Đề tài Khảo sát đa dạng di truyền và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng một số dòng bơ (persea americana miller) đã qua sơ bộ tuyển chọn tại Lâm Đồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠTKHOA SINH HỌC BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊNGiáo viên hướng dẫn: LÊ NGỌC TRIỆUSinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHONG (CSK 38) NGUYỄN THANH TIỀN (CSK 38) MAI TIẾN ĐẠT (CSK 39) THÁI THẠCH BÍCH (CSK 39) ĐỀ TÀIKHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VIỆC NHẬN DẠNG MỘT SỐ DÒNG BƠ (Persea americana Miller) ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM ĐỒNGĐẶT VẤN ĐỀĐánh giá đa dạng di truyền, xác lập chỉ thị phân tử cùng với khảo sát hình thái cũng như đặc điểm nông học của các tập đoàn giống đã được tiến hành phổ biến trên các đối tượng tài nguyên thực vật. Đây là những công việc cần thiết nhằm làm tăng hiệu quả cho quá trình nhận dạng, phát triển và chọn tạo giống mới đối với cây trồng. Bơ là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, có tiềm năng phát triên ở Lâm Đồng. Đã có nhiều chủng giống bơ được trồng nơi đây nhưng cơ sở dữ liệu cho việc nhận dạng, chọn tạo và công nhận giống còn chưa hoàn thiện, cần phải được nghiên cứu thêm. Trước mặt cần triển khai ghi nhận đặc điểm sơ bộ về hình thái quả và năng suất của các dòng bơ đang được phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn này và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng các dòng bơ tiềm năng nhằm: - Bổ sung cho cơ sở dữ liệu nhận dạng dòng đối với cây trưởng thành cũng như ngay từ giai đoạn vườn ươm. - Tạo cơ sở cho chiến lược chọn tạo và phát triển giống. Đó là lý do đề tài này được đăng ký và triển khai thực hiện.Vật liệu:Qua khảo sát ban đầu, có nhiều dòng/giống bơ nhập nội và được chọn tạo trong nước được canh tác tại Lâm Đồng. Tuy vậy có 11 dòng bơ được chọn tạo trong nước đang được phát triển. Đây là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài. Trong đó, 06 dòng cần được xác lập chỉ thị phân tử, gồm: 04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34 3611 dòng được khảo sát các đặc điểm cơ bản về năng suất và hình thái quả và đánh giá đa dạng di truyền gồm: 04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34 36 34 lai HO TO BM00 BM02Nội dung, phương pháp và kết quả nghiên cứu Nội dung 1: Ghi nhận sơ bộ đặc điểm hình thái và nông học của các dòng bơ khảo sát Phương pháp: Dựa vào dữ liệu ghi nhận thực tế và thu thập thông tin từ người dân, các nhà nghiên cứu, kinh doanh bơ, đặc biệt là tham khảo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển cây trồng thành phố Bảo Lộc. Các đặc điểm ghi nhận gồm: + Đặc điểm quả: màu sắc, độ dày vỏ, chất lượng thịt quả, kích thước hạt, trọng lượng và hình dạng chung của quả. + Đặc điểm năng suất thông qua các phiếu hỏi. Kết quả:DÒNG BƠ 04Địa chỉ thu mẫu: Đức Giang – Bảo LâmNăng suất: 300kg/cây/năm Quả thon dài, thịt quả vàng nhạt, ráo, dẻoKhi chín vỏ quả màu xanh Cỡ hạt: Trung bìnhDÒNG BƠ 05Địa chỉ thu mẫu: Thôn 8 – Tâm châu – Di LinhNăng suất: 220kg/cây/năm Thịt qủa vàng, hạt nhỏQuả thuôn dài Vỏ quả chín có màu xanh Cỡ hạt: Trung bìnhTrọng lượng quả trung bình: 600g DÒNG BƠ 34 Địa chỉ thu mẫu: khu 4 – Phường B’Lao – Bảo Lộc. Năng suất: khoảng 300kg/cây/năm Chín vỏ da màu xanh thuôn dài, cơm vàng, hạt bé ( có trái không hạt ) Chiều dài quả từ 25 cm đến 35 cm Khối lượng quả từ 300g đến 800g DÒNG BƠ 34 LAI Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri – Bảo Lộc Năng suất: khoảng 250kg/cây/năm Khi chín vỏ quả có màu xanh, quả hơi tròn Hạt trung bình, không dính vỏ DÒNG BƠ 036 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết - Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 200- 300 kg/cây/năm Vỏ quả chín có màu xanh, quả hình bầu dục, thịt quả dày màu vàng đậm, dẻo, béo Trọng lượng quả trung bình 750g Kích cỡ hạt: Trung bìnhDÒNG BƠ HOĐịa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm ĐồngNăng suất: 160 – 180 kg/cây/nămTrọng lượng quả: 380 – 450 gVỏ quả già màu tím nhạt, thịt quả vàng kem, khá béo, không xơ. Hạt gắn khít thịt quả nhưng dễ tách.Hoa sai, khả năng đậu quả cao DÒNG BƠ TOĐịa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn KếtĐức Trọng- Lâm ĐồngNăng suất: 150 – 200 kg/cây/nămTrọng lượng quả: 380 – 450 gVỏ quả già màu tím nhạt, hơi sần, không xơ Kích cỡ hạt: Trung bìnhHoa trổ đồng thời và đều nhau trên toàn cây DÒNG BƠ BM00Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn KếtĐức Trọng- Lâm ĐồngNăng suất: 160 – 180 kg/cây/nămTrọng lượng quả: 380 – 450 gVỏ quả già màu tím, mỏng, nhẵn bóng, cơm dày, ít sơKích cỡ hạt: Trung bìnhDÒNG BƠ BM02Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn KếtĐức Trọng- Lâm ĐồngNăng suất: 140 – 180 kg/cây/nămTrọng lượng quả: 180 – 200 gQuả hình tròn đềuVỏ quả chín xanh, hơi sần,Kích cỡ hạt: Trung bìnhDÒNG BƠ HẢI TRIỀU 2Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo LộcNăng suất: Vẫn chưa rõMàu quả khi chín : XanhHình hạng quả: Oval hơi dàiThịt quả: Vàng nhạt, không sơ, đặc đềuHạt: Tròn, không lắcKhối lượng của quả: 250- 475gDÒNG BƠ HẢI TRIỀU 1Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo LộcNăng suất: 650 kg/cây/nămMàu quả khi chín : XanhHình hạng quả: Oval dài đều-Hạt: Dính thịt quả , không lắc, hình tròn-Khối lượng của quả: 420- 680gNội dung 2: Tách chiết, kiểm tra nồng độ và chất lượng DNADNA từ mẫu lá được tách chiết theo quy trình CTAB I có cải tiến (bổ sung SDS 10% vào đệm chiết)DNA sau tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng phương pháp kiểm tra mật độ quang ở các bước sóng 260nm và 280nm.Kết quả+ 11 mẫu DNA của 11 dòng bơ khảo sát, trong đó có 6 dòng cần phát triển marker nhận dạng với 3 mẫu/dòng đã được tách chiết và tinh sạch+ Các mẫu DNA sau tách chiết đạt độ tinh sạch cao với lượng đủ cho các thực nghiệm tiếp theo.Nội dung 3: Làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA dựa trên PCRPhương pháp:Sử dụng kỹ thuật ISSR (Khuếch đại đoạn giữa các trình tự lặp đơn giản) để làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA với 10 mồi được sử dụng sau:STTTên mồiTrình tự Ta(0C)Số band ghi nhận cho đánh giá đa dạng di truyền11 dòng bơSố band ghi nhận cho việc xác lập chỉ thị phân tử nhận dạng 6 dòng bơ1ISSR 8085' –(AG)8 C-3'527172ISSR 844B5' –(CT)8 GC-3'5210183ISSR 17899B5'-(CA)6 GG-3'5416124HB95'-(GT)6 GG-3'527145HB145'-(CTC)3 GC-3'5210116HB135'-(GAG)3 GC-3'5211107UBC 856C5'-(AC)8 CA-3'529148UBC 856T5'-(AC)8 TA-3'5211139UBC 8735'-(GACA)4 -3'52151410UBC 859G5' –(TG)8 GC-3'51,5202Tổng thể98125Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20 µl chứa 2 mM MgCl2, 0.25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0.2 µM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu DNA, BSA 0.5%. Chương trình nhiệt sau: 94 0C trong 5 phút; 10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong bảng trên) trong 45 giâygiảm dần 0,5 0C/chu kỳ Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây; 36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giây Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giâyBước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút.(Touchdown PCR)Điện di, chụp ảnh gel: Sản phẩm khuếch đại được phân tách trên gel agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Volt, gel sau điện di được nhuộm với ethidium bromide (0.5 µg/ml), và được chụp ảnh dưới các ánh sáng cực tím có bước sóng 254/312 nmKết quả:Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền 11 dòng bơ theo 10 mồiMồi ISSR 808Mồi ISSR 844BMồi ISSR 856TMồi ISSR 856CMồi ISSR 17899BMồi ISSR HB13Mồi ISSR UBC859GMồi ISSR UBC873Mồi ISSR HB14Mồi ISSR HB9Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng Hải Triều 2, 4: dòng Hải Triều 1, 5: dòng 34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng BM020.Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho việc xác lập marker phân tử nhận dạng 06 dòng bơ theo 10 mồiGhi chú: 1, 2, 3: các mẫu dòng 04; 4, 5, 6: các mẫu dòng 05; 7, 8, 9: các mẫu dòng Hải Triều 2; 10, 11, 12: các mẫu dòng Hải Triều 1; 13, 14, 15: các mẫu dòng 34; 16, 17, 18: các mẫu dòng 36.Dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt các band trên gel, thiết lập ma trận 0/1 để đánh giá đa dạng và xây dựng marker cho việc nhận dạng dòng Mồi ISSR 808Mồi ISSR 844BMồi ISSR 856CMồi ISSR 856TMồi ISSR 17899BMồi ISSR HB9Mồi HB13Mồi HB14Mồi ISSR UBC873Mồi ISSR UBC859GNội dung 4: Đánh giá đa dạng di truyềnSử dụng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền trong tập hợp mẫu của de Vicente và cs., 2003 với công cụ Microsoft Excel, các chỉ tiêu:Tỷ lệ % band đa hình:Công thức tính : PPB = npj/ntotal × 100 Với npj là số lượng band đa hình và ntotal là tổng số band ghi nhận.Mức độ dị hợp trung bình:Công thức tính : He = ΣjLhj/L; hj = 1 – Σ(pi)2Với hj là mức độ dị hợp tử của locus thứ j, pi là tần số của allele thứ i ở locus thứ j, He là mức độ dị hợp trông đợi trung bình cho tất cả các locus khảo sát và L là tổng số locus. Ngoài ra, phần mềm Popgen32 được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tập hợp các dòng bơ khảo sát, hai chỉ số đa dạng là chỉ số đa dạng gene (h) và chỉ số đa dạng Shannon (I) cho tập hợp mẫu thu được. Kết quả Sử dụng công cụ Excel với các công thức như trình bày như trên, thu được kết quả về sự đa dạng di truyền tập hợp 11 mẫu khảo sát như sau: + Tỷ lệ phần trăm band đa hình: PPB = 91,84% + Mức độ dị hợp trông đợi trung bình: He = 0,3072 Sử dụng phần mềm Popgen 32, thu được kết quả sau: + Chỉ số đa dạng gene (tương ứng với mức độ dị hợp trông đợi trung bình): h = 0,3072 + Chỉ số Shannon: I = 0,4608 Mức độ đa dạng di truyền của tập hợp mẫu trong nghiên cứu này thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây với tập hợp mẫu lớn hơn của các dòng/giống bơ thu thập từ nhiều nơi trên thế giới. Điều này cho thấy có thể các dòng bơ được phát triển nội địa được khảo sát trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng có nguồn gốc gần nhau.Nội dung 5: Xây dựng marker phân tử cho việc nhận dạng 06 dòng bơ tiềm năng Phương pháp: Dựa trên Kết quả phân tích ảnh điện di và ma trận dữ liệu về sự xuất hiện/thiếu vắng các band một cách đặc biệt trên gel điện di, hai kiểu chỉ thị phân tử đơn và kép được xác định để nhận dạng các dòng.Kết quảVới cách thức như trên, 9 chỉ thị đơn và 25 chỉ thị kép đã được xác định để nhận dạng 06 dòng bơ khảo sát, cụ thể: + Nhận dạng dòng 04: Vắng band 520bp mồi UBC 873; Vắng band 700bp mồi UBC 856T (02 chỉ thị đơn); Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 540bp mồi 808; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B và Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (07 chỉ thị kép). + Nhận dạng dòng 05: Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B và Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (chỉ có 05 chỉ thị kép). + Nhận dạng dòng Hải Triều 2: Vắng band 400bp mồi 17899B; Vắng band 400bp mồi UBC 856C; Vắng band 540bp mồi 808; Có band 750bp mồi 17899B và Có band 1500bp mồi HB13 (05 chỉ thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 nhưng vắng band 700bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band 520bp mồi UBC 873 và Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band 700bp mồi UBC 856T (03 chỉ thị kép).Kết quả + Nhận dạng dòng Hải Triều 1: Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band 540bp mồi 808; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 và Có band 500bp mồi 844B đồng thời vắng band 700bp mồi 17899B (chỉ có 06 chỉ thị kép). + Nhận dạng dòng 34: Có band 700bp mồi 17899B (01 chỉ thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 và Có band 500bp mồi 844B đồng thời có band 890bp mồi HB9 nhưng có band 400bp mồi 17899B/ band 400bp mồi UBC 856C/ band 540bp mồi 808 hoặc vắng band 750bp mồi 17899B/ band 1500bp mồi HB13 (06 chỉ thị kép). + Nhận dạng dòng 36: Có band 220bp mồi HB9 (chỉ có 01 chỉ thị đơn)Kết luậnĐã khảo sát tình hình canh tác các dòng bơ bản địa tại Lâm Đồng, ghi nhận đặc điểm 11 dòng quan trọng chủ yếu dựa trên đặc điểm quả và năng suất. Tuy nhiên dữ liệu thu nhận được chỉ là sơ bộ để hỗ trợ xây dựng bộ dữ liệu về đặc điểm dòng/ giống ở cây trưởng thành.Đã xác lập được 9 chỉ thị đơn và 25 chỉ thị kép để nhận dạng 06 dòng bơ tiềm năng được khảo sát. Cả 6 dòng đều xác lập được chỉ thị ISSR để nhận dạng. Kết quả này có thể ứng dụng được cho việc nhận dạng các dòng bơ ngay tại vườn ươm.Mức độ đa dạng di truyền của 11 dòng bơ được khảo sát thấp: mức dị hợp trông đợi đạt 0.3072, chỉ số Shannon đạt: 0.4608, tỷ lệ band đa hình: 91.84%. Điều đó cho thấy các dòng bơ được tạo giống và qua tuyển chọn tại Lâm Đồng có nguồn gốc gần nhau.Kiến nghịCần tiến hành nghiên cứu thêm với nhiều mồi ISSR và các kỹ thuật DNA fingerprinting khác để có bộ dữ liệu tốt, dễ ứng dụng hơn trong thực tiễn công tác kiểm tra giống, đặc biệt là giống vườn ươm.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊXIN CHÂN THÀNH CẢM ƠNQUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN SINH VIÊNĐÃ LẮNG NGHE