Đề tài Nghiên cứu chiết xuất chất màu betacyanin từ vỏ quả thanh long Hylocereus spp.

 (k: hằng số Boltzmann) Như vậy, tốc độ khuếch tán phân tử càng mạnh khi chênh lệch nồng độ chất cần chiết giữa 2 pha tiếp xúc nhau, diện tích bề mặt tiếp xúc giữ nguyên liệu và dung môi càng lớn, nhiệt độ càng cao và kích thước phân tử chất cần chiết càng nhỏ. 1 Hiện nay, có thể hạn chế nhược điểm này bằng kỹ thuật siêu lọc và lên men dịch chiết củ cải đường với sự có mặt của Candida utilis trong điều kiện kỵ khí (Adams et al., 1976). 18 b) Khuếch tán đối lưu: là sự vận chuyển vật chất từ môi trường này sang môi trường khác trong dòng chuyển động của chất lỏng ở chế độ chảy xoáy. Khuếch tán đối lưu là hình thái di chuyến vật chất trong dung dịch ở phạm vi nhỏ. Khuếch tán đối lưu theo định luật Sucarep: dCSBdt dm .. trong đó: dm, dt, dC và S có ý nghĩa giống như công thức khuếch tán phân tử ở trên; B: hằng số tốc độ khuếch tán đối lưu. Trong khuếch tán phân tử sự di chuyển vật chất nhờ vào động năng của chuyển động nhiệt phân tử. Trong khuếch tán đối lưu di chuyển vật chất nhờ vào năng lượng bên ngoài dẫn tới. Khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu được gọi là khuếch tán nồng độ vì động lực của quá trình khuếch tán đều là do chênh lệch nồng độ. 1.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết Trong quá trình chiết, để đạt được vận tốc chiết và hiệu suất chiết cao, cần cần lưu ý các yếu tố sau: a) Chênh lệch nồng độ chất cần chiết ở trong nguyên liệu và dung môi phải cao để quá trình khuếch tán các phân tử cần chiết càng mạnh. - Muốn vậy, có thể lợi dụng nguyên lý chiết ngược dòng để tạo ra sự chênh lệch nồng độ lớn (trong chiết liên tục) hay thay mới dung môi chiết nhiều lần (trong chiết gián đoạn). - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phải đủ lớn. Tuy nhiên chỉ lớn ở mức độ hợp lý nhất định: nếu tỷ lệ này quá lớn sẽ làm cho nồng độ chất cần chiết trong dung dịch chiết rút đuợc thấp, gây khó khăn và hiệu quả kinh tế kém (tốn năng lượng và thời gian đuổi dung môi) b) Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu: - Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần chiết và dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn. - Kích thước càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng, hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên cũng chỉ nên nhỏ tới mức nhất định vì quá nhỏ 19 nguyên liệu dễ bị vón lại các hạt mịn lắng đọng trên các lớp nguyên liệu. Mặt khác, nguyên liệu quá nhỏ sẽ bị cuốn vào dịch chiết gây khó khăn cho quá trình xử lý dịch chiết sau khi chiết. - Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết. Khi chiết bằng dung môi hữu cơ, độ ẩm nguyên liệu giảm thì tốc độ chiết tăng lên. c) Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết - Thời gian càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn. Khi đạt được mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế. - Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, do đó phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi. Tuy nhiên, nhiệt độ tăng có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao sẽ có thể phân hủy phân tử cần chiết và gây khó khăn cho quá trình công nghệ. c) Dung môi chiết Dung môi chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau: - hòa tan chất cần chiết ở bất kì tỷ lệ nào. - có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi dịch chiết. - có thành phần hóa học ổn định, không phản ứng phụ với nguyên liệu. - không độc hại , không ảnh hưởng sức khỏe và chất lượng sản phẩm. - khó cháy nổ, an toàn cho quá trình sản xuất. - không ăn mòn thiết bị. - rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất. Tuy nhiên hiện nay chưa có loại dung môi nào đáp ứng đầy đủ những điều kiện trên. Do đó, tùy trường hợp chiết cụ thể để chọn dung môi cho hợp lý. 1.4.2. Các phương pháp chiết Dựa vào cách tiến hành, có thể chia thành các phương pháp chiết sau: 1.4.2.1. Chiết gián đoạn: Theo phương pháp này ta ngâm nguyên liệu vào dung môi. Sau một thời gian nhất định, khi giữa dung môi và nguyên liệu đạt nồng độ chất cần thiết ở mức độ 20 cân bằng, tiến hành đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào. Cứ như thế cho đến khi chiết hết chất cần chiết. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện. Nhược điểm là tốn công, tốn thời gian cũng như tốn dung môi chiết nên không kinh tế, không phù hợp với quy mô sản xuất lớn. 1.4.2.2. Chiết bán liên tục Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiều thiết bị chiết gián đoạn bố trí thành một hệ thống liên hợp tuần hoàn nhằm mục đích giảm thời gian chiết, ít tốn công hơn, tiết kiệm được nhiều dung môi hơn. Đối với phương pháp này quá trình chiết thực hiện theo nguyên tắc dung môi đi từ nơi có nồng độ chất chiết cao đến nồng độ chất chiết thấp. 1.4.2.3. Chiết liên tục Nguyên lý là ngâm dung môi trong dòng chuyển động cùng chiều hay ngược chiều của dung môi. Ưu điểm của phương pháp này là cho hiệu quả kinh tế cao, thích hợp cho sản xuất công suất lớn, áp dụng cho quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, nhược điểm là thiết bị khá phức tạp, chi phí đầu tư lớn. 1.4.3. Vài kỹ thuật chiết hiện đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên 1.4.3.1. Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction): Nguyên liệu được trộn với dung môi thích hợp rồi chiết bằng siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, do đó gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần chiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết. 1.4.3.2. Chiết siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction): Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm. Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn2. Ở trạng thái này, chất lỏng có 2 tức là ở nhiệt độ và áp suất cao hơn điểm tới hạn của nó 21 những tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần. Trong phương pháp này, thường dùng CO2 trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (đôi khi trộn với vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, metanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoit của CO2) do nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoit và an toàn trong vận hành. 1.4.3.3.Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) hay chiết dưới áp suất cao (PFE : Pressurized Fluid Extraction): Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tương tự như phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40 – 2000C). Dung môi được bơm vào ống chiết và giữ ở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình được lặp lại vài lần (cycles). Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ (N2) Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị chiết SFE Hình 1.7. Sơ đồ thiết bị chiết ASE 22 Đề tài này sẽ nghiên cứu và so sánh hiệu quả chiết chất màu betcyanin từ vỏ quả thanh long ruột trắng (Hylocereus undatus) trồng ở Việt Nam bằng phương pháp ngâm chiết gián đoạn và phương pháp siêu âm. Từ đó, chọn lựa quy trình thích hợp cho việc chiết betacyanin từ nguồn nguyên liệu này. Ngoài ra, đề tài còn khảo sát độ bền màu của dịch chiết betacyanin thu được trong một số điều kiện bảo quản khác nhau và đề xuất phương pháp thích hợp cho việc ứng dụng và bảo quản các loại thực phẩm bổ sung chất màu này. 23 Phần 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1.1. Nguyên liệu chính: Trong nghiên cứu này, nguyên liệu dùng để chiết betacyanin là vỏ quả thanh long ruột trắng (Hylocereus undatus). Quả thanh long (chọn những quả vừa chín, vỏ có màu đỏ hồng đậm) được mua ở chợ Vĩnh Hải (Nha Trang). 2.1.1.2. Hóa chất - Etanol tuyệt đối - Nước cất 1 lần - Na2SO4 khan - Acid ascorbic Tất cả hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Dụng cụ Bình nón, phễu lọc thủy tinh, ống nghiệm, ống đong, bình định mức, pipet, bông y tế, giấy bạc. 2.1.2.2. Thiết bị - Cân kỹ thuật  1 g (Việt Nam) - Cân phân tích  1 mg (Shimadzu, Nhật) - Cân phân tích  0,1 mg (Satorius, Nhật) - Tủ sấy  10C (Memert , Đức) - Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) - Thiết bị cô quay RV 10 Control (IKA, Đức) - Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA) 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định thành phần khối lượng của quả thanh long Quả thanh long được rửa sạch và lau khô nước. Sau đó, xác định thành phần khối lượng của thanh long như sau: - Cân quả thanh long được khối lượng là mQ - Tách vỏ. Cắt bỏ những phần không có màu đỏ (cuống, đầu, tai) và cạo bỏ lớp màu trắng nhầy bên trong (sát phần ruột quả), đem cân phần còn lại, được khối lượng là mV - Phần ruột đem cân ta được khối lượng là mR - Phần bỏ đi cũng được đem cân được khối lượng mB Thành phần khối lượng của quả thanh long được tính như sau: % Vỏ = %100. Q V m m ; % Ruột = %100. Q R m m ; % Bỏ đi = %100. Q B m m 2.2.2. Xác một số thành phần hóa học của vỏ thanh long a) Xác định hàm lượng nước: sấy ở 105 – 1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 1) b) Xác định hàm lượng betacyanin tổng số trong vỏ thanh long: chiết betacyanin bằng nước cất và đo độ hấp thụ của dung dịch ở 538 nm dùng H2O làm dung dịch so sánh (Phụ lục 2). 2.2.3. Quy trình dự kiến sản xuất betacyanin từ vỏ quả thanh long Trên cơ sở kết quả của một số nghiên cứu liên quan, chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến sản xuất chất màu betacyanin từ vỏ thanh long như sau: 25 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất chất màu betacyanin từ vỏ thanh long phế liệu Điều kiện chiết thích hợp: - Dung môi - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu - Thời gian chiết - Nhiệt độ chiết - Số lần chiết thích hợp - Phương pháp chiết Bột màu betacyanin Trộn với dung dịch maltodextrin Xử lý thích hợp Lọc Chiết Vỏ thanh long phế thải Dịch chiết betacyanin Cô đuổi dung môi (áp suất thấp; < 400C) Sấy phun Dịch chiết betacyanin thô cô đặc Tinh chế EtOH - CHCl3 3/1 (v/v) 26  Giải thích quy trình * Vỏ thanh long đem cắt bỏ các phần không có màu đỏ (cuống, đầu, tai) và nạo bỏ phần không màu bên trong. Sau đó, cắt thành miếng nhỏ, bảo quản lạnh (- 200C) đến khi chiết . * Chiết xuất chất màu betacyanin trong vỏ quả thanh long bằng dùng môi và phương pháp chiết thích hợp (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ và số lần chiết được chọn sao cho đạt hiệu suất chiết cao hợp lý) * Lọc lấy dịch chiết. * Cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp: để tránh sự phân hủy betacyanin, tiến hành cô đặc dịch chiết ở nhiệt độ không quá 400C . * Sau khi đuổi dung môi, thu được dịch chiết thô chứa betacyanin cô đặc * Sau khi cô đuổi hết dung môi, tinh chế betacyanin bằng cách chiết betacyanin sang cloroform, sau đó kết tinh betacyanin bằng cách thêm etanol 3/1 (v/v) và để ở 40C qua đêm. Gạn và rửa tinh thể betacyanin bằng etanol lạnh [9] * Hòa tan betacyanin tinh thể trong nước và bổ sung maltodextrin (tỷ lệ thích hợp) * Sấy phun hỗn hợp betacyanin-maltodextrin để thu bột màu betacyanin. 2.2.4. Xác định điều kiện thích hợp chiết betacyanin từ vỏ thanh long Vỏ quả thanh long tươi được cắt thành miếng nhỏ (2 - 3 mm), sau đó trộn đều, cân chính xác thành nhiều mẫu nhỏ (1÷ 2 g) rồi cho vào các ống nghiệm, bịt kín, bảo quản ở -200C đến khi chiết. Betacyanin kém bền nhiệt nên chỉ nghiên cứu chiết bằng phương pháp ngâm chiết (ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối) và phương pháp siêu âm. Để xác định điều kiện chiết betacyanin bằng phương pháp chiết nhờ siêu âm và ngâm chiết, tiến hành các lô thí nghiệm sau: 2.2.4.1. Chọn dung môi chiết (Lô TN1): Cố định tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 5/1(w/v). Tiến hành chiết 1 lần bằng phương pháp siêu âm (5 min, ở 300C). 27 Dung môi chiết sử dụng là dung dịch etanol-nước, trong đó tỷ lệ etanol trong dung dịch (X1) thay đổi lần lượt từ 0 – 100% (v/v): X1 = 0; 20; 40; 60; 80; 100 % (v/v) Dịch chiết sau đó được pha loãng bằng etanol tuyệt đối rồi đo quang ở 538 nm để xác định hiệu suất chiết betacyanin theo công thức: %H = (lượng betacyanin chiết được/ lượng betacyanin tổng số).100% 2.2.4.2. Chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (Lô TN2): Dùng dung môi chiết thích hợp đã chọn. Tiến hành chiết 1 lần bằng phương pháp siêu âm (5 min, ở 300C), trong đó tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (X2) thay đổi như sau: X2 = 5/1; 10/1; 15/1; 20/1; 25/1; 30/1 (v/w) Betacyanin kém bền nhiệt nên chỉ nghiên cứu chiết bằng phương pháp ngâm chiết (ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối) và phương pháp siêu âm. Do thời gian chiết và số lần chiết phụ thuộc vào phương pháp chiết nên cần nghiên cứu ảnh hưởng sự thay đổi hiệu suất chiết theo thời gian chiết và số lần chiết bằng hai phương pháp chiết đã chọn. 2.2.4.3. Chọn thời gian chiết (Lô TN3): a) Phương pháp siêu âm: Dùng dung môi và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã xác định. Tiến hành chiết 1 lần. Ở đây ta khảo sát thêm yếu tố nữa là nhiệt độ siêu âm. Nhiệt độ và thời gian siêu âm thích hợp được xác định phương pháp quy hoạch thực nghiệm toàn phần 2 yếu tố theo mô hình cấu trúc có tâm 22+ 3 (gồm 4 thí nghiêm ở biên và 3 thí nghiệm ở tâm), trong đó: Thời gian: X3 = 5 ÷ 35 (min); Nhiệt độ : T = 30 ÷ 80 (0C) Hàm mục tiêu (Y) là hiệu suất betacyanin chiết được (xác định bằng phương pháp đo quang). Phương trình hồi quy thực nghiệm theo mô hình bậc hai được xác định bằng phầm mềm EXCEL: Y = b0 + b1X3 + b2T + b3X3.T + b4X32 + b5T2 28 Dùng chuẩn Student để loại bỏ các hệ số không có ý nghĩa và chuẩn Fisher để kiểm định tính tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm (độ tin cậy 95%). Sau đó, xác định các thông số tối ưu bằng phần mềm Maple 7.0. b) Phương pháp ngâm chiết: Dùng dung môi và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã xác định. Tiến hành chiết 1 lần, trong đó thời gian ngâm chiết (X3) thay đổi như sau: X3 = 2; 4; 6; 8; 10; 12 (h) 2.2.4.4. Chọn số lần chiết (Lô TN4): Dùng dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian chiết (và nhiệt độ chiết thích hợp, nếu chiết bằng phương pháp siêu âm), trong đó thay đổi số lần chiết (X4) như sau: X4 = 1; 2; 3; 4 (lần) Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết betacyanin tử vỏ thanh long bằng phương pháp siêu âm và phương pháp ngâm chiết được trình bày ở hình 2.2. 29 Ngâm chiết (X1 opt ; X2 opt ; X4 = 1) Số lần chiết (X4 opt) X3 = t/gian (h) 2 4 6 4 8 10 12 Dịch chiết betacyanin Tính hiệu suất thu hồi betacyanin Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp (X2 opt) X2 = Dmôi/N.Liệu (v/w) 5/1 10/1 15/1 20/1 25/1 30/1 Siêu âm (X2 = 5/1 v/w; X3 = 5 min; X4 =1 lần) Dịch chiết betacyanin Tính hiệu suất thu hồi betacyanin % Etanol thích hợp (X1 opt) Siêu âm (X1 opt; X3 = 5 min, X4 = 1 lần) X1 = % etanol (v/v) 0 20 40 80 100 60 Lô TN 2 Lô TN 1 Lô TN3 Siêu âm (X1 opt ; X2opt; X4=1) X3 = 5 ÷ 35 (min) T = 30 ÷ 80 (0C) Quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần Dịch chiết betacyanin Tính hiệu suất thu hồi betacyanin Thời gian (nhiệt độ) chiết thích hợp (X3 opt; Topt ) X4 = số lần chiết 1 2 3 4 Dịch chiết betacyanin Tính hiệu suất thu hồi betacyanin Lô TN4 Siêu âm (Topt) /Ngâm chiết (X1 opt; X2 opt ; X3 opt ) Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết betacyanin từ vỏ thanh long 30 2.2.5. Lựa chọn quy trình thích hợp chiết betacyanin Sau khi xác định được điều kiện chiết thích hợp để chiết betacyanin từ vỏ thanh long bằng phương pháp siêu âm và ngâm chiết, tiến hành chiết thử nghiệm trong các điểu kiện trên. So sánh hiệu suất chiết thu được. Từ đó, chọn quy trình chiết thích hợp nhất (Hình 2.3.) Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn lưa quy trình thích hợp chiết xuất betanin từ vỏ thanh long 2.2.6. Nghiên cứu phương pháp bảo quản dịch chiết betacyanin Tiến hành khảo sát độ bền màu của dịch chiết betacyanin theo thời gian bảo quản trong các trường hợp sau: Dịch chiết betacyanin Vỏ thanh long đã xử lý Tính hiệu suất chiết – So sánh Quy trình chiết thích hợp Siêu âm (điều kiện thích hợp) Lọc Ngâm trong dung môi thích hợp Ngâm chiết (điều kiện thích hợp) 31 2.2.6.1. Không bổ sung vitamin C: Dịch chiết được bảo quản và đánh giá độ bền màu trong 2 điều kiện: - Ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên - Bảo quản ở 40C, trong tối Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ bền màu của dịch chiết betacyanin không bổ sung vitamin C Tiến hành: Cho vào 6 bình nón mỗi bình 20 ml dịch chiết betacyanin trong etanol, bịt kín lại (dùng giấy bạc và màng polyetylen). Sau đó, để 3 bình ở nhiệt độ phòng (ánh sáng tự nhiên), 3 bình còn lại giữ trong ngăn mát tủ lạnh (40C). Cứ sau 24 h tiến hành quan sát và đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 538 nm (dùng etanol làm dung dịch so sánh). Xác định %betacyanin còn lại theo công thức: %betacyanin còn lại = (lượng betacyanin còn lại/lượng betacyanin ban đầu).100% Dịch chiết betacyanin - Bảo quản ở nhiệt độ phòng - Ánh sáng tự nhiên Bảo quản lạnh (40 C), trong tối Đo quang - Quan sát 1 2 3 4 5 7 6 Thời gian (ngày): Đánh giá độ bền màu 32 2.2.6.2. Khi bổ sung vitamin C Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên nhưng các dịch chiết betacyanin được bổ sung 0,1% (w/v) vitamin C. Các dịch chiết này được bảo quản trong 3 điều kiện: - Ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên - Ở nhiệt độ phòng, trong tối - Bảo quản ở 40C, trong tối So sánh độ bền màu của dịch chiết betacyanin trong các điều kiện bảo quản nói trên. Từ đó, xác định phương pháp thích hợp cho việc bảo quản và ứng dụng dịch chiết betacyanin thu được. 2.2.7. Thử nghiệm quy trình chiết - Đánh giá chất lượng sản phẩm Sau khi chọn được quy trình thích hợp để chiết betacyanin từ vỏ quả thanh long, tiến hành sản xuất thử nghiệm betacyanin với quy mô phòng thí nghiệm. Sản phẩm thử nghiệm được đem phân tích để đánh giá chất lượng sản phẩm. - Xác định dư lượng Pb: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (phụ lục 3) - Xác định hàm lượng betacyanin tổng số trong sản phẩm: phương pháp đo quang UV-Vis (phụ lục 2) 2.2.8. Xử lý số liệu Các kết quả nghiên cứu đều là trung bình cộng của 3 lần xác định song song. Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2003. Vẽ đồ thị hai chiều bằng phần mềm Excel và đồ thị ba chiều bằng phần mềm Maple 7.0. 33 Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần khối lượng của quả thanh long Kết quả xác định thành phần khối lượng của quả thanh long được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của quả thanh long Vỏ Ruột Phần bỏ đi Mẫu Khối lượng (g) Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) Tỷ lệ (%) 1 150 25,0 400 67,0 50 0,1 2 170 26,2 420 64,6 60 0,1 3 145 23,6 410 66,7 60 0,1 Trung bình - 24,9 - 66,1 - 0,1 Kết quả trên cho thấy : - Phần ăn được trong quả thanh long chiếm tỷ lệ lớn (khoảng 66% trọng lượng quả). Đây cũng là thành phần có ích nhất, được dùng để ăn tươi hay chế biến thành các dạng sản phẩm khác nhau. - Phần vỏ có chứa betacyanin cũng chiếm tỷ lệ khá lớn (gần 25% trọng lượng quả). Nếu phần vỏ này bị thải bỏ trong dây chuyền chế biến các sản phẩm thanh long đóng hộp thì sẽ sinh ra một lượng phế liệu rất lớn, gây ô nhiễm môi trường. Do vậy, việc tận dụng nguồn phế liệu này để chiết xuất chất màu betacyanin là điều có ý nghĩa thực tiễn và giúp nâng cao hiệu quả kinh tế của quá trình sản xuất thanh long đóng hộp. - Phần bỏ đi chiếm tỷ lệ rất nhỏ (khoảng 0,1%). Phần này có thể tận dụng để chế biến thành phân vi sinh. Như vậy, có thể nói thanh long là một loại quả rất có ích: tất cả thành phần của nó đều có thể dùng để chế biến thành những sản phẩm có giá trị kinh tế. Tuy nhiên, để thực hiện được điều này thì song song với việc phát triển các vùng thanh 34 long nguyên liệu cần xây dựng các cơ sở chế biến cho phép tận dụng một cách hiệu quả tất cả các thành phần này. 3.2. Một số thành phần hóa học của vỏ thanh long Bảng 3.2. Một vài thành phần hóa học cơ bản của vỏ thanh long Thành phần Hàm lượng Nước (%) 89 Betacyanin tổng số (mg/kg TL tươi) 109 Qua kết quả trên ta thấy: - Vỏ quả thanh long chứa hàm lượng nước khá cao (khoảng 89%), do đó rất dễ bị hư thối. Vì thế, vỏ sau khi bóc tách nên tiến hành chiết betacyanin ngay để tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm chất màu thu được. - Hàm lượng betacyanin trong vỏ quả thanh long Hylocereus undatus hơi thấp so với trong với trong củ cải đường3 (bằng khoàng 1/6 - 1/3). Như vậy, giá thành betacyanin tự nhiên chiết từ vỏ thanh long sẽ cao hơn khi chiết từ củ cải đường. Tuy nhiên, nhược điểm này có thể được bù trừ nhờ sự giảm bớt chi phí khử mùi đất khó chịu và nồng độ nitrat và nitrit khá cao của dịch chiết củ cải đường. 3.3. Xây dựng quy trình chiết betacyanin từ vỏ quả thanh long 3.3.1. Chọn dung môi chiết Bản chất của dung môi ảnh hưởng đến nhiều đến hiệu suất chiết betacyanin. Kết quả thu được khi tiến hành chiết betacyanin từ vỏ quả thanh long bằng phương pháp siêu âm (Bảng PL4.1. và hình 3.1) cho thấy: - Khi tăng nồng độ etanol trong dung dịch nước từ 0 - 40% thì hiệu suất chiết betacyanin tăng lên. Nhưng sau đó, tiếp tục tăng nồng độ etanol (60 - 100%) thì hiệu suất chiết lại giảm đi. - Với dung môi etanol 40% thì hiệu suất chiết betacyanin lớn nhất. Do đó, dung dịch etanol-nước 40% (v/v) được chọn làm dung môi chiết. 3 chứa 300 – 600 mg/kg [7] 35 Chọn tỷ lệ etanol/nước 17,43 20,18 38,53 27,52 22,94 12,84 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 Tỷ lệ etanol/nước (% v/v) H iệ u s u ất c h iế t ( % ) Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết betacyanin 3.3.2 Chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hiệu suất chiết betacyanin từ nguyên liệu vỏ thanh long tươi (Hình 3.2) cho thấy: - Khi tỷ lệ dung môi nguyên liệu này nhỏ hơn 20/1(v/w) thì hiệu suất chiết tăng lên khi tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thì hiệu suất chiết gần như không thay đổi. Điều này có thể giải thích như sau: Với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu nhỏ hơn 20/1 (v/w), lượng dung môi chưa đủ ngập hết nguyên liệu, do đó hiệu suất chiết khá thấp (chỉ khoảng gần 40%). Khi tỷ lệ này đạt đến ngưỡng giá trị trên, toàn bộ khối nguyên liệu ngập hết trong dung môi lên hiệu suất chiết tăng đáng kể. - Với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu từ 25/1 (v/w) trở lên, toàn bộ khối nguyên liệu được tiếp xúc hoàn toàn với dung môi và dưới tác động của sóng siêu âm thì gần như toàn bộ betacyanin trong nguyên liệu sẽ được chuyển vào trong dung môi, do đó hiệu suất gần như là không thay đổi. Mặc dù khi tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu lớn hơn 20/1 (v/w) thì hiệu suất chiết tăng lên nhưng không đáng kể, trong khi đó phải tốn nhiều chi phí dung môi cũng 36 như chi phí năng lượng và thời gian cho việc đuổi dung môi. Do đó, tỷ lệ dung môi nguyên liệu thích hợp nhất được chọn là 20/1 (v/w) Chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 19,20 32,28 39,39 49,12 52,92 53,43 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 5/1 10/1 15/1 20/1 25/1 30/1 DMôi/N.Liệu (v/w) H iệ u s uấ t ch iế t (% ) Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết betacyanin 3.3.3. Chọn thời gian chiết và số lần chiết 3.3.3.1. Chiết bằng phương pháp siêu âm a) Xác định thời gian và nhiệt độ siêu âm Kết quả nghiên cứu sự phụ thuộc của hiệu suất chiết (Y%) vào thời gian chiết (X3, min) và nhiệt độ siêu âm (T, 0C) được thể hiện trên bảng 3.3. và hình 3.3. Từ kết quả này, đã xác định được phương trình hồi quy như sau: Y = - 110,77 + 6,70T – 0,03T.X3 – 0,06T2+ 0,05X32 (R2 = 0,9893) Dùng phần mềm Maple 7.0 đã xác định được nhiệt độ và thời gian siêu âm tối ưu để chiết betacyanin từ vỏ thanh long là: T = 470C ; X3 = 35 min Do đó, chúng tôi chọn thời gian chiết là 35 min ứng với nhiệt độ siêu âm là 450C. 37 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất chiết betacyanin từ vỏ thanh long Thời gian X3 (min) Nhiệt độ T (0C) Hiệu suất chiết Y (%) 5 30 35,29 5 80 46,76 35 30 64,94 35 80 33,45 20 55 70,55 20 55 67,65 20 55 73,78 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất chiết betacyanin từ vỏ thanh long b) Xác định số lần chiết bằng phương pháp siêu âm Sự thay đổi hiệu suất chiết vào số lần chiết bằng phương pháp siêu âm được thể hiện trên bảng PL4.4 và hình 3.4. 38 Xác định số lần chiết bằng phương pháp siêu âm 62,98 83,17 99,19 100 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 Số lần chiết H i ệ u su ất c hi ết (% ) Hình 3.4. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào số lần siêu âm Kết quả này cho thấy khi tăng số lần chiết từ 1 đến 3 lần thì hiệu suất chiết tăng nhanh. Nhưng tiếp tục tăng số lần chiết lên 4 lần thì hiệu suất tăng không đáng kể. Nguyên nhân là do sau 3 lần siêu âm thì dưới tác dụng của sóng siêu âm các tế bào chứa chất màu bị phá vỡ gần hoàn toàn và betacyanin được chiết gần như triệt để. Do vậy, nếu tiếp tục chiết thì hiệu suất chiết gần như không tăng. Do vậy, để giảm chi phí sản xuất, chúng tôi chọn số lần siêu âm là 3 lần. 3.3.3.2. Chiết bằng phương pháp ngâm chiết a) Xác định thời gian ngâm chiết Qua đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất chiết betacyanin vào thời gian ngâm chiết (Hình 3.5 và bảng PL4.5) ta thấy: - Khi tăng thời gian chiết từ 2 – 6 h thì hiệu suất chiết tăng mạnh (từ 21,79 đến 45,71%). Nhưng với thời gian chiết dài hơn thì hiệu suất chiết lại giảm đi. Sự giảm hiệu suất chiết trong trường hợp này có thể giải thích bởi sự thủy phân betacyanin (màu tím đỏ) thành betanidin (màu đỏ) hay acid betalamic (màu vàng) khi để betacyanin tiếp xúc với môi trường có nồng độ nước cao (60%) trong thời gian dài. 39 Với thời gian ngâm chiết là 6h thì hàm lượng betacyanin thu được là cao nhất. Do đó, thời gian ngâm chiết được chọn là 6 h. Xác định thời gian ngâm chiết 21,79 41,79 45,71 40,66 37,56 33,7 0 10 20 30 40 50 2 4 6 8 10 12 Thời gian chiết (h) H iệ u su ất c hi ết (% ) Hình 3.5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào thời gian ngâm chiết b) Xác định số lần ngâm chiết Kết quả khảo sát sự thay đổi hiệu suất chiết theo số lần ngâm chiết (Hình 3.6 và bảng PL4.6) cho thấy: khi tăng số lần chiết từ 1 đến 3 lần thì hiệu suất chiết tăng lên (67,47 đến 98,04%), nhưng sau đó (sau 4 lần chiết) thì hiệu suất tăng rất ít. Nguyên nhân là sau 3 lần chiết hàm lượng betacyanin còn lại trong nguyên liệu rất ít (khoảng 2% so với hàm lượng chất màu tổng số ban đầu), do đó gradient nồng độ giữa bề mặt phân cách pha rắn (nguyên liệu) với dung môi rất nhỏ, dẫn đến tốc độ chiết không đáng kể. Như vậy, để giảm chi phí sản xuất ta chọn số lần chiết là 3 lần. 40 Chọn số lần ngâm chiết 67,47 83,73 98,04 100,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 1 2 3 4 Số lần ngâm chiết H iệ u s u ất c h iế t (% ) Hình 3.6. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào số lần ngâm chiết Tóm lại, điều kiện thích hợp để chiết betacyanin từ vỏ thanh long như sau: - Dung môi chiết: dung dịch nước chứa 40% etanol (v/v) - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1 (v/w) - Số lần chiết: 3 lần - Thời gian chiết:  35 min/lần chiết ở 450C (nếu chiết nhờ siêu âm)  6 h/lần chiết ở nhiệt độ phòng (nếu dùng phương pháp ngâm chiết) 3.3.4. So sánh hiệu suất chiết của hai phương pháp Sau khi xác định điều kiện thích hợp đề chiết betacyanin từ vỏ thanh long bằng 2 phương pháp nêu trên, tiến hành chiết thử nghiệm các mẫu lớn (khoảng 40 g) bằng các phương pháp trên. Kết quả so sánh hiệu quả chiết của các phương pháp trên được trình bày trên hình 3.7 và bảng PL4.7. 41 So sánh 2 phương pháp chiết 98,04 96,26 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 Siêu âm Ngâm chiết Phương pháp chiết H iệ u su ất c hi ết (% ) Hình 3.7. So sánh hiệu quả chiết của 2 phương pháp chiết Kết quả trên cho thấy: Phương pháp siêu âm cho hiệu suất chiết cao hơn phương pháp ngâm chiết. Tuy nhiên, sự chênh lệch đó không đáng kể. Do vậy, tùy theo điều kiện, quy mô sản xuất hay mục đích nghiên cứu mà ta lựa chọn phương pháp chiết phù hợp.  Phương pháp siêu âm: * Ưu điểm: cho phép chiết nhanh, tiết kiệm thời gian * Nhược điểm: tốn chi phí đầu tư trang thiết bị, điện năng  Phương pháp ngâm chiết: * Ưu điểm: không tốn chi phí đầu tư trang thiết bị và điện năng * Nhược điểm: mất nhiều thời gian Tuy nhiên, cả 2 phương pháp chiết trên đều chỉ phù hợp với quy mô nhỏ (nghiên cứu phòng thí nghiệm hay sản xuất nhỏ). Do vậy, việc nghiên cứu thiết kế các hệ thống chiết bán liên tục hay liên tục thích hợp cho việc chiết những hợp chất kém bền nhiệt như betacyanin là điều cần thiết để có thể áp dụng quy trình chiết trên trong thực tế. 42 Ngoài ra, cũng cần nghiên cứu chọn dung môi chiết có nhiệt độ sôi thấp hơn có khả năng chiết betacyanin nhằm giúp tránh sự phân hủy betacyanin do kéo dài thời gian cô đuổi dung môi. Trong nghiên cứu này, để rút ngắn thời gian chiết, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết nhờ siêu âm. 3.4. Kết quả khảo sát độ bền màu của dịch chiết betacyanin 3.4.1. Khi không bổ sung vitamin C Hình 3.8 (trang 44) trình bày kết quả khảo sát độ bền màu của dịch chiết betacyanin trong các điều kiện bảo quản khác nhau: - Mẫu 1-sáng: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên - Mẫu 2-0-tối: Bảo quản lạnh (40C), trong tối Qua quan sát bằng mắt cho thấy: khi bảo quản ở nhiệt độ phòng có ánh sáng thì màu đỏ mất dần, thay vào đó là màu vàng nhạt và dần dần mất màu hoàn toàn. Trong khi đó, nếu bảo quản lạnh (40C) trong tối thì màu đỏ có nhạt dần nhưng không đáng kể. Điều này chứng tỏ betacyanin bị phân hủy mạnh khi bảo quản ở điều kiện thường nhưng khá bền ở nhiệt độ thấp trong tối. Kết quả đo cường độ màu của dịch chiết betacyanin cũng đã khẳng định kết luận trên một cách định lượng: sau 1 tuần bảo quản ở điều kiện thường betacyanin đã bị phân hủy gần hết (khoảng 87%), trong khi đó mức độ phân hủy này chỉ khoảng 17% nếu bảo quản ở 40C trong bóng tối. Điều này được giải thích bởi sự tăng tốc độ thủy phân betacyanin dưới tác dụng của ánh sáng và nhiệt, tạo thành betanidin, acid betalamic hay các sản phẩm cấp thấp khác. 43 Độ bền màu của betacyanin khi không bổ sung vitammin C 100,00 53,33 24,33 20,67 16,67 15,00 13,33 12,67 , 96,67 86,67 86,33 85,33 85,00 83,33 83,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) % B et ac ya ni n c òn lạ i Mẫu 1-0-sáng Mẫu 2-0-tối Hình 3.8. Độ bền màu của betacyanin khi chưa bổ sung vitamin C Độ bền màu của betacyanin khi bổ sung 0,01% vitamin C 100,00 76,00 51,00 24,33 20,00 15,00 13,33 12,67 96,67 86,67 86,33 85,33 85,00 83,33 83,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) % B et ac ya ni n cò n lạ i Mẫu 1-sáng Mẫu 1-tối Mẫu 2-tối Hình 3.9. Độ bền màu của betacyanin khi bổ sung 0,01% (w/v) vitamin C 44 3.4.2. Khi bổ sung vitamin C Hình 3.9 (trang 44) trình bày kết quả khảo sát độ bền màu của dịch chiết betacyanin có bổ sung 0,01% (w/v) vitamin C trong các điều kiện bảo quản sau: - Mẫu 1-sáng: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên - Mẫu 1-tối: Bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong tối - Mẫu 2-tối: Bảo quản lạnh (40C), trong tối Kết quả cho thấy: - Ở các mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng: màu đỏ nhạt đi, sau đó chuyển sang vàng và mất màu đi nhanh chóng, tương ứng với sự suy giảm hàm lượng betacyanin rất nhanh. Sự suy giảm này có chậm hơn đối với mẫu bảo quản trong tối nhưng không đáng kể. Như vậy, ánh sáng cũng ảnh hưởng tới độ bền màu của betacyanin nhưng không đáng kể. Ngoài ra, so với mẫu cũng bảo quản ở nhiệt độ phòng nhưng không bổ sung vitamin C thì sự suy giảm hàm lượng betacyanin có chậm hơn một ít. Như vậy, với hàm lượng vitamin C bổ sung là 0,01% (w/v) thì tác dụng kìm hãm tốc độ phân hủy của betacyanin không nhiều. - Đối với mẫu bảo quản lạnh: màu đỏ gần như không thay đổi và hàm lượng betacyanin giảm đi không đáng kể. Sự giảm hàm lượng betacyanin cũng tương tự như mẫu bảo quản ở cùng nhiệt độ nhưng không có vitamin C. Tóm lại, những kết quả khảo sát trên cho thấy : - Nhiệt độ và ánh sáng làm tăng tốc độ phân hủy betacyanin, tuy nhiên nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng nhiều đến tốc độ quá trình phân huỷ nói trên. - Vitamin C có tác dụng làm chậm tốc độ phân hủy betacyanin. Tuy nhiên, tác dụng này chưa nhiều ở nồng độ vitamin C 0,01% (w/v). Do vậy, cần nghiên cứu xác định nồng độ vitamin C thích hợp hơn hay lựa chọn tác nhân acid hữu cơ khác có khả năng kìm hãm tốt hơn sự phân hủy betacynin. 45 Hình 3.10. Mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng Hình 3.11. Mẫu bảo quản ở 40C Những kết quả trên có thể được ứng dụng vào quá trình tách chiết và bảo quản betacyanin: - Khi chiết nên tiến hành ở nhiệt độ thấp nhất có thể được và bổ sung viatmin C hay acid hữu cơ có khả năng kìm hãm sự phân hủy betacyanin - Betacyanin bị phân hủy khá chậm khi bảo quản lạnh (≤ 40C). Do vậy, chỉ nên sử dụng betacyanin để tạo màu cho các thực phẩm được bảo quản lạnh (chẳng hạn kem, bơ, phomat, sữa chua, các loại đồ uống lạnh) 3.5. Hoàn thiện quy trình chiết sản xuất chất màu betacyanin từ vỏ quả thanh long – Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm Từ những khảo sát trên đây, có thể đề xuất quy trình sản xuất chất màu betacyanin từ vỏ thanh long như sau: 46 Hình 3.12. Sơ đồ quy trình sản xuất chất màu betacyanin từ vỏ thanh long - Dung môi: etanol 40% (v/v) + vitamin C 0,01% (w/v) - Dmôi/N.Liệu: 20/1 (v/w) - Phương pháp chiết: Siêu âm: 35 min/lần chiết; 450C ( hay: Ngâm chiết, t0phòng; 6 h/lần) - Chiết 3 lần (trong tối) Bột màu betacyanin Trộn với dung dịch maltodextrin Xử lý thích hợp Lọc Chiết Vỏ thanh long phế thải Dịch chiết betacyanin Cô đuổi dung môi (áp suất thấp; < 400C) Sấy phun Dịch chiết betacyanin thô cô đặc Tinh chế 47  Thuyết minh quy trình * Vỏ thanh long đem cắt bỏ các phần không có màu đỏ (cuống, đầu, tai) và nạo bỏ phần không màu bên trong. Sau đó, cắt thành miếng nhỏ, bảo quản lạnh (- 200C) đến khi chiết. * Khi chiết cứ 1 kg vỏ thanh long tươi thì thêm vào 20 lít etanol 40% (v/v) chứa 0,01% (w/v) vitamin C. Tiến hành chiết betacyanin bằng cách siêu âm trong 35 phút ở 450C (hay ngâm ở nhiệt độ phòng trong 6 h). Sau thời gian trên, gạn lấy dịch chiết và lặp lại quá trình trên thêm 2 lần nữa với phần bã còn lại. Tất cả các thao tác trên đều thực hiện trong bóng tối. * Các dịch chiết betacyanin sau đó được gộp lại, lọc hút chân không để loại bỏ các tạp chất lơ lửng. * Dịch chiết sau đó được đem cô đuổi dung môi bằng thiết bị cô quay dưới áp suất thấp (tốc độ quay: 150 vòng/phút, nhiệt độ không quá 400C) để tránh sự phân hủy betacyanin. Khi cô đặc chú ý giảm áp suất từ từ xuống 100 mbar, sau đó tiếp tục giảm dần xuống 40 mbar để tránh sự sôi trào quá mạnh của dịch chiết gây thất thoát chất màu. * Sau khi đuổi dung môi, thu được dịch chiết thô chứa betacyanin cô đặc * Dịch chiết beacyanin cô đặc có thể được tinh chế bằng cách chiết betacyanin sang cloroform. Sau đó, kết tinh betacyanin bằng cách thêm etanol 3/1 (v/v) và để ở 40C qua đêm. Gạn và rửa tinh thể betacyanin bằng etanol lạnh [9] * Hòa tan betacyanin tinh thể trong nước và bổ sung maltodextrin (tỷ lệ thích hợp) * Sấy phun hỗn hợp betacyanin-maltodextrin để thu bột màu betacyanin. * Tất cả các thao tác trên nên thực hiện trong bóng tối. Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian, kinh phí và trang thiết bị nghiên cứu (thiết bị sấy phun bị hỏng) nên chúng tôi chỉ có thể thu được sản phẩm betacyanin dưới dạng dịch chiết thô cô đặc. 48 Bảng 3.4. Kết quả sản xuất thử nghiệm dịch chiết betacyanin cô đặc Mẫu Lượng mẫu (g) Dịch betacyanin cô đặc thu được (g) Hiệu suất thu nhận betacyanin cô đặc (%) 1 40,000 4,006 10,02 2 40,000 4,052 10,13 3 40,000 3,882 9,71 T.Bình 40,000 3,980 10,01 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu quan trọng của sản phẩm betacyanin cô đặc được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.5. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chất lượng quan trọng của sản phẩm betacyanin cô đặc Chỉ tiêu Kết quả Betacyanin tổng số (mg/kg) 948 Pb (mg/kg) 0,17 Từ kết quả phân tích hàm lượng betacyanin tổng số trong sản phẩm, tính được hiệu suất thu hồi betacyanin của toàn bộ quy trình như sau: Hiệu suất thu hồi betacyanin (%) = %54,86 109 %100. 40 1000. 1000 98,3*948  Hình 3.13. Sản phẩm betacyanin cô đặc thu được 49 Kết luận: Quy trình chiết đã xây dựng cho phép thu nhận betacyanin cô đặc với hiệu suất khá cao (86,54%). Sản phẩm thu được có hàm lượng betacyanin khoảng 948 mg/kg và dư lượng Pb dưới mức cho phép 0,17mg/kg. Do vậy, sản phẩm có thể xem là đạt yêu cầu chất lượng. 3.6. Tính toán sơ bộ giá thành sản phẩm. Bảng 3.6. Ước tính chi phí nguyên vật liệu để chiết betacyanin từ 1000 kg vỏ thanh long Nguyên vật liệu Lượng sử dụng Đơn giá Thành tiên Etanol tuyệt đối 8.000 lít 53.000đ 424.000đ Vitamin C 2 00g 110.000 đ 220.000đ Ngày lao động 2 ngày 50.000đ 100.000đ Điện 5 kWh 2.000đ 10.000đ Nước 3 m3 5.000đ 15.000đ Tổng: 769.000đ Lượng sản phẩm betacyanin cô đặc thu được M = 1000.000.3,98/40 = 99,5 kg Chi phí sản xuất 1 kg sản phẩm là 7.729 đ Nhận xét: Để sản xuất ra 1kg sản phẩm betacyanin cô đặc thì chi phí cho quá rình sản xuất là 7.729 đ 50 KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên đây, có thể đi đến những kết luận sau: 1/ Hàm lượng betacyanin trong vỏ thanh long Hylocereus undatus trồng ở Việt Nam vào khoảng 109 mg/kg, hơi thấp hơn hàm lượng betacyanin trong củ cải đường (bằng khoảng 1/6 – 1/3 lần). 2/ Điều kiện thích hợp cho phép chiết betacyanin từ vỏ thanh long quy mô nhỏ là: chiết bằng phương pháp siêu âm (35 min/lần chiết ở 450C) hay bằng phương pháp ngâm chiết (6 h/lần chiết, nhiệt độ phòng) sử dụng dung môi chiết là etanol 40% (v/v) trộn với vitamin C 0,01% (w/v). Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 20/1 (w/v), số lần chiết là 3 lần. 3/ Dịch chiết betacyanin phân hủy nhanh khi bảo quản ở nhiệt độ phòng nhưng khá bền khi bảo quản ở nhiệt độ thấp (40C). Do vậy, nên sử dụng chất màu này cho mục đích tạo màu cho các thực phầm bảo quản lạnh. 4/ Sản phẩm dịch chiết betacyanin sản xuất thử nghiệm chứa hàm lượng betacyanin khoảng 948 mg/kg với dư lượng Pb dưới ngưỡng cho phép (không quá 2 mg/kg). Sản phẩm thu được có thể sử dụng làm chất màu thực phẩm. 51 Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 1/ Cần nghiên cứu thiết kế và ứng dụng các hệ thống chiết bán liên tục hay liên tục thích hợp cho việc chiết những hợp chất kém bền nhiệt như betacyanin để có thể áp dụng quy trình chiết trên trong thực tế. 2/ Cần nghiên cứu chọn dung môi chiết có nhiệt độ sôi thấp hơn, thích hợp cho việc chiết betacyanin nhằm giúp cho khâu cô đặc dịch chiết được nhanh chóng, dễ dàng hơn, tránh sự phân hủy betacyanin do kéo dài thời gian cô đuổi dung môi. 3/ Cần nghiên cứu phương pháp tinh chế loại bỏ các tạp chất trong sản phẩm betacyanin để tránh ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm được tạo màu. 4/ Cần nghiên cứu sâu hơn về độ bền màu của betacyanin dưới dạng các dạng sản phẩm có hoạt độ nước khác nhau (dạng khô, dạng dịch cô đặc) và những nhiệt độ, bản chất và nồng độ chất bảo quản khác nhau) để chọn được điều kiện chiết và bảo quản betacyanin tốt nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Hoàng Minh Châu (2003), Cơ sở hóa học phân tích, nhà xuất bản KHKT [2]. Nguyễn Thị Cúc (2003), Nghiên cứu thử nghiệm chiết rút chất màu từ ruột bí đỏ, luận văn tốt nghiệp trường Đại Học Nha Trang [3]. Vũ Đăng Đô (1998), Cơ sở lý thuyết các quá trình hóa học, nhà xất bản giáo dục [4]. Nguyễn Thị Hương Giang(2004), Nghiên cứu thử nghiệm chiết rút chất màu thực phẩm từ ruộ tquả bí đỏ bằng dung môi cồn, luận văn tốt nghiệp trường Đại Học Nha Trang [5]. Trần Kim Quy(1987), Kỹ thuật các chất màu, nhà xuất bản TPHCM Tiếng Anh [6]. Alison, D., Paul, C. (2000), Colouring our foods in the last and next millennium, J. Food Sci. & Tech., 35, p.5-22. [7]. Harivaindaran, K.V., Rebecca, O.P.S; Chandran, S. (2008), Study of Optimal Temperature, pH and Stability of Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) Peel for Use as Potential Natural Colorant, Pakistan J. Bio. Sci., 11 (18), 2259 – 2263. [8]. Henriette M.C.A., André N.S., Arthur C.R.S., Kênya C.B. M., Maria I. R.A. (2007), Betacyanin Stability During Processing and Storage of a Microencapsulated Red Beet Extract, American J. Food Tech., Vol 2 (4), 307-312. [9]. Lim Tze Han (2004), Betacyanins from Hylocereus undatus as natural food colorants, Thesis of Master Science, National University of Singapore. [10]. Lima,E.C., Krug, F. J., Arruda, M.A.Z. (1998), Direct determination in sweet fruit-flavoured powder drinks by electrothermal atomic absorption spectrometry, J. Spectrochimica Acta, Part B 53, p.601-611. Internet [11]. [12]. PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục 1 Phương pháp xác định hàm lượng nước của vỏ quả thanh long a) Nguyên tắc : Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi nước hết trong mẫu phân tích. Dựa vào hiệu khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy để tính hàm lượng nước có trong mẫu phân tích. b) Tiến hành: - Chuẩn bị cốc sấy : đem cốc đi rửa để ráo, sau đó sấy ở 105÷1100C trong vòng 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. - Chuẩn bị mẫu: Nguyên liệu được băm nhỏ rồi cân chính xác khoàng 2 g cho vào 3 cốc sấy (đã được xac định khối lượng ở trên). Dùng đũa thủy tinh nhỏ trộn mẫu với Na2SO4 khan đến lúc thấy thành dạng bột rời. Cân cốc có chứa mẫu và đũa (khối lượng G1). Đưa cốc có chứa mẫu và đũa sấy ở 60÷700C trong vòng 2 h, sau đó nâng nhiệt độ lên 105÷1100C và sấy trong vòng 2 h (thỉnh thoảng trộn đều). Lấy mẫu ra, để nguội trong bình hút ẩm và đem cân (khối lượng G2). Lặp lại quá trình sấy vài lần đến khi chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,2 mg. Ghi khối lượng cuối cùng (G2). Hàm lượng nước trong nguyên liệu tinh theo công thức: %H2O = %100.21 G GG  G: khối lượng mẫu; G1: khối lượng mẫu trước khi sấy; G2: khối lượng mẫu sau khi sấy Phụ lục 2. Phương pháp xác định hàm lượng betacyanin tổng số [6] a) Nguyên tắc: Chiết betacyanin từ mẫu phân tích bằng dung môi thích hợp. Đo độ hấp thụ của dịch chiết betacyanin trong etanol ở 538 nm và xác định hàm lượng betacyanin bằng định luật Lambert-Beer. a) Tiến hành Mẫu rắn: Cân chính xác khoảng 1-2 g mẫu phân tích đã cắt nhỏ. Thêm 20 mL nước cất. Siêu âm trong 5 min, ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy dịch chiết, phần bã tiếp tục chiết đến lúc dịch chiết không có màu. Gộp các dịch chiết lại cho vào bình định mức thể tích D mL, thêm nước cất đến vạch. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở 538 nm, cuvet 1 cm trên quang kế UV- Vis, dùng nước cất làm dung dịch so sánh (Nếu dung dịch đặc quá thì pha loãng với hệ số F). Hàm lượng betacyanin tổng số trong mẫu phân tích tính theo công thức:   Gd FDMAkgmgBetacyanin .. ..1000/    Mẫu dung dịch : Lấy chính xác V mL mẫu dịch chiết cho vào bình định mức D mL. Định mức đến vạch bằng nước cất. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở 538 nm, cuvet 1 cm trên quang kế UV- Vis, dùng nước cất làm dung dịch so sánh. Nồng độ betacyanin trong dung dịch phân tích tính theo công thức :   d FMALmgBetacyanin . .1000/    trong đó : A: độ hấp thụ ; D: thể tích bình định mức (mL) F: độ pha loãng ; M: phân tử lượng betacyanin (M = 550 g/mol) : hệ số hấp thụ của betacyanin trong H2O ( = 60000 L/mol.cm) d: bề dày cuvet (d = 1cm); G: khối lượng mẫu (g) Phụ lục 3. Xác định hàm lượng Pb trong dịch chiết betacyanin cô đặc [7] (Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử -AAS) Tiến hành : a) Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Hòa tan 0,7992 g Pb(NO3)2 (Johnson & Mathey) trong 1 lít dung dịch HNO3 1,0% (v/v) để thu được dung dịch chuẩn gốc Pb 1000 mg/L. Từ dung dịch chuẩn gốc Pb, pha chế các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ trong khoảng 0,00 – 20,0 mg/L (dùng dung dịch HNO3 0,2% (v/v) để pha loãng). b) Dựng đường chuẩn : Hút 20,0 µL dung dịch chuẩn và 10 µL dung dịch điều chỉnh chứa Pd 0,05% w/v + Mg(NO3)2 0,03% w/v lần lượt cho vào ống nguyên tử hóa THGA (transversely heated graphite atomizer). Tiến hành nguyên tử hóa theo chương trình nhiệt như sau : Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian nâng nhiệt (s) Thời gian nâng nhiệt (s) Tốc độ dòng của Argon (mL/min) 1 150 5 25 250 2 180 5 25 250 3 600 5 5 250 4 1000 5 20 250 5 1800 0 5 0 6 2400 1 4 250 Ghi độ hấp thụ của các dung dịch ở 283,3 nm sử dụng đèn phát xạ không điện cực EDLI. Dựng đường chuẩn: A = a.C +b c) Phân tích mẫu : Cân chính xác 4 g mẫu (cân phân tích 0,1 mg), hòa tan trong một ít nước cất và acid hóa bằng HNO3 0,2%(v/v) rồi định mức lên 50 mL. Hút 20,0 µL dung dịch mẫu phân tích và 10 µL dung dịch điều chỉnh chứa Pd 0,05% w/v + Mg(NO3)2 0,03% w/v cho vào ống nguyên tử hóa THGA (transversely heated graphite atomizer). Tiến hành nguyên tử hóa theo chương trình nhiệt như trên. Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch. Từ đường chuẩn, tính được nồng độ Pb trong mẫu theo công thức : 4 50. )( (mg/kg) Pb a bAx  Phụ lục 4 Bảng PL4.1. Ảnh hưởng của bản chất dung môi đến hiệu suất chiết Tỷ lệ etanol/nước (%,v/v) Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết được (mg/g) Hiệu suất chiết (%) 0 1,0733 0,217 0,019 17,43 20 0,9877 0,242 0,022 20,18 40 1,0244 0,470 0,042 38,53 60 0,9585 0,315 0,030 27,52 80 1,0376 0,286 0,025 22,94 100 0,9777 0,150 0,014 12,84 Bảng PL4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết betacyanin D.Môi/Ng.liêu (v/w) Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết được (mg/g) Hiệu suất chiết (%) 5/1 0,9853 0,450 0,021 19,20 10/1 0,9898 0,380 0,035 32,28 15/1 1,0247 0,320 0,043 39,39 20/1 1,0272 0,300 0,054 49,12 25/1 1,0328 0,260 0,058 52,92 30/1 1,0859 0,230 0,058 53,43 Bảng PL4.3. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết betacyanin vào số lần siêu âm Số lần siêu âm Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết tổng cộng (mg/g) Hiệu suất chiết (%) 1 1,0457 0,393 0,069 62,98 2 1,0457 0,126 0,091 83,17 3 1,0457 0,010 0,108 99,19 4 1,0457 0,005 0,109 100,00 Bảng PL4.4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hiệu suất chiết betacyanin Thời gian (h) Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết được (mg/g) Hiệu suất chiết (%) 2 1,0113 0,131 0,024 21,79 4 1,0585 0,263 0,046 41,79 6 1,0413 0,283 0,050 45,71 8 0,9928 0,240 0,044 40,66 10 1,0568 0,236 0,041 37,56 12 1,088 0,218 0,037 33,70 Bảng PL4.5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết betacyanin vào số lần ngâm chiết Số lần chiết Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết tổng cộng (mg/g) Hiệu suất chiết (%) 1 1,0775 0,448 0,076 67,47 2 1,0775 0,108 0,095 83,73 3 1,0775 0,095 0,111 98,04 4 1,0775 0,013 0,113 100,00 Bảng PL4.7. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào phương pháp chiết Phương pháp chiết Lượng mẫu G (gam) Độ hấp thụ (A) Betacyanin chiết được (mg/g) Hiệu suất chiết (%) Siêu âm 40,023 0,162 0,107 98,04 Ngâm chiết 40,005 0,159 0,105 96,26 Bảng PL4.8. Kết quả khảo sát độ bền màu của betacyanin khi không bổ sung vitamin C Mẫu 1 (t0phòng, có ánh sáng) Mẫu 2 (40C, trong tối) Thời gian (ngày) Độ hấp thụ (A) Betacyanin (mg/L) % Betacyanin còn lại Độ hấp thụ (A) Betacyanin (mg/L) % Betacyanin còn lại 0 0,300 2,750 100,00 0,300 2,750 100,00 1 0,160 1,467 53,33 0,290 2,658 96,67 2 0,073 0,669 24,33 0,260 2,383 86,67 3 0,062 0,568 20,67 0,259 2,374 86,33 4 0,050 0,458 16,67 0,256 2,347 85,33 5 0,045 0,413 15,00 0,255 2,338 85,00 6 0,040 0,367 13,33 0,250 2,292 83,33 7 0,038 0,348 12,67 0,249 2,283 83,00 Bảng PL4.9. Kết quả khảo sát độ bền màu của betacyanin khi bổ sung vitamin C Mẫu 1 (t0phòng, có ánh sáng) Mẫu 2 (t0phòng, trong tối) Mẫu 3 (40C, trong tối) Thời gian (ngày) Độ hấp thụ (A) BtC (mg/L) % BtC còn lại Độ hấp thụ (A) BtC (mg/L) % BtC còn lại Độ hấp thụ (A) BtC (mg/L) % BtC còn lại 0 0,300 2,75 100,00 0,30 2,75 100,00 0,300 2,75 100,00 1 0,228 2,09 76,00 0,229 2,10 76,33 0,290 2,66 96,67 2 0,153 1,40 51,00 0,154 1,41 51,33 0,260 2,38 86,67 3 0,073 0,67 24,33 0,074 0,68 24,67 0,259 2,37 86,33 4 0,060 0,55 20,00 0,062 0,57 20,67 0,256 2,35 85,33 5 0,045 0,41 15,00 0,058 0,53 19,33 0,255 2,34 85,00 6 0,040 0,37 13,33 0,050 0,46 16,67 0,250 2,29 83,33 7 0,038 0,35 12,67 0,040 0,37 13,33 0,249 2,28 83,00