Đề tài Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm giảm chiều cao cây và tăng khả năng chống đổ của các giống lúa chất lượng cao

Mở đầu Công nghệ sinh học thực vật đang có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới. Sự ra đời và phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại như nuôi cấy mô tế bào thực vật, chọn dòng đột biến, công nghệ gen... đang là công cụ có hiệu quả cao trong việc nghiên cứu và cải tiến các giống cây trồng có giá trị kinh tế và đã thu được nhiều kết quả trên nhiều đối tượng cây trồng [1]. Ở Việt nam công nghệ sinh học thực vật đang được nghiên cứu ứng dụng triển khai trong công tác giống cây trồng và đã thu được những kết quả đáng kể như nhân giống cây sạch bệnh bằng nuôi cấy mô, nuôi cấy đơn bội, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần, chọn dòng tế bào đột biến... trên các đối tượng cây trồng như lúa, khoai lang, thuốc lá, dứa sợi...[9]. Đặc biệt Viện Công nghệ sinh học đã chọn tạo được hai giống lúa DR1 và DR2 bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào mang biến dị soma cho năng suất cao và ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn so với giống gốc [10]. Lúa là cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, 90% diện tích lúa trồng và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á.... Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả vùng nhệt đới, á nhiệt đới và ôn đới ở các châu lục [3, 8]. Việt Nam là nước đứng thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo, nhưng giá trị kinh tế không cao, vì chất lượng nhiều giống lúa không đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Trong khi đó chúng ta có những giống lúa chất lượng cao đặc sản rất quí, hạt dài, cơm dẻo và rất thơm ngon như Tám thơm, Dự thơm, Tẻ di hương... nhưng năng suất thấp vì cây cao thân mềm, chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạt thưa, thời gian sinh trưởng dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [2, 7, 8]. Kết hợp giữa công nghệ tế bào thực vật, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen cho phép cải biến các giống lúa nói trên theo các hướng như gây đột biến tế bào bằng tia gamma và chọn dòng tế bào để chọn các đột biến thấp cây, chống đổ hoặc sử dụng công nghệ gen để chuyển gen hạ thấp chiều cao cây. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi xây dựng đề tài: “Nghiên cứu biện pháp công nghệ sinh học thực vật nhằm giảm chiều cao cây và tăng khả năng chống đổ của các giống lúa chất lượng cao”. Với mục đích hạ thấp chiều cao cây, tăng cường tính chống đổ để cải thiện năng suất, rút ngắn thời gian sinh trưởng của giống lúa Tám thơm, Dự thơm và Tẻ di hương. 2. Tæng quan tµi liÖu 2.1. C¸c gièng lóa chÊt l­îng cao ë miÒn B¾c ViÖt Nam ë n­íc ta c©y lóa lu«n gi÷ vÞ trÝ träng yÕu trong hÖ thèng c¸c c©y trång n«ng nghiÖp . Ngµy nay khi mµ lóa g¹o ®· cã ®ñ cho nhu cÇu trong n­íc vµ cã d­ ®Ó xuÊt khÈu th× vÞ trÝ cña c¸c gièng lóa chÊt l­îng cao ®Æc s¶n ngµy cµng quan träng. Nhu cÇu sö dông c¸c gièng lóa chÊt l­îng cao ®Æc s¶n ngµy mét gia t¨ng, trong khi ®ã hÇu hÕt c¸c gièng lóa nµy ®ang trong t×nh tr¹ng bÞ tho¸i ho¸, chÊt l­îng gieo trång thÊp, kü thuËt canh t¸c ch­a phï hîp nªn s¶n phÈm ch­a ®¹t yªu cÇu chÊt l­îng nh­ mong muèn. C¸c gièng lóa chÊt l­îng cao nh­ T¸m xoan, TÎ di h­¬ng, Dù th¬m, Nµng h­¬ng.... lµ gièng lóa ®Æc s¶n vïng ®ång b»ng B¾c bé cã phÈm chÊt g¹o rÊt tèt vµ cã mïi th¬m ngon, nh­ng n¨ng suÊt thÊp do cã nhiÒu ®Æc ®iÓm yÕu nh­ cao c©y, th©n yÕu chèng ®æ kÐm, kÐm chÞu ph©n, l¸ dµi rñ, h¹t th­a, cæ b«ng dµi, trong ®ã tÝnh tr¹ng cÇn kh¾c phôc nhÊt lµ cao c©y [7, 8]. C¸c gièng lóa chÊt l­îng thuéc nhãm lóa mïa chÝnh vô cã thêi gian sinh tr­ëng dµi 150-160 ngµy, ph¶n øng chÆt chÏ víi ¸nh s¸ng ngµy ng¾n, biªn ®é thêi vô kh¸ réng. HiÖn nay cã kho¶ng 12 gièng lóa T¸m ®­îc trång ë miÒn B¾c n­íc ta, trong ®ã c¸c gièng chÊt l­îng cao næi tiÕng nhÊt nh­: T¸m xoan H¶i HËu, T¸m Êp bÑ Xu©n §µi, T¸m cæ ngçng Nam ®Þnh. C¸c gièng nµy th­êng ®­îc trång ë vïng Th¸i B×nh, Nam ®Þnh, H¶i D­¬ng, H¶i Phßng... C¸c gièng lóa Dù th¬m, TÎ di h­¬ng còng lµ nh÷ng gièng lóa ®Æc s¶n næi tiÕng ®­îc trång nhiÒu ë c¸c tØnh ven biÓn ®ång b»ng B¾c bé, hiÖn nay ®­îc chó ý kh«i phôc trë l¹i do tÝnh chÊt chÞu mÆn, chÞu chua phÌn, g¹o dù h­¬ng ®­îc coi lµ lo¹i g¹o ®Æc s¶n dïng trong ngµy lÔ, ngµy tÕt...[8]. HÇu hÕt c¸c gièng lóa chÊt l­îng cao ®ang trång ë miÒn B¾c n­íc ta ®Òu cao c©y, chèng ®æ kÐm vµ ®­îc trång vµo vô mïa, ®©y lµ mïa m­a nhiÒu. Nªn vµo giai ®o¹n gÇn thu ho¹ch c¸c gièng nµy do cao c©y chèng ®æ kÐm nªn dÔ bÞ khi gÆp giã vµ m­a, v× vËy h¹t lóa dÔ bÞ mäc mÇm, ¶nh h­ëng ®Õn chÊt l­îng vµ n¨ng suÊt. TÝnh tr¹ng qui ®Þnh chiÒu cao c©y lµ do ®a gen qui ®Þnh vµ chÞu ¶nh h­ëng cña ®iÒu kiÖn m«i tr­êng. ViÖc nghiªn cøu c¸c biÖn ph¸p ®Ó gi¶m chiÒu cao c©y cã ý nghÜa rÊt lín kh«ng chØ ®èi víi c¸c gièng lóa chÊt l­îng cao mµ cßn cã ý nghÜa ®èi víi c¸c gièng c©y trång kh¸c nh­ lóa nÕp, lóa tÎ, c¸c gièng ng«. 2.2. C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 2.2.1. C¬ së chän dßng biÕn dÞ soma trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt. Mçi mét tÕ bµo bÊt kú lÊy tõ c¬ thÓ sinh vËt ®a bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh. §ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo [1]. Soma lµ tªn gäi c¸c tÕ bµo sinh d­ìng, nã kh¸c víi tÕ bµo sinh dôc. BiÕn dÞ soma dïng ®Ó chØ tÊt c¶ c¸c biÕn dÞ x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy m«, tÕ bµo. Tõ c¸c tÕ bµo soma cã thÓ t¹o nªn bÊt kú bé phËn nµo cña c©y hay c©y hoµn chØnh th«ng qua kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt. Nguyªn lý chung cña viÖc chän dßng mang biÕn dÞ soma lµ c¸c tÕ bµo nu«i cÊy in vitro cã tû lÖ biÕn dÞ di truyÒn lín (10-5-10-8), nÕu kÕt hîp xö lý ®ét biÕn hoÆc xö lý stress th× tÇn sè cã thÓ t¨ng lªn gÊp 10 lÇn, v× thÕ cã thÓ chän ®­îc c¸c c¸ thÓ ®ét biÕn nhanh h¬n vµ cã hiÖu qu¶ h¬n so víi c¸c ph­¬ng ph¸p chän gièng th«ng th­êng kh¸c ¸p dông cho c©y nguyªn vÑn. ë møc ®é tÕ bµo, nhÊt lµ tÕ bµo ®¬n béi hÇu nh­ nh÷ng ®Æc ®iÓm ®ét biÕn ®­îc thÓ hiÖn ra ngay. Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo cßn cho phÐp gi¶m bít ®¸ng kÓ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó chän ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng theo ý muèn [1]. Theo Lª TrÇn B×nh vµ CS. (1997), b¶n chÊt vµ c¬ chÕ cña biÕn dÞ soma liªn quan mËt thiÕt ®Õn nh÷ng thay ®æi trong genome cña tÕ bµo nu«i cÊy. Do nhiÒu nguyªn nh©n nh­ t¸c ®éng cña hocmon sinh tr­ëng trong thêi gian dµi vµ c¸c yÕu tè kh¸c lµm cho nhiÔm s¾c thÓ trong tÕ bµo nu«i cÊy cã thÓ t¨ng lªn t¹o ra c¸c d¹ng ®a béi lÖch vµ møc béi thÓ cao. NhiÒu tr­êng hîp c¸c, c¸c ®o¹n cña nhiÔm s¾c thÓ ®­îc chuyÓn ®æi hoÆc ®¶o ng­îc. CÊu tróc cña ph©n tö DNA còng cã thÓ bÞ thay ®æi dÉn ®Õn ®ét biÕn kiÓu h×nh thùc sù. T­¬ng tù nh­ vËy, nhiÒu c«ng tr×nh c«ng bè còng cho r»ng biÕn dÞ soma th­êng xuÊt hiÖn ë c¸c c©y t¸i sinh ®­îc sau khi nu«i cÊy tÕ bµo qua giai ®o¹n m« sÑo [14], cã nhiÒu kiÓu ®ét biÕn nh­: ®ét biÕn nh©n, ®ét biÕn tÕ bµo chÊt, ®a béi thÓ vµ c¸c bÊt th­êng kh¸c trong nhiÔm s¾c thÓ [25]. Nh÷ng øng dông lín nhÊt trong viÖc chän dßng mang biÕn dÞ soma cña c«ng t¸c gièng chÝnh lµ chän ra c¸c kiÓu h×nh víi c¸c kiÓu gene t­¬ng øng, thÝch hîp víi yªu cÇu cña c¸c gièng míi lµ cã n¨ng suÊt cao, chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh bÊt lîi, chÊt l­îng tèt vµ æn ®Þnh. NhiÒu c«ng tr×nh c«ng bè ®· thµnh c«ng trong viÖc chän dßng mang biÕn dÞ soma trªn c¸c ®èi t­îng gièng c©y trång, ë thuèc l¸, nu«i cÊy h¹t phÊn vµ tÕ bµo trÇn ®· thu ®­îc nh÷ng c©y ®ét biÕn cã n¨ng suÊt cao, thêi gian sinh tr­ëng ng¾n, hµm l­îng ®­êng vµ alkaloid thÊp [1]. 2.2.2. Nu«i cÊy m« sÑo vµ sù biÕn dÞ di tryuÒn M« sÑo (callus) lµ khèi m« thùc vËt gåm nh÷ng tÕ bµo kh«ng ph©n ho¸, cã kh¶ n¨ng ph©n bµo liªn tôc. Trong tù nhiªn, m« sÑo th­êng ph¸t sinh trªn vÕt th­¬ng ë c©y v× vËy cã tªn gäi theo nghÜa ®en lµ m« sÑo. Bëi v× m« sÑo lµ mét khèi c¸c tÕ bµo m« mÒm cã møc ®é cÊu tróc thÊp, ch­a ph©n ho¸ nh­ng ph©n chia mét c¸ch hçn lo¹n vµ th­êng cã tÝnh biÕn ®éng di truyÒn cao. Trong nu«i cÊy in vitro m« sÑo ®­îc t¹o ra b»ng c¸ch nu«i cÊy c¸c c¬ quan cña thùc vËt (th©n, rÔ, l¸, hoa, qu¶...) ë c¸c m«i tr­êng chøa chÊt ®iÒu khiÓn sinh tr­ëng cÇn thiÕt (auxin, cytokinin) vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp. Khi t¸i sinh c©y tõ nh÷ng m« sÑo ®­îc cÊy chuyÓn nhiÒu lÇn, th× nh÷ng c©y nµy dÔ mang nh÷ng biÕn ®éng di truyÒn vÒ nhiÔm s¾c thÓ (dÞ béi, ®a béi) vµ nh÷ng biÕn ®æi di truyÒn kh¸c [1]. §èi víi viÖc chän dßng biÕn dÞ soma, nh÷ng c©y t¸i sinh tõ m« sÑo víi nh÷ng biÕn dÞ di truyÒn cã mét ý nghÜa rÊt lín, tõ ®©y ta cã thÓ chän ra ®­îc nhiÒu dßng c©y mang nh÷ng ®Æc ®iÓm kh¸c nhau so víi gièng ban ®Çu. VÊn ®Ò nµy ®· më ra mét triÓn väng trong viÖc sö dông c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt ®Ó c¶i tiÕn di truyÒn nh÷ng gièng c©y trång cã ý nghÜa kinh tÕ. 2.2.3. T¸i sinh c©y tõ m« sÑo Trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt, kü thuËt t¹o, nu«i vµ t¸i sinh c©y tõ m« sÑo ph¶i ®­îc hoµn thiÖn mét c¸ch tèi ­u nhÊt, trong ®ã ®Æc biÖt lµ vÊn ®Ò t¸i sinh c©y. NhiÒu t¸c gi¶ sau khi chän ®­îc dßng tÕ bµo ®ét biÕn tõ nu«i cÊy m« sÑo ®· kh«ng t¸i sinh ®­îc c©y hoÆc nh÷ng c©y nµy l¹i kh«ng duy tr× ®­îc tÝnh tr¹ng võa chän läc. ë mét vµi lo¹i c©y cho h¹t quan träng, viÖc t¸i sinh chåi tõ m« sÑo cßn gÆp nhiÒu khã kh¨n. ë c¸c ®èi t­îng thuéc hä Fabacaea viÖc t¸i sinh c©y hoµn chØnh cho tíi nay chØ thµnh c«ng trong mét sè tr­êng hîp ch¼ng h¹n Archis hypogaea, Onobrychis viciifolia.... Nu«i cÊy m« sÑo cña thuèc l¸ sau nhiªu lÇn cÊy chuyÓn vÉn duy tr× ®­îc kh¶ n¨ng t¸i sinh [18]. Theo Amirato vµ cs (1984) nguån gèc m« sÑo còng ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y, ch¼ng h¹n ng­êi ta chØ thu ®­îc c©y t¸i sinh tõ m« sÑo nu«i cÊy b»ng ®o¹n hoa tù cña lóa m×. Møc béi thÓ cña m« sÑo còng lµ nguyªn nh©n g©y sù kh¸c nhau trong qu¸ tr×nh t¸i sinh c©y, m« sÑo ®¬n béi tõ ®o¹n th©n hoÆc m¶nh l¸ cña Datura innoxia t¹o chåi nhanh h¬n m« sÑo cïng loµi cña c©y nhÞ béi. Theo Sharp (1984) n¨m 1951-Levine lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· thµnh c«ng trong viÖc t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y tõ m« sÑo cña Nicotiana affinis vµ Helianthus annuus, ®Õn nay ng­êi ta ®· t¹o vµ t¸i sinh c©y thµnh c«ng tõ m« sÑo trªn h¬n 100 loµi. 2.3. §ét biÕn thùc nghiÖm vµ øng dông trong chän t¹o gièng c©y trång TÝnh æn ®Þnh trong cÊu tróc di truyÒn ë c¸ thÓ sèng kh«ng ph¶i lµ tuyÖt ®èi, nã cã thÓ bÞ biÕn ®æi do t¸c ®éng cña c¸c t¸c nh©n vËt lý vµ ho¸ häc. Ng­êi ta gäi nh÷ng biÕn ®æi nhá nhÊt trong cÊu tróc gen hoÆc nhiÔm s¾c thÓ lµ ®ét biÕn [11]. Cïng víi t¸c nh©n g©y ®ét biÕn lµ c¸c t¸c nh©n ho¸ häc, th× c¸c t¸c nh©n vËt lý (chiÕu x¹ bëi tia R¬nghen, tia Gamma, bøc x¹ Neutron...) lµ nh÷ng t¸c nh©n g©y ®ét biÕn cã hiÖu qu¶ gióp con ng­êi t¹o ra hµng lo¹t gièng míi cã nh÷ng thuéc tÝnh míi cã lîi vÒ mÆt kinh tÕ: thÊp c©y, thêi gian sinh tr­ëng ng¾n, n¨ng suÊt cao, chÊt l­îng dinh d­ìng tèt, ®Ò kh¸ng víi s©u bÖnh... [5]. §èi víi chiÕu x¹ tia Gamma th­êng dïng nguån lµ Co60 hoÆc Cs137 cã ho¹t tÝnh phãng x¹, tuú tõng ®èi t­îng cô thÓ cã thÓ sö dông 2 c¸ch chiÕu x¹: (1). ChiÕu x¹ nhanh trong mét thêi gian ng¾n b»ng nguån m¹nh vµ c­êng ®é chiÕu x¹ m¹nh, (2). ChiÕu x¹ tõ tõ b»ng nguån yÕu vµ thêi gian chiÕu x¹ kÐo dµi. 2.3.1. C¬ chÕ g©y ®ét biÕn khi chiÕu x¹ Dùa vµo tÝnh chÊt biÕn ®æi cÊu tróc di truyÒn mµ ng­êi ta chia ®ét biÕn thµnh hai kiÓu c¬ b¶n: §ét biÕn gen (cßn gäi lµ ®ét biÕn ®iÓm) vµ ®ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ. §ét biÕn gen lµ nh÷ng biÕn ®æi trong cÊu tróc ph©n tö cña gen, tøc lµ nã thay ®æi trËt tù c¸c nucleotid trong DNA hoÆc thay thÕ c¸c baz¬ nit¬ trong c¸c cÆp nucleotid. §ét biÕn NST lµ nh÷ng ®ét biÕn lµm ®øt vµ thay ®æi cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ, v× thÕ nã lµm thay ®æi nhiÒu dÊu hiÖu hay c¸c ®Æc tÝnh kh¸c nhau cña c¬ thÓ. Ngoµi ra cßn lo¹i ®ét biÕn n÷a lµ sù t¨ng hoÆc gi¶m mét sè lÇn bé nhiÔm s¾c thÓ, gäi lµ ®a béi thÓ. Khi chiÕu x¹ b»ng tia Gamma tõ nguån Co60 lªn tÕ bµo hoÆc m« th× c¸c ph©n tö sinh häc chÞu t¸c dông trùc tiÕp vµ gi¸n tiÕp cña bøc x¹ ion ho¸. T¸c dông trùc tiÕp: bøc x¹ trùc tiÕp ion ho¸ vµ kÝch thÝch c¸c ph©n tö sinh häc lµm tæn th­¬ng c¸c ph©n tö ®ã, ®èi víi vËt chÊt di truyÒn x¶y ra c¸c hiÖu øng sau: (1) Thay ®æi thµnh phÇn cÊu t¹o cña DNA: ®øt liªn kÕt photphodieste gi÷a c¸c ph©n tö ®­êng, ph¸ huû liªn kÕt baz¬ - ®­êng, thay ®æi cÊu tróc bËc 2 cña DNA (®øt ®o¹n, biÕn tÝnh, kÕt hîp chÐo). (2). ¶nh h­ëng lªn sù sao chÐp DNA - RNA. (3) Tay ®æi cÊu tróc nhiÔm s¾c thÓ: ®øt ®o¹n, mÊt ®o¹n, ®¶o ®o¹n, lÆp ®o¹n, trao ®æi chÐo, thay ®æi møc béi thÓ. T¸c dông gi¸n tiÕp: bøc x¹ ion ho¸ t¸c dông lªn c¸c ph©n tö n­íc víi ion H+, OH-, c¸c gèc tù do OH., H. vµ c¸c s¶n phÈm oxy ho¸ m¹nh nh­ H2O2. C¸c s¶n phÈm kÓ trªn cña qu¸ tr×nh x¹ ph©n (Radiolyse) n­íc rÊt ho¹t ®éng vÒ mÆt ho¸ häc, chóng sÏ c«ng ph¸ c¸c ph©n tö sinh häc lµm thay ®æi cÊu tróc chøc n¨ng cña chóng. Bøc x¹ cã thÓ g©y ra nh÷ng thay ®æi h×nh th¸i còng nh­ thay ®æi chøc n¨ng trong tÕ bµo vµ m«. Nh­ng bøc x¹ kh«ng t¹o ra chøc n¨ng míi trong tÕ bµo vµ m« mµ chØ lµm thay ®æi c¸c chøc n¨ng s½n cã hay lµm xuÊt hiÖn c¸c chøc n¨ng tr­íc ®ã tiÒm tµng [5, 11]. 2.3.2. Mét sè thµnh tùu cña chän gièng ®ét biÕn C«ng t¸c chän gièng vµ t¹o gièng míi cã vai trß hÕt søc quan träng trong viÖc t¨ng n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y trång ®Æc biÖt lµ c©y l­¬ng thùc. ChÝnh c«ng t¸c nµy ®· ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh trong cuéc c¸ch m¹ng xanh trong nh÷ng n¨m 1960 ë Ên §é vµ nhiÒu n­íc kh¸c trªn thÕ giíi [5]. Mét trong nh÷ng thµnh tùu xuÊt s¾c nhÊt cña thÕ kû 20 lµ kh¸m ph¸ ra ph­¬ng ph¸p t¹o gièng b»ng c¸ch g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm. Víi kÕt qu¶ cña h¬n 60 n­íc ®· thu ®­îc chøng tá ®©y lµ ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ ®Ó t¹o gièng míi. Theo thèng kª cña Tæ chøc l­¬ng thùc vµ Tæ chøc n¨ng l­îng nguyªn tö thÕ giíi (FAO/IAEA) n¨m 1960 chØ cã 7 gièng c©y trång ®ét biÕn, 1975 cã 145 gièng, 1992 cã 1530 gièng, n¨m 1997 cã 1870 gièng. PhÇn lín c¸c gièng t¹o ra lµ c©y ngò cèc nh­: lóa, lóa m×, lóa m¹ch, ng«..... C¸c n­íc t¹o ra nhiÒu gièng ®ét biÕn nh­: Trung Quèc, Ên §é, NhËt B¶n, c¸c n­íc Liªn X« cò... [11]. Tõ n¨m 1968, ViÖt Nam ®· b¾t ®Çu nghiªn cøu chän gièng ®ét biÕn vµ ®· thu ®­îc kÕt qu¶ ®¸ng kÓ nh­ t¹o ra c¸c gièng lóa A-20, DT10, DT-11, DT13, gièng ng« DT-6, ®Ëu t­¬ng DT84, DT-90 (Quý1997)... GÇn ®©y NguyÔn Minh C«ng vµ céng sù ®· t¹o ®­îc gièng T¸m th¬m ®ét biÕn kh«ng c¶m quang, cã thÓ gieo cÊy ®­îc c¶ hai vô [2]. 2.4. ChuyÓn gen ë thùc vËt vµ thµnh tùu trong c¶i t¹o gièng c©y trång 2.4.1. C¸c ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen ë thùc vËt HiÖn nay cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen ë thùc vËt ®· ®­îc nghiªn cøu vµ thµnh c«ng trªn nhiÒu ®èi t­îng c©y trång. Nh÷ng thµnh c«ng chuyÓn gen ®Çu tiªn ®­îc tiÕn hµnh b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn hay sö dông polyethylene glycol. Sö dông sóng b¾n gen ®Ó chuyÓn c¸c gen mong muèn vµo m« sÑo cho tû lÖ t¸i sinh cao ®· thµnh c«ng trong chuyÓn gen vµo ph«i non b»ng c¸ch l©y nhiÔm víi Agrobacterium [23, 24]. Hai ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen thµnh c«ng nhÊt lµ chuyÓn gen trùc tiÕp b»ng sóng b¾n gen vµ chuyÓn gen gi¸n tiÕp th«ng qua Agrobacterium: - ChuyÓn gen trùc tiÕp b»ng sóng b¾n gen: §©y lµ mét trong nh÷ng ph­¬ng ph¸p ®­a c¸c gen ngo¹i lai vµo tÕ bµo do Sanford, 1990 ®­a ra. Ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc ¸p dông víi nh÷ng ®èi t­îng mµ viÖc chuyÓn gen b»ng Agrobacterium khã thùc hiÖn ®­îc (do kh«ng mÉn c¶m víi Agrobacterium) hay kh¶ n¨ng t¸i sinh kÐm (khi chuyÓn gen vµo tÕ bµo trÇn) [15]. Ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc sö dông réng r·i sau ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen qua Agrobacterium víi c¸c ­u vµ nh­îc ®iÓm sau [16]: + ¦u ®iÓm: Cã thÓ ¸p dông víi hÇu hÕt c¸c lo¹i m« vµ tÕ bµo, chuyÓn DNA ngo¹i lai vµo tÕ bµo nhanh, dÔ sö dông víi quy tr×nh ®¬n gi¶n, mét sè l­îng lín mÉu cã thÓ ®­îc xö lý trong thêi gian ng¾n, c¸c vecto ®­îc thiÕt kÕ ®¬n gi¶n: kh«ng ®ßi hái c¸c tr×nh tù DNA cho ®o¹n T-DNA nh­ chuyÓn gen b»ng Agrobacterium, cÇn mét l­îng nhá plasmid DNA, biÓu hiÖn gen t¹m thêi cã thÓ ®­îc quan s¸t sau vµi ngµy + Nh­îc ®iÓm: NhiÒu b¶n sao vµo tÕ bµo cïng mét lóc, g©y khã kh¨n cho viÖc ph©n tÝch chän läc vÒ sau nµy, hiÖu qu¶ chuyÓn gen vÉn cßn thÊp, chi phÝ cao [23]. - Ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen b»ng Agrobacterium: §©y lµ ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen ®­îc sö dông réng r·i nhÊt, cã hiÖu qu¶ cao víi sè b¶n copy chuyÓn vµo tÕ bµo thùc vËt thÊp [30]. Ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen b»ng Agrobacterium th­êng ®­îc dïng cho c¸c lo¹i c©y hai l¸ mÇm v× Agrobacterium mÉn c¶m víi c¸c lo¹i c©y nµy. Tuy nhiªn, ngµy nay ng­êi ta ®· t×m ra c¸c chñng Agrobacterium mÉn c¶m víi c©y mét l¸ mÇm trong ®ã cã ng«, lóa vµ c¸c c©y chuyÓn gen h÷u thô ®· nhËn ®­îc [21, 23]. ChuyÓn gen b»ng Agrobacterium ®· ®­îc nghiªn cøu thµnh c«ng bëi nhiÒu t¸c gi¶, c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng tíi hiÖu qu¶ chuyÓn gen ®· ®­îc tèi ­u ho¸ nh­ chñng Agrobacterium, kiÓu gen cña tõng loµi, gièng, thµnh phÇn m«i tr­êng nu«i cÊy, nhiÖt ®é...) [24]. Mét nghiªn cøu gÇn ®©y ë ®Ëu t­¬ng ®· kÕt hîp hai ph­¬ng ph¸p dïng sóng b¾n gen vµ Agrobacterium: tr­íc khi l©y nhiÔm m« b»ng Agrobacterium m« ®­îc lµm bÞ th­¬ng b»ng c¸ch “b¾n” ®¹n kh«ng mang gen. Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ cho hiÖu qu¶ l©y nhiÔm cao, bëi sau khi bÞ “b¾n” m« t¹o ph¶n øng ®èi víi vÕt th­¬ng, t¹o ®iÒu kiÖn cho l©y nhiÔm b»ng Agrobacterium [19]. 2.4.2. Gibberellin vµ øng dông chuyÓn gen øc chÕ tæng hîp gibberellin 2.4.2.1. Vai trß sinh lý gibberellin Gibberellin (GA) lµ phytohoocmon tån t¹i ë trong c¸c bé phËn cña c©y, hiÖn nay ng­êi ta ®· ph¸t hiÖn ®­îc h¬n 50 lo¹i gibberellin, trong ®ã cã GA3 (axit gibberellic) cã ho¹t tÝnh m¹nh nhÊt. TÊt c¶ c¸c GA ®Òu cã cïng mét vßng gibban c¬ b¶n, cßn ®iÓm kh¸c nhau nhá gi÷a chóng chñ yÕu lµ vÞ trÝ cña nhãm - OH trong ph©n tö. Gibberellin ®­îc tæng hîp ë trong c¸c c¬ quan ®ang sinh tr­ëng nh­ h¹t n¶y mÇm, l¸ non, qu¶ non... trong ®ã sù tæng hîp m¹nh nhÊt lµ ë tÕ bµo lôc l¹p. GA ®­îc tæng hîp tõ mevalonat qua hµng lo¹t c¸c ph¶n øng dÉn ®Õn hîp chÊt trung gian quan träng lµ kaurent c¬ së cña tÊt c¶ c¸c GA trong c©y. Vai trß sinh lý cña GA ®· ®­îc nghiªn cøu trªn nhiÒu ®èi t­îng. GA kÝch thÝch sù n¶y mÇm cña h¹t vµ cñ, kÝch thÝch sù ra hoa vµ ph©n ho¸ giíi tÝnh, lµm t¨ng kÝch th­íc qu¶ vµ t¹o qu¶ kh«ng h¹t. HiÖu qu¶ sinh lý râ rÖt nhÊt cña GA lµ kÝch thÝch m¹nh mÏ sù sinh tr­ëng kÐo dµi cña th©n, sù v­¬n dµi cña lãng c©y hä lóa do kÝch thÝch ®Æc tr­ng cña GA lªn pha gi·n tÕ bµo theo chiÒu däc [12]. 2.4.2.2. øng dông chuyÓn gen øc chÕ tæng hîp Gibberellin Nh÷ng nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy qu¸ tr×nh tæng hîp vµ ®iÒu hoµ ho¹t ®éng cña GA lµ do gen qui ®Þnh. C¸c nghiªn cøu vÒ trao ®æi chÊt di truyÒn cña GA ®· kh¼ng ®Þnh r»ng c¸c ®ét biÕn lïn cña mét sè thùc vËt nh­ ng«, ®Ëu Hµ lan (chiÒu cao c©y chØ b»ng kho¶ng 20% chiÒu cao c©y b×nh th­êng) lµ c¸c ®ét biÕn gen ®¬n gi¶n, dÉn ®Õn sù thiÕu hôt c¸c enzym trªn con ®­êng tæng hîp GA mµ c©y kh«ng thÓ h×nh thµnh ®­îc GA. Víi nh÷ng ®ét biÕn nµy th× viÖc bæ sung GA ngo¹i sinh sÏ lµm cho c©y sinh tr­ëng b×nh th­êng [12]. Theo th«ng b¸o cña Goodman ë c©y A. thaliana gen GA2 n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ sè 1 vµ cã chiÒu dµi lµ 2506 base [32], khi GA2 bÞ ®ét biÕn th× thiÕu sù tæng hîp cña chÊt trung gian ent-kaurent B dÉn ®Õn lµm thay ®æi ho¹t ®éng cña enzym ®Ó chuyÓn tõ Copalyl pyrophosphate sang ent-kaurene ë giai ®o¹n ®Çu cña qu¸ tr×nh sinh tæng hîp GA. Theo Meier C. vµ CS. (2001) ë c©y A. thaliana cßn cã gen lïn ®ét biÕn - lue1, gen nµy còng n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ sè 1 vµ gÇn vÞ trÝ cña gen GA2, c©y cã gen lïn ®ét biÕn lue1 cã chiÒu cao chØ b»ng 30% so víi c©y ®èi chøng vµ c¸c chåi thø cÊp còng bÞ gi¶m. Nghiªn cøu gÇn ®©y ®· thµnh c«ng chuyÓn gen øc chÕ ho¹t ®éng cña GA2-oxidase (AtGA2-ox) ë c©y A. thalinia, c©y ®­îc chuyÓn gen AtGA2-ox cã chiÒu cao c©y thÊp h¬n h¼n so víi ®èi chøng [29]. Hahn vµ CS. [2000] nghiªn cøu ë lóa cã gen nöa lïn Sd-1 n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ sè 1, Sd-1 lµ gen ®¬n lÆn lµm gi¶m chiÒu cao c©y lóa vµ ®­îc sö dông réng r·i ®Ó t¨ng kh¶ n¨ng chèng ®æ, n©ng cao n¨ng suÊt. 2.4.3. C¸c thµnh tùu cña chuyÓn gen t¹o gièng c©y trång Ngµy nay kü thuËt chuyÓn gen ®· ®­îc ¸p dông réng r·i trong viÖc chuyÓn c¸c gen h÷u Ých vµo c¸c gièng c©y trång, ®Æc biÖt lµ c¸c c©y 2 l¸ mÇm. Lîi nhuËn thu ®­îc tõ trång gièng ng« chuyÓn gen Bt t¨ng 99 triÖu USD vµ tiÕt kiÖm ®­îc 216 triÖu USD do gi¶m chi phÝ thuèc diÖt cá vµ thuèc trõ s©u khi trång ®Ëu t­¬ng Roundup ready vµ b«ng Bt (Nguån: Trung t©m chÝnh s¸ch N«ng nghiÖp thùc phÈm 01/2001). TÝnh ®Õn n¨m 1996 ®· cã kho¶ng 2000 dßng c©y chuyÓn gen kh¸c nhau ®· ®­îc t¹o ra ë Mü, 250 dßng c©y chuyÓn gen ®­îc t¹o ra ë ch©u ¢u, trong ®ã cã 1030 gièng/dßng ng«, 325 gièng/dßng cµ chua, 279 gièng/dßng ®Ëu t­¬ng, 265 gièng/dßng khoai t©y vµ 193 gièng/dßng b«ng. Trong sè c¸c c©y ®­îc t¹o ra b»ng con ®­êng chuyÓn gen nµy cã 761 gièng/dßng c©y kh¸ng thuèc diÖt cá, 252 dßng kh¸ng virus, 676 dßng kh¸ng c«n trïng, 106 dßng kh¸ng bÖnh, 738 dßng mang tÝnh tr¹ng chÊt l­îng vµ 199 dßng mang c¸c tÝnh tr¹ng kh¸c (Nguån: Transgene Nutzpflanzen, 1999). Trªn thÕ giíi c¸c gièng c©y chuyÓn gen ®­îc trång trªn diÖn tÝch 44,2 triÖu ha vµo n¨m 2000, chiÕm 16% tæng diÖn tÝch c¸c c©y trång chÝnh. ë c¸c n­íc ®ang ph¸t triÓn, diÖn tÝch kh¶o nghiÖm c¸c gièng chuyÓn gen chiÕm 15% tæng diÖn tÝch trång c©y chuyÓn gen. DiÖn tÝch trång c¸c c©y chuyÓn gen dù kiÕn sÏ tiÕp tôc t¨ng trong thêi gian tíi. C¸c n­íc trång c©y chuyÓn gen chÝnh lµ Mü, Argentina, Canada vµ Trung quèc. Mü lµ n­íc c«ng nghiÖp ®Çu tiªn cho phÐp s¶n xuÊt c©y chuyÓn gen lµm thøc ¨n vµo n¨m 1994 víi gièng/dßng cµ chua mang gen chÝn chËm Flavr-SavrTM. TiÕp theo ®ã c¸c c©y chuyÓn gen ®· ®­îc trång trªn quy m« lín vµo n¨m 1996. Trung quèc lµ n­íc ®Çu tiªn th­¬ng m¹i ho¸ c©y chuyÓn gen vµo nh÷ng n¨m ®Çu cña thËp kû 90 víi c¸c gièng thuèc l¸, khoai t©y kh¸ng virus vµ c¸c gièng b«ng chuyÓn gen Bt kh¸ng s©u. TÝnh ®Õn n¨m 1999 Trung Quèc ®· trång ®­îc 2,0 triÖu ha c¸c gièng b«ng chuyÓn gen Bt vµ 8 gièng b«ng ®· ®­îc th­¬ng m¹i ho¸. (Nguån: Transgene Nutzpflanzen, 1999) 3. Môc ®Ých cña luËn ¸n - Sö dông kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo kÕt hîp víi ®ét biÕn thùc nghiÖm ®Ó chän t¹o ra c¸c dßng lóa thÊp c©y. - X©y dùng qui tr×nh chuyÓn gen h¹ thÊp chiÒu cao c©y ë lóa. - Thu ®­îc c¸c dßng c©y chuyÓn gen h¹ thÊp chiÒu cao c©y. 4. §iÓm míi cña luËn ¸n §©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu sö dông kÕt hîp gi÷a c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ®ét biÕn m« sÑo lóa vµ ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen ®Ó h¹ thÊp chiÒu cao c©y cña c¸c gièng lóa chÊt l­îng cao. 5. VËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 5.1. VËt liÖu - C¸c gièng lóa ®Æc s¶n cña ViÖt Nam: T¸m xoan, T¸m Êp bÑ, Dù th¬m, TÎ di h­¬ng, do Trung t©m tµi nguyªn di truyÒn thùc vËt, ViÖn Khoa häc kü thuËt n«ng nghiÖp ViÖt nam cung cÊp. - Vector pCAMBIA1301 vµ Promoto 35S do tæ chøc CAMBIA, australia cung cÊp. - C¸c ho¸ chÊt, enzim sö dông cña c¸c h·ng Sigma, Biolab, Invitrogen... 5.2. Ph­¬ng ph¸p H×nh 1: S¬ ®å thÝ nghiÖm tæng qu¸t (1). Xö lý ®ét biÕn (2). ChuyÓn gen H¹t lóa chÝn T¹o m« sÑo KiÓm tra b»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö T¸i sinh c©y Chän läc dßng ­u tó vµ kh¶o nghiÖm Theo dâi vµ chän läc trªn ®ång ruéng 5.2.1. Ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt - T¹o m« sÑo - Xö lý m« sÑo - T¸i sinh c©y - T¹o c©y hoµn chØnh vµ ®­a ra ®ång ruéng 5.2.2. Ph­¬ng ph¸p xö lý phãng x¹ - M« sÑo ®­îc t¹o ra sao 3 tuÇn ®­îc xö lý phãng x¹ Co60 ë c¸c liÒu l­îng kh¸c nhau (5krad, 10krad, 15krad, 20krad), x¸c ®Þnh ng­ìng chiÕu x¹ hîp lý ®èi víi tõng gièng. - Chän läc m« sÑo sèng sãt vµ t¸i sinh c©y 5.2.3. Ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen - ThiÕt kÕ vector chuyÓn gen mang gen h¹ thÊp chiÒu cao c©y (ký hiÖu atGA) + T¸ch dßng gen atGA + X¸c ®Þnh tr×nh tù gen atGA + ThiÕt kÕ cÊu tróc gen (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) + §­a cÊu tróc (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) vµo vector chuyÓn gen - ChuyÓn gen - KiÓm tra sù cã mÆt cña gen trong c©y: PCR, lai Southern, lai Western 5.2.4. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu trªn ®ång ruéng - C©y tõ èng nghiÖm ®­a ra ngoµi ®ång ruéng (thÕ hÖ R0) ®­îc cÊy 1 d¶nh vµ ®­îc gäi lµ 1 dßng. B«ng cña mçi dßng thu ®­îc ®¸nh dÊu vµ thu ho¹ch riªng ®Ó gieo trång cho vô tiÕp theo. - Theo dâi sù ph¸t triÓn cña c¸c dßng chän läc qua c¸c giai ®o¹n ph¸t triÓn trong mçi vô gieo trång. Ph©n tÝch c¸c ®ét biÕn vµ thu nhËn c¸c dßng cã c¸c ®ét biªn cã lîi, ®¸nh gi¸ c¸c chØ tiªu n«ng sinh häc cña c¸c dßng chä läc theo c¸c chØ tiªu n«ng sinh häc: - ChiÒu cao c©y - Sè b«ng trªn khãm - ChiÒu dµi b«ng - Sè h¹t ch¾c trªn b«ng - ChiÒu dµi h¹t - ChiÒu réng h¹t - Träng l­îng 1000 h¹t - Thêi gian sinh tr­ëng - §Æc ®iÓm h×nh th¸i cña bé l¸ vµ l¸ ®ßng - Kh¶ n¨ng chèng ®æ 5.2.5. Ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh ®a h×nh DNA T¸ch DNA tæng sè tõ l¸ X¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch DNA So s¸nh RAPD vµ ph©n tÝch sè liÖu RAPD 5.3. C¸c thiÕt bÞ sö dông trong nghiªn cøu - C¸c m¸y mãc, thiÕt bÞ chuyªn dông cho nu«i cÊy m« vµ nghiªn cøu sinh häc ph©n tö cña phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt vµ Phßng m¸y chung thuéc ViÖn C«ng nghÖ sinh häc nh­ m¸y PCR, m¸y ®iÖn di, m¸y ly t©m, m¸y ®o quang phæ... 6. Néi dung nghiªn cøu + Chän dßng ®ét biÕn: - Thu thËp vµ nh©n h¹t gièng gèc ®Ó lµm nguyªn liÖu - X©y dùng hÖ thèng t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh tèi ­u ®èi víi c¸c gièng lóa T¸m. - X¸c ®Þnh liÒu l­îng chiÕu x¹ ®èi víi m« sÑo lóa b»ng tia Gamma Co60 - X¸c ®Þnh sù ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c gièng lóa T¸m th¬m vµ c¸c dßng chän läc b»ng kü thuËt RAPD - Xö lý ®ét biÕn m« sÑo, t¸i sinh c©y - Trång vµ theo dâi c¸c dßng thu ®­îc trªn ®ång ruéng - Ph©n tÝch c¸c ®ét biÕn cña c¸c dßng thu ®­îc - Chän läc c¸c dßng ®ét biÕn thÊp c©y vµ ®­a trång thö nghiÖm. + ChuyÓn gen: + T¸ch dßng gen atGA + X¸c ®Þnh tr×nh tù gen atGA + ThiÕt kÕ cÊu tróc gen (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) + §­a cÊu tróc (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) vµo vector chuyÓn gen + ChuyÓn gen atGA vµo m« sÑo lóa - KiÓm tra sù cã mÆt cña gen trong c©y: PCR, lai Southern, lai Western - Trång vµ theo dâi c¸c dßng c©y chuyÓn gen trong nhµ l­íi 7. Dù kiÕn s¬ bé vÒ viÖc thùc hiÖn ®Ò tµi 7.1. N¬i thùc hiÖn ®Ò tµi T¹i phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. KÕt hîp víi mét sè c¬ quan kh¸c: Tr¹i thÝ nghiÖm cña ViÖn CNSH, Trung t©m chiÕu x¹ quèc gia - Tõ Liªm, Trung t©m kh¶o kiÓm nghiÖm gièng c©y trång trung ­¬ng... 7.2. Thêi gian thùc hiÖn - 2001: - Thu thËp h¹t gièng gèc - Nh©n h¹t gièng ®Ó lµm nguyªn liÖu - X¸c ®Þnh liÒu l­îng chiÕu x¹ hîp lý ®èi víi m« sÑo lóa - 2002: - T¹o m« sÑo, xö lý ®ét biÕn m« sÑo, t¸i sinh c©y - Trång vµ theo dâi c¸c dßng thu ®­îc (thÕ hÖ R0) trªn ®ång ruéng - Ph©n tÝch c¸c ®ét biÕn thÊp c©y cña c¸c dßng thu ®­îc + T¸ch dßng gen qui ®Þnh thÊp c©y ë lóa (ký hiÖu atGA) + X¸c ®Þnh tr×nh tù gen atGA - 2003: - TiÕp tôc trång, theo dâi vµ ph©n tÝch c¸c dßng c©y ®ét biÕn thÊp c©y ë thÕ hÖ R1 + ThiÕt kÕ cÊu tróc gen (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) + §­a cÊu tróc (®o¹n khëi ®éng+ gen cÊu tróc (atGA) + ®o¹n kÕt thóc) vµo vector chuyÓn gen + ChuyÓn gen h¹ thÊp chiÒu cao c©y atGA - 2004: - Chän läc vµ trång c¸c dßng ®ét biÕn thÊp c©y thÕ hÖ R2 - X¸c ®Þnh sù ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c dßng ®ét biÕn thÊp c©y - KiÓm tra sù cã mÆt cña gen atGA trong c©y: PCR, lai Southern - Trång vµ theo dâi c¸c dßng c©y chuyÓn gen trong nhµ l­íi - ViÕt vµ hoµn thµnh luËn ¸n 7.3. Kinh phÝ nghiªn cøu: Dùa vµo kinh phÝ ®µo t¹o cña Bé Gi¸o dôc vµ §µo t¹o, c¸c ®Ò tµi cÊp Nhµ n­íc, cÊp Bé vµ cÊp C¬ së cña Phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu tiÕng ViÖt Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi (1997). C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång (gi¸o tr×nh cao häc n«ng nghiÖp), NXB N«ng nghiÖp, Hµ néi. NguyÔn Minh C«ng, §ç H÷u Êt, Bïi Huy Thuû, (1999). Nghiªn cøu chän t¹o gièng lóa t¸m th¬m ®ét biÕn. N«ng nghiÖp vµ C«ng nghiÖp thùc phÈm, sè 5/1999, 212-213. Bïi Huy §¸p, (1999). Mét sè vÊn ®Ò vÒ c©y lóa. NXB N«ng nghiÖp - Hµ néi, 154tr. Tr­¬ng §Ých, (1999). 265 gièng c©y trång míi. NXB N«ng nghiÖp - Hµ néi, 323tr. Phan V¨n DuyÖt, (1998). Ph­¬ng ph¸p vËt lý vµ lý sinh phãng x¹ dïng trong n«ng nghiÖp, sinh häc vµ y häc. NXB Khoa häc vµ kü thuËt - Hµ néi, 177tr. HÖ thèng tiªu chuÈn ®¸nh gi¸ nguån gen lóa, IRRI, INGRE-1996. NguyÔn V¨n HiÓn, TrÇn ThÞ Nhµn, (1982). Gièng lóa miÒn B¾c ViÖt nam. NXB N«ng nghiÖp - Hµ néi, 203tr. NguyÔn V¨n Hoan, (1997). H­íng dÉn kü thuËt t©m canh c¸c gièng lóa chuyªn mïa chÊt l­îng cao. NXB N«ng nghiÖp - Hµ néi, 87tr. NguyÔn Hoµng Léc (1992). Chän dßng chÞu muèi NaCl vµ chÞu mÊt n­íc ë thuèc l¸ (Nicotiana tabacum L.) (luËn ¸n Phã tiÕn sÜ sinh häc), Hµ néi. §inh ThÞ Phßng, NguyÔn V¨n TÜnh, Lª TrÇn B×nh, Lª ThÞ Muéi (1998). KÕt qu¶ chän t¹o vµ triÓn khai s¶n xuÊt hai gièng lóa míi DR1 vµ DR2 b»ng c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt. T¹p chÝ Khoa Häc vµ C«ng NghÖ, Trung T©m Khoa Häc Tù Nhiªn vµ C«ng NghÖ Quèc Gia, tËp XXXVI, sè 4. TrÇn Duy Quý, (1997). C¸c ph­¬ng ph¸p míi trong chän t¹o gièng c©y trång. NXB N«ng nghiÖp - Hµ néi, 348tr. Vò V¨n Vô, Vò Thanh T©m, Hoµng Minh TÊn (1997). Sinh lý häc thùc vËt. NXB Gi¸o dôc, 251 tr. Tµi liÖu tiÕng n­íc ngoµi Amirato P.V., Evans D.A., Sharp W.R. and Yamada Y. (1984). Handbook of plant cell culture. Crop Species, New York, Macmilan.Vol. 3. Bartels D., Singh M., Salamini F. (1988). Onset of desiccation tolerance during development of the barley embryo. Planta Mol. Biol. 11, 277-291. Brown et al. (1994). Development of simple bombardment device for gene transfer into plant cells. Plant Cell Tissue Organ Cul., 37, 47-53. Casas, A.M. et al (1995). Cereal transformation through particle bombardment. Plant Breed. Rev., 13, 235-264. Claes B., Dekeyser R., Villarroel R., Bulcke V.D.M., Baum G., Montagu M.V. (1990). Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought. Plant Cell 2, 19-27. Dix P.J. (ed) (1990). Plant cell line selection (Procedures and applications) VCH Verlagsgellschft MBH. Droste A., Pasquali G., Zanettini M.H.B. (2000). Intergratd bombardment and Agrobacterium transformation system: an alternatve method for Soybean transformation. Plant molecular biology reporter 18: 51-59. Goodman, H. M. Hadi MZ, McMullen MD and Finer JJ (1996). Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment. Plant Cell Rep 15: 500-505. Hahn J.H., Yoon U.H, Lee K.S., Kim U.W., Yun C.H., Kim Y.K. (2000). Plant & animal Genome VIII Conferenc, Ton & Country Hotel, San Diego, 12/2000. Hiei et al, (1994). Breeding Sci. Suppl. 1: 52. Kaeppler, H.; Akula C.; Akula, A. Kaeppler, S.M.; Chandler V.; Sidorenko, L.; Napoli, C. and Jorgensen R. (2001). Agrobacterium-mediated transformation of maize: optimization of parameters for utilization of nonsuperbinary vectors. In: Plant & animal genome IX conference. McHughen A., Swartz M. (1984). A tissue culture derived salt tolerant line of flax (Linum usitassimum). J. Plant Physiol. 117, 109-117. Meier C., Bouquin T., Nielsen M.E. (2001). Gibberellin response mutants identified by luciferase imaging. The plant journal 25(5), 509-519. Sanford, J.C. (1990). Biolistic plant transformation. Physiol.Planta., 79, 206-209. Sharp W.R., Evans D.A., Anmirato P.V. and Yamada Y. (1984). Handbook of plant cell culture. Volume 2. Crop species, New york : Macmillan. Sonewald U. (2000). Abteilung molekulare zellbiologie. Jahresforschungsbericht 2000, 87-88. Tinland B and Hohn B (1995). Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of A. tumefaciens T-DNA into the plant genome, 209-229. In: Setlow JK (ed), Genetic Craterostigma plantagineum Hochst. In: Planta 202 (4), 459-71. Yamaguchi, S., Sun, T.P., Kawaide, H and Kamiya, Y. (1998). The GA2 locus of Arabidopsi thaliana encodes ent-kaurene synthase of gibberellin biosynthesis. Plant Physiol. 116, 1271 - 1278. ----------------------------------------------------