Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.) Việt Nam

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, việc tìm kiếm, phát hiện và nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật phong phú của nước ta là mối quan tâm chung của các ngành Hoá, Sinh, Y, Dược. Việc khai thác, sử dụng nguồn tài nguyên này trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm có hiệu quả kinh tế cao. Trong vô số loài thực vật ở Việt Nam, cây me thuộc chi Tamarindus của họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của cây me đều được dùng trong cuộc sống quả me mà thành phần hóa học chủ yếu là polysaccharide được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Cho đến thời điểm này tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các thành phần có trong quả me, do vậy quả me là một đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tế. Trên những cơ sở phân tích trên, tác giả và tập thể hướng dẫn lựa chọn đề tài nghiên cứu của luận án là: "Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.) Việt Nam". 2. Mục tiêu của luận án: Xác định thành phần hóa học, cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) có trong quả me. Điều chế được các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa có hoạt tính sinh học cao hơn TSP tự nhiên từ đó góp phần sáng tỏ ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học. 3. Phương pháp nghiên cứu: Luận án được thực hiện trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống các phương pháp nghiên cứu đã được công bố. Cụ thể, phương pháp sắc ký gel (GPC), phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng tĩnh và động, tán xạ tia X góc nhỏ, kính hiển vi điện tử quét, phương pháp thử hoạt tính sinh học 4. Ý nghĩa khoa học của luận án: Lần đầu tiên cấu trúc của TSP từ quả me được nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt bằng cách sử dụng các phương pháp hiện đại trên thế giới trong nghiên cứu cấu trúc của polymer bao gồm phổ NMR, phổ khối ESI-MS,ESI-MS/MS các phương pháp tán xạ ánh sáng 2 tĩnh SLS và động DLS, tán xạ tia X góc nhỏ SAXS, xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của TSP dựa trên cấu trúc hóa học. 5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án: Đã sulfate hóa và acetyl hóa TSP tự nhiên để thu được mẫu biến tính TSPS và TSPA có hoạt tính cao hơn mẫu tự nhiên (Kết quả nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa làm tăng khả năng ly giải cục máu đông, khả năng chống đông tụ máu và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định còn dẫn xuất acetyl hóa làm tăng khả năng oxy hóa so với mẫu TSP tự nhiên). 6. Các kết quả mới của luận án đạt được: - Lần đầu tiên cấu trúc của TSP từ quả me được nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt - Đã xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của TSP dựa trên cấu trúc hóa học. - Hoạt tính sinh học và cấu trúc của mẫu TSP và TSPS với các mức độ sulfate hóa khác nhau đã được nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng của sự sulfate hóa lên cấu trúc và hoạt tính sinh học (Đây cũng là một điểm mới của luận án so với các nghiên cứu trong nước ở cùng lĩnh vực). 7. Cấu trúc của luận án: Luận án gồm 132 trang: Đặt vấn đề 2 trang; Chương 1 – Tổng quan 18 trang; Chương 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17 trang; Chương 3 – Thực nghiệm 18 trang; Chương 4 – Kết quả và thảo luận 48 trang; Kết luận và kiến nghị 3 trang; Danh mục đã công bố của luận án 1 trang; 122 tài liệu tham khảo 13 trang; có 30 bảng biểu và 46 hình ảnh và đồ thị. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) phân lập từ quả me. Quả me được thu hái tại huyện Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 5 năm 2013 và tại huyện Cần Giuộc –Long An vào tháng 7 năm 2014. Cây me có tên khoa học là Tamaridus indica.L. thuộc họ đậu chi Tamaridus, loài T.indica 3 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết tách Chiết tách polysaccharide từ quả me bằng các phương pháp chiết tách thông thường, kết hợp các phương pháp tinh chế, làm sạch đồng thời tham khảo các công bố trên thế giới để đưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của luận án [85,86]. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc 2.2.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Gel Permeation Chromatography (GPC) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó 2.2.2.2 Phương pháp phổ IR. Phổ hồng ngoại xác định sự dao động của nguyên tử trong phân tử. Khi tia hồng ngoại được chiếu qua mẫu, các nhóm nguyên tử trong phân tử mẫu hấp thụ các tia ánh sáng tại các tần số phù hợp với sự dao động của nguyên tử trong phân tử. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharide. 2.2.2.3 . Phương pháp phổ NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid). Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer, đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D-1H-NMR. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC. 2.2.2.4. Phương pháp phổ MS Hiện nay phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật phổ khối nhiều lần (Tandem – mass spectrometers) là công cụ rất hữu hiệu để phân tích 4 cấu trúc chuỗi của polysaccharide. Kỹ thuật MALDI-ToF-MS và ESI– MS là phương pháp hữu hiệu trong việc xác định trọng lượng phân tử xyloglucan và các dẫn xuất sau khi được thủy phân và enzym hóa, hai kỹ thuật này đều thu được dữ liệu nhanh chóng và các phân mảnh nhỏ. 2.2.2.5. Phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Hiện nay các phương pháp tán xạ (LS) là rất hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung dịch. Phương pháp này dựa vào đường cong tán xạ ta có thể biết được các thông số cấu trúc như trọng lượng, kích thước và hình dạng của phân tử chất tan. 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào. Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư và không ung thư in vitro của các mẫu chiết, cũng như để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư. Phép thử này dựa vào khả năng nhuộm màu của SRB (Sulforhodamine B) bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi acid trichloroaxetic (TCA). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. 2.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến chuyển nguyên tử hydrogen hay chuyển e độc thân. Cơ chế hai phép thử này xảy ra đồng thời phụ thuộc vào cấu trúc của chất chống oxy hóa và pH. Phép thử theo cơ chế chuyển nguyên tử hydrogen đựa theo việc đo khả năng của chất chống oxy hóa để quét những gốc tự do bởi sự cho hydrogen. Trong phép thử dựa trên cơ chế chuyển e độc thân, phản ứng được xác định bởi sự khử proton và khả năng ion hóa của nhóm chức (IP), phép thử này phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì giá trị IP càng thấp và tăng sự khử proton. Những hợp chất có IP  45kcal/mol cơ chế phản ứng thường là chuyển e độc thân. Phản ứng chuyển e độc thân thường chậm và chịu ảnh hưởng âm tính bởi những hợp phần vết, chất nhiễu đặc biệt là kim loại 5 2.2.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu của các mẫu thử thông qua đường kính khuếch tán. Các vi sinh vật kiểm định được tiến hành hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dịch thể đặc biệt. Sau đó được pha loãng tới nồng độ thích hợp trước khi tiến hành thử nghiệm. Chất kháng sinh so sánh là Ampicilin, Streptomycin, Amphotericin B hoặc mẫu trắng. 2.2.3.4 Hoạt tính chống đông tụ máu Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại. Đông máu và chống đông là một quá trình rất phức tạp, cả hai hiện tượng này cùng xảy ra, song song tiến triển, nhưng cuối cùng là để nhằm cầm máu, hoặc tránh hiện tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽn mạch máu một khi đã hình thành đủ. Kết quả đánh giá qua quan sát trực quan và dùng pipet hút kiểm tra trạng thái của máu. 2.2.3.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông Hình thành cục máu đông là một phản ứng tự nhiên để cơ thể tự bảo vệ mình. Tuy nhiên, cục máu đông sẽ trở nên rất nguy hiểm nếu hình thành ở bên trong mạch máu. Chúng sẽ di chuyển tới khắp mọi nơi trong cơ thể, lên não làm tắc mạch máu não gây đột quỵ, đến tim thì làm hẹp động mạch vành gây nhồi máu cơ tim, điều này sẽ thực sự nguy hiểm, thậm chí là đe dọa tính mạng Kết quả đánh giá là sự thay đổi khối lượng ly giải huyết khối trước và sau các thí nghiệm. Phần trăm ly giải cục máu đông tính bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và sau ly giải cục máu đông. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Thu hái, định danh và xử lý mẫu quả me 3.1.1 Thu hái và định danh Quả me được thu hái tại vùng Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 5 năm 2013 và tại Cần Giuộc –Long An vào tháng 12 năm 2014. Cây me (có tên khoa học là Tamarindus indica L. trong chi Tamarindus thuộc họ Đậu (Fabaceae)) được giám định bởi TS. Bạch Thị Như Quỳnh - Khoa Kỹ thuật Y học - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng. Tiêu bản số 56891 6 và số 56891A của mẫu quả me được lưu giữ tại Khoa Kỹ thuật Y học - Trường Đại học Y Dược Hải phòng. 3.1.2 Xử lý mẫu Quả me sau khi thu hái được rửa sạch chất bẩn thô dưới vòi nước, rồi sấy tại 60-700C trong 48h, sau đó tách bỏ vỏ, tách riêng phần hạt me và thịt me. Thịt và hạt me được sấy lại tại 600C đến khối lượng không đổi, hạt me được tách bỏ vỏ cứng sau đó được nghiền nhỏ và giữ trong bình hút ẩm. Thịt và hạt me được dùng để chiết tách TSP. 3.2. Xác định thành phần hóa học, chiết tách và tính chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) 3.2.1. Xác định thành phần hóa học Xác định hàm ẩm, protein, chất béo, lượng tro, cacbonhydarate và sợi thô được tiến hành theo phương pháp AOAC thực hiện 03 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm ẩm được xác định bằng phương pháp khối lượng. Chất béo thô được phân tích bằng cách chiết mẫu bột hạt me khô với ether dầu hỏa trong bình chiết Soxhlet. Lượng protein thô có trong mẫu được xác định bằng phương pháp micro- Kjeldahl được cải tiến bởi Cocon và Dian. Phân tích tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-acid sulfuric Xác định lượng tro, sợi thô: Xác định lượng sợi thô theo phương pháp AOCS-AOAC Xác định ượng axit tổng số: Lượng axit tổng được xác định bằng phương pháp trung hòa theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4589:1988. 3.2.2 Chiết tách và tinh chế Tiến hành khảo sát các quy trình chiết tách sau: Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào một lượng bột me, khuấy mạnh để loại màu và các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, quá trình này được lập lại 3 lần thu được bột me màu nâu nhạt. Quy trình 1: Theo quy trình của Rupali Singh và cộng sự. Quy trình 2: Theo Phani Kumar và cộng sự Quy trình 3: Chiết tách TSP theo quy trình của Rao và cộng sự Mẫu sau khi chiết tách được loại bỏ protein theo phương pháp của Oliveira và cộng sự. 7 Sau khi loại protein và lipid mẫu được tiến hành tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO No 68035 SnakeSkin Dialysis Tubing, 10000K của hãng Thermo Scientific - USA để thu được TSP có độ sạch cao. Sơ đồ chiết tách được đưa ra ở Hình 3.1 Hình 3.1. Sơ đồ chiết tách TSP từ hạt quả me 3.3. Điều chế dẫn xuất 3.3.1 Sulfate hóa Tamarind seed polysacchride sulfate được tổng hợp theo phương pháp của Lihong Fan, Xiaolin Chen và cộng sự. Bằng cách thay đổi tỷ lệ tác nhân sulfate hóa (Bảng 3.2), chúng tôi thu được các mẫu TSPS có mức độ sulfate hóa (DS) khác nhau Bảng 3.1. Ký hiệu mẫu và tỉ lệ số mol các chất tạo tác nhân sulfate hóa STT Mẫu nNaHSO3 nNaNO2 1 TSPS1 0.050 0.086 2 TSPS2 0.050 0.059 3 TSPS3 0.050 0.045 4 TSPS4 0.051 0.029 5 TSPS5 0.051 0.016 8 6 TSPS6 0.050 0.007 Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp TSPS Xác định mức độ sulfate hóa: Xác định hàm lượng sulfate của TSP bằng phương pháp phân tích khối lượng. 3.3.2 Acetyl hóa Tamarind seed polysacchride acetyl hóa được tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu và cộng sự theo sơ đồ Hình 3.3 Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp TSPA 9 Tiến hành tổng hợp TSPA có mức độ acety hóa (DA) khác nhau bằng các cho TSP tác dụng với tác nhân acetyl có nồng độ khác nhau trên Bảng 3.2. Bảng 3.2. Ký hiệu mẫu và nồng độ tác nhân acetyl hóa STT Mẫu n(CH3CO)2O 1 TSPA1 0.011 2 TSPA2 0.021 3 TSPA3 0.032 4 TSPA4 0.042 5 TSPA5 0.053 6 TSPA6 0.064 Xác định mức độ acetyl hóa: Xác định hàm lượng acetyl của TSP bằng phương pháp phân tích thể tích theo Luis và cộng sự 3.4 Xác định cấu trúc hóa học 3.4.1. Xác định thành phần đường Để xác định thành phần đường bằng phương pháp HPLC, mẫu TSP được thủy phân hoàn toàn bằng TFA 4M tại nhiệt độ 800C trong thời gian 8h. Phân tích trên hệ thống HPLC Shimazu- Nhật Bản với detector RI, tại Trung tâm Phân tích và Kiểm định – Viện Công nghiệp Thực phẩm. 3.4.2. GPC GPC đo trên máy HPLC Agilent 1100 tại PTN Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP HCM. Với pha động NaNO3 0,1N, detector RI, cột đo TSK G3000-PW, nồng độ mẫu TSP 4,4% (khối lượng). Các dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Jiangshen Workstation. 3.4.2 Phổ IR Phổ hồng ngoại FT-IR được ghi trên máy FT-IR Affinity-1S Shimadzu tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, trong vùng số sóng 4000-400 cm-1. Mẫu được ép viên với KBr. 3.4.3. Phổ NMR Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance III 500MHz tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu được pha trong dung môi D2O +1% 10 CD3COOD với nồng độ 3 mg/ml. DSS được sử dụng làm chất nội chuẩn, đo ở nhiệt độ 70oC với kỹ thuật đo khử tín hiệu nước. 3.4.4. Phổ MS Để tiến hành đo phổ khối, mẫu TSP được thủy phân trong TFA 2M tại nhiệt độ 800C trong thời gian 4h để tạo các oligosaccharide. Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị LTQ Orbitrap XLTM của hãng Thermo SCIENTIFIC tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với nguồn ion hóa phun mù điện tử và kiểu ion hóa dương. 3.4.5. Phương pháp SEM Ảnh SEM được thực hiện trên hệ thiết bị FE-SEM S4800 (Hitachi) tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 3.4.6. Phương pháp LS Thí nghiệm được tiến hành đo tại mỗi 5° trong dải đo từ 30-150 trên thiết bị SLS-6500 & EDLS-9000 tại Đại học Điện- Truyền thông Osaka, Nhật Bản. 3.4.7. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được đo trên máy BL- 10C tại Photon Factory, Tsukuba, Nhật Bản. 3.5. Đánh giá hoạt tính sinh học Các hoạt tính sinh học thường được tiến hành thử nghiệm đối với các polysaccharide tự nhiên và biến tính. Các phương pháp thử đều tuân theo các qui định chung về thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử, mẫu đối chứng, ghi, đọc kết quả, tính toán nồng độ gây đáp ứng. 3.5.1 Hoạt tính gây độc tế bào. Hoạt tính gây độc tế bào được xác định tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. Các dòng tế bào được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L- glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3- 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Chất thử (20 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng (khay 96 11 giếng) để có nồng độ 150 g/ml; 75g/ml; 38 g/ml; 19 g/ml, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 370C, sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 540 nm. Xác định khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử từ đó xác định khả năng ức chế tế bào theo công thức sau: % ức chế tế bào = 100% - % sống sót 3.5.2 Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa tổng và khả năng khử sắt được tiến hành tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Xác định khả năng khử sắt: tiến hành theo phương pháp Zhu và cộng sự [120]. Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml đệm phốt phát pH= 7,2 và 0,2 mL kaliferricyanid 1%. Hỗn hợp được giữ ở 500C trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2mL CCl3COOH 10%. Sau cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp trên và 0,125ml nước cất được đặt vào giếng 96 lỗ cùng với 0,02 mL FeCl3. Độ hấp thụ của hỗn hợp tăng tại bước sóng 655 nm chỉ ra khả năng khử của hỗn hợp. Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Huimin và cộng sự [43]. Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm vào 3 ml chất phản ứng bao gồm (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate và 4 mM amoni molybdat). Để phản ứng tại 950C trong 3 giờ, để nguội đo tại bước sóng 695 nm. Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo axid ascorbic. Xác định hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào: Tách não chuột (chuột thuần chủng dòng BALB/c) và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (pH 7,4), theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-50C. Phản ứng bao gồm 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.2ml các nồng độ mẫu thử và 0.8ml đệm phosphat. Ủ ở 370C/15 phút (tự oxy hóa) hoặc ủ ở 370C trong 5 phút với hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15 mM theo tỉ lệ 1:1). Kết thúc phản ứng bằng 1ml acid tricloacetic 10%. Li tâm lấy dịch trong. Bổ sung 1ml acid thiobarbituric 0.8% ở 1000C trong 15 phút. Cuối cùng làm lạnh các ống nghiệm và tiến hành đo cường độ mầu bằng máy quang phổ ELISA ở bước sóng 532 nm. Chất đối chứng là malonyl dialdehyd (Sigma, USA). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp khuyếch tán đĩa thạch tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha trang theo phương pháp của Vanden; Uchechukwu.U; Nehad.M và cộng sự. Chất đối chứng là Cloramphenicol (10g/đĩa) đối với khuẩn Gr(+), Tetracylin (30g/đĩa) với khuẩn Gr (-) và mẫu trắng (dung môi 12 nước). Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm : Vi khuẩn Gr (-): E. coli (vi khuẩn đại tràng), Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), L.mon. Vi khuẩn Gr (+): Bacillus cereus (đường ruột), Streptococcus faecalis (tiêu hóa), Staphylococcus aureus(tụ cầu khuẩn)- Nâm men: Candida albicans (nấm sinh dục). 3.5.4 Hoạt tính chống đông tụ máu Hoạt tính chống đông tụ máu được tiến hành tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hút 10 µl mẫu nghiên cứu hoặc dextrose hoặc nước cất vào ống eppendof. Hút 50 µl máu chuột (chuột nhắt trắng dòng BALB/c) vào các ống eppendof đã có mẫu thử hoặc aspirin hoặc dextrose hoặc nước cất. Lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng. Ghi thời giam máu bị đông tụ. Dextrose (Sigma) được sử dụng làm đối chứng tham khảo. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.5.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông Hoạt tính ly giải cục máu đông in vitro được tính hành tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện theo phương pháp của Dang, Wang và cộng sự. Lấy 0,5 ml máu từ hốc mắt chuột cho vào mỗi eppendof vô trùng (đã cân trước), ủ ở 37°C trong 45 phút. Sau khi hình thành cục máu đông, hút loại bỏ hết huyết thanh (không làm ảnh hưởng đến cục máu đông đã hình thành). Tiến hành cân các ống eppendof có cục máu đông trước ly giải để xác định trọng lượng cục máu đông theo công thức: “khối lượng cục máu đông trước ly giải = khối lượng của ống chứa cục máu động – khối lượng của ống”. Với mỗi ống eppendof chứa cục máu đông đã được cân trước, thêm vào 100 μl mẫu TSPS (nồng độ 50 mg/ml) TSP (nồng độ 25 mg/ml). Mẫu đối chứng là 100 μl DMSO 100%; đối chứng tham khảo là streptokinase (5 IU). Tất cả các ống đem ủ ở 37°C trong 90 phút và quan sát sự ly giải của cục máu đông. Sau khi ủ, hút loại bỏ chất lỏng và tiến hành cân ống để xác định khối lượng cục máu đông không bị ly giải. Phần trăm ly giải cục máu đông tính bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và sau ly giải cục máu đông. Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần với máu của hai chuột cùng loại. 13 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định thành phần hóa học của hạt và thịt quả me Thành phần hóa học của quả me bào gồm cacbonhydrate, protein, chất béo, lượng tro, sợi thô, axit tổng... các thành phần này bị ảnh hưởng của môi trường phát triển. Kết quả nghiên cứu thành phần chính của thịt và hạt me được đưa ra trên Bảng 4.1 Bảng 4.1 Thành phần chính của quả me Thành phần Me tại Thủy Nguyên- Hải Phòng Me tại Cần Giuộc- Long An Hạt me Thịt me Hạt me Thịt me Hàm ẩm(%) 11.2 20.6 11.2 22.8 Protein(%) 13.0 9.2 18.0 8.9 Chất béo(%) 3.9 0.6 3.1 0.4 Sợi thô(%) 3.0 3.0 4.6 3.7 Tro(%) 2.5 2.4 2.2 3.2 Carbonhydrate(%) 66.4 63.7 60.9 60.2 Axit tổng (mg/100g) - 9.2 - 11.0 Như vậy, loài me đang nghiên cứu có hàm lượng protein và hàm lượng lipid và các thành phần khác là tương đương so với các công bố trên. Thành phần polysaccharide chủ yếu trong hạt và thịt me. So sánh với kết quả phân tích hàm lượng polysaccharide trong hạt và thịt quả me trên thế giới 11, 32, 33 thì mẫu me thu hái tại Thủy Nguyên - Hải Phòng và tại Cần Giuộc – Long An có hàm lượng polysaccharide tương đương. 4.2 Lựa chọn quy trình chiết tách và mẫu nghiên cứu Kết quả hiệu suất chiết tách của TSP từ hạt và thịt của quả me theo 3 quy trình đã nêu trong Phần thực nghiệm được đưa ra trên Bảng 4.2. Kết quả cho thấy hàm lượng TSP thu được tương đối cao, với TSP từ hạt me khoảng 26,2-39,3 %w và từ thịt me là từ 12,6-17,5%w. Bảng 4.2: Hiệu suất chiết tách TSP (%w) Theo quy trình 1 Theo quy trình 2 Theo quy trình 3 Ghi chú TSP từ hạt me 28,0 39,3 38,7 Thu hái tại Thủy Nguyên, Hải Phòng TSP từ thịt quả me 14,5 17,5 16,8 TSP từ hạt me 26,2 36,0 35,7 Thu hái tại Cần Giuộc, TSP từ thịt quả 12,6 16,5 16,2 14 me Long An Kết quả phân tích thành phần đường của TSP trong thịt và hạt me của mẫu thu hái ở Hải Phòng được đưa ra trên Bảng 4.3. Kết quả cho thấy TSP từ thịt và hạt me đều có thành phần đường giống nhau bao gồm 3 loại đường glucose, galactose và xylose với tỷ lệ khác nhau. Kết quả này cũng thể hiện trên sự giống nhau của phổ 1H-NMR của 2 mẫu trên (Hình 4.1) Bảng 4.3. Thành phần đường của TSPchiết từ hạt và thịt me Mẫu Thành phần đường (% mol) Glucose Xylose Galactose TSP (từ hạt me) 1 0,22 0,33 TSP (từ thịt me) 1 0,05 0,17 Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của mẫu TSP chiết từ hạt me a) từ hạt me, b) từ thịt me Trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, một thông số cần kiểm tra là độ đa phân tán và mức độ phân bố trọng lượng phân tử, sắc đồ của phép đo GPC của TSP thu được từ hạt và thịt me được đưa ra trên Hình 4.2. Sắc đồ GPC cho thấy TSP chiết tách từ thịt me có mức độ đa phân tán cao không thích hợp cho việc nghiên cứu cấu trúc do vậy chúng tôi lựa chọn TSP chiết tách từ hạt làm đối tượng nghiên cứu của luận án. Hình 4.2. Sắc đồ GPC của mẫu TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt quả me 15 Thành phần đường của mẫu TSP chiết từ hạt me của 2 mẫu thu hái tại 2 vị trí được đưa ra trên Bảng 4.4. Kết quả cho thấy thành phần đường của hai mẫu TSP chiết tách từ hạt me có nguồn gốc tại Hải Phòng và Long An là gần giống nhau. Do vậy cho các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi lựa chọn mẫu hạt me thu hái tại Hải Phòng. Bảng 4.4. Thành phần đường của TSP TSP (chiết tách từ hạt me) Mẫu me tại Hải Phòng (% mol) Mẫu me tại Long An (% mol) Glucose Xylose Galactose Glucose Xylose Galactose 1 0,33 0,22 1 0,29 0,20 Phổ 1H-NMR của mẫu TSP tách chiết từ hạt me thu hái tại Hải Phòng bằng 3 quy trình khác nhau được đưa ra trên Hình 4.3. Kết quả cho mẫu TSP theo quy trình thấy quy trình 1 và quy trình 3 có độ sạch cao hơn, kết hợp với kết quả về hiệu suất chiết tách (Bảng 4.2), quy trình 3 được chúng tôi lựa chọn để chiết tách TSP cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.3. Xác định cấu trúc của TSP Hiện nay GPC là phương pháp hữu hiệu để xác định trọng lượng phân tử và sự phân bố trọng lượng phân tử của polymer. Kết quả đo GPC cùng với kết quả phân tích thành phần đường của mẫu TSP được đưa ra trên Bảng 4.5. Thành phần đường của TSP từ hạt me thu hái ở Thủy Nguyên –Hải phòng gồm 03 loại đường là glucose, xylose và galactose, với tỷ lệ mol Glc : Xyl : Gal = 1 : 0,33 : 0,22. Với trọng lượng phân tử mẫu TSP thu được là 1,16x106 Da, kết quả này tương tự với các công trình đã công bố là trọng lượng phân tử của TSP từ các nguồn khác nhau nằm trong khoảng từ 115kDa đến 2500kDa [32,33,50]. Bảng 4.5. Trọng lượng phân tử và thành phần đường của TSP Mẫu Kết quả GPC Thành phần đường (%mol) Mw Mw/Mn Glucose Xylose Galacstose TSP 1,16x106Da 4,46 1 0,33 0,22 Phổ IR của TSP từ hạt me (Hình 4.5) thể hiện dao động đặc trưng của các nhóm có mặt trong phân tử TSP, dao động tại 3325 cm-1 thể hiện đặc trưng dao động hóa trị của nhóm -OH; tại tần số 1417 cm-1 và 1396 cm-1 thể hiện đặc trưng dao động δ CH2 trong của glucose và galactose; tại tần số 1078cm-1 thể hiện đặc trưng dao động (C-O), (C-C) đặc trưng của vòng pyranose, tại tần số 999 cm-1 thể hiện dao động (C-O), (C-C) trong liên kết C6(H)-O6, tại tần số 943cm-1 thể hiện dao động nhóm δ (C-1-H), tại tần số 895 cm-1 thể hiện dao động của vòng - amomeric. Kết quả phân tích phổ IR được đưa ra trên Bảng 4.6. Bảng 4.6. Kết quả phân tích thành phần phổ IR của TSP 16 Tần số (cm-1) Nhóm đặc trưng Liên kết 3325 (OH) 1417, 1396 δ CH2 Glucose, galactose 1078 (C-O), (C-C) Vòng 999 (C-O), (C-C) C6(H)-O6 943 δ (C-1-H) 895 Vòng -anomeric Vậy trên phổ IR của mẫu thấy xuất hiện các nhóm dao động đặc trưng của polysaccharide, như có nhóm dao động của liên kết (OH), δ CH2, (C-O), (C-C) của vòng, (C-O), (C-C) của liên kết C-6-H2-O- 6, δ(C-1-H), và dao động của vòng -anomeric, không thấy có nhóm chức acid. Vậy trong phân tử polysaccharide chỉ có liên kết glycoside và nhóm OH của các gốc đường. Phổ 1H và 13C-NMR của TSP được đưa ra ở Hình 4.6a và b. Phổ 1H-NMR cho thấy phổ rất phức tạp với độ rộng vạch lớn và trùng chập, điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp. Tại vùng anomeric của phổ 1H-NMR (từ δ 4,56 - 5,11 ppm) và 13C-NMR (từ δ 101,4 - 106,9 ppm) đều có 4 pic. Các tín hiệu từ δ3.39-4.51 ppm trên phổ 1H-NMR và δ 69,0-77,7ppm trên phổ 13C-NMR là thuộc về proton và carbon vòng pyranose. Các pic ở khoảng δ 62,9-64,2ppm là của carbon ở vị trí C6 của glucose và galactose và C5 của xylose . Các phổ thu được không có các tín hiệu của tạp chất và tín hiệu đặc trưng của protein tại vùng 6,0-7,0 ppm, điều đó chứng tỏ protein đã được loại khỏi mẫu nghiên cứu [24,25]. Phổ COSY của TSP được đưa ra ở Hình 4.7. Trên phổ 1H-NMR cho thấy có 4 tín hiệu ở vùng anomeric tại δ 5,12; 4,93; 4,56 và 4,55 ppm được ký hiệu tương ứng là A, B, C và D. Sự cộng hưởng từ H1 đến H6 của nhóm C, D và H1 đến H5 của nhóm A, B được gán cho các tín hiệu như được chỉ ra trên phổ COSY. Kết hợp với kết quả từ phân tích thành phần đường là TSP gồm 3 loại đường là glucose, galactose và xylose, có thể kết luận rằng C và D là thuộc về glucose và galactose; A và B là thuộc về xylose. Trên cơ sở độ dịch chuyển hóa học của proton, độ dịch chuyển hóa học của tất các cacbon của các đường A, B, C và D đều được gán dựa trên phổ HSQC (Hình 4.8). Trên phổ HSQC, các tín hiệu của C1/H1 tại (106,96/4,56ppm); (105,05 /4,55 ppm) và C6/H6 tại (64,50/3.75–3,95 ppm) là thuộc về C và D (-glucose và -galactose) và C6 của D tồn tại ở cả 2 dạng tham gia và không tham gia liên kết glycoside như được chỉ ra có 2 tín hiệu tại 69.00/3.95ppm và 65.50/3.75ppm. Tín hiệu của C5/H5 tại (64.50/3.60 ppm) được gán cho -xylose. Tín hiệu của C4 (81.00 ppm) và của C6 (69.50 ppm) của -glucose hoặc -galactose, cũng như tín hiệu tại 82.00 ppm của C2 của -xylose đều bị dịch chuyển về phía 17 trường thấp so với các carbon khi không tham gia liên kết glycoside, điều đó chứng tỏ xylose tham gia liên kết glycoside tại vị trí C2 còn glucose và/hoặc galactose tham gia liên kết tại vị trí C4 hoặc C6. Khi so sánh về độ chuyển dịch hóa học vùng anomeric của glucose và galactose thì galactose nằm ở trường thấp hơn, do vậy có thể kết luận D là glucose, điều này cũng phù hợp vì TSP thuộc về lớp chất xyloglucan nên glucose là ở mạch chính sẽ tồn tại ở nhiều trạng thái cả không tham gia liên kết glycoside và tham gia liên kết ở các vị trí khác nhau. Liên kết glycoside được xác định dựa ra trên phổ HMBC (Hình 4.9). Trên phổ HMBC thể hiện mối tương quan giữa H1 của nhóm B (xylose) và C6 của nhóm D (glucose), H6 của nhóm D (glucose) và C1 của nhóm A (xylose) và B (xylose). H1 của nhóm D (glucose) và C4 của nhóm D (glucose), H1 của nhóm C (galactose) và C2 của nhóm A (xylose). Như vậy, qua phân tích phổ NMR kết hợp với phân tích thành phần đường ở trên có thể kết luận rằng TSP có mạch chính là (14)--Glucose với mạch nhánh là -Xylose và -Galactose(12)--Xylose có liên kết (16) với glucose ở mạch chính. Bảng 4.7. Độ dịch chuyển hóa học trên phổ 1H và 13C NMR của TSP (125/500MHz, D2O, δ ppm) Đặc trưng C-1/H-1 C-2/H- 2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H- 5 C-6/H-6 A nhóm -xylose 101.50/ 5,12 82.00/ 3.65 72.00/ 3,92 74.50/ 3.65 64.50/ 3.60 B nhóm cuối không khử -xylose 101.50/ 4.93 74-75/ 3.55 75.50/ 3.72 72.50/ 3.60 64.50/ 3.60 C -Galactose 106.96/ 4.56 72.50/ 3.60 75.50/ 3.70 71-72/ 3.90 72-73/ 3.60 64.50/ 3.75 D -Glucose 105.05/ 4.55 76.00/ 3.40 75.50/ 3.67 81.00/ 3.60 76.00/ 3,80 64.50; 69.00/ 3.75; 3,95 Để nghiên cứu chuỗi trúc của TSP chiết từ hạt me chúng tôi tiến hành phân tích phổ khối ESI-MS của TSP-oligosacharide thu được bằng phương pháp thủy phân TSP được nêu trong phần thực nghiệm. Phổ ESI- MS của TSP-oligosaccharide được đưa ra trên Hình 4.11. Pic cơ sở tại m/z 413 là của [Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1. Pic tại mảnh m/z 457 đươc gán cho [Glc[Xyl]-Glc+H]+1 hay của nhóm [Glc[Xyl-Gal]+H]+1 , pic tại mảnh m/z 615 là của [Glc-Glc-Glc-Glc+H]+1. Pic tại mảnh m/z 1011 gán cho [Glc[Xyl]- Glc[Xyl]-Glc[Xyl] ]-Glc+H]+1. Tín hiệu ở m/z 1077 là của [Glc[Xyl]-Glc[Xyl- 18 Gal]-Glc-Glc]+H]+1 và pic tại mảnh m/z 1224 là của: [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]- Glc[Xyl-Gal] +H]+1 Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1224 pic tại mảnh m/z 525 đặc trưng cho nhóm ion [Glc-Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 631 đặc trưng cho nhóm [Glc-Glc-Glc-Glc-H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 661 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc -3H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 833 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc+2H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 935 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic tại mảnh m/z 1025 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc - 3H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 1157 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl-Gal]- Glc[Xyl] -Glc[Xyl ]-Glc -3H2O+H]+1. Phổ ESI-MS/MS của mảnh tại m/z 1077 đưa ra trên Hình 4.13, pic tại mảnh m/z 401 thể hiện của mảnh [Glc[Xyl-Gal] -3H2O+H]+1 hoặc của pic tại mảnh [Glc[Xyl]-Glc] -3H2O+H]+1 , pic tại mảnh m/z 479 thể hiện của mảnh [Glc-Glc-Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 773 thể hiện đặc trưng của mảnh [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc -5H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 879 thể hiện mảnh [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc] -H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 945 thể hiện mảnh [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc[Xyl] -3H2O+H]+1 và pic tại mảnh m/z 1011 thể hiện mảnh [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+H]+1 . Phổ ESI- MS/MS của mảnh m/z 1011 thu được trên Hình 4.14, hình pic tại mảnh m/z 545 được gán cho nhóm [Glc[-Xyl-Gal]-4H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 879 được gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc-H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 929 được gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc+H]+1, pic tại mảnh m/z 945 được gán cho nhóm [Glc-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]- 3H2O+4H]+1, pic tại mảnh m/z 992 được gán cho nhóm [Glc-Glc[-Xyl]- Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-H2O+H]+1. Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 457 được đưa ra trên Hình 4.15, với pic tại mảnh m/z 200 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc-Glc -6H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 309 thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 337 đặc trưng cho nhóm [Glc-Glc-Glc -6H2O+3H]+1, pic tại mảnh m/z 397 thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc-4H2O+H]+1, tại m/z 439 thể hiện đặc trưng nhóm [Glc- Glc-Glc+3H+]+1. Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 413 được đưa ra trên Hình 4.16, với pic tại mảnh m/z 181 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc+2H]+1, pic tại mảnh m/z 254 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc[Xyl] - 3H2O+3H]+1, pic tại mảnh m/z 309 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 311 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc[Xyl]+H]+1, pic tại mảnh m/z 386 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc- Glc-Glc-3H2O+3H]+1. Các kết quả từ phổ ESI-MS cho phép xác định TSP là một galactoxyloglucan có các tập hợp mảnh chính là -Glc-Glc-Glc-, -Glc- Xyl-Glc, -Glc-Xyl-Gal-... Kết hợp với kết quả phân tích NMR, cấu trúc 19 hóa học của monomer của TSP được đưa ra trên Hình 4.16, theo danh pháp của lớp chất xyloglucan, cấu trúc chuỗi của TSP có dạng GXL. Xyl GlcGlcGlc GalXyl Hình 4.16. Cấu trúc hóa học của monomer của TSP Theo ảnh SEM của TSP thấy cấu trúc bề mặt là hợp chất cao phân tử có dạng vô dịnh hình, kết quả này phù hợp với các công bố trước đây của Jongil Choi [48]. Kết quả phép đo LS được tổng hợp trên Bảng 4.14 Bảng 4.14. Kết quả từ phép đo LS của TSP Mẫu dn/dc (ml/g) Mw x 10-5 Mw/Mn Rg (nm) Rh (nm)  (=Rg/Rh) TSP 0.137 11.55 4.36 211.7 229.4 0.92 Giá trị  của TSP là 0,92 điều đó cho thấy phân tử TSP có dạng hình cầu, đặc điểm hình dạng này tương tự như polysaccharide từ hạt đậu tương và từ hạt lanh [92,122]. Mô phỏng hình dạng của TSP được đưa ra trên Hình 4.19 Hình 4.19. Mô phỏng hình dạng của phân tử TSP Vậy TSP chiết tách từ hạt me là polysaccharide phân nhánh có trọng lượng phân tử là 1.15 x106Da. Trong dung dịch nước phân tử TSP có dạng hình cầu. Cấu trúc không gian của TSP ở kích thước cỡ nano được xác định bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS của dung dịch TSP 0,5% trong nước được biểu diễn qua đường tán xạ và 2 biểu đồ Kratky và Guinier (Hình 4.21 a, b,c). Các dạng biểu đồ là điển hình của polysaccharide trung tính. 20 Qua biểu đồ Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc=1,3nm. Đối với các polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh như carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng 0,4-0,53nm [106,107], điều này cho thấy TSP có mạch nhánh tương đối dài, kết quả này cũng phù hợp với cấu trúc hóa học xác định được theo các phương pháp phổ IR, NMR và ESI- MS ở trên. Kết quả cho thấy đường tán xạ thu được từ thực nghiệm và tính toán dựa trên mô hình cấu trúc phân tử là trùng nhau. Điều đó một lần nữa khẳng định cấu trúc hóa học của TSP là như được đưa ra trên Hình 4.16. Vậy có thể đưa ra nhận định sau về TSP chiết tách từ hạt me Về cấu trúc hóa học: TSP chiết tách từ quả me thu thập tại huyện Thủy Nguyên – Hải Phòng là một polysaccharide mạch nhánh với cấu trúc chuỗi dạng GXL, cấu trúc hóa học của phân tử TSP được đưa ra trên Hình 4.22. Xyl GlcGlcGlc GalXyl n Hình 4.22. Cấu trúc phân tử của TSP Về cấu trúc bề mặt: TSP là chất vô định hình Về cấu trúc không gian: TSP có dạng hình cầu. 4.4. Dẫn xuất TSPS Tiến hành tạo các dẫn xuất TSPS có DS từ 3,3-26,2% Phổ IR của TSPS4 (Hình 4.24) thể hiện dao động đặc trưng của các nhóm có mặt trong phân tử TSP, dao động tại 3335 cm-1 thể hiện dao động đặc trưng của nhóm -OH liên kết hydro; dao động tại 1213 cm-1 thể hiện dao động đặc trưng của nhóm S=O; tại dao động 824 cm-1 thể hiện dao động đặc trưng nhóm sulfate tại C2 và/hoặc C3. Trên phổ 13C-NMR của TSPS4 xuất hiện một pic mới tại δ 69.7ppm, chứng tỏ vị trí C6 của galactose hoặc/và glucose bị thế sulfate, độ chuyển dich hóa học bị chuyển dịch về phía trường yếu 5-6 ppm. Xuất hiện pic tại vùng δ 80-84ppm thể hiện thế sulfate tại vị trí C4, trong khi đó với mẫu không sulfate tại vùng δ 74-78 ppm. Kết quả phổ 13C NMR khẳng định nhóm hydroxyl của glucose và galactose ở vị trí C6 và xylose và/hoặc galactose ở vị trí C4 của TSP đã được thế bằng nhóm sulfate. Kết quả đo tán xạ ánh sáng của 2 mẫu TSP và TSPS4 được đưa ra trên bảng 4.17. 21 Bảng 4.17. Kết quả từ phép đo GPC và LS của TSP và TSPS Sample dn/dc (ml/g) Mw x 10-5 Mw/Mn Rg (nm) Rh (nm)  (=Rg/Rh) TSP 0.137 11.55 4.36 211.7 229.4 0.92 TSPS4 0.161 2.69 1.52 216.6 186.4 1.16 Kết quả cho thấy giá trị  của TSP và TSPS tương ứng là 0.92 và 1.16, điều đó chứng tỏ cả TSP và TSPS4 đều có cấu hình không gian dạng hình cầu. Tuy nhiên sự tăng giá trị Rh khi sulfate hóa có thể được giải thích do việc thay thế một phần các nhóm hydroxyl bằng nhóm sulfate có thể dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian của chuỗi đường trong phân tử TSPS do lực đẩy giữa các nhóm sulfate có thể làm cho cấu trúc không gian của TSPS bị dãn rộng hơn (extended structure) so với TSP. Theo ảnh SEM của TSPS4 thấy cấu trúc bề mặt vẫn là hợp chất cao phân tử nhưng không còn trạng thái vô định hình mà chuyển sang trạng thái tinh thể. Cấu trúc không gian của dẫn xuất sulfate của TSP ở kích thước cỡ nano được xác định bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS của 2 mẫu TSPS1 (DS=8,1%) và TSPS4 (DS=26,2%), nồng độ 0,5% (khối lượng) trong nước được biểu diễn qua đường tán xạ và 2 biểu đồ Kratky và Guinier (Hình 4.27 a, b,c). Qua biểu đồ Kratky thấy sự khác nhau, mẫu TSPS4 có pic ở khoảng góc tán xạ nhỏ q<4 đó là cho thấy dấu hiệu sự có mặt của nhóm mang điện (nhóm sulfate), với mức độ sulfate hóa ít hơn ở TSPS1 thì cường độ pic giảm. 4.5 Dẫn xuất TSPA Tiến hành tạo mẫu acetyl polysaccharide mẫu TSP có DA là 5,2- 7,2%. Phổ IR của TSPA trên Hình 4.28 thể hiện dao động đặc trưng của các nhóm có mặt trong phân tử TSP, dao động tại 3314 cm-1 thể hiện dao động đặc trưng của nhóm -OH, dao động tại 1732 cm-1 thể hiện dao động đặc trưng (C=O) của liên kết (CH3CO), tại tần số 1417 và 1367 cm-1 thể hiện dao động δ CH2 trong nhóm của glucose và galactose, tại tần số 1246 cm-1 thể hiện dao động (C-O) trong liên kết C-O-C, ngoài ra còn có các dao động đặc trưng của C1-H tại tần số 945cm-1 và của vòng polysaccharide của liên kết -anomeric tại tần số 897cm-1. Trên phổ 1H-NMR của TSPA4 (Hình 4.29) thấy các pic ở 2,18 ppm và 180 ppm thể hiện sự có mặt của nhóm O-CH3 và nhóm C=O. Như vây, bằng phổ IR và 1H-NMR khẳng định mẫu TSP đã bị acetyl hóa. 22 Theo ảnh SEM của TSPA4 thấy cấu trúc bề mặt vẫn là hợp chất cao phân tử và không thay đổi trạng thái vô định hình so với mẫu tự nhiên. Cấu trúc không gian của dẫn xuất acetyl của TSP ở kích thước cỡ nano được xác định bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS của dẫn xuất acetyl TSP 0,5% trong nước cho thấy mức độ acetyl không ảnh hưởng gì đến dạng đường tán xạ (Hình 4.27). 4.6. Hoạt tính sinh học và mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của TSP và các dẫn xuất. Hoạt tính độc tế bào được tiến hành thử nghiệm đối với các mẫu TSP chiết từ hạt me và các mẫu TSPS với các dòng tế bào ung thư HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và Hela (ung thư cổ tử cung). Kết quả được đưa ra trên bảng 4.20 Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu đều chưa thể hiện hoạt tính độc tế bào ở khoảng nồng độ nghiên cứu, chỉ có duy nhất mẫu TSPS4 thể hiện hoạt tính yếu. Kết quả thử họat tính oxy hóa được đưa trên bảng 4.21. Kết quả trên cho thấy: Các mẫu nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính khử sắt và hoạt tính chống oxy hóa tổng số. Các mẫu TSPS1, TSPS3, TSPS5, TSPA6 đã thể hiện hoạt tính khử sắt cao hơn mẫu tự nhiên. Các TSPS1, TSPS3, TSPS5, TSPA1, TSPA3, TSPA5, TSPA6 có hoạt tính chống oxy hóa tổng số cao hơn mẫu tự nhiên. Thử peroxy hoá lipid màng tế bào với một số mẫu. Kết quả cho thấy TSPS và TSP đều chưa thể hiện hoạt tính peroxy hoá màng tế bào ở các nồng độ nghiên cứu. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng virut. Mẫu TSPS1, TSPS3, TSPS4, TSPS5 đã thể hiện khả năng kháng các các chủng loại vi khuẩn E. coli, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, riêng mẫu TSPS1, TSPS3, TSPS5 còn thể hiện khả năng kháng chủng vi khuẩn L.mono, Staphylococcus aureu và tốt hơn kháng sinh đối chứng. Tất cả các mẫu đều không kháng chủng vi khuẩn Candida albicans. Trong khi đó mẫu TSP tự nhiên và mẫu TSPA không thể hiện hoạt tính này. Vậy các dẫn xuất sulfate hóa của TSP tự nhiên đều thể hiện được khả năng kháng vi sinh vật tốt, điều này mở ra hướng mới trong quá trình nghiên cứu để tạo ra loại dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên để sử dụng trong y học Kết quả chống đông tụ máu của các mẫu TSPS với các mức độ sulafte hóa khác nhau ở nồng độ 150mg/ml được đưa ra trên Bảng 4.23. Kết quả cho thấy các mẫu có thời gian đông tụ máu khoảng 35-55 phút. 23 Do vậy có thể kết luận dẫn xuất sulfate hóa sẽ làm tăng khả năng chống đông tụ máu, tuy nhiên trong khoảng DS nghiên cứu thì chúng tôi không thấy mối tương quan tỷ lệ giữa mức độ sulfate hóa và khả năng chống đông tụ máu. Trên Bảng 4.24 trên cho thấy mẫu TSPS1 và TSPS4 ở nồng độ nghiên cứu ly giải được khoảng 8,26 và 8,88% cục huyết khối so với đối chứng còn các dẫn xuất acetyl không thể hiện hoạt tính này. Vậy với mẫu sulfate hóa đã làm tăng hoạt tính ly giải cục máu đông so với mẫu tự nhiên, điều này mở ra hướng mới trong quá trình nghiên cứu để tạo ra loại dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên để sử dụng trong huyết học, truyền máu phục vụ cho y học. KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả sau: 1. Đã thu thập và xác định được tên khoa học của 02 mẫu me ở các vùng Thủy Nguyên (Hải Phòng) và Cần Giuộc (Long An)- là hai địa phương có khí hậu, thổ nhưỡng tương đối khác nhau. Đã xác định được độ ẩm, hàm lượng tro và thành phần hóa học chủ yếu có trong hạt và thịt của quả me là protein thô, chất béo thô, tro, sợi thô và carbohydrate. Với luận án này, lần đầu tiên quả me Việt Nam được chọn làm đối tượng nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học. 2. Đã khảo sát 03 quy trình chiết tách để lựa chọn được 01 quy trình tối ưu thu được Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) với độ sạch và hiệu suất cao. 3. Đã nghiên cứu cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt của TSP từ quả me bằng các phương pháp hiện đại bao gồm phổ NMR, phổ khối nhiều lần ESI-MS, các phương pháp tán xạ ánh sáng tĩnh và động SLS, DLS, tán xạ tia X góc nhỏ SAXS. Kết quả cho thấy TSP là một galactoxyloglucan có mạch chính là (14)--Glucan, mạch nhánh là -Xylopyranose và -Galactopyranosyl (12) -- Xylopyranose liên kết (16) với glucose, cấu trúc chuỗi có dạng GXL, cấu trúc không gian có dạng hình cầu và cấu trúc bề mặt có dạng vô định hình. 4. Đã xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của TSP dựa trên cấu trúc hóa học. 5. Đã sulfate hóa và acetyl hóa TSP tự nhiên để thu được mẫu biến tính TSPS và TSPA với mục đích tìm kiếm các mẫu biến tính có hoạt tính cao hơn mẫu tự nhiên, đây cũng là xu hướng nghiên cứu hiện nay trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa làm tăng khả năng ly giải cục máu đông, khả năng chống đông tụ máu và hoạt tính kháng vi 24 sinh vật kiểm định còn dẫn xuất acetyl hóa làm tăng khả năng chống oxy hóa so với mẫu TSP tự nhiên. Đây là kết quả mang ý nghĩa thực tiễn của luận án. 6. Hoạt tính sinh học và cấu trúc của mẫu TSP và TSPS với các mức độ sulfate hóa khác nhau đã được nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng của sự sulfate hóa lên cấu trúc và hoạt tính sinh học. Kết quả nghiên cứu cho thấy; a. Về mặt cấu trúc: sự sulfate hóa có ảnh hưởng đến cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt của mẫu tự nhiên. b. Về mặt hoạt tính sinh học: sự sulfate hóa làm tăng đáng kể hoạt tính sinh học so với mẫu tự nhiên. Tuy nhiên mức độ tăng này không tỷ lệ với mức độ sulfate hóa. Đây là một điểm mới của luận án so với các nghiên cứu trong nước ở cùng lĩnh vực KIẾN NGHỊ Trên cơ sở các kết quả thu được từ luận án, chúng tôi có một số kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ các cây khác thuộc họ đậu của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam. 2. Tiếp tục nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính để làm rõ hơn sự ảnh hưởng của cấu trúc polysaccharide và các dẫn xuất đến hoạt tính sinh học, làm cơ sở để tạo ra các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn mẫu tự nhiên.