Đề tài Nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay không còn ai nghi ngờ rằng công nghệ sinh học đã trở thành một trong những ngành khoa học mũi nhọn có tác động to lớn đến đời sống con người trong thế kỷ 21. Không chỉ cung cấp hàng loạt sản phẩm cần cho dinh dưỡng hoặc điều trị bệnh của người, động vật, thực vật, công nghệ sinh học còn cho ta các chế phẩm hữu hiệu làm giảm nhẹ nạn ô nhiễm toàn cầu_ một thảm hoạ có thể của nhân loại trong thế kỷ tới. Hơn lúc nào hết, chúng ta nhớ đến câu nói của L. Pasteur: “Messieurs, c’est les microbes, qui auront le dernier mot” (Thưa các ngài, chính vi sinh vật là kẻ có lời nói cuối cùng). Bởi vì chỉ vi sinh vật với hoạt tính phong phú đa dạng và hiệu quả mới là kẻ đóng vai trò quyết định cho công nghệ sinh học. Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học phát triển ngày càng mạnh mẽ và thu được nhiều lợi nhuận mang lại lợi ích kinh tế cao. Một trong những lĩnh vực được quan tâm nhiều nhất của công nghệ sinh học là công nghệ sản xuất ra các chế phẩm enzyme trong đó có enzyme protease. Từ khi enzyme được phát hiện thì chúng ta không ngừng đưa nó vào trong thực tiễn của cuộc sống, phục vụ cho nhiều ngành như công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm …Enzyme được xem là thành phần quan trọng và tất yếu trong thực phẩm. Bằng cách bổ sung có định hướng và chọn lọc thì có thể tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác. Trong lượng enzyme được sử dụng trên thế giới thì protease chiếm đến 60% hàm lượng enzyme. Trước đây, phần lớn các protease đều được thu từ nội tạng động vật, thực vật nhưng ngày nay nó đang được thay thế dần bằng protease của vi sinh vật rẻ tiền. Chính vì tầm quan trọng đó mà mấy chục năm gần đây hình thành và phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 20 hãng sản xuất ra hơn 100.000 tấn chế phẩm enzyme. Tuy nhiên, nó tập trung chủ yếu ở các nước phương Tây, còn ở phương Đông thì còn rất non kém. Thực tế ở nước ta, các chế phẩm enzyme hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành rất cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất chưa được rộng rãi. Do đó căn cứ vào nguồn nguyên liệu và điều kiện hiện có tại Việt Nam, đồng thời sử dụng những phương pháp phân tích và phương án ma trận trực giao cấp một trong hoá học, dưới sự hướng dẫn của cô giáo Th.S Lê Xuân Phương, tôi chọn đề tài "Nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc". Mục tiêu của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease trong môi trường dịch thể. Xác định điều kiện tối ưu nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp protease trong môi trường dịch thể. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Sở dĩ chọn nấm mốc là đối tượng để khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease với phương pháp nuôi cấy trong môi trường dịch thể là do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp, có thể chủ động về nguồn nguyên liệu, chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, do đó ta có thể thu hoạch hàng trăm lần một năm, có thể điều khiển sự sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme, giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền. Và hiện nay trên thế giới, nuôi cấy bề sâu là phương pháp phổ biến nhất trong công nghiệp sản xuất enzyme vi sinh vật. Nội dung được trình bày trong đề tài gồm: Chương I : Tổng quan tài liệu . Chương II : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu . Chương III : Kết quả và thảo luận . Chương IV : Kết luận . Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về vi sinh vật Giới thiệu về vi sinh vật Vi sinh vật là những cơ thể vô cùng nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi. Vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau: vi rút, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, niêm vi khuẩn, vi khuẩn lam, tảo... Vi sinh vật sống ở khắp mọi nơi trên trái đất: từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu, trong không khí, trong đất, trong hầm mỏ, trong sông ngòi, ao hồ, trên da, trong từng bộ phận của cơ thể người, động vật, thực vật, trong các sản phẩm, vật liệu, hàng hóa… Ngay cả trong những nơi mà điều kiện sống tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển của vi sinh vật. Từ cổ xưa, mặc dầu chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài người đã biết khá nhiều về tác dụng của vi sinh vật gây nên. Trong sản xuất và trong đời sống, con người đã tích luỹ được nhiều kinh nghiệm về các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại. Vai trò của vi sinh vật: Xét về mặt tích cực Vi sinh vật tham gia vào việc khép kín vòng tuần hoàn vật chất và giữ cân bằng sinh thái tự nhiên Một số chủng vi sinh vật tiết ra chất kháng sinh, vitamin, chất kích thích sinh trưởng… vì thế chúng được áp dụng trong sản xuất các chất trên. Một số chủng, giống vi sinh vật trong tế bào có chứa tinh thể diệt côn trùng. Người ta dùng các chủng, giống vi sinh vật này vào quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong bảo vệ thực vật để diệt côn trùng có hại. Vi sinh vật còn phân huỷ các chất độc hại, các phế thải công nghiệp, làm sạch môi trường. Từ đầu thập kỉ 70 của thế kỉ này người ta bắt đầu thực hiện thành công thao tác di truyền ở vi sinh vật. Nhờ đó đã mang lại lợi ích to lớn bởi vì có thể sản sinh ở qui mô công nghiệp những sản phẩm trước đây chưa hề được tạo thành bởi vi sinh vật. Đến nay chúng đã phát huy tích cực trong nhiều lĩnh vực: y tế và thú y, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp hoá học và công nghiệp năng lượng, bảo vệ môi trường… Xét về mặt tiêu cực Vi sinh vật gây ra các bệnh cho người, động vật thực vật, chúng phá huỷ mùa màn trong quy trình sản xuất chế biến, bảo quản lương thực thực phẩm. Vi sinh vật còn phá huỷ các công trình xây dựng cầu cống, các di tích lịch sử, gây phiền nhiễu trong hoạt động sống của con người. Như vậy vi sinh vật có mặt mọi nơi thâm nhập vào mọi hoạt động sống của chúng ta. Nắm vững hoạt động của chúng, chúng ta có thể đề ra các biện pháp làm cho chúng trở thành vũ khí sắc bén trong công cuộc chinh phục và cải tạo thiên nhiên để phục vụ con người. Giới thiệu về nấm mốc 1. Đặc điểm chung của nấm mốc Nấm mốc là tên chung để chỉ các loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi. Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng có bào tử, không có diệp lục, không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu cơ sẵn có để sinh sống. Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì vậy chúng thường phát triển trên bề mặt của cơ chất dưới dạng những sợi lùn phún hình sợi, lớp mạng nhện, hay khối sợi bông. Chúng có thể phát triển ở một số môi trường mà nấm men, vi khuẩn không thể phát triển được như môi trường có áp suất thẩm thấu, độ ẩm và acid lớn. Nhiều loại nấm mốc có giá trị lớn trong công nghiệp. Chúng được dùng trong việc sản xuất nhiều loại axit hữu cơ, enzyme, chất kháng sinh, vitamin, thực phẩm… Trái lại nhiều loại nấm mốc cũng gây nhiều thiệt hại trong việc bảo quản thực phẩm và nhiều hàng công nghiệp khác. Nhiều nấm mốc ký sinh trên người, trên động vật, thực vật và gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm, nhiều nấm mốc sinh ra độc tố có thể gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh khác. Trong tự nhiên, nấm mốc phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là trong quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn. Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất khi gặp khí hậu nóng ẩm. 2. Đặc điểm hình thái của nấm mốc Nấm mốc là loại sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh. Những sợi phân nhánh này phát triển thành từng đám chằng chịt gọi là khuẩn ty hay hệ sợi nấm khi phát triển trên môi trường đặc, bao gồm: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng. Hai loại khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau. Khuẩn ty dinh dưỡng làm nhiệm vụ hấp thụ chất dinh dưỡng, còn khuẩn ty khí sinh thì hấp thụ oxy và đóng vai trò sinh sản là chủ yếu. Nấm mốc không di chuyển được và không có một cơ quan vận chuyển nào. Chúng có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ (Neospora Crassa), màu đen (Asp. niger), màu xám (Asp. usami), màu trắng xám (Mucor hay Rhyzopus) và lại có những loại màu xanh (Penicillium). Về hình thái của khối bào tử thì cũng có nhiều kiểu khác nhau. Có loại bọc xung quanh thể hình chai và tạo thành một khối cân đối như hoa cúc, hoa hướng dương (Aspergillus). Lại có loài có hình dạng phân nhánh như chiếc chổi (Penicillium), lại có loài như trái bưởi bị đốt cháy đen vỏ (Mucor, Rhyzopus). Đặc điểm cấu tạo của nấm mốc Do có cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn và nấm men. Dựa vào cấu tạo của nấm mà người ta chia chúng ra làm hai loại: Loại nấm mốc có vách ngăn Đây là trường hợp khuẩn ty được tạo thành do một chuỗi tế bào nối tiếp nhau. Sự nối tiếp này có thể xem như những đốt tre trên một cây tre. Ngăn cách hai tế bào là một màng ngăn. Trong mỗi tế bào nấm hầu như có đủ cơ quan của một tế bào, trong đó quan trọng là có nhân. Thường thấy ở Aspergillus và Penicillium. Loại nấm mốc không có vách ngăn Đây là những loại nấm mốc đa hạch. Trong đó giữa các hạch không có màng ngăn. Hầu hết màng tế bào nấm không có lớp vỏ cellulose như ở thực vật mà lại có lớp kitin như lớp vỏ cứng ở sâu bọ. Chất dự trữ hydrat cacbon của nấm cũng không là đường mà là chất glycogen. Đặc biệt trong tế bào nấm rất giàu các chất có hoạt tính sinh học (enzyme) và rất giàu kháng sinh. Lợi dụng đặc điểm này người ta đã sử dụng nấm mốc để sản xuất ra những sản phẩm phục vụ cho đời sống. Cấu tạo thành tế bào nấm mốc hiện nay vẫn chưa hiểu biết hết. Tuy nhiên nhiều tài liệu cho thấy rằng nó có: 80 – 90% polysacarit, 1 - 3% hecxozamin, 3 – 8% lipit, 4% protein, chất màu (melanin). 4. Đặc tính sinh sản của nấm mốc Nấm mốc có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản bằng bào tử và bằng sợi nấm. Bào tử của các chủng nấm mốc khác nhau có màu sắc không giống nhau, và đây chính là đặc điểm nhận biết để phân loại nấm mốc. Một số nấm mốc thường gặp Nấm mốc đơn bào: + Giống Mucor: Thường có dạng bên ngoài giống như nỉ tạo những khối lông tơ trắng trên các nguồn bã thải hữu cơ để lâu ngày. Một số loại mucor có khả năng lên men rượu và oxy hoá, chúng được dùng trong sản xuất axit hữu cơ, rượu và chế phẩm enzyme. +Giống Rhyzopus: Giống này thường lan tràn rất nhanh nhờ chúng có khả năng mọc nhánh ra khắp mọi hướng. Các giống này gắn chặt vào cơ chất nhờ những sợi giống rễ cây. Điển hình nhất là Rhyzopus nigricans thường hay mọc đen trên bánh mì bị ẩm trong thời gian vài ba ngày. Hai giống trên đều phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, được dùng sản xuất các enzyme, axit thực phẩm và chuyển hoá thuốc. Trong tương cũng gặp nhưng chúng thường làm tương chua và nhão. Ở điều kiện yếm khí chúng có thể lên men rượu, vì vậy trước kia đã được dùng làm rượu như Mucor rouxii và Rhyzopus delemar nhưng cũng có loài làm hư hỏng thực phẩm như Mucor mucedo. Nấm mốc đa bào: + Aspergillus: Giống nấm Aspergillus có thể tới hơn 200 loài, sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài (stalk) và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi (vesicle). Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình (sterigmata). Từ bộ cuống đính bào tử cuối cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia). Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính tương tự. Giống nấm này phát triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. + Pennicillium: Giống này phức tạp hơn so với giống Aspergillus. Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh, một số đầu sợi lại chia thành các nhánh và từ các nhánh này mới mọc các cuống bào tử. Toàn bộ nhánh sinh đính bào tử này có hình dạng giống cái chổi. Bào tử đính có hình cầu và khi chín có màu xanh, vàng hoặc trắng…nhưng các mốc Pennicillium thường có màu xanh và người ta thường gọi mốc này là mốc xanh. Bề mặt khuẩn lạc thường có một số các giọt lỏng. Giống Pennicillium thường không phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Giống Pennicillium chỉ có vài loài có giai đoạn sinh sản hữu tính. Vì vậy việc định danh các loài trước hết dựa vào hình thái bào tử. Giống này có ba loại bào tử đính: loại đơn giản nhất của một hệ bào tử đính gồm có sợi cuống, túi nhỏ và một cuống đính bào tử hình lọ, cổ thóp và bào tử đính; loại thứ hai gồm sợi cuống nhưng không có túi. Ở đầu sợi cuống là một loạt các tế bào nằm kề nhau gọi là cuống thể bình (metulae). Ở đầu các cuống thể bình là các cuống đính bào tử hình giáo, nhọn, dài cho bào tử đính được tạo ra; loại thứ ba rất không đối xứng gồm có một sợi cuống phân nhánh tự do ở đầu sợi, gắn vào các đầu nhánh là các cuống thể bình tạo ra cuống đính bào tử và bào tử đính. [7, tr52]. Hai giống này có ứng dụng rất nhiều trong công nghệ thực phẩm. Ứng dụng của nấm mốc Vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của nền kinh tế quốc dân. Đặc biệt là ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm. Trong công nghệp thực phẩm, nấm mốc được sử dụng cho các ngành sản suất chính như: sản xuất axit hữu cơ; sản xuất chất kháng sinh; sản xuất enzyme; sản xuất nước chấm, tương, chao; sản xuất rượu… Trong tế bào vi sinh vật rất giàu các hệ enzyme để thực hiện các phản ứng sinh hóa phức tạp. Có một số hệ enzyme tiết vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất có cấu tạo cao phân tử, biến các cơ chất này thành những chất có phân tử thấp mà vi sinh vật có thể đồng hóa được. Thuộc loại này là những enzyme ngoại bào_ những enzyme thủy phân như protease, amylase, pectinase, cellulose…Những enzyme ngoại bào đầu tiên được được hình thành trong tế bào khi môi trường có những cơ chất cảm ứng rồi tiết dần vào môi trường. Vi sinh vật tạo thành những enzyme này chủ yếu ở thời kỳ phát triển, khi các tế bào còn non. rất nhiều Nhiều chế phẩm enzyme có nguồn gốc vi sinh vật được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Nấm mốc là loại đặc biệt giàu các enzyme ngoại bào. Tổng quan về enzyme Giới thiệu về enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hoà tan trong nước và trong dung dịch muối loãng. Đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định để đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000÷1.000.000 danton, được cấu tạo từ các L-
- acid amin kết hợp với nhau qua liên kết peptid. Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như kiềm đặc, acid đặc, muối kim loại nặng…đều có thể làm enzyme biến tính và mất hoạt tính xúc tác. Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hoá học: Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: Ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với tốc độ nhanh gấp 108 – 1011 lần so với phản ứng không có chất xúc tác. Enzyme có tính đặc hiệu cao: Mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hoá được một hoặc một số cơ chất nhất định. Sự tác dụng có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Enzyme có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra sản phẩm phụ. Enzyme thường tác dụng thích hợp ở nhiệt độ 30 – 50OC, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần nồng độ acid hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu acid, kiềm và chịu áp suất cao đắc tiền. Tất cả các enzyme có nguồn gốc không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học. Các chế phẩm enzyme được sản xuất từ nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền. Enzyme động vật thường thu nhận từ các phụ phẩm lò mổ như: tụy, tạng, dạ dày… Enzyme thực vật được thu từ vỏ, lá dứa, lá, thân, nhựa sung, vả, nhựa đu đủ xanh…Còn để thu enzyme vi sinh vật người ta nuôi vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt hoặc phương pháp bề sâu từ nhiều nguồn phế phẩm của các ngành công nghiệp khác. Hơn nữa enzyme lại là thành phần không thể thiếu được trong mọi tế bào sinh vật, chúng đóng vai trò quyết định cho mọi chuyển hoá vật chất trong tế bào và quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trường sống. Chính vì những tính chất ưu việt và vai trò to lớn của chúng trong sự sống, enzyme đã trở thành đối tượng rất quan trọng trong nghiên cứu không chỉ các nhà khoa học sinh học, công nghệ sinh học mà còn là mối quan tâm rất lớn của những nhà khoa học trong nhiều lĩnh vực khoa học có liên quan. Tính đến năm 1984 người ta đã biết đến 2477 loại enzyme khác nhau và chúng đã có mặt trong rất nhiều hoạt động sản xuất và đời sống của con người. Trong những năm cuối của thế kỉ 20 và những năm đầu của thế kỉ 21, công nghệ sinh học trong đó có công nghệ enzyme đã phát triển rất mạnh, dự báo cho những thành công lớn trong khoa học và trong kinh tế. Các chế phẩm enzyme đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong hoá phân tích để định tính và định lượng các chất, trong nông nghiệp, trong y học, trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp hoá học và nhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt, công nghiệp da v.v ... Với đà phát triển hiện nay của enzyme học, chắc chắn trong tương lai không xa chúng ta có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác enzyme để sử dụng trong thực tế. Điều này sẽ có ý nghĩa kinh tế hơn đối với các enzyme khó tách từ các nguyên liệu tự nhiên. Giới thiệu về enzyme protease Protease là enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.[ 3, tr127 ]. Dưới tác dụng của enzyme protease, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau : Protein pepton polypeptid peptid acid amin. Đây là quá trình thuỷ phân tương đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loại protease khác nhau. Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin (CO-OH). Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm: Aminopeptidase: Xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid ở đầu nitơ của mạch polypeptit. Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo-peptidase. Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thuỷ phân các liên kết dipeptid. Proteinase: Xúc tác sự thuỷ phân các liên kết peptid nội mạch. Từ năm 1950 trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về protease cho thấy các protease khác nhau về cơ chế phản ứng, phân hủy các cơ chất có cấu trúc khác nhau, điều kiện môi trường hoạt động khác nhau. Ứng dụng của enzyme protease Các protease nói chung cũng như protease từ vi sinh vật nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học… Trong công nghệ chế biến thực phẩm Trong chế biến cá: Việc sử dụng enzyme protease vào quá trình chế biến cá không những rút ngắn thời gian chế biến mà còn tận dụng được phế thải của các nhà máy chế biến thuỷ sản và các loại cá vụn, cá không ăn được. Sản phẩm thu được của quá trình thuỷ phân có chất lượng dinh dưỡng cao và chứa các acid amin thiết yếu. Trong công nghiệp thịt: Sự làm mềm thịt có thể được tác động bởi protease nội sinh, đặc biệt là enzyme cathespin và bởi protease trung tính được tìm thấy trong hoặc gần protein sợi cơ. Các protease thực vật và vi sinh vật có tác động làm mềm thịt khác nhau. Cần phải kết hợp cả enzyme thực vật và enzyme vi sinh vật để làm mềm thịt. Trong quá trình chế biến sữa và sản xuất phomat: Protease không những có khả năng thuỷ phân protein mà còn có khả năng đông tụ sữa. Trong công nghiệp sản xuất nước quả và rượu vang: Protease được sử dụng như một chất hỗ trợ kỹ thuật trong việc làm trong và ổn định chất lượng nước quả và rượu vang. Hiện nay người ta đã sản xuất ra nhiều chế phẩm protease axit từ Aspergillus. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus, Asp. satoi… dùng để xử lý nước quả. Trong sản xuất bia và dịch chiết ngũ cốc: Trong quá trình đường hoá, các protease có tác dụng làm tăng hiệu suất dịch chiết và tăng lượng nitơ α-amino trong dịch đường hoá và trong quá trình hoàn thiện bia, chúng góp phần loại bỏ kết tủa lạnh. Nhờ đó chúng góp phần nâng cao chất lượng đồng thời hạ giá thành sản phẩm. Trong công nghệ sản xuất bánh mì và các loại bánh nướng: Các tính chất đặc trưng và khác nhau của bột nhào để làm bánh phụ thuộc phần lớn vào các protein gluten không hoà tan vì các gluten này tạo tính nhớt không đàn hồi cho bột nhào. Độ bền của bột liên quan đến chất lượng và hàm lượng gluten và bột bền có khả năng nhào trộn tốt. Việc thêm protease vào bột nhào sẽ làm hoàn thiện các tính chất của chúng, độ nhớt đàn hồi, độ mịn gluten và làm tăng đáng kể thể tích bánh mì, làm cho bánh cân đối hơn với bề mặt mịn. Việc sử dụng enzyme cho phép tự động hoá trong quá trình sản xuất. Sự ứng dụng của protease của nấm mốc làm cho thời gian trộn đựơc rút ngắn cho nên hoạt động sản xuất hiệu quả hơn, tiết kiệm năng lượng hơn. Trong các ngành công nghiệp phi thực phẩm Trong công nghiệp dệt: Sợi thu được sau khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin. Chỉ cần một lượng nhỏ xerixin nằm lại trên tơ lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó, ta dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn. Trong kỹ nghệ phim ảnh: Protease vi khuẩn và xạ khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu cảm quang khác nhau như phim điện ảnh, giấy phim, phim Rơnghen, phim chụp máy bay... Trong công nghiệp da: Protease được dùng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi collagen. Khi xử lý bằng protease tính đàn hồi của da cũng tăng lên. Sử dụng protease cũng rút ngắn được quá trình tẩy lông, lượng lông thu được tăng lên 25÷30% so với phương pháp hoá học. Sử dụng enzyme trong công nghệ thuộc da tránh được độc hại cho công nhân, tránh được ô nhiễm môi trường. Trong công nghiệp dược phẩm và y học Protease được dùng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein của những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tụy tạng không bình thường, thiếu enzyme. Protease cũng được sử dụng để phân giải các chất hữu cơ trong cơ thể, chữa bệnh tắt tĩnh mạch. Protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôi cấy sinh vật để sản xuất chất kháng sinh, chất kháng độc... Ngoài ra còn dùng chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Trong nông nghiệp: Protease dùng trong chăn nuôi để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của động vật hoặc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm. Trong nghiên cứu khoa học Protease được dùng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Trong thời gian gần đây người ta dùng chế phẩm protease không hoà tan bằng cách gắn vào những chất không tan như cellulose, sephadex, sepharose và các dẫn xuất của chúng: gel polyacrylamit, các polyme tổng hợp, bột thuỷ tinh, zeolit… Enzyme được giữ trên chất mang nhờ lực hấp phụ, lực liên kết hoá trị... để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong thực phẩm, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Ngoài ra protease còn được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, thuốc đánh răng... làm cho da mịn, làm sạch cao răng, chữa viêm lợi và trong chừng mực nhất định có tác dụng diệt vi khuẩn. Trên đây ta thấy các protease được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, để có thể mở rộng hơn nữa phạm vi ứng dụng của nó cần tiếp tục nghiên cứu, cải tiến phương pháp tách và tinh chế nhằm giảm giá thành chế phẩm enzyme. Mặt khác để nâng cao hơn nữa hiệu suất sử dụng protease còn cần nghiên cứu kĩ hơn nữa về tính chất của chúng đặc biệt là tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng của chúng. Ưu điểm của vi sinh vật trong công nghiệp enzyme Enzyme cũng như protease nói riêng có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong các nguồn nguyên liệu này, vi sinh vật là nguồn thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính sau: Có thể chủ động nguồn nguyên liệu. Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, vào khoảng từ 16 – 100 giờ do đó ta có thể thu hoạch hàng trăm lần một năm và tốc độ sinh trưởng của chúng rất mạnh. Có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme. Có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Enzym thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao. Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền, dễ kiếm… Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp. Tuy nhiên cần lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố, vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp. So với protease thực vật và động vật, protease vi sinh vật có nhiều đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân riêng biệt và đa dạng. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ năm 1960, mặc dù từ năm 1918, 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protease của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm gần đây, số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể hơn nhiều so với các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease của vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme protease trong thực tế. Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Nhiều loại nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp một lượng lớn protease được áp dụng trong công nghệ thực phẩm là các chủng: Aspergillus. oryzae, Asp. terricola, fumigatus, Asp. satoi, Penicillium chrysogenum…Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tuỳ theo thành phần của môi trường. Ví dụ Asp. oryzae nuôi trong điều kiện bình thường sinh tổng hợp chủ yếu protease tính kiềm còn trong môi trường giảm gluxit thì chủ yếu tạo thành protease tính acid. Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất trong qui mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau, trong công nghiệp và trong y học. Bảng 1.1: Bảng tóm tắt một số nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease [14, tr131] Tên nấm mốc  Enzyme protease   Asp. oryzae Asp. satoi Asp. awamori Asp. niger Asp. shirousami Asp. fumigatus Asp. candidus Asp. ochraceus Asp. sojae Asp. flavus Pen. janthinellum Pen. cyaneo fulvum Mucor pusillus Rh. Chinensis Rh. delema Rh. niveus Rh. nodous Rh. pseudokinensis Rh. Peka Phymatotrichum omnivorum  Protease acid, protease trung tính và protease kiềm Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid và protease kiềm Protease acid Protease trung tính Protease kiềm Protease trung tính và protease kiềm Protease acid Protease kiềm Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Aminopeptidase , cacboxypeptidase và một protease   Các yếu tố hoá lý ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease ở vi sinh vật. Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật nói riêng cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm môi trường, nhiêt độ nuôi, pH môi trường, độ thông khí, thành phần môi trường… Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp có khác nhau: các loại nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ 22-32OC, còn các vi khuẩn ở nhiệt độ cao hơn 36-55OC. Nói chung đa số vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Ảnh hưởng của pH môi trường Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật. Hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm mốc pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5. Các vi khuẩn phát triển tốt và tạo thành nhiều enzyme ở pH gần trung tính 6,6 - 7,4. Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích luỹ protease trong môi trường. Đáng lưu ý là pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. PH ban đầu của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau không giống nhau. Đối với các nấm mốc, pH này vào khoảng 3,8 – 5,6, còn đối với vi khuẩn là 6,2 – 7,4. Độ thông khí của môi trường Độ thông khí của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo vi sinh vật. Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy có kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau (Aleeva 1973-Aravina và tập thể năm 1976). Ngay cả đối với một số vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau (Crivova và tập thể năm 1977). Trong một số trường hợp, sự hiếu khí mạnh lại kiềm hãm tổng hợp protease. Ảnh hưởng của thành phần môi trường Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng vì protease là enzyme cảm ứng. Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp các enzyme khác nhau thì không giống nhau. Nắm vững các qui luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật sinh tổng hợp định hướng một loại enzyme xác định. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường dùng là các glucid: mono – di và cả polysacarit. Các chất này ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật. Đặc tính tác dụng của nguồn cacbon tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn cacbon và nitơ tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mỳ, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Trong số monosacarit, glucose ảnh hưởng rất khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như sinh tổng hợp protease. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Các chất có thể dùng làm nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của chúng) hoặc các muối vô cơ (muối amôn, muối nitrat). Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng cả nitơ của HNO3, HNO2. Nồng độ dạng nitơ trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt và có quy luật đến quá trình tổng hợp protease ngoại bào ở vi sinh vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein… Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon, nitơ thích hợp còn cần phải chải chọn tỷ lệ thích hợp giữa C : N. Bên cạnh đó photpho và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Ngoài các yếu tố kể trên các nguyên tố vi lượng (Steiner 1961), NaCl (Kovaleva và tập thể 1977), vitamin (Emxêva 1975) và một số yếu tố khác (Aravina và tập thể 1977) cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật [14, tr144]. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme Để thu được enzyme, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu hay còn gọi là phương pháp chìm. Trong phương pháp nuôi bề mặt, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn. Còn phương pháp nuôi chìm, vi sinh vật phát triển trên môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. Cả hai phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng. Tuy nhiên phương pháp bề mặt không phù hợp trong sản xuất công nghiệp, chỉ sử dụng trong một số nhà máy sản xuất enzyme dưới dạng canh trường. Trong khi đó phương pháp bề sâu được sử dụng rộng rãi để sản xuất các chế phẩm enzyme tinh khiết. Do đó tuỳ theo đặc điểm công nghệ cũng như yêu cầu của sản phẩm mà chọn phương pháp nuôi cho phù hợp. 1.3. Các kết quả nghiên cứu đã được công bố của Việt Nam và thế giới Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Việt Mẫn, Nguyễn Văn Hồng - Trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh: “Xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm sợi Asp. oryzae tổng hợp protease theo phương pháp bề sâu”. Tác giả đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp hai để xác định mối quan hệ định lượng giữa hàm lượng bột đậu nành, hàm lượng và hoạt tính protease chất chiết nấm men thu được trong phương pháp nuôi cấy bề sâu chủng nấm sợi Asp. oryzae NT-1. Một số điều kiện nuôi cấy với quy mô phòng thí nghiệm như sau: nhiệt độ 30OC, tỷ lệ giống 178 mg chất khô bào tử cho 1l môi trường, tốc độ lắc 350 vòng/phút và thời gian nuôi cấy là 54h. Chế phẩm enzyme thô thu được có hoạt tính protease là 0.95đvhđ/ml. hoạt tính riêng là 5.35đvhđ/mg protein. Các nghiên cứu đang được tiếp tục thực hiện bao gồm việc nuôi cấy nấm sợi với quy mô lớn hơn, tinh sạch enzyme, xác đinh các tính chất của enzyme và thử ứng dụng chế phẩm trong công nghiệp hoá học và thực phẩm [14]. Báo cáo khoa học của KS. Nguyễn Văn Hồng _Phân Viện KTTV&MT phía Nam (2004), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme protease dùng thay thế một số chất xúc tác hoá học trong công nghiệp”. Kết quả cho thấy thành phần môi trường thích hợp để nấm mốc Asp. oryzae phát triển và sinh tổng hợp protease là môi trường lỏng có thành phần như sau: dexterin là 2.5g, bột đậu nành: 5g, saccharose: 3g, Na2CO3: 0.9g, NaHCO3: 0.3g, Na3PO4: 0.3g, chất chiết nấm men: 0.1g, nước: 100ml. [17] 3. “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩu phần ăn của bò vắt sữa và bê sâu cai sữa” của TS. Đinh Văn Cải_ Viện KHKTNN MN (1999 – 2001). Kết quả đã tạo ra chế phẩm BiO-D cho bò sữa và BiO-C cho bê sau cai sữa, với tỷ lệ pha trộn khác nhau dựa trên 3 thành phần nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc dùng sản xuất sinh khối bã khoai mì giàu cellulase, amylase, protease, lipase; Nấm men đưa vào rỉ mật tạo sinh khối giàu đường, đạm, acid amin; Vi khuẩn sống cho tác động lên cám, đậu nành để tạo sinh khối giàu protease và amylase. [16] CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và hoá chất và thiết bị Nguyên liệu bao gồm: cơm (gạo), vỏ cam, chanh, đất. Hoá chất bao gồm: Các hoá chất tinh khiết: NaNO3, KH2PO4, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O, FeSO4.6H2O, saccharose, glucose, dextrin, Na2CO3, CaCO3, NaHCO3, Na3PO4, phenol tinh thể, acid lactic đậm đặc, glyxerin, nước cất, gelatin, foocmol 40%, cồn tuyệt đối, NaOH, H3PO4 0.1N, NaCl, Na2HPO4.2H2O, HCl, acid acetic, CH3COONa. Chỉ thị màu: thimolphtalein. Cao nấm men, peptone, agar-agar, bột đậu nành. Thiết bị : Tủ ổn định nhiệt, máy lắc, thiết bị thanh trùng, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, máy đo pH, giấy pH. Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10-2, 10-4 Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm . Phương pháp nghiên cứu Phương pháp vi sinh Phương pháp chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, môi trường phân lập, môi trường lên men Định lượng thành phần môi trường rồi tiệt trùng ở chế độ theo yêu cầu đối với từng loại môi trường. Phương pháp phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease Nguồn phân lập: Môi trường cơm: ký hiệu R. Vỏ cam, chanh: ký hiệu F. Đất: ký hiệu S. Môi trường phân lập và bảo quản giống: MT1 [phụ lục 1]. Quy trình phân lập: Tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao: Để tuyển chọn loài vi sinh vật có hoạt tính protease cao, ta dùng môi trường sữa. Cấy nấm mốc vào các hộp petri có chứa môi trường trên thành từng chấm, nuôi ở 30OC sau 2, 3, 4 ngày hoặc lâu hơn rồi đem quan sát. Protease được tạo thành sẽ thuỷ phân casein của sữa nên vòng thuỷ phân hoàn toàn trong suốt, còn môi trường sữa thì trắng đục nên ta dễ dàng đo đường kính vòng thuỷ phân (D) và đường kính khuẩn lạc (d). Chủng nào cho tỷ lệ D/d càng lớn tức có khả năng sinh tổng hợp protease cao. Phương pháp bảo quản giống: cấy truyền trên ống thạch nghiêng, nuôi rồi sau đó bảo quản ở nhiệt độ 2 – 4 OC khoảng 15 ngày hay một tháng thì phải cấy truyền lại. Phương pháp hoá lý Xác định pH của dung dịch: Bằng pH metre. Xác định nhiệt độ: Bằng nhiệt kế bách phân. Xác định độ ẩm: Bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Xác định tốc độ lắc: Thông qua máy lắc vi sinh có thổi không khí tiệt trùng. Phương pháp hoá sinh Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp chuẩn độ foocmol Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong các nhóm này để xác định hoạt độ enzyme. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmol bao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ xác định. Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. Hoạt độ enzyme được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme mà sau 1h ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin. Tính kết quả: Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là: HđP =
(đvhđ/ml) V1: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn bình thí nghiệm V2 : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn bình kiểm tra f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch NaOH 0.1N (f = 1.2) t: thời gian enzyme tác dụng (h) V: thể tích dung dịch enzyme đã dùng (ml) 1.42: là số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N Phương pháp toán học Xử lý số liệu thống kê, quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa hàm mục tiêu. Để tối ưu hóa hàm mục tiêu, trong nghiên cứu này, ta sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp một hai yếu tố để xác định sự ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp protease của nấm sợi. Ngoài ra, phương pháp này còn giúp đánh giá có định lượng về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp protease. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng số thí nghiệm có chọn lọc, ít nhất mà vẫn diễn tả được nhiều nhất sự ảnh hưởng của các yếu tố đã chọn. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, tiến hành quy hoạch theo mô hình trực giao cấp một hai yếu tố: pH của môi trường và thời gian nuôi cấy. Phương trình hồi quy trong trường hợp này có dạng: Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 Trong đó: Y: hoạt lực enzyme protease tích lũy trong môi trường. bi, bij: các hệ số hồi quy. x1, x2: các biến số. Quá trình phân tích, xử lý toàn bộ kết quả thực nghiệm cho phép xác đinh các hệ số và sự tương thích của phương trình. Sau đó tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm theo phương án đường dốc nhất đứng (građien) để tìm điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sơ đồ quy trình thí nghiệm: 3.1. Kết quả phân lập nấm mốc từ nguồn R, F, S Để sản xuất chế phẩm enzyme người ta có thể dùng các giống vi sinh vật phân lập được trong tự nhiên hoặc các giống đột biến đã được lựa chọn. Do đó ta tiến hành phân lập nấm mốc từ các nguồn R, F và S trên môi trường đặc hiệu MT1 [phụ lục 1]. Sau đó tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao. Sở dĩ ta chọn các nguồn trên để phân lập tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease vì đây là những nguồn có chứa nhiều chủng thuộc giống Aspergillus, Mucor và Pennicillium_ những giống có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease mạnh. Kết quả phân lập được 5 chủng từ nguồn R được ký hiệu: R1, R2, R3, R4 R5, R5; 5 chủng từ nguồn F được ký hiệu F1, F2, F3, F4, F5 và 4 chủng từ nguồn S được ký hiệu: S1, S2, S3, S4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chúng sau khi nuôi 4 ngày trên môi trường MT1được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập được Số thứ tự  Ký hiệu chủng nấm mốc  Đặc điểm khuẩn lạc sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường MT1 ở nhiệt độ 30OC  Số lượng khuẩn lạc (cùng độ pha loãng)     Hình dạng khuẩn lạc  Kích thước khuẩn lạc (mm)  Bề mặt khuẩn lạc  Màu sắc bào tử    1  R1  Dạng tròn, hệ sợi  35  sần sùi, sợi tơ  Màu xám đen  5   2  R2  Dạng tròn, hệ sợi  26  sần sùi, sợi tơ  Màu vàng hoa cau  8   3  R3  Dạng rễ cây, hệ sợi  32  sần sùi, sợi tơ  Màu nâu  6   4  R4  Dạng tròn, hệ sợi  25  sần sùi, sợi tơ  Màu xanh lá cây  9   5  R5  Dạng tròn, hệ sợi  22  sần sùi, sợi tơ  Màu xám xanh  17   6  F1  Dạng không đều, hệ sợi  29  sần sùi, sợi tơ  Màu xanh rêu  7   7  F2  Dạng tròn, hệ sợi  26  sần sùi, sợi tơ  Màu xanh lá cây  6   8  F3  Dạng rễ cây, hệ sợi  31  sần sùi, sợi tơ  Màu nâu  5   9  F4  Dạng rễ cây, hệ sợi  30  sần sùi, sợi tơ  Màu đen  2   10  F5  Dạng tròn, hệ sợi  21  sần sùi, sợi tơ  Màu xanh rêu  9   11  S1  Dạng tròn, hệ sợi  5  sần sùi, sợi tơ  Màu xám đen  1   12  S2  Dạng tròn, hệ sợi  4  sần sùi, sợi tơ  Màu nâu  2   13  S3  Dạng tròn, hệ sợi  5  sần sùi, sợi tơ  Màu trắng  1   14  S4  Dạng tròn, hệ sợi  5  sần sùi, sợi tơ  Màu đen  1   Nhận xét: Như vậy trên cùng một loại môi trường (MT1), trong cùng điều kiện nuôi cấy, phân lập, từ các nguồn R (cơm), F (vỏ cam, chanh), S (đất), ta có thể phân lập được nhiều chủng nấm mốc với đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau. Dựa trên sự khác nhau về kích thước, số lượng khuẩn lạc, có thể nhận thấy các chủng nấm mốc: S1, S2, S3, S4 có số lượng rất ít, kích thước nhỏ hơn nhiều so sới các chủng khác. Như vậy các chủng nấm mốc từ đất có tốc độ sinh trưởng, phát triển chậm hơn từ nguồn cơm và nguồn vỏ cam, chanh. Vì thế ta không chọn chủng này để làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo. Theo lý thuyết và một số tài liệu tham khảo [18], dựa vào đặc điểm khuẩn lạc hệ sợi nấm và đặc biệt là màu sắc bào tử, ta có thể nhận thấy các chủng nấm mốc R1, R2, R3, R4, R5, F1, F2, F3, F4, F5 với các màu sắc từ xanh rêu, vàng hoa cau, nâu đen…có thể có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease nếu như được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc ở những điều kiện thích hợp. Do đó ta chỉ tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme trên các chủng được phân lập từ nguồn R và F. Sau đây là một số hình ảnh về các các ống giống từ các chủng phân lập được từ nguồn R và F:
Hình3.1: Các chủng được phân lập từ nguồn R 
Hình 3.2: Các chủng được phân lập từ nguồn F Kết quả tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao Tiến hành tuyển chọn sơ bộ các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao từ các chủng phân lập được theo phương pháp đo đường kính vòng thủy phân trên môi trường thạch sữa. Sau khi nuôi 3 ngày ta bắt đầu đo đường kính vòng thuỷ phân D và đường kính khuẩn lạc d. Cứ tiếp tục đo D, d trong các ngày tiếp theo. Kết quả tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme protease cao: R5 và F1, cho tỉ lệ D/d đạt giá trị cực đại sau 6 này nuôi được thể hiện ở bảng 3.1, còn các chủng còn lại không tạo vòng thủy phân: Bảng 3.2: Bảng đo đường kính vòng thủy phân và đường kính khuẩn lạc của chủng F1 và R5 Tên chủng  D (mm)  d (mm)  D/d   F1  44  39  1.1282   R5  55.5  50  1.0700   Nhận xét: Trong 10 chủng phân lập được từ R và F chỉ có hai chủng R5 và F1 tạo vòng thủy phân tức có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease, các chủng còn lại thì không có khả năng đó. Do đó ta chọn hai chủng này để khảo sát tiếp theo. Chủng F1 có D/d lớn hơn so với chủng R5, điều này chứng tỏ chủng F1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease mạnh hơn chủng R5 trên môi trường thạch sữa Sau đây là một số hình ảnh mô tả khả năng thủy phân protein sữa của hai chủng F1 và R5:

3.3. Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng F1 và R5 Hình thái khuẩn lạc của chủng F1 và R5 Có thể nói màu sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho từng chủng, giống nấm mốc khác nhau. Do đó ta cần khảo sát hình thái khuẩn lạc cụ thể của F1 và R5 để phỏng đoán sơ bộ chúng thuộc giống mốc nào. Kết quả thể hiện qua hình 3.5 và hình 3.6.

Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc của R5 sau 4 ngày nuôi trên môi trường đặc MT1 Nhận xét: Qua hình thái khuẩn lạc của chủng F1 và R5 được thể hiện ở hai hình trên, ta thấy chủng F1 có bào tử màu xanh lục, hình dạng khuẩn lạc không đều, hệ sợi, bề mặt khuẩn lạc sần sùi, sợi tơ; chủng R5 có màu xám xanh khuẩn lạc dạng tròn, hệ sợi, bề mặt khuẩn lạc sần sùi, sợi tơ tương ứng với bảng 3.1. 3.3.2. Hình thái tế bào của chủng F1 và chủng R5 Sau khi khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc của hai chủng F1 và R5, để góp phần nhận biết chủng, giống của chúng, ta tiếp tục khảo sát hình thái tế bào qua kính hiển vi. Kết quả được thể hiện các qua hình sau:

Hình 3.8: Hình thái thái tế bào của R5 khi phóng đại lên 40
10 lần Nhận xét: Dựa vào khóa phân loại nấm mốc [7] và thông qua màu sắc bào tử (hình 3.5), hình thái tế bào (hình 3.7) của chủng F1, ta thấy mốc này có những đặc điểm giống mốc Pennicillium. Tương tự thông qua màu sắc bào tử (hình 3.6), hình thái tế bào (hình 3.8) của chủng R5, ta thấy mốc này có những đặc điểm giống mốc Aspergillus. Như vậy có thể chủng mốc F1 thuộc giống Pennicillium, chủng R5 thuộc giống Aspergillus. Đây chính là nguồn nấm mốc chủ đạo trong sinh tổng hợp enzyme protease. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của nấm mốc F1 và R5 trong môi trường dịch thể Từ kết quả tuyển chọn sơ bộ các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease, ta thấy chủng F1 và R5 có hoạt tính protease cao. Do đó ta chọn hai chủng này đi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của chúng. Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, người ta phải nuôi cấy chúng trên các môi trường đặc hiệu. Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu. Việc nghiên cứu sản xuất enzyme bằng phương pháp bề mặt đã được tiến hành và cho kết quả tốt. Tuy nhiên, do sản xuất enzyme theo phương pháp bề mặt có nhiều nhược điểm hơn so với phương pháp nuôi cấy bề sâu. Chính vì vậy, trên thế giới việc sản xuất enzyme theo phương pháp bề mặt chỉ chiếm 10%, còn lại 90% được thay thế bằng phương pháp chìm. Do đó ta tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc cũng từ môi trường lỏng (phương pháp chìm). Qui trình thu nhận enzyme protease từ nấm mốc F1 và R5 như sau: Để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease theo mục tiêu đề tài, ta chọn môi trường lên men là môi trường lỏng với thành phần sẽ được chọn thông qua thực nghiệm. Quá trình nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme được thực hiện ở 30OC, trong môi trường có pH = 6 trên máy lắc với tốc độ 300 vòng/phút, trong các bình tam giác có dung tích 250ml chứa 100ml môi trường. Nấm sợi được nhân giống trên môi trường thạch malt để thu nhận bột bào tử rồi cấy vào môi trường lỏng trên với tỷ lệ nhất định không đổi. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật nói chung đã được trình bày ở mục [1.2.6.]. Nắm vững những quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này chúng ta có thể điều khiển hoạt động sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo ý muốn. Trong phạm vi của đề tài, ta chỉ xét ảnh hưởng của một số yếu tố. Sau đây là các kết quả nghiên cứu của về các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt lực protease và tìm ra điều kiện tối thích cho quá trình sinh tổng hợp protease. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng F1 và R5 Đối với mỗi một vi sinh vật, khả năng sinh tổng hợp protease thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào môi trường. Hơn nữa môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ giữa các dạng protease được tổng hợp và tính chất của chúng. Do đó ta cần chọn môi trường để quá trình lên men cho protease có hoạt lực cao.