Đề tài Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

u: Cứ ½ kg đường tôi nấu với 4 lít nước, và kèm theo một gói trà túi lọc lipton nhãn vàng. Hình 1.6. Trà túi lọc lipton Hình 1.7. Đường saccharose 1.2. Giới thiệu về vi khuẩn ST và LB 1.2.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus 1.2.1.1. Streptococcus thermophillus (ST) Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình cầu đơn hoặc đôi hoặc xếp đuôi nhau tạo thành chuỗi, không di động. Hình 1.8. Streptococcus thermophillus 1.2.1.2. Lactobacillus bulgaricus (LB) Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình que, không di động. Hình 1.9. Lactobacillus bulgaricus 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus Hai chủng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu khí, lên men đồng hình và chịu được nồng độ acid thấp (pH = 4 – 4,5). Cả hai sống cộng sinh với nhau và hỗ trợ lẫn nhau [11,5]. Streptococcus thermophillus Phát triển tốt ở nhiệt độ 500C và sinh sản tốt ở nhiệt độ 37 – 400C, đây là vi khuẩn chịu nhiệt lên men điển hình, có thể chịu được nhiệt độ đun nóng ở 650C trong 30 phút, nhưng chỉ có thể phát triển được trong môi trường acid thấp hơn LB [11,4]. Lactobacillus bulgaricus LB cũng là vi khuẩn lên men điển hình, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 500C, trong môi trường có độ acid cao. Loài này có khả năng tạo ra khối sữa chua 2,7% acid lactic từ đường lactose. Loài LB có khả năng thủy phân casein thành một số acid amin, trong đó việc tạo thành valin là quan trọng nhất, nó như một chất kích thích cho loài ST phát triển. Vì thế trong quá trình lên men sữa chua, việc cấy hỗn hợp hai loài này cho kết quả sinh acid lactic tốt hơn khi cấy riêng từng loài [11,4]. 1.3. Các phương pháp bảo quản vi sinh vật Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật là sau quá trình bảo quản các tính trạng quan trọng của giống không bị mất hoặc bị giảm. Để làm được điều đó, người ta tiến hành các biện pháp dựa trên nguyên tắc làm giảm quá trình trao đổi chất và làm giảm quá trình hô hấp của vi sinh vật, người ta chú ý đến tác động mạnh lên hai quá trình này, trong đó ba yếu tố được quan tâm nhiều nhất là: Nhiệt độ, độ ẩm, lượng không khí tiếp xúc trực tiếp. Ngoài ra còn một số yếu tố khác cũng được quan tâm đúng mức. Để bảo quản vi khuẩn ST và LB người ta thường dùng một trong các số phương pháp sau: 1.3.1. Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh Hầu hết các cơ sở sản xuất và nghiên cứu rất nhiều phương pháp này trong giữ giống vi sinh vật. Nguyên tắc này là dựa trên sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian nhất định. Sau một khoảng thời gian lặp lại công việc trên. Cách này tỏ ra hiệu quả đối với nhiều vi sinh vật [18]. Trước khi đem bảo quản, người ta thường cấy truyền giống vi sinh vật vào 3 – 5 ống nghiệm thạch nghiêng, nuôi chúng ở nhiệt độ thích hợp (thường nuôi ở nhiệt độ 370C) cho đến khi tạo được lượng sinh khối lớn nhất, sau đó bảo quản ở nhiệt độ lạnh khoảng 40C. Sau một tháng cấy truyền và lặp lại như trên. Nếu kéo dài, giống dễ bị thoái hóa vì độ ẩm môi trường thạch rất dễ bị giảm trong quá trinh bảo quản lạnh [18]. 1.3.2. Phương pháp bảo quản đông khô Hình 1.10. Đông khô vi khuẩn Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không [18]. Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: – Tuổi của vi sinh vật bảo quản. – Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật. – Tốc độ đông khô. – Nhiệt độ đông khô thấp nhất. – Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu [18]. 1.3.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Hình 1.11. Bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (–196°C đến –800C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào [18]. 1.3.4. Phương pháp cố định trên chất mang Các tế bào vi sinh vật được bám dính trên chất mang bằng nhiều phương pháp, sau đó mẫu được mang đi sấy khô ở nhiệt độ thích hợp sao cho không làm chết lượng vi sinh vật đã được cố định trên chất mang. Sau đây là một số ví dụ cụ thể: Trên đất, cát và silicagel: Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4 – 5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi [18]. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn [18]. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm [18]. Bảo quản trên BC: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thích hợp. Sau đó bằng phương pháp bẫy – hấp phụ, người ta nhốt vi sinh vật vào trong giá thể BC. Sau đó sấy khô mẫu ở nhiệt độ thích hợp cho từng loài vi khuẩn. Đối với phương pháp bảo quản trên chất mang BC, vi sinh vật được cố định có khả năng bám dính rất cao và nó thích hợp với nhiều loại vi sinh vật như nhiều loài vi khuẩn lactic, nấm men Saccharomyces cerevisae N28 [5]. 1.3.4.1. Các nguyên liệu thường dùng làm chất mang Nguyên liệu tự nhiên: Xơ dừa, vỏ bưởi, táo, cát, đất sét vô trùng, các loại hạt ngũ cốc… Nguyên liệu đã qua xử lý: Aliganate, pectin, kết hợp trên phức chất mang Aliganate – BC, gelatin… 1.3.4.2. Ưu điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do Tế bào sau khi cố định có thể tái sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể ngừng phản ứng theo ý muốn [6]. Có thể vận chuyển và lưu thông dễ dàng, mỗi lần sử dụng không cần phải hoạt hóa lại khi tiến hành lên men sản phẩm. 1.3.4.3. Ưu điểm nổi trội của chất mang BC khi dùng cố định vi khuẩn BC là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, độ tinh khiết cao và rất chủ động được nguyên liệu để sản xuất BC, lên men từ nhiều cơ chất khác nhau [3]. BC hội đủ những điều kiện cần thiết mà một chất mang cần: Không độc, an toàn vệ sinh thực phẩm, đàn hồi, cấu trúc sợi rất phù hợp để vi sinh vật bám trên hệ thống sợi này, BC có khả năng hút ẩm và trữ môi trường tốt nên rất thuận tiện để làm giá thể cho vi khuẩn cố định trên chất mang này [4]. 1.4. Tình hình nghiên cứu và cố định vi khuẩn trên chất mang BC trong và ngoài nước Tình hình nghiên cứu cố định vi sinh vật trên chất mang BC tại Việt Nam ngày càng nhân rộng trên nhiều đối tượng vi sinh vật, hiện tại đã có nhiều đề tài nghiên cứu rất thành công: Đề tài “Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC) trong lĩnh vực thực phẩm” do tác giả Nguyễn Thúy Hương (Đại học Bách Khoa TP.HCM) thực hiện nhằm cố định tế bào vi khuẩn AX trên giá thể cellulose vi khuẩn do chính nó sản xuất ra để chế tạo chế phẩm phục vụ nhân giống nhanh và hiệu quả. “Thu nhận Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococus lactic cố định trên chất mang BC và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu” (Nguyễn Thúy Hương – Trần Thị Tưởng An) trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG – HCM). Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni bằng phức chất mang alginate – bacterial cellulose để ứng dụng lên men malolactic” (Nguyễn Thúy Hương – Thái Thịnh Thượng Trí), Đại học Bách khoa, ĐHQG – HCM. “Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisae N28 bằng chất mang BC và bước đầu ứng dụng trong lên men rượu vang” (Nguyễn Thúy Hương – Bùi Thị Thanh Hương), Đại học Bách khoa, ĐHQG – HCM. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu hóa chất Nguyên liệu Chủng vi khuẩn lactic: Streptococcus thermophillus và Lactobaccillus bulgaricus được phân lập từ canh trường sữa chua vinamilk. Chất mang BC sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum. Môi trường tuyển chọn để hoạt hóa hai chủng vi khuẩn lactic trên trong bảng 1.1 phụ lục. Sữa đặc có đường, nước giếng tốt. Hóa chất NaOH 10%, NaOH 0,1N, HCl, thuốc nhuộm xanh metylen, cồn 960, giấy pH, phenolphtalein, giấy lọc, nước cất, bông thấm nước và không thấm nước. 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thường dùng – Các dụng cụ thường dùng như: Ống nghiệm, đĩa petri, pipet, bình tam giác, que gạt, ống thủy tinh, ống cao su, buret 25ml, cốc thủy tinh… tủ sấy ở 120 – 1600C. – Bếp điện, đèn cồn, que cấy, lưới amiăng, tủ sấy, nồi hấp vô trùng. – Cân phân tích và cân kỹ thuật. – Tủ ấm: Có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy khoảng 25 – 280C và 370C, thường dùng để nuôi dưỡng các chủng vi sinh vật làm giống trong sản xuất, kiểm tra vô trùng và kiểm tra các loại vi sinh vật tạp nhiễm. – Tủ lạnh: Để giữ giống, giữ các dung dịch nuôi cấy chưa các kịp kiểm tra, giữ các mẫu sản phẩm… Chú ý các thiết bị và dụng cụ cần phải được khử trùng. Các dụng cụ sau khi rửa sạch. Phương pháp khử trùng các dụng cụ này là bằng không khí nóng trong các tủ sấy ở 120 – 1600C. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp cố định vi khuẩn ST và LT trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy – hấp phụ Trên chất mang BC (kích thước 2cm*2cm*1cm) – sau khi sấy, tế bào vi khuẩn: Streptococcus thermophillus và Lactobaccillus bulgaricus được hấp phụ vào chất mang bằng phương pháp bẫy – hấp phụ (gồm 2 giai đoạn: Hấp phụ vi khẩn lactic trên bề mặt BC và bẫy tăng sinh trên và trong chất mang BC). Cụ thể gồm các bước như sau: Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bổ sung chất mang BC vô trùng vào dịch tế bào đã hoạt hóa Quá trình cố định tế bào trên chất mang BC sẽ trải qua hai giai đoạn liên tiếp: Giai đoạn hấp phụ: Trong khoảng 30 phút đầu tiên, sau khi ngâm BC trong dịch tế bào, BC sẽ trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vi khuẩn vào hệ thống sợi bên trong và bên ngoài. Trong giai đoạn hấp phụ, trong quá trình ngâm sẽ sử dụng thêm máy cánh khuấy để gia tăng mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang trong thời gian trương nở. Tiến hành khuấy trong 30 phút. Giai đoạn bẫy tăng sinh: Kế tiếp giai đoạn hấp phụ, tách BC ra khỏi dịch huyền phù vi khuẩn, các tế bào đã được hấp phụ ở giai đoạn trên sẽ tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC khi ủ ở nhiệt độ và thời gian tối ưu của giống vi sinh vật cố định. Giai đoạn này ta sẽ nhốt thêm 1 lượng lớn tế bào trong chất mang BC. 2.2.2. Phương pháp vi sinh 2.2.2.1. Phương pháp định lượng vi khuẩn bằng cách đếm khuẩn lạc Trước tiên, tiến hành ngâm mẫu trong dịch huyền phù vi khuẩn, rồi tiến hành mang đi ủ sau giai đoạn ủ ta tiến hành xác định lượng tế bào bằng phương pháp sau: Sấy lại mẫu đã cố định sau thời gian ủ ở 380C nghiền mẫu trong điều kiện vô trùng tiến hành pha loãng thập phân đến 10–9 Ghi vào đáy đĩa petri có môi trường thạch các thông tin: . Nồng độ pha loãng . Ngày cấy Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt quá vài trăm. Khi tất cả các thể tích 0,1ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch. Que cấy gạt thủy tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào đĩa petri tiếp theo, bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để lại đi lượng cồn dư bám trên que cấy, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách chạm nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó. Nếu thể tích chất lỏng đem cấy quá nhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong chất lỏng và sau khi phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào có thể hình thành. Các đĩa thạch được chuẩn bị một ngày trước khi cấy thường hấp thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy. Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh. Sau khi đã cấy mẫu vào môi trường, để cho bề mặt thạch khô, đem đĩa vào trong tủ ấm và đặt úp ngược để tránh gây nhiễm do chất lỏng ứa ra từ mặt trên của thạch khi đĩa vừa ấm lên, đồng thời tránh các giọt nước ngưng tụ dưới nắp đĩa rơi xuống bề mặt thạch. Tiến hành đếm: Khi kết thúc thời gian ủ, đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch như sau: – Lấy bút chì két hai đường vuông góc dưới đáy đĩa petri và đánh dấu thứ tự từng vùng 1, 2, 3, 4. – Đếm số khuẩn lạc trong từng vùng. Đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm. – Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1ml mẫu được tính theo công thức sau: Số tế bào/ml mẫu = Trong đó: n: Số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa petri ở một độ pha loãng nhất định. V: Thể tích dịch mẫu đem cấy (bằng 0,1ml đối với phương pháp cấy gạt và 1ml đối với phương pháp đổ đĩa) D: hệ số pha loãng 2.2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn ST và LB a. Thiết lập quy trình thí nghiệm (hình 2.1) b. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ + Pha loãng ở nồng độ cần thiết. + Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường đã làm. + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch. + Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri + Đặt các đĩa petri trên vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C sau một thời gian 2 ngày ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa. c. Kiểm tra độ tinh khiết của giống gốc Có nhiều cách kiểm tra: Kiểm tra vết cấy: Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc. + Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ. Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc: + Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. + Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. + Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường. + Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. + Đặt các đĩa petri trên vào tủ ấm với nhiệt độ 370C và thời gian 48 – 72 giờ. + Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống. Giống vi khuẩn ST Cấy giống lên đĩa có môi trường dinh dưỡng thích hợp Nuôi trong tủ ấm ở 370C Kiểm tra sự thuần khiết của giống Giống vi khuẩn LB Cấy chuyền sang ống nghiệm Phân lập Sữa chua vinamilk Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn ST và LB Kiểm tra hình dạng tế bào bằng cách soi trên kính hiển vi Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. Cách nhuộm: + Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính. + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. + Đậy lá kính lên giọt dịch. + Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40). Sau khi thu nhận được hai chủng thuần khiết tiến hành cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu. 2.2.2.3. Phương pháp đo sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic bằng cách đo chỉ số OD trên máy quang phổ UV – Vis Cơ sở của phương pháp Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic, tốc đọ sinh trưởng và phát triển của chúng được xác định gián tiếp thông qua độ đục của môi trường nuôi cấy. Độ đục tỷ lệ với mật độ tế bào, số lượng tế bào càng nhiều độ đục càng cao. Khi một pha lỏng có chứa cấu tử không tan tạo nên hệ huyền phù có độ đục, chúng có tác dụng cản trở ánh sáng, làm phát tán chùm sáng tới. Vì vậy, có thể dựa vào độ đục để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Chuẩn bị mẫu: Lấy 70 ml môi trường lỏng chứa trong bình tam giác, cấy một vòng que vi khuẩn. Đậy chặt bằng nút bông và bao gói kĩ giống như bảo quản giống trong ống nghiệm. Chuẩn bị thêm 1 mẫu trắng để làm mẫu chuẩn. Cách tiến hành: Cho vi khuẩn lactic vào bình tam giác chứa 100ml môi trường dinh dưỡng trong bảng 1.1 phụ lục và môi trường dinh dưỡng trong bảng 1.1 phụ lục không agar. Mẫu chuẩn là mẫu chứa môi trường mà không có vi sinh vật. Cài đặt bước sóng cần đo là 600 nm. Tiến hành đo mật độ quang lần thứ nhất của dung dịch. Phần còn lại tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 280C và cứ sau 3 giờ thì lại lấy mẫu và đo một lần. 2.2.3. Phương pháp hóa sinh Hoạt lực của vi khuẩn sau cố định được xác đinh bởi năng lực lên men sữa chua, đó chính là khả năng sinh acid lactic. Sẽ tiến hành lên men sữa chua theo quy trình công nghệ ở hình 2.2, từ đó xác định được khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn lactic được cố định trên chất mang BC sau thời gian bảo quản bằng phương pháp chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. 2.2.4. Phương pháp phân tích hóa học Xác định lượng acid lactic sinh ra Nguyên lý: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH 0,1N hoặc KOH) để trung hoà hết các acid trong thực phẩm, với phenolphtalein làm chỉ thị màu. Cách tiến hành: Cân 10 gam mẫu (hoặc 10 ml sữa), thêm 20 ml nước cất và làm đồng nhất mẫu, sau đó định phân mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N với chất chỉ thị màu là phenolphtalein 1% trong cồn. Tính kết quả Kết quả được tính theo công thức: X(%) = K*V*100/P Trong đó: X: Hàm lượng acid lactic sinh ra (%) K: Hệ số sử dụng cho từng loại acid (K = 0,009) V: Thể tích NaOH 0,1N P: Khối lượng hoặc thể tích mẫu 2.2.5. Phương pháp bảo quản vi khuẩn được cố định trên chất mang BC Nguyên tắc: Tiến hành sấy khô sản phẩm sau cố định ở nhiệt độ 400C, tiến hành sấy ở nhiệt độ sao cho lượng tế bào vi khuẩn không bị chết đi trong quá trình sấy. Khảo sát các phương pháp bảo quản mẫu để lượng vi sinh vật trên chất mang bị chết đi là ít nhất. Cách tiến hành: Tiến hành đóng gói sản phẩm, cho vào hộp nhựa kín và dùng parafin nóng chảy hàn kín miệng để tránh sản phẩm bị ẩm trở lại. Tiến hành bảo quản mẫu: Tham khảo các nghiên cứu trước đây và các phương pháp bảo quản vi sinh vật, em sẽ tiến hành bảo quản chế phẩm vi khuẩn lactic ở nhiệt độ 40C. Sau khoảng thời gian bảo quản là 1 tháng và các khoảng thời gian dài hơn, em sẽ tiến hành hoạt hóa lại mẫu để kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trên chất mang trên chất mang BC. Từ đó em sẽ rút ra đánh giá phương pháp bảo quản đã tiến hành. Phương pháp công nghệ 2.3.1. Lên men sữa chua Sản phẩm sữa chua sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC được lên men theo quy trình công nghệ được thể hiện trong hình 2.2. Thuyết minh quy trình: Sữa đặc có đường được được phối chế với nước sôi ấm, với tỷ lệ sữa và nước là 1:2. Sau đó sữa được gia nhiệt đến 700C rồi tiến hành làm nguội đến 390C. Tiếp theo ta bắt đầu cho giống ST vào dịch sữa, một giờ sau ta tiến hành bổ sung LB vào dịch sữa, nhiệt độ lên men luôn giữ ở 390C. Trong quá trình lên men ta theo dõi hàm lượng acid lactic sinh ra theo thời gian, đến khi độ acid dừng đạt 0,9 – 1 % ta dừng quá trình lên men và cho sản phẩm sang công đoạn ổn định lạnh ở 180C trong thời gian 40 phút để ổn định cấu trúc gel của yaourt, tránh hiện tượng tách huyết thanh sữa trong sản phẩm làm mất giá trị cảm quan. 2.3.2. Lên men tạo ra cellulose Tiến hành lên men với nguyên liệu trong bảng 1.2 phụ lục, cho đường và nước giếng tốt vào đun sôi, tiếp đến cho trà túi lọc lipton vào đun cùng cho trà hòa tan hết chất chiết của trà vào dịch lên men và điều chỉnh pH cũng như nồng độ Bx cho phù hợp, sau đó thanh trùng môi trường ở 1000C trong 15 phút và làm nguội đến 300C, tiếp đó sẽ cho vi khuẩn AX vào và lên men trong tủ ấm để theo dõi quá trình lên men. Tỷ lệ của sữa và nước là 1:2 Bổ sung ST Gia nhiệt Ổn định lạnh Làm nguội Phối chế Lên men Bảo quản (40C) Sữa đặc có đường (700C) (390C) (390C) Làm nguội dần sau đó ổn định ở 180C Độ axit dừng 0,9 – 1 % axit lactic 1h sau bổ sung LB 40 phút Hình 2.2. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sữa chua 2.4. Phương pháp bảo quản vi khuẩn được cố định trên chất mang BC Sau khi thu nhận được chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC, em sẽ tiến hành sang giai đoạn bảo quản giống. Nguyên tắc bảo quản là làm sao lượng tế bào vi khuẩn trên chất mang BC bị chết đi là ít nhất. Cách tiến hành: Tiến hành đóng gói sản phẩm, cho bao nilon hàn kín miệng bao và tiếp tục vào hộp nhựa kín và dùng parafin hàn kín miệng hộp để tránh sản phẩm bị ẩm trở lại. Tiến hành bảo quản mẫu: - Tham khảo các tài liệu nghiên cứu trước đây tôi đã chọn nhiệt độ bảo quản mẫu là 40C. - Sau các mốc thời gian bảo quản tôi sẽ tiến hành hoạt hóa lại mẫu để kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trên chất mang này đồng thời kiểm tra hoạt lực của vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản. - Từ đó tôi sẽ tiến hành đánh giá phương pháp của mình. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu bằng chương trình exel. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập ST và LT từ sữa chua vinamilk Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết [9,37]. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ một tế bào ban đầu [9,37]. Sữa chua vinamilk là một thương hiệu nổi tiếng và uy tín trên thị trường và chứa nhiều 2 chủng vi khuẩn ST và LB tôi cần phân lập. Nên tôi đã lựa chọn canh trường sữa chua vinamilk để tiến hành phân lập 2 loài vi khuẩn ST và LB. Từ canh trường đã lựa chọn ta tiến hành phân lập theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.2.2.2 trên môi trường đã lựa chọn ở bảng 1.2 phụ lục. Kết hợp với những kiến thức đã biết về vi khuẩn, trong cùng một độ pha loãng chỉ chọn các khuẩn lạc có kích thước lớn để tiến hành nghiên cứu. Kích thước của khuẩn lạc lúc này đặc trưng cho khả năng phát triển của chủng vi khuẩn lactic tương ứng trên môi trường phân lập. Vì trong cùng một điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, thành phần môi trường) thì khuẩn lạc nào cho kích thước lớn hơn thì khả năng phát triển của nó tốt hơn. Tiến hành pha loãng và gieo mẫu sữa chua trên môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục. Kết quả thu được khuẩn lạc của hỗn hợp hai chủng vi khuẩn ST và LB có hình dạng bên ngoài được ghi nhận lại trong hình 3.1. Hình 3.1. Khuẩn lạc hỗn hợp hai vi khuẩn ST và LB từ sữa chua vinamilk Sau khi thu nhận được hỗn hợp hai chủng vi khuẩn ST và LB, tôi đã dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc điển hình làm tiêu bản, nhuộm tế bào bằng dung dịch xanh metylen như mục 2.2.2.2 sau đó soi trên kính hiển vi để nhận dạng hình thái tế bào của hai chủng vi khuẩn lactic. Sau khi soi xong kết hợp với một số tài liệu đã nghiên cứu trước đây tôi khẳng định rằng đây là 2 chủng vi khuẩn lactic tôi cần phân lập. (1) (2) Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn ST (1) và LB (2) đã thuần khiết Kết quả tôi tiến hành phân lập được 2 chủng vi khuẩn LB và ST được tổng hợp lại trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 2 vi khuẩn LB và ST STT Loài vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc (Hình dạng, màu sắc, bề mặt, độ đặc) Hình thái tế bào 1 ST Hình tròn, màu trắng đục,mép nhẵn, bóng, không nhớt, mặt hơi lồi và bám chặt trên môi trường phân lập. Hình cầu, xếp chuỗi liên tiếp nhau, không di động. 2 LB Hình que, không di động. Nhận xét: Khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn ST và LB có những đặc điểm chung về hình thái, nhưng hình thái tế bào lại khác nhau [bảng 3.1] vì thế chúng tôi đã dễ dàng phân lập bằng phương pháp làm tiêu bản, nhuộm tế bào bằng dung dịch xanh metylen và soi trên kính hiển vi. Sau khi phân lập được hai chủng vi khuẩn ST và LB thuần khiết tôi đã tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm để tiến hành bảo quản và giữ giống phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Hình 3.3. Hình ảnh ống giống của chủng ST Hình 3.4. Hình ảnh ống giống của chủng LB 3.2. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ST và LT bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) trên máy quang phổ UV – Vis Tiến hành nuôi hai chủng vi khuẩn ST và LB trong các bình tam giác có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp trong bảng 1.1 phụ lục (không có chứa agar) ở điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi ở nhiệt độ 280C để vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển trong môi trường dinh dưỡng. Cứ sau khoảng thời gian 3 giờ, tôi tiến hành đo mật độ quang (OD) một lần ở bước sóng 600 nm trên máy UV – Vis để biết được thời gian lấy mẫu và tiến hành ủ vi khuẩn lactic trên chất mang BC. Tiến hành đo sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn LB và ST trong 72 giờ theo phương pháp ở mục [2.2.2.3] để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của hai chủng vi khuẩn ST và LB. Kết quả đo OD đối với hai chủng vi khuẩn ST và LB được biểu diễn bằng hình 3.5. Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của 2 chủng LB và ST trong 72 h Sự sinh trưởng và phát triển của 2 loài vi khuẩn ST và LB tuân theo 1 quy luật và chia làm 4 pha nối tiếp nhau như sau: Pha mở đầu: Cả hai chủng vi khuẩn ST và LB, giai đoạn này kéo dài 3 giờ. Đây là giai đoạn vi khuẩn bắt đầu thích nghi với điều kiện môi trường nuôi cấy mới và sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể. Pha logarit: Cả hai chủng vi khuẩn ST và LB, sau 3 giờ bắt đầu vào pha tăng trưởng, giai đoạn này kéo dài 51 giờ. Trong pha này vi khuẩn phát triển và sinh trưởng theo lũy thừa. Giai đoạn này kích thước tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý nói chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được coi là những “tế bào tiêu chuẩn”. Pha ổn định: Hai chủng vi khuẩn bắt đầu ổn định ở 51 giờ, giai đoạn này kéo dài được 3 giờ, đạt cực đại ở 54 giờ và bắt đầu giảm mạnh sau 54 giờ. Và chuyển sang pha tử vong. Trong pha này tế bào ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Đây là giai đoạn mật độ tế bào đã đạt cực đại, tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Pha suy vong: Mật độ tế bào của hai chủng vi khuẩn lactic bắt đầu giảm mạnh sau thời gian là 54 giờ, giai đoạn này xảy ra là do 2 yếu tố : Môi trường bị cạn thức ăn, môi trường bị nhiễm độc do các sản phẩm trao đổi chất của tế bào. Nhận xét: Từ hình 3.5 trên ta nhận thấy được vi khuẩn ST có tốc độ sinh trưởng và phát triển mạnh hơn LB rất nhiều khi chúng ta nuôi cấy với cùng một lượng giống và nuôi trong điều kiện môi trường và nhiệt độ như nhau. Từ kết quả đo được, vậy ở nhiệt độ thường thời gian mật độ vi khuẩn lactic đạt cực đại là 54 giờ, và sau khoảng thời gian này vi khuẩn bắt đầu giảm mạnh do môi trường nuôi cấy bị cạn thức ăn. Từ kết quả trên ta chọn được thời điểm để lấy mẫu cố định tế bào vi khuẩn ST và LB là: Chọn thời gian ủ và nuôi vi khuẩn trong dịch tế bào để cho vi khuẩn lactic tăng sinh nhằm đạt được mật độ cực đại là 54 giờ. 3.3. Kết quả thu nhận BC 3.3.1. Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy Tiến hành lên men tạo ra khối cellulose với tác nhân vi khuẩn AX và sử dụng nguồn cơ chất chủ yếu là đường saccharose bằng phương pháp công nghệ như đã trình bày trong mục 2.3.2 với thành phần nguyên liệu trong bảng 1.2 phụ lục. Tiến hành lên men nổi trong thời gian 15 ngày với các thông số lên men: nhiệt độ là 300C, tương ứng với nồng độ Bx là 11,5 – 12, điều chỉnh pH = 5. Kết quả thu nhận khối lượng BC trong quá trình nghiên cứu được ghi nhận lại trong hình 3.6. Trong quá trình lên men tạo ra cellulose từ vi khuẩn AX tôi đã sử dụng thêm trà túi lọc lipton để tăng khả năng lên men tạo ra BC bởi nó có bản chất là nấm chè, bên cạnh đó tôi lựa chọn trà túi lọc này vì nó tiện lợi trong quá trình thao tác và lấy ra khỏi môi trường lên men một cách dễ dàng so với các loại chè xanh hay các loại trà khác. Hình 3.6. Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy Nhận xét: BC rất dai và có độ chịu lực cao, đàn hồi, rất thích hợp để cố định vi khuẩn lactic trên giá thể của BC. Kết quả lên men thu nhận khối lượng BC được thể hiện cụ thể trong hình 3.7. Hình 3.7. Khối lượng BC tạo thành ở các mốc thời gian Trong thời gian lên men màng BC, tôi đã quan sát thấy rằng, thời gian đầu để vi khuẩn AX thích ứng với môi trường lên men mới nên màng BC xuất hiện rất mỏng với khối lượng không đáng kể. Đến ngày thứ 8 trở đi màng BC tăng rất nhanh và dần đạt đến giá cực đại ở ngày thứ 15, đến ngày thứ 16 và 17 lượng khối lượng màng BC tăng lên không đáng kể. Do đó đến ngày thứ 15, tôi kết thúc quá trình lên men, thu nhận khối lượng BC. Nhận xét: Từ kết quả trên ta chọn được thời gian thu nhận BC từ môi trường lên men nổi là 15 ngày, nhiệt độ là 300C, tương ứng với nồng độ Bx là 11,5 – 12, điều chỉnh pH = 5. 3.3.2. Xử lý BC Màng BC sau khi vớt ra từ môi trường nuôi cấy, tiến hành rửa bằng nước cất để nguội, sấy ở 1050C trong thời gian 8 giờ để chuẩn bị cho quá trình bẫy hấp phụ. Màng BC sau khi xử lý được ghi nhận lại trong hình 3.8. Hình 3.8. Màng BC sau khi sấy Nhận xét: Chất mang BC sau khi sấy: Mỏng, đàn hồi, có khả năng chịu lực cao khi chịu tác dụng của nhiệt độ, hay tiến hành ngâm vào dịch tế bào khi kết hợp dùng cánh khuấy. Mặc khác nó rất mỏng và nhẹ nên rất dễ dàng bảo quản, lưu thông phục vụ cho nhu cầu sử dụng với khối lượng lớn. 3.4. Cố định ST và LT trên chất mang BC 3.4.1. Ngâm BC BC sau quá trình sấy, tiến hành cắt nhỏ theo tỷ lệ dài*rộng = 2 cm*2 cm nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc của vi khuẩn lactic đến chất mang BC giúp cho giai đoạn hấp phụ đạt được hiệu suất cao nhất, sau đó ngâm BC trong dịch huyền phù vi khuẩn. Trong quá tình ngâm tôi đã kết hợp sử dụng cánh khuấy để tăng khả năng hấp phụ thay vì ngâm đơn thuần như phương pháp cổ điển trong 30 phút [4]. Trong quá trình ngâm, quan sát thấy rằng khi sử dụng phương pháp ngâm đơn thuần BC phải mất thời gian rất lâu, khoảng 4 giờ đồng hồ mới trương nở về trạng thái ban đầu, trong khi đó khi sử dụng kết hợp với cánh khuấy thời gian BC trương nở về trạng thái ban đầu được rút ngắn trong 30 phút. Bên cạnh đó cánh khuấy còn có tác dụng như một máy massage, lúc này dịch huyền phù giống như một gia vị, còn chất mang BC giống như một nguyên liệu cần ướp gia vị, cánh khuấy có tác dụng tăng khả năng hấp phụ tế bào vi khuẩn lactic vào trong giá thể BC một cách nhanh chóng. 2 1 Hình 3.9. BC trước khi ngâm (1) và sau khi ngâm dịch vi khuẩn (2) Nhận xét: BC trước khi ngâm: Mỏng, sau khi ngâm đã trương nở về trạng thái ban đầu đồng thời quá trình ngâm sẽ hấp phụ được một lượng lớn vi khuẩn lactic vào trong hệ thống sợi cellulose và được hệ thống sợi này giữ lại cùng với các thành phần dinh dưỡng. 3.4.2. Khảo sát nhiệt độ ủ và thời gian ủ Nhiệt độ trong thời gian ủ của quá trình bẫy – hấp phụ chính là nhiệt độ cần thiết để tăng sinh khối vi khuẩn lactic trên giá thể BC, nhằm nhốt thêm 1 lượng lớn tế bào trong chất mang BC. Tiến hành khảo sát với 7 mức nhiệt độ sau 260C, 320C, 340C, 360C, 380C, 390C, 400C tương ứng với thời gian ủ cố định là 54 giờ (dựa vào kết quả đo trong mục 3.2). Thời gian ủ chính là thời gian vi khuẩn lactic tăng sinh trên giá thể BC để nhốt thêm một lượng lớn tế bào vi khuẩn trong mạng lưới cellulose sau quá trình hấp phụ. Thời gian ủ kéo dài phụ thuộc vào đặc điểm sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic cố định. Trong đề tài này em đã lựa chọn thời gian ủ cố định là 54 giờ, vì theo kết quả đo OD trong hình 3.5, ta dễ dàng thấy rằng mật độ vi khuẩn lactic đạt cực đại lúc 54 giờ, vì thế em đã chọn mốc thời gian này để cố định việc ủ để nhốt thêm một lượng lớn tế bào vi khuẩn lactic trên giá thể BC. Dựa vào một số kết quả nghiên cứu khi tiến hành sấy vi sinh vật và tài liệu tham khảo về hai chủng vi khuẩn ST và LB, nên em chọn nhiệt độ sấy là 380C. Sau khi ủ xong em tiến hành sấy mẫu và kết quả thu được là chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên BC được thể hiện trong hình 3.10. Hình 3.10. Chế phẩm vi khuẩn lactic trên BC sau khi sấy Nhận xét: Chế phẩm vi khuẩn lactic trên BC sau khi sấy là một màng mỏng, nhẹ, bền cơ học vì thế rất tiện trong bảo quản, lưu thông cung cấp giống cũng như lấy mẫu lên men sau này. Sau khi thu nhận được chế phẩm lacic cố định trên chất mang BC tương ứng với các nhiệt độ ủ thì tôi tiến hành kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn lactic cố định trên BC tương ứng với các nhiệt độ ủ. Tôi tiến hành kiểm tra bằng cách hoạt hóa chế phẩm vi khuẩn lactic trên môi trường dinh dưỡng thích hợp trong bảng 1.1 phụ lục và nuôi trong 54 giờ, ở nhiệt độ 370C và quan sát sự tạo thành khuẩn lạc và tiến hành đếm lượng tế bào sống trên đĩa petri theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.2.2.1. Kết quả kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trên chất mang BC được thể hiện cụ thể trong hình 3.9. Hình 3.11. Khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC Nhận xét: - Ở 370C lượng tế bào vi khuẩn trên chất mang BC đạt giá trị cực đại. - ST: 7,78*10^9 tế bào/ml. - LB: 7,63*10^9 tế bào/ml. Chọn được nhiệt độ ủ thích hợp để lượng tế bào vi khuẩn ST và LB đạt mật độ cao nhất là 370C, tương ứng với thời gian ủ là 54 giờ. Với việc cố định bằng phương pháp bẫy - hấp phụ trên chất mang BC kết hợp với việc sấy mẫu ở 380C cho lượng tế bào sống sót trên chất mang BC rất lớn so với nhiều phương pháp cố định khác trên những chất mang như gelatin, vỏ bưởi, xơ dừa…Lượng tế bào vi khuẩn lactic trên chất mang BC nhiều đến như vậy là do em đã lựa chọn phương pháp cố định là phương pháp bẫy – hấp phụ và sử dụng chất mang BC để cố định. Giai đoạn đầu, khi ta ngâm BC vào dịch vi khuẩn, kết hợp sử dụng cánh khuấy trong 30 phút để tăng hiệu quả hấp phụ, BC sẽ hút nước và trương nở về trạng thái ban đầu. Khi nước đi vào cấu trúc BC, nó sẽ mang cả tế bào vi khuẩn đi vào. Tại đây tế bào vi khuẩn sẽ được hệ thống sợi cellulose trong chất mang BC giữ lại đồng thời trên bề mặt BC cũng có tế bào vi khuẩn được hấp phụ. Tiếp theo là giai đoạn bẫy tăng sinh, thời gian kéo dài phụ thuộc vào đặc điểm sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC. Các tế bào cố định sẽ sử dụng cơ chất khuếch tán từ môi trường để sinh trưởng và phát triển trong chất mang BC để nhốt thêm một lượng lớn tế bào vi khuẩn lactic trong và bề mặt chất mang BC. Trong khi đó nhiều phương pháp cố định trên chất mang khác như gelatin, xơ dừa, hạt ngũ cốc… thì không có giai đoạn bẫy tăng sinh để nhốt thêm một lượng lớn tế bào vi khuẩn trên giá thể cần cố định. Vì vậy phương pháp cố định vi sịnh vật trên chất mang BC là một phương pháp khá ưu việt, tốn ít chi phí, điều kiện bảo quản chế phẩm lại dễ dàng, gọn nhẹ, dễ lưu thông và cung cấp giống. 3.4.3. Kiểm tra hiệu quả của quá trình cố định trên giá thể BC 3.4.3.1. Kiểm tra khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC 1 2 Hình 3.12. Khuẩn lạc của chế phẩm ST (1) và LB (2) sau hoạt hóa Kiểm tra khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang, bằng cách hoạt hóa chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC trên môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục và nuôi trong 54 giờ, ở nhiệt độ 370C và quan sát sự tạo thành khuẩn lạc và tiến hành đếm lượng tế bào sống trên đĩa petri theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.2.2.1, kết quả sống sót của vi khuẩn ST và LB được thể hiện cụ thể trong hình 3.12. Nhận xét: Chế phẩm lactic cố định trên chất mang BC sau khi hoạt hóa lại cho khả năng sống sót rất cao. Hình thái khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn lactic trên chất mang BC giống hệt hình thái của vi khuẩn lactic trước khi cố định. Điều này chứng tỏ sau quá trình cố định, vi khuẩn đã chịu nhiều tác động như khuấy, sấy…tuy nhiên vi khuẩn không hề bị đột biến hay biến chứng về hình thái, đặc biệt là tỷ lệ sống sót của vi khuẩn lactic trên chất mang BC là rất cao. 3.4.3.2. Kiểm tra hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic so với giống trên ống thạch nghiêng ở thế hệ thứ nhất Tiến hành lên men với hai mẫu: - Mẫu 1: Chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC. - Mẫu 2 (Mẫu đối chứng): Hai chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được bảo quản trong ống nghiệm ở thế hệ thứ nhất. Sau khi thu nhận chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC, em tiến hành pha loãng và gieo mẫu trên đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục. Sau thời gian hai ngày, quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, dùng que cấy vô trùng lấy một lượng vi khuẩn lactic tương đương vi khuẩn đã bảo quản trong ống thạch nghiêng để kiểm tra năng lực lên men của chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC bằng phương pháp công nghệ và phương pháp hóa học đã đề cập trong mục 2.2.4 và 2.2.7. Kết quả so sánh với mẫu đối chứng được thể hiện cụ thể trong hình 3.13. Hình 3.13. Khả năng sinh acid lactic của mẫu 1 và mẫu 2 Nhận xét: - M1 và M2: Khả năng sinh acid lactic xấp xỉ bằng nhau, sau 6 giờ bắt đầu đạt độ acid dừng. - Hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên BC hầu như không thay đổi gì so với trên ống thạch nghiêng ở thế hệ thứ nhất. - Từ đây ta thấy rằng phương pháp cố định vi khuẩn lactic trên chất mang BC rất tốt, đảm bảo khả năng sống sót và năng lực lên men của vi khuẩn lactic rất cao. 3.5. Xác định hiệu quả cố định vi khuẩn lactic trên chất mang BC sau các thời gian bảo quản 3.5.1. Xác định khả năng sống sót của vi khuẩn lactic được cố định trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản Để khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn ST và LB, cũng như biết được phương pháp bảo quản hai chủng vi khuẩn ST và LB trên giá thể BC có hiệu quả không thì sau 1 tháng và 2,5 tháng bảo quản chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC ở 40C kết hợp với phươg pháp đã đề cập ở mục 2.5. Em tiến hành hoạt hóa lại hai chủng vi khuẩn này trên môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục và nuôi trong 54 giờ, ở nhiệt độ 370C và quan sát sự tạo thành khuẩn lạc và tiến hành đếm lượng tế bào sống trên đĩa petri theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.2.2.1. Tiến hành so sánh với mẫu ban đầu. Sau quá trình bảo quản và hoạt hoá lại em đã thu được số lượng sống sót của hai chủng vi khuẩn ST và LB được đồ thị biễu diễn trong hình 3.14. Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản là 1 tháng và 2,5 tháng Từ kết quả trên ta có nhận xét sau: Vi khuẩn ST và LB khi được bảo quản bằng phương pháp cố định trên chất mang BC kết hợp với bảo quản lạnh ở 40C thì tỉ lệ sống sót rất cao. Trong thời gian bảo quản số lượng tế bào chỉ giảm đi một lượng rất ít so với ban đầu sau hai mốc thời gian và lượng tế bào vẫn ở đạt mức 10^9 tế bào/ml. Từ đây ta thấy rằng phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic trên chất mang BC rất tốt, khả năng sống sót của vi khuẩn rất cao so với nhiều phương pháp khác, điều kiện bảo quản lại dễ dàng, chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC lại rất nhẹ nên rất tiện lợi trong bảo quản và lưu thông. Với nghiên cứu này thì vấn đề bảo quản giống trong các nhà máy sản xuất sữa chua cũng như các lĩnh vực khác cần đến hai chủng vi khuẩn lactic này thật sự đã được giải quyết, và giảm được rất nhiều chi phí trong việc bảo quản cũng như chuẩn bị giống. 3.5.2. Xác định hoạt lực vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản Tiến hành kiểm tra hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC ở các mốc thời gian bảo quản bằng cách đánh giá thông qua năng lực lên men sữa chua theo quy trình công nghệ ở hình 2.2 để kiểm tra khả năng sinh acid lactic của chế phẩm vi khuẩn lacic cố định trên chất mang BC qua thời gian. Tiến hành so sánh với mẫu ban đầu (chế phẩm vi khuẩn lactic vừa thu nhận được) để xem xét khả năng sinh acid lactic có bị thay đổi nhiều không. Kết quả được thể hiện cụ thể trong hình 3.15. Hình 3.15. Khả năng sinh acid lactic của chế phẩm vi khuẩn lactic qua các mốc thời gian bảo quản Nhận xét: - Hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên BC hầu như không thay đổi gì nhiều so với mẫu ban đầu. - Từ đây ta thấy rằng phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic trên chất mang BC kết hợp với bảo quản lạnh ở 40C qua các mốc thời gian rất ưu việt khi khả năng sinh acid lactic hầu như không thay đổi nhiều. 3.6. Đánh giá phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic trên chất mang BC so với một số phương pháp khác So với nhiều phương pháp khác thì phương pháp cố định vi khuẩn lactic trên chất mang BC có rất nhiều ưu điểm nổi trội: Điều kiện bảo quản dễ dàng hơn rất nhiều, không cần sự hỗ trợ cao về cơ sở vật chất, thiết bị cho việc đầu tư bảo quản như phương pháp đông khô hay lạnh sâu. Bên cạnh đó công việc bảo quản vi khuẩn lactic trên chất mang BC thao tác khá dễ dàng hơn nhưng lượng tế bào vi khuẩn sống sót trên chất mang vẫn cho khả năng sống sót rất cao sau các thời gian bảo quản là trên mức 10^9 tế bào/ml. Mặt khác, BC còn có nhiều ưu thế của một chất mang như: Nó là một chất hút nước rất mạnh nhưng nước trong BC đa phần là nước ở dạng tự do nên khả năng bay hơi nước của BC cũng rất nhanh chóng và đạt đến độ khô cần thiết, khiến cho vi khuẩn lactic cố định trên BC không phải trải qua thời gian dài trong quá trình sấy, điều này hạn chế đi sự nhiễm khuẩn cũng như giảm chi phí về mặt năng lượng tiêu hao. Về mặt kinh tế thì khi so sánh phương pháp cố định vi khuẩn trên giá thể BC so với phương pháp cố định khác như trên gelatin, hạt ngũ cốc…thì khả năng đạt đến độ khô cần thiết của các phương pháp đó phải trải qua thời gian sấy rất lâu, mất khoảng 72 giờ trong khi đó vi khuẩn cố định trên BC chỉ mất khoảng 48 giờ đồng hồ (áp dụng các phương pháp khác làm cho vi sinh vật dễ bị nhiễm khuẩn và tốn chi phí về mặt năng lượng). BC còn rất tinh khiết nên không phải mất nhiều thời gian xử lý như đất, cát… nên hạn chế được khả năng nhiễm tạp. Bên cạnh đó BC rất chủ động được nguồn cung cấp cũng như có thể tự sản xuất rất dễ dàng với giá thành rẻ so với các chất mang khác có giá thành đắt như gelatin, aliganate… nhưng lượng vi khuẩn sống sót trên chất mang BC đạt giá trị cao so với trên giá thể của chất mang khác. Một đặc điểm nổi bật nữa của BC khi dùng để cố định vi khuẩn lactic là nó có tác động bảo vệ tế bào (Yoshinaga et al.,1997) trong khi đó những chất mang truyền thống như aliganate chưa tìm thấy tác động vệ tế bào hay kiềm hãm tế bào. Ngoài ra, chất mang BC rất bền cơ học, nên có thể chịu nhiều tác động trong thời gian bảo quản cũng như lấy mẫu còn aliganate rất dễ vỡ khi bị tác động mạnh. Với những đặc tính nổi bật của BC, kết hợp với phương pháp bẫy – hấp phụ tôi đã thu được kết quả cố định vi khuẩn lactic trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn AX thành công với lượng tế bào sống sót trên giá thể BC sau các mốc thời gian bảo quản vẫn trên mức 10^9 tế bào/ml. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT KUẬN Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu em đã rút ra được các kết luận như sau: Phân lập được hai chủng vi khuẩn ST và LB từ canh trường sữa chua vinamilk đồng thời kiểm tra sự thuần khiết của giống và tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm để phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Sản xuất thành công cellulose từ vi khuẩn AX để phục vụ cho quá trình nghiên cứu, với các thông số lên men lựa chọn là: Thời gian: 15 ngày. Nhiệt độ: 300C. pH = 5. Độ Bx = 11,5 – 120. Bằng phương pháp bẫy – hấp phụ kết hợp sử dụng cánh khuấy trong 30 phút em đã cố định thành công hai chủng vi khuẩn ST và LB trên chất mang BC với lượng tế bào sống sót trên giá thể BC là 7,89*10^9 tế bào/ml (ST) và 7,63*10^9 tế bào/ml (LB), tương ứng với điều kiện cố định tối ưu: nhiệt độ ủ là 370C, thời gian ủ là 54 giờ. Sau đó tiến hành sấy mẫu ở 380C trong thời gian 48 giờ để tiện lợi cho quá trình bảo quản và lưu thông cũng như lấy mẫu lên men sau này. Bảo quản thành công chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC kết hợp với phương pháp bảo quản lạnh ở 40C, với lượng tế bào vi khuẩn sống sót trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản 1- 2,5 tháng vẫn đạt mức 10^9 tế bào/ml và hoạt lực của vi khuẩn ST và LB được đánh giá thông qua năng lực lên men sữa chua, đạt hiệu quả rất cao khi so sánh với mẫu ban đầu: Hoạt lực lên men hầu như không thay đổi gì nhiều so với mẫu ban đầu. KIẾN NGHỊ Tiếp tục hoàn thiện phương pháp bảo quản giống vi khuẩn ST và LB trên chất mang BC như tiến hành khảo sát ở các khoảng thời gian bảo quản dài hơn hay bổ sung thêm chất bảo vệ ưu thế hơn trong quá trình bảo quản để lượng tế bào sống sót đạt mật độ cao nhất. Từ kết quả cố định thành công hai chủng vi khuẩn lactic trên chất mang BC góp phần thăm dò thêm ý tưởng sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC này ứng dụng trong quá trình ủ chín phô mai, lên men kefir và nhiều lĩnh vực khác cần đến chế phẩm vi khuẩn lactic này. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vương Trọng Hào, Tống Thị Mơ, “Nghiên cứu quá trình lên men sữa chua canxi”, Tạp chí khoa học số 4 (2002). [2] Nguyễn Thúy Hương, Nghiên cứu về thạch dừa, Luận văn thạc sỹ sinh học. [3] Nguyễn Thúy Hương, “Ảnh hưởng của nguồn cơ chất và kiểu lên men đến năng suất và chất lượng cellulose vi khuẩn”, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24, (2008), tr. 205 – 210. [4] Nguyễn Thúy Hương – Trần Thị Tưởng An, “Thu nhận Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococus lactic cố định trên chất mang BC và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Science Technology Development, Vol 11, No.09, (2008), tr.100 – 109. [5] Nguyễn Thúy Hương – Bùi Thị Thanh Hương, “Nghiên cứu điều kiện cố định nấm men Saccharomyces cerevisae N28 bằng chất mang BC và bước đầu ứng dụng trong lên men rượu vang”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(3), (2008), tr.383 – 389. [6] Nguyễn Thúy Hương – Thái Trịnh Thượng Trí, “Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni bằng phức chất mang aliganate – bacterial cellulose để ứng dụng lên men malolctic”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(3), (2008), tr. 383 – 389. [7] Nguyễn Trung Kiên, Đào Thị Bích Uyên, “Nghiên cứu sử dụng dâu tây và nha đam để nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua”, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng (2010). [8] Lê Văn Việt Mẫn, (2004), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống tập 1, Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, Trường Đại học Bách Khoa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. [9] Lê Xuân Phương, Giáo trình thí nghiệm Vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Trường Đại Học Bách Khoa. [10] Lê Xuân Phương, Vi sinh vật công nghiệp, Đại học Đà Nẵng, Trường Đại học Kỹ thuật, Nhà xuất bản xây dựng. [11] TS. Đinh Văn Thuận cùng những người tham gia, Hà Nội – 2003, “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị sản xuất sữa chua 600l/h”, Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu khoa học, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng – Viện KH & CN Nhiệt Lạnh. [12] Goh, W.N.,Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A.A. and * Rajeev Bhat, “Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth”, International Food Research Journal 19(1), tr.153 – 158 (2012). [13] (ngày 11/04/2012; 10:00). [14] –bentre.gov.vn/tin–tuc–su–kien/khoa–hoc–cong–nghe/1107–k–thut–sn–xut–thch–da.html (ngày 11/04/2012; 09:00). [15] (ngày truy cập 12 –01 –2012; 07:20). [16] https://www.google.com.vn/ (ngày 22/02/2012; 10:00). [16] (ngày truy cập 13 –01 –2012; 07:00). [17] (ngày 27/02/2012; 09:00). [18] (ngày 27/02/2012; 9:57). [19] (ngày 11/04/2012; 09:20). PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 Bảng 1.1. Thành phần môi trường hoạt hóa vi khuẩn lactic Thành phần Hàm lượng Thạch agar 20g Nước nho ép 5ml Pepton 5g Lactose 5g Nước cất 11ml Nước chiết thịt 15ml pH 7 Bảng 1.2. Nguyên liệu sản xuất BC STT Nguyên liệu Thành phần 1 Đường saccharose ½ kg 2 Trà túi lọc lipton 2 gói 3 Giống vi khuẩn AX 10% so với nguyên liệu PHỤ LỤC 2 Bảng 2.1. Số liệu đo sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn LB và ST bằng thiết bị đo mật độ quang trên máy qung phổ UV– vis Thời gian Mật độ chỉ số OD Thời gian Mật độ chỉ số OD ST LB ST LB 0 0,194 0,2 39 0,419 0,491 3 0,202 0,206 42 0,44 0,493 6 0,202 0,219 45 0,441 0,499 9 0,204 0,23 48 0,446 0,52 12 0,208 0,25 51 0,455 0,59 15 0,21 0,271 54 0,466 0,669 18 0,217 0,354 57 0,399 0,665 21 0,23 0,402 60 0,39 0,445 24 0,265 0,45 63 0,38 0,351 27 0,36 0,465 66 0,366 0,334 30 0,39 0,467 69 0,22 0,318 33 0,395 0,483 72 0,15 0,208 36 0,398 0,48 Bảng 2.2. Khối lượng BC tạo thành ở các mốc thời gian lên men Thời gian (ngày) Khối lượng BC tạo thành (g) 8 40 9 55 10 92 11 144 12 180 13 240 14 290 15 380 16 381 17 382 Bảng 2.3. Lượng tế bào vi khuẩn ST và LB sống sót sau khi sấy phụ thuộc vào các mốc nhiệt độ Nhiệt độ ST(*10^9 tế bào/ml) LB(*10^9 tế bào/ml) 26 7,11 6,98 32 7,32 7 34 7,39 7,2 36 7,5 7,45 37 7,78 7,63 38 7,6 7,48 39 7,49 7,33 40 7,4 7,21 Bảng 2.4. Hàm lượng acid lactic sinh ra theo thời gian của chế phẩm vi khuẩn lactic so với mẫu bảo quản trên ống thạch nghiêng ở thế hệ thứ nhất Thời gian (h) Thể tích NaOH tiêu tốn (ml) Mẫu 1 Mẫu 2 2 5.2 4,7 4 7,1 6,7 6 9,6 9,3 7 10,7 10 Bảng 2.5. Số lượng tế bào vi khuẩn ST và LB trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản Thời gian ST (*10^9 tế bào/ml) LB (*10^9 tế bào/ml) Ban đầu 7,78 7,63 1 tháng 7,71 7,58 2,5 tháng 7,56 7,5 Bảng 2.6. Hàm lượng acid lactic sinh ra theo thời gian của chế phẩm vi khuẩn lactic sau các mốc thời gian bảo quản Thời gian (h) Thể tích NaOH tiêu tốn (ml) Ban đầu 1 tháng 2,5 tháng 2 4,7 4,5 4,1 4 6,7 6,4 6 6 9,3 8,9 8,7 7 10 9,6 9,2