, ToCSV: Tobacco curly shoot virus Qua c©y ph¸t sinh chñng lo¹i vµ dùa vµo kÕt qu¶ so s¸nh chóng t«i thÊy c¸c chñng TYLCV ph©n lËp ®­îc ë ViÖt Nam cã ®é t­¬ng ®ång kh¸ cao víi nhau vµ lËp thµnh mét ph©n nhãm cïng víi dßng virut g©y bÖnh xo¨n l¸ trªn c©y ®u ®ñ (PLCV-CHN-AJ558125) ph©n lËp ®­îc t¹i tØnh Qu¶ng Ch©u, Trung Quèc. Chñng virut cã quan hÖ di truyÒn gÇn nhÊt víi ph©n nhãm nµy lµ chñng virut g©y bÖnh xo¨n l¸ trªn c©y ít (PeLCV-MAL-AF414287) ®­îc ph©n lËp t¹i ë Malaysia (®é t­¬ng ®ång di truyÒn kho¶ng 0,85). Cïng víi mét sè TYLCV cña Trung Quèc, §µi Loan, Lµo, Philippine vµ Australia c¸c TYLCV cña ViÖt Nam, PLCV cña Trung Quèc vµ PeLCV cña Malaysia lËp thµnh mét nhãm lín trªn c©y ph¸t sinh chñng lo¹i. §iÒu nµy cã thÓ cho chóng ta thÊy sù phøc t¹p vµ tÝnh ®a d¹ng cña c¸c virut thuéc chi begomo. Trong ph¹m vi nghiªn cøu cña kho¸ luËn nµy do ®iÒu kiÖn thêi gian cã h¹n nªn chóng t«i míi chØ thu mÉu vµ ph©n tÝch ®­îc víi c¸c virut g©y bÖnh xo¨n l¸ trªn c©y cµ chua cña 6 tØnh thuéc miÒn b¾c ViÖt Nam nªn ch­a thÓ ®­a ra kÕt luËn cã tÝnh tæng qu¸t vÒ ®é ®a d¹ng cña TYLCV. Nh­ng qua kÕt qu¶ thu ®­îc chóng ta còng cã ®· cã thÓ s¬ bé thÊy ®­îc ®é ®a d¹ng cña chñng TYLCV cña ViÖt Nam. Trong s¸u tØnh thu mÉu, c¸c chñng cã sù sai kh¸c vÒ nucleotit nhiÒu nhÊt lµ 14,6% (so s¸nh gi÷a chñng virut ë Th¸i B×nh vµ H­ng Yªn). §é sai kh¸c cña c¸c TYLCV ViÖt Nam víi c¸c chñng TYLCV vµ mét sè lo¹i virut thuéc chi Begomovirus trªn thÕ giíi ®Òu trªn 15%, theo tiªu chuÈn cña Uû ban Quèc tÕ vÒ ph©n lo¹i virus (International commitee on Taxonomy of Viruse, ICTV) ®èi víi chi Begomovirus th× hai dßng virus kh¸c nhau cã ®é t­¬ng ®ång vÒ tr×nh tù nucleotide d­íi 90% th× cã thÓ coi lµ hai loµi kh¸c nhau [37]. Trªn c¬ së tiªu chÝ nµy cã thÓ kÕt luËn s¬ bé c¸c dßng TYLCV chóng t«i ph©n lËp ®­îc thuéc vÒ mét hoÆc mét vµi loµi míi ®Æc tr­ng cho ViÖt Nam. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu gÇn ®©y t¹i Trung Quèc, Ên §é vµ Th¸i Lan trªn c©y cµ chua cã biÓu hiÖn triÖu chøng bÖnh xo¨n cho thÊy cã rÊt nhiÒu loµi virut kh¸c nhau thuéc chi Begomovirus cïng g©y ra bÖnh xo¨n l¸ cho c©y cµ chua [13], [23], [32]. Tõ kÕt qu¶ nghiªn cøu cña chóng t«i còng ®· cã thÓ kÕt luËn s¬ bé vÒ tÝnh ®a d¹ng cña c¸c virut g©y bÖnh xo¨n l¸ trªn cµ chua cña ViÖt Nam, tuy nhiªn vÉn cßn cÇn ph¶i cã c¸c nghiªn cøu mét c¸ch toµn diÖn h¬n vÒ c¸c dßng TYLCV g©y bÖnh ë c¸c vïng kh¸c nhau cña ViÖt Nam thÝ míi cã thÓ cã mét kÕt luËn mang tÝnh tæng qu¸t. HiÖn nay viÖc sö dông kü thuËt chuyÓn gen t¹o c©y cµ chua kh¸ng bÖnh virus ®· ®­îc chøng minh lµ rÊt h÷u hiÖu vµ ®ang ®­îc chó ý nghiªn cøu t¹i rÊt nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi, mét trong nh÷ng gen ®­îc chuyÓn vµo c©y cµ chua ®Ó t¹o tÝnh kh¸ng lµ c¸c gen cã nguån gèc tõ b¶n th©n virus TYLCV ch¼ng h¹n nh­ gen m· ho¸ cho protein vá (CP), gen m· ho¸ cho replicase. C¬ chÕ t¹o ra tÝnh kh¸ng cho c©y chÝnh lµ c¬ chÕ lµm c©m gen sau phiªn m· (post-transcriptional gene silencing) [12]. NhiÒu nghiªn cøu chøng minh r»ng dùa trªn c¬ chÕ nµy cã thÓ b¶o vÖ ®­îc c©y nÕu gen ®­îc chuyÓn vµ virus ®­îc g©y nhiÔm sau ®ã cã ®é t­¬ng ®ång vÒ tr×nh tù trªn 90%. Do ®ã, ®Ó cã thÓ t¹o ra ®­îc gièng c©y chuyÓn gen cã phæ kh¸ng réng ®èi víi c¸c lo¹i TYLCV cho ViÖt Nam th× mét viÖc lµm cÇn thiÕt lµ ph¶i tiÕn hµnh c¸c nghiªn cøu mét c¸ch toµn diÖn vÒ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c virut g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua cña ViÖt Nam. Nghiªn cøu cña chóng t«i lµ mét nghiªn cøu ®Çu tiªn ®­îc tiÕn hµnh ë ViÖt Nam theo h­íng nµy vµ lµ mét ®ãng gãp ban ®Çu gãp phÇn cho viÖc nghiªn cøu t¹o c©y cµ chuyÓn gen kh¸ng bÖnh xo¨n l¸ ë ViÖt Nam. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn Nh©n dßng vµ t¸ch dßng thµnh c«ng ®o¹n gen m· hãa protein vá (CP) cña c¸c dßng virut g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua thu thËp ë s¸u tØnh miÒn B¾c ViÖt Nam bao gåm Qu¶ng Ninh, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh, H­ng Yªn, Hµ Néi vµ Th¸i B×nh. X¸c ®Þnh ®­îc tr×nh tù nucleotit ®o¹n gen CP t­¬ng øng cho 6 dßng virut nghiªn cøu. C¸c ®o¹n gen nµy cã ®é dµi gièng nhau lµ 576 bp m· ho¸ cho c¸c polypeptit t­¬ng øng dµi 191 axit amin. Tr×nh tù c¸c ®o¹n gen nµy ®· ®­îc ®¨ng ký vµo Ng©n hµng d÷ liÖu gen quèc tÕ víi sè ®¨ng ký lµ AJ972379 - AJ972384. KÕt qu¶ so s¸nh cho thÊy, c¸c tr×nh tù gen CP cña 6 dßng virut g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua thu thËp ë s¸u tØnh miÒn B¾c ViÖt Nam cã hÖ sè t­¬ng ®ång víi nhau tõ 86,8% (TB so víi QN) ®Õn 98,8% (TB so víi HY) ë møc ®é nucleotit vµ tõ 96,3% (TB so víi QN) ®Õn 99,5% (HD so víi QN) ë møc ®é axit amin. KÕt qu¶ ph©n tÝch ph¸t sinh chñng lo¹i cho thÊy c¸c virut xo¨n l¸ cµ chua cña ViÖt Nam cã thÓ thuéc vÒ mét loµi míi do cã t­¬ng ®ång gÇn nhÊt d­íi 90% vÒ mÆt di truyÒn víi mét sè chñng virut cïng chi cña Trung Quèc vµ Malaysia. kiÕn nghÞ - TiÕp tôc t¸ch dßng vµ gi¶i m· toµn bé genom cña 6 dßng TYLCV nghiªn cøu. - TiÕp tôc thu thËp vµ t¸ch dßng gen cña c¸c dßng virut TYLCV cña c¸c ®Þa ph­¬ng kh¸c ®Ó cã thÓ cã mét ®¸nh gi¸ mang tÝnh tæng thÓ vÒ c¸c virut g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua cña ViÖt Nam vµ t¹o c¬ së cho viÖc x©y dùng chiÕn l­îc t¹o c©y cµ chua chuyÓn gen kh¸ng bÖnh xo¨n l¸. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu tiÕng viÖt 1. Mai ThÞ Ph­¬ng Anh (2003), KÜ thuËt trång cµ chua an toµn, quanh n¨m, Nxb NghÖ An. 2. Lª TrÇn B×nh, Phan V¨n Chi, N«ng V¨n H¶i, Tr­¬ng Nam H¶i, Lª Quang HuÊn (2003), ¸p dông c¸c kü thuËt ph©n tö trong nghiªn cøu tµi nguyªn sinh vËt ViÖt Nam, Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi. 3. Vâ V¨n Chi (1997), Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam, Nxb Y häc. 4. Hå Huúnh Thïy D­¬ng (2003), Sinh häc ph©n tö, Nxb Gi¸o dôc. 5. Lª ThÞ ¸nh Hång (2002), BÖnh häc ph©n tö thùc vËt, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi. 6. TrÞnh ThÞ Thu H­¬ng (2003), KÜ thuËt trång vµ ch¨m sãc v­ên rau, v­ên qña Hé gia ®×nh, Nxb V¨n hãa D©n téc. 7. Lª §×nh L­¬ng, QuyÒn §×nh Thi (2003), KÜ thuËt di truyÒn vµ øng dông, Nxb §¹i häc Quèc gia Hµ Néi. 8. Lª L­¬ng TÒ, Vò TriÖu M©n (1999), BÖnh vi khuÈn vµ virus h¹i c©y trång , Nxb Gi¸o dôc. 9. KhuÊt H÷u Thanh (2003), C¬ së di truyÒn ph©n tö vµ kÜ thuËt gen, Nxb Khoa häc Kü thuËt, Hµ Néi. 10. Pocket 1-5 (2000), Trung t©m tri thøc toµn cÇu vÒ c«ng nghÖ sinh häc c©y trång, ISAAA. Tµi liÖu tiÕng anh 11. Accotto G.P., Castillo N., Noris J., Moriones E., Louro D. (2000), “Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe”, European Journal of Plant Pathology, 106, pp. 179-186. 12. Baulcombe D.C. (1996), “Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants”, The Plant Cell, 8, pp. 1833-1844. 13. Chowda Reddy R.V., Colvin J., Muniyappa V., Seal S. (2005), “Diversity ADN distribution of begomoviruses infecting tomato in India”, Archives of Virology, 150, pp. 845-867. 14. Cohen, Stanley N., Boyer Herbert W. (1979), “Process for producing biologically functional molecular chimeras”, United States Patent, 1021, pp. 1030-1034. 15. Cui X., Tao X., Xie Y., Fauquet C.M., Zhou X. (2004), “A DNAb associated with Tomato yellow leaf curl china virus is required for symptom induction”, Journal of Virology, 78, pp. 13966-13974. 16. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E, Mello C.C. (1998), “Potent ADN specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”, Nature, 391, pp. 806-811. 17. ICTVdB (1998), “geminivirus”, 18. James Clive (2002), “Global Status of commercialized Transgenic Crops”, ISAAA Briefs, 27, pp. 3-4. 19. Kheyr-Pour A., Bendahmane M., Matzeit N., Accotto G.P., Crespi S., Gronenborn B. (1991), “Tomato yellow leaf curl virus from Sardinia is a whitefly-transmitted geminivirus”, Nucleic Acids Research, 19, pp. 6763-6769. 20. Kirthi N., Priyadarshini C.G., Sharma P., Maiya S.P., Hemalatha V., Sivaraman P., Dhawan P., Rishi N., Savithri H.S., (2004), “Genetic variability of begomoviruses associated with cotton leaf curl disease originating from India”, Archives of Virology, 149, pp. 2047-2057. 21. Kochieva E.Z., Ryzhova N.N., Khrapalova I.A., Pukhalskyi V.A. (2000), “Genetic Diversity ADN Phylogenetic Relationships in the Genus Lycopersicon (Tourn.) Mill. as Revealed by Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Analysis”, Russian Journal of Genetics, 8, pp. 958-966. 22. Laboratorio Integrato di Biologia Cellulare, “Molecolare Immunologia”, 23. Li Z.H., Zhou X.P., Zhang X., Xie Y. (2004), “Molecular characterization of tomato-infecting begomoviruses in Yunnan, china”, Archives of Virology, 149, pp. 1721-1732. 24. Moriones E., Castillo J.N. (2000), “Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide”, Virus research, 71, pp. 123-134. 25. Murphy F.S., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis A.W., Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D. (1994), Virus Taxonomy, 6th Report of the Internation Committee on Taxanomy of Viruses, Springer-Verlag Wien New York, USA, pp. 158-163. 26. Navot N., Pichersky E., Zeidan M., Zamir D., Czosnek H. (1991), “Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component”, Virology, 185, pp. 151-161. 27. Padidam M., Beachy R.N., Fauquet C.M. (1995), “Tomato leaf curl geminivirus from India has a bipartite genome ADN coat protein is not essential for infectivity”, Journal of General Virology, 76, pp. 25-35. 28. Polston J.E., Anderson P.K. (1997), “The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere”, Plant Disease, 81, pp. 1358-1369. 29. Revington G.N., Sunter G., Bisaro D.M. (1989), “DNA sequences essential for replication of the B genome component of tomato golden mosaic”, Plant Cell, 1, pp. 985-992. 30. Robertson LAB, “Department of Botany”, 31. Saiki R.S., GelfADN D.H., Schary S.J., Higuchi R., Horn G.Y., Mulliss K.B., Ehlish H.A. (1998), “Primer directed enzymatic amplication of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, pp. 487-491. 32. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977), "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." Proceedings of the National Academy of Sciences USA , 74, pp. 5463-5467. 33. Shimizu S., Ikeami M. (1999), “Complete nucleotide sequence DNA the genome organization of tobacco leaf curl geminivirus from Japan”, Microbiology Immunology, 43, pp. 989-992. 34. SWFREC (2005), “Cultural Control of the Whitefly/Geminiviruses Complex in Tomato”, 35. The Phytoplasm genome project, “Rolling circle replication (RCR) mechanism”, 36. Thomas J.E., Massalski P.R., Harrison B.D. (1986), “Production of monoclonal antibodies to African cassava mosaic virus DNA differences in their reactivies with other whitefly-transmitted geminivirus”, Journal of General Virology, 67, pp. 2739-2748. 37. Van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E., Estes M., Lemon S., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D., Pringle C., Wickner R. (2000), “Virus Taxonomy”, 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Academy Press, pp. 285-297. 38. Wyatt S.D., Brown J.K. (1996), “Detection of subgroup III geminivirus isolates in leaf extracts by degenerate primers DNA polymerase chain reaction”, Phytopathology, 86, pp. 1288-1293. 39. Xie Y., Zhou X.P. (2003), “Molecular characterization of squash leaf curl Yunnan virus, a new begomovirus ADN evidence for recombination”, Archives of Virology, 148, pp. 2047-2054. 40. Zhou X., Xie Y., Tao X., Zhang Z., Li Z., Fauquet C.M. (2003), “Characterization of DNAb associated with begomoviruses in China ADN evidence for co-evolution with their cognate viral DNA-A”, Journal of General Virology, 84, pp. 237-247. Phô lôc Th«ng tin vÒ c¸c tr×nh tù gen CP ph©n lËp ®­îc ë s¸u tØnh Accesion: AJ972379 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-BacNinh. Accesion: AJ972380 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-HaiDuong. Accesion: AJ972381 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-HaNoi. Accesion: AJ972382 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-QuangNinh. Accesion: AJ972383 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-ThaiBinh. Accesion: AJ972384 Status: confidential until 26-AUG-2006 Description: Tomato yellow leaf curl virus partial V1 gene for coat protein, isolate VN-HungYen.