Đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa

bÊt ®èi nªn chóng tån t¹i d−íi d¹ng 2 cÆp ®ång ph©n ®èi quang. i. Isoflavonoit: Bao gåm c¸c dÉn xuÊt cña 3-phenyl chroman. j. Rotenoit vµ neoflavonoit: C¸c rotenoit cã quan hÖ chÆt chÏ víi c¸c isoflavon vÒ mÆt cÊu tróc còng nh− sinh tæng hîp. 1.2.7. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña phÊn hoa. 1.2.7.1. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ thµnh ph©n ho¸ häc cña phÊn hoa NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 22 N¨m 1993, b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c kÝ cét víi c¸c hÖ dung m«i phï hîp mµ Jean - Claude Dauguet vµ céng sù ®· ph©n lËp c¸c hîp chÊt flavonoit tõ phÊn hoa lµ: aglycone 8-methoxykaempferol (sexangularetin); flavonoit glycozit sexangularetin 3-glucozit, sexangularetin 3-neohesperidoside vµ kaempferol3-neohesperidoside [32]. N¨m 2005, L.B. Almeida-Muradian vµ céng sù ®· ®−a ra ®−îc mét sè thµnh phÇn ho¸ häc cã trong phÊn hoa Brazil nh− sau [36]: B¶ng 1.3. Hµm l−îng mét sè thµnh phÇn ho¸ häc cã trong phÊn hoa Brazil [36] PhÊn hoa tu¬i PhÊn hoa kh« §é Èm (%) 7,4 ± 0,7 - Protein (%) 20 ± 4 21 ± 4 Lipit (%) 6 ± 2 7± 2 T¹p chÊt (%) 2,2 ± 0,7 2,4 ± 0,8 N¨m 2006, Tania Maria Sarmento Silva vµ céng sù sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ®· ph©n lËp ®−îc thªm 8 hîp chÊt lµ: β-sitosterol, tricetin, selagin), 8-methoxiherbacetin, D-mannitol, D-mannitol hexaacetate, naringenin, vµ isorhamnetin. Tuy nhiªn trong nghiªn cøu nµy ch−a ®−a ra ®−îc c¸c d÷ kiÖn ®Ó x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c chÊt ®· ph©n lËp ®−îc. §ång thêi nghiªn cøu nµy còng ®· x¸c ®Þnh ®−îc ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ cña phÊn hoa [52] 1.2.7.2. Mét sè kÕt qu¶ vÒ ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ cña phÊn hoa N¨m 2007, C¸c nhµ khoa häc Mexico ®· nghiªn cøu vÒ ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ cña phÊn hoa. KÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy phÊn hoa lµ mét t¸c nh©n chèng oxi ho¸ tù nhiªn v× cã chøa hµm l−îng flanonoit cao. Hä còng ®· kÕt luËn r»ng phÊn hoa cã ho¹t ®éng chèng oxi ho¸ cã liªn quan ®Õn nång ®é NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 23 flavonol, nÕu ë nång ®é cao th× phÊn hoa cã t¸c dông chèng oxi ho¸ m¹nh mÏ [37]. N¨m 2009, Ana Saric vµ céng sù còng ®· kh¼ng ®Þnh r»ng, trong phÊn hoa cã chøa hµm l−îng flavonoit cao. MÆc dï flavonoit cã kh¶ n¨ng hÊp thu kÐm trong c¬ thÓ, nh−ng sau khi hÊp thu vµo m¸u chóng nhanh chãng chuyÓn ho¸ ë ruét vµ gan, trë thµnh chÊt chèng oxi ho¸ ho¹t ®éng m¹nh hoÆc ng¨n chÆn c¸c gèc tù do cã ®éc tÝnh, chèng sù c¨ng th¼ng. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 24 Ch−¬ng 2: Thùc NghiÖm 2.1. §èi t−îng vµ kü thuËt thùc nghiÖm 2.1.1. Nguyªn liÖu - S÷a ong chóa t−¬i ®−îc c«ng ty cæ phÇn Ong mËt §¾c L¾c cung cÊp, ®−îc b¶o qu¶n l¹nh ë -20oC. MÉu tr−íc khi ®em nghiªn cøu ®−îc lµm kh« b»ng sÊy ®«ng kh«. - PhÊn hoa ®−îc c«ng ty cæ phÇn Ong mËt §¾c L¾c cung cÊp. MÉu tr−íc khi ®em nghiªn cøu ®−îc b¶o qu¶n kh« trong tñ n¬i tho¸ng m¸t vµ tr¸nh ¸nh s¸ng. 2.1.2. Ho¸ chÊt - Dung m«i h÷u c¬: Axeton, ®iclometan, etannol, etylaxetat, n-hexan, metanol, clorofom… C¸c dung m«i nµy ®Òu lµ ho¸ chÊt c«ng nghiÖp Trung Quèc. Tr−íc khi sö dông c¸c dung m«i ®Òu ®−îc lµm khan vµ ch−ng cÊt l¹i. Sau ®ã pha hÖ dung m«i theo tû lÖ phï hîp víi yªu cÇu sö dông trong s¾c ký. Dïng ®òa thuû tinh khuÊy cho c¸c dung m«i trén ®Òu vµo nhau råi ®−a lªn ch¹y cét. NÕu ch¹y s¾c ký líp máng th× ph¶i ®îi dung m«i ®Õn khi b·o hoµ míi ®−îc sö dông. - Ho¸ chÊt kh¸c: ADC, RB, H2O2 0,2N, Indigo 0,1N, DMSO 20 mg/ml, Natriaxetat, TCA, Abumin huyÕt thanh bß, OPA, FMOC, HCl, Phenol, H2SO4, vanilin, CeSO4, c¸c dung m«i chuÈn cho HPLC. 2.1.3. C¸c dông cô vµ trang thiÕt bÞ nghiªn cøu Dông cô vµ trang thiÕt bÞ nghiªn cøu ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 2.1. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 25 B¶ng 2.1: C¸c dông cô vµ thiÕt bÞ nghiªn cøu - B¶n máng tr¸ng s½n TLC (AluO, silica Gel 60 F254, 0.2mm) Merck Silica Gel 60, 0,04-0,063 mm mesh size Merck Sephadex LH 20,25 – 100 mm mesh size Merck Metanol for HPLC, MeOH LiChrosolv HPLC Merck Cét s¾c ký Schot C©n ph©n tÝch Sartorious RC 210P Tñ sÊy Heraeus T5050 M¸y høng ph©n ®o¹n ISCO Cygnet HPLC – Water Pump:Dionex P580A LPG HPLC program:Chromeleon (V.6.3) Detector: Photodiode Array Detector UVD 340 S Column thermostat: STH 585 Autosampler: ASI-100T HPLC/MS – Aglient 1100 ThermoFinnigan LCQ Deca M¸y quay cÊt ch©n kh«ng Büchi Rotavap RE111 Siªu ©m Bendelin Sonorex RK 102 §Ìn tö ngo¹i Camag (254 and 366 nm) M¸y NMR Brucker 500 MHz 2.1.4. C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch, ph©n t¸ch vµ ph©n lËp c¸c hîp chÊt a. C¸c ph−¬ng ph¸p chiÕt mÉu NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 26 * Chän dung m«i chiÕt Th−êng th× c¸c chÊt chuyÓn ho¸ thø cÊp trong thùc vËt cã ®é ph©n cùc kh¸c nhau. Tuy nhiªn nh÷ng thµnh phÇn tan trong n−íc Ýt khi ®−îc quan t©m. Dung m«i dïng cho qu¸ tr×nh chiÕt cÇn ph¶i ®−îc lùa chän rÊt cÈn thËn. §iÒu kiÖn cña dung m«i lµ ph¶i hoµ tan ®−îc nh÷ng chÊt chuyÓn ho¸ thø cÊp ®ang nghiªn cøu, dÔ dµng ®−îc lo¹i bá, cã tÝnh tr¬ (kh«ng ph¶n øng víi chÊt nghiªn cøu), kh«ng ®éc, kh«ng dÔ bèc ch¸y. Nh÷ng dung m«i nµy nªn ®−îc ch−ng cÊt ®Ó thu ®−îc d¹ng s¹ch tr−íc khi sö dông. Sau khi chiÕt dung m«i ®−îc cÊt ra b»ng m¸y cÊt quay ë nhiÖt ®é kh«ng qu¸ 400- 450C, víi mét vµi ho¸ chÊt chÞu nhiÖt cã thÓ thùc hiÖn ë nhiÖt ®é cao h¬n. * Qu¸ tr×nh chiÕt Qu¸ tr×nh chiÕt ®¬n gi¶n ®−îc ph©n lo¹i nh− sau: - ChiÕt ng©m. - ChiÕt sö dông mét lo¹i thiÕt bÞ lµ b×nh chiÕt Xoclet. - ChiÕt s¾c víi dung m«i n−íc. - ChiÕt l«i cuèn theo h¬i n−íc. - ChiÕt siªu ©m. Tuú thuéc môc ®Ých cÇn chiÕt lÊy chÊt g× ®Ó lùa chän dung m«i cho thÝch hîp vµ thùc hiÖn qui tr×nh chiÕt hîp lÝ ®Ó ®¹t hiÖu qu¶ cao. b. C¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký * S¾c ký líp máng (TLC) S¾c ký líp máng ®−îc thùc hiÖn trªn b¶n máng tr¸ng s½n DC – Alufolien 60 F254 (Merck). Ph¸t hiÖn chÊt b»ng ®Ìn tö ngo¹i ë hai b−íc sãng 254 nm vµ 368 nm hoÆc dïng thuèc thö, sÊy kh« h¬ nãng trªn bÕp ®iÖn tõ tõ ®Õn khi hiÖn mµu. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 27 C¸ch ®−a chÊt lªn TLC: LÊy mét l−îng nhá mÉu chÊt hoµ tan b»ng 2-3 giät dung m«i thÝch hîp, sau ®ã dïng capila chÊm chÊt lªn líp máng. Dung m«i: Pha hÖ dung m«i thÝch hîp, l¾c kü cho c¸c dung m«i trén ®Òu nhau trong hÖ råi cho vµo b×nh khai triÓn ®¸y b»ng cã n¾p nh¸m. §Ëy n¾p l¹i vµ ®îi ®Õn khi dung m«i b·o hoµ th× cho b¶n máng vµo ch¹y. * S¾c ký cét (CC) S¾c ký cét ®−îc tiÕn hµnh víi hîp chÊt hÊp phô lµ silica Gel cã cì h¹t lµ 0,04 -0,063 mm. Dung m«i ®−îc dïng trong s¾c ký cét lµ: metanol, diclometan, n-hexan, etylaxetat, axeton… C¸c dung m«i ®Òu ®−îc lµm khan, ch−ng cÊt l¹i vµ b¶o qu¶n trong chai kÝn. ChÊt cÇn ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét ®−îc hoµ tan trong dung m«i, thªm mét l−îng nhá chÊt hÊp phô. Trén ®Òu hçn hîp vµ lµm bay h¬i hÕt dung m«i. thu ®−îc hçn hîp ë d¹ng bét t¬i. Khi ®−a chÊt lªn cét chÊt hÊp phô ph¶i dµn ®Òu vµ dïng b«ng thuû tinh phñ lªn bÒ mÆt chÊt. Nhåi cét s¾c ký theo ph−¬ng ph¸p nhåi kh« hoÆc nhåi −ít, trong qu¸ tr×nh nhåi cét ph¶i lo¹i bá triÖt ®Ó c¸c bät khÝ b»ng c¸ch cho dung m«i ch¶y qua cét nhiÒu lÇn vµ gâ nhÑ vµo th©n cét. Khi cét ®· æn ®Þnh cã thÓ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký cét. * S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao – ph©n tÝch (HPLC – ph©n tÝch) §èi víi kü thuËt HPLC ph©n tÝch, hiÖu n¨ng ph©n t¸ch ®¹t ®−îc dùa trªn viÖc sö dông b¬m ¸p suÊt cao ®Ó ®Èy dung m«i pha ®éng qua cét s¾c ký. Kü thuËt ph©n tÝch HPLC ®−îc sö dông ®Ó nhËn d¹ng c¸c pic tõ c¸c dÞch chiÕt hoÆc c¸c ph©n ®o¹n. C¸c thµnh phÇn kh¸c nhau ®−îc ®−a qua cét víi c¸c tèc ®é dßng tuú theo sù ph©n bè gi÷a dung m«i pha ®éng vµ pha tÜnh. HÖ dung m«i ®−îc dïng d−íi d¹ng gradient lµ MeOH : n−íc (nanopure) cã sö dông ®Öm pH=2 b»ng axÝt photsphoric víi sù t¨ng dÇn cña MeOH ®Õn 100% trong NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 28 thêi gian 45 phót. C¸c hîp chÊt ®−îc ph¸t hiÖn b»ng UV- VIS diode array detector. * S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao - ®iÒu chÕ (HPLC – preparative) Ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ®iÒu chÕ lµ ph−¬ng ph¸p hiÖn ®¹i nhÊt ®Ó ph©n lËp c¸c hîp chÊt cã ®é ph©n cùc cao ®èi víi c¸c ph©n ®o¹n ®· qua xö lý b»ng c¸c cét s¾c ký thÝch hîp. C¸c hîp chÊt ®−îc ph¸t hiÖn trªn UV – VIS diode array detector. 2.1.5. C¸c ph−¬ng ph¸p c¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc c¸c hîp chÊt * Phæ khèi l−îng (ESI – MS) Phæ khèi l−îng phun mï ®iÖn tö (Electronspray Ionization Mass Spectra) ®−îc ®o trªn m¸y AGILENT 1100 LC – MSD trap cña ViÖn Ho¸ häc,ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. * Phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n (NMR) Phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n (NMR): 1H- NMR (500MHz) và 13C-NMR (125 MHz) ®−îc ®o trªn m¸y Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. 2.1.6. Ph−¬ng ph¸p thö ho¹t tÝnh sinh häc a. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh chèng «xy hãa * Nguyªn t¾c Dùa trªn c¬ së x¸c ®Þnh ho¹t ®éng cña enzym peroxydaza m¸u ng−êi xóc t¸c cho ph¶n øng oxi ho¸ indigocacmin khi cã mÆt H2O2 trong m«i tr−êng axÝt yÕu. Ho¹t ®éng cña enzym ®−îc ®¸nh gi¸ b»ng viÖc lµm gi¶m mµu cña indigocacmin vµ ®−îc ®o hÊp thô ë b−íc sãng 600 nm trªn m¸y quang phæ Genios Tecan (¸o). * TiÕn hµnh NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 29 OD®èÝ chøng (-) - ODmÉu OD®èi chøng (-) - OD®èichøng(+) - M¸u t−¬i ®−îc chèng ®«ng b»ng ADC (Citrat dextroz¬ adenin), pha lo·ng 1/500 lÇn b»ng dung dÞch NaCl 0.9%. - H2O2 0,2N hay 2% - Indigo: chuÈn bÞ dung dÞch stock -80oC: 0,1N. Pha lo·ng 100 lÇn thµnh dung dÞch ph¶n øng cã nång ®é 0,001N. - MÉu phÊn hoa pha lo·ng trong DMSO 100% vµ dung dÞch ®Öm ph¶n øng ®−îc thªm vµo ph¶n øng sao cho nång ®é cuèi cïng ®¹t 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml. - Ph¶n øng bao gåm: + 50µl ®Öm natri axetat 0,1N cã pH 4,7. + 10 µl mÉu pha trong DMSO vµ ®Öm + 60 µl enzym pha lo·ng 500 lÇn + 60 µl H2O2 0,2N hay 2% + 20 µl indigocacmin 0,001N + 50 µl TCA 20% - GiÕng ®èi chøng ©m kh«ng cã enzym, kh«ng cã chÊt khö, giÕng ®èi chøng d−¬ng enzym ho¹t ®éng 100%, kh«ng cã chÊt khö. - §Ó thêi gian ph¶n øng 20-25 phót ë nhiÖt ®é phßng, dõng c¸c ph¶n øng b»ng TCA. §äc kÕt qu¶ ë b−íc sãng 600 nm. Dïng chÊt tham kh¶o lµ Resveratrol IC50 = 5,24 µg/ml. * Xö lý kÕt qu¶ TÝnh ho¹t ®éng cña enzym peroxydaza ®−îc tÝnh theo c«ng thøc sau: AE% = . 100% NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 30 ODmÉu - OD®íÝ chøng (+) OD®èi chøng (-) - OD®èichøng(+) PhÇn tr¨m k×m h·m ho¹t ®éng cña enzym ®−îc tÝnh b»ng c«ng thøc: IC =100% - AE% Gi¸ trÞ IC50 (nång ®é øc chÕ 50%) ®−îc tÝnh dùa trªn t−¬ng quan cña nång ®é chÊt thö vµ gi¸ trÞ IC ®−îc tÝnh theo c«ng thøc trªn. b. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh ung th− Dßng tÕ bµo ung th− ®−îc nu«i cÊy trong m«i tr−êng nu«i cÊy phï hîp cã bæ sung thªm 10% huyÕt thanh ph«i bß (FBS) vµ c¸c thµnh phÇn kh¸c ë ®iÒu kiÖn tiªu chuÈn. Dßng tÕ bµo ung th− biÓu m« KB (Human epidermic carcinoma) ë ng−êi ®−îc cung cÊp bëi ATCC. - Thö ®éc tÕ bµo: + 200 µl dung dÞch tÕ bµo pha ë log nång ®é 3.104 tÕ bµo/ml vµo mçi giÕng (®Üa 96 giÕng) trong m«i tr−êng RPMI 1640. + MÉu s÷a ong chóa ®−îc xö lý víi c¸c tÕ bµo ë c¸c nång ®é pha lo·ng kh¸c nhau sao cho ®¹t ®Õn nång ®é cuèi cïng lµ 256 µg/ml; 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml. ñ ë 370C, 5% CO2 trong 3 ngµy, thªm 50 µl MTT, ñ 370C trong 4 giê. + Lo¹i bá m«i tr−êng, thªm 10 µl DMSO l¾c ®Òu, ®äc kÕt qu¶ ë b−íc sãng 540 nm trªn m¸y Spectrophotometer Genios Tecan. PhÇn tr¨m k×m h·m sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo: IC50= Gi¸ trÞ IC50 ®−îc tÝnh dùa trªn kÕt qu¶ sè liÖu phÇn tr¨m k×m h·m (IC50) sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo b»ng phÇn mÒm m¸y tÝnh table curve. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 31 2.2. Quy tr×nh ph©n lËp chÊt trong s÷a ong chóa vµ phÊn hoa 2.2.1 Quy tr×nh ph©n lËp chÊt trong s÷a ong chóa 2.2.1.1 X¸c ®Þnh hµm l−îng protein * Nguyªn t¾c X¸c ®Þnh hµm l−îng protein trong s÷a ong chóa b»ng ph−¬ng ph¸p Bradford lµ ph−¬ng ph¸p phæ biÕn nhÊt vµ cã ®é nh¹y cao. Ph−¬ng ph¸p nµy dùa trªn sù thay ®æi b−íc sãng hÊp thô cùc ®¹i cña thuèc nhuém Coomassie Brilliant Blue khi t¹o phøc víi protein. Trong dung dÞch mang tÝnh axit, khi ch−a kÕt nèi víi protein th× thuèc nhuém cã b−íc sãng hÊp thô cùc ®¹i 465 nm; khi kÕt hîp víi protein th× thuèc nhuém hÊp thô cùc ®¹i ë b−íc sãng 595 nm. §é hÊp thô ë b−íc sãng 595 nm cã liªn hÖ mét c¸ch trùc tiÕp tíi nång ®é protein. H×nh 2.1: C«ng thøc cña ph©n tö Coomassie Brilliant Blue * Ph−¬ng ph¸p tiÕn hµnh Tr−íc tiªn x©y dùng mét ®−êng chuÈn víi dung dÞch protein chuÈn ®· biÕt tr−íc nång ®é. Dung dÞch protein chuÈn lµ albumin huyÕt thanh bß. Sau khi cho dung dÞch protein vµo dung dÞch thuèc nhuém, mµu sÏ xuÊt hiÖn sau 2 phót vµ bÒn tíi 1 giê. TiÕn hµnh ®o dung dÞch b»ng m¸y quang phæ kÕ ta ®−îc NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 32 ODx, ®é hÊp thô sÏ tû lÖ víi l−îng trong mÉu. Thùc hiÖn mét ®èi chøng víi n−íc cÊt (OD0). LÊy gi¸ trÞ OD = ODx – OD0. L−îng protein mÉu trong dung dÞch ®o ®−îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch chÊm trªn ®−êng chuÈn theo OD, lÊy gi¸ trÞ cña ®iÓm ®ã trªn trôc hoµnh. §ã chÝnh lµ hµm l−îng Protein mÉu trong dung dÞch ®o. Dùng ®−êng chuÈn Albumin: - Pha lo·ng dung dÞch albumin gèc 10% ra nång ®é 0.1% vµ cø tiÕp tôc pha lo·ng 2 lÇn thu ®−îc c¸c nång ®é: 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625%, 0,003125%. - Cho 90 µl dung dÞch thuèc thö Bradford vµo c¸c giÕng trªn ®Üa 96 giÕng. - TiÕp tôc cho 10 µl albumin ®· pha lo·ng, tÝnh thêi gian, mçi nång ®é lÆp l¹i hai lÇn - Sau 5 phót, tiÕn hµnh ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch ë b−íc sãng 595 nm - TiÕn hµnh x©y dùng ®−êng tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é albumin chuÈn vµ gi¸ trÞ OD595 TiÕn hµnh t−¬ng tù ®èi víi mÉu s÷a ong chóa cÇn ®Þnh l−îng protein: - C©n 6 mg s÷a ong chóa vµ hoµ tan trong 6 ml n−íc cÊt. §å thÞ thÓ hiÖn mèi t−¬ng quan gi÷a nång ®é protein vµ OD595 ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 2.2. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 33 y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 20 40 60 80 100 120 Series1 Linear (Series1) H×nh 2.2 : §−êng chuÈn t−¬ng quan gi÷a nång ®é protein vµ OD595 Nh− vËy ph−¬ng tr×nh biÓu diÔn mèi quan hÖ gi÷a nång ®é Protein vµ gi¸ trÞ OD lµ: Y = 0.0034X + 0.0069 2.2.1.2 Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch axit amin * Nguyªn t¾c - C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch axÝt amin dùa trªn nguyªn lý: Thuû ph©n protein thµnh peptit, dÉn xuÊt ho¸ vµ ph©n tÝch c¸c dÉn xuÊt axÝt amin. - §é chÝnh x¸c cña viÖc ph©n tÝch phô thuéc vµo tÝnh lÆp l¹i cña ph−¬ng ph¸p mµ cßn phô thuéc vµo hiÖu qu¶ cña ph¶n øng ph©n c¾t vµ qu¸ tr×nh dÉn xuÊt ho¸. - Ph−¬ng ph¸p nµy sö dông OPA (o-phthaldialdehyd) vµ FMOC ( 9- Fluorenylmethyl chloroformate) t¹o dÉn xuÊt cña chóng trªn hÖ HP aminoquant series II. OPA lµ mét chÊt kh«ng ph¸t quang nh−ng kÕt hîp víi axÝt amin bËc mét t¹o nªn isoindoles cã kh¶ n¨ng ph¸t quang cao. Cßn chÊt FMOC cã kh¶ n¨ng ph¶n øng nhanh víi c¸c axÝt amin, dÔ t¹o s¶n phÈm ph¸t quang bÒn v÷ng. * Ph−¬ng ph¸p tiÕn hµnh NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 34 - Sö dông ph−¬ng ph¸p thuû ph©n mÉu s÷a ong chóa b»ng HCl 6N cã chøa 0.5% phenol ë ®iÒu kiÖn 110°C vµ 24 giê. Sau khi thuû ph©n xong lµm s¹ch dung dÞch b»ng ly t©m vµ läc bá tña. - Sau ®ã lÊy mét l−îng dung dÞch mÉu ®em ®i c« b»ng m¸y speed vac ®Õn kh«. - CÆn kh« ®−îc hoµ tan b»ng HCl 0.1N ®Ó chuÈn bÞ cho lªn cét s¾c kÝ. - MÉu läc s¹ch ®−îc cho vµo èng microvial cïng víi axit amin chuÈn nång ®é 250 pmol. DÉn xuÊt ho¸ tiÒn cét ®−îc tiÕn hµnh tù ®éng theo tr×nh tù: ®Öm borat, OPA, FMOC, trén ®Òu, b¬m vµo cét. Qu¸ tr×nh s¾c kÝ ®−îc tiÕn hµnh tù ®éng ë 40°C. 2.2.1.3 ChiÕt mÉu s÷a ong chóa vµ ph©n lËp axÝt 10 – HDA - MÉu s÷a ong chóa (30g) ®· ®−îc sÊy ®«ng kh« ®Ó lo¹i n−íc råi tiÕn hµnh chiÕt siªu ©m trong CH2Cl2; CH2Cl2:MeOH (2:1) vµ MeOH. - Lo¹i dung m«i thu ®−îc c¸c cÆn cÇn thiÕt. - Ch¹y s¾c kÝ cét sö dông Sephadex LH-20; silicagel 0,04-0,06 mm. C¸c ph©n ®o¹n sau khi t¸ch ra ®−îc kiÓm tra b»ng HPLC ph©n tÝch ë b−íc sãng 214 nm ®Ó ®Þnh h−íng tinh chÕ tiÕp, cuèi cïng thu ®−îc hîp chÊt 1 (10 – HDA) ë d¹ng v« ®Þnh h×nh mÇu tr¾ng. * D÷ kiÖn phæ cña chÊt 1 (10-HDA) ESI-MS m/z: [M+H]+ 186,8; kÕt qu¶ tÝnh to¸n lÝ thuyÕt cho c«ng thøc C10H18O3. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 5,81 (dt; 1,5 Hz; 17Hz, H-2), δ 6,97 (dt; 7Hz; 17Hz; H-3); δ 3,56 (t; 6,5 Hz; H-10); δ 2,25 (t; H-4); δ 2,30 (H- 9), δ 1,55(m, H-5, H-6) và δ 1,50 (m, H-7, H-8). NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 35 2.2.2. ChiÕt mÉu phÊn hoa vµ ph©n lËp hîp chÊt 2 (7-O-β – Xyloside-naringenin) - MÉu phÊn hoa (450g) ®−îc ®em ®i xay nghiÒn nhá råi lÇn l−ît chiÕt b»ng ba dung m«i cã ®é ph©n cùc t¨ng dÇn lµ n-hexan, etyl axetat vµ metanol. - Hîp chÊt 2 ®−îc ph©n lËp theo 2 c¸ch sau ®©y: *C¸ch 1: LÊy 3,2 gam dÞch chiÕt trong metanol tæng cña phÊn hoa ®· thu ®−îc ë trªn, tÈm silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) råi quay kh« ®−a lªn cét ϕ3 theo ph−¬ng ph¸p nhåi kh«. Pha tÜnh ®−îc dïng còng lµ silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) víi l−îng gÊp 30 lÇn khèi l−îng cña chÊt ®−îc ®−a lªn cét. Chän dung m«i nhåi cét lµ etylaxetat vµ pha ®éng ch¹y cét lµ hÖ dung m«i gradient etylaxetat - metanol. Sau khi ch¹y xong thu ®−îc 63 ph©n ®o¹n, kiÓm tra b¶n máng TLC vµ tiÕn hµnh gép thu ®−îc 5 ph©n ®o¹n chÝnh ký hiÖu lµ F1-F5. Ph©n ®o¹n F4 ®−îc ch¹y TLC ®iÒu chÕ thu ®−îc chÊt 2. *C¸ch 2: LÊy 10 gam dÞch chiÕt phÊn hoa trong metanol ®−a lªn cét Sephadex ϕ 3 theo ph−¬ng ph¸p nhåi −ít, víi pha tÜnh lµ Sephadex LH 20, 25 - 100 mm mesh size (Merck), dung m«i pha ®éng ®−îc sö dông lµ 100% metanol thu ®−îc 40 ph©n ®o¹n. KiÓm tra b¶n máng TLC tiÕn hµnh gép c¸c ph©n ®o¹n gièng nhau thu ®−îc 6 ph©n ®o¹n ký hiÖu lµ F1-F6. Ph©n ®o¹n F4 (®−îc gép tõ ph©n ®o¹n 28 ®Õn ph©n ®o¹n 32) ®−îc ch¹y trªn cét ϕ 1 ®Ó t¸ch tiÕp, sö dông pha tÜnh lµ silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) vµ hÖ dung m«i gradient diclometan-metanol thu ®−îc 36 ph©n ®o¹n nhá ký hiÖu lµ F4.1 – F4.36. Hîp chÊt 2 thu ®−îc tõ ph©n ®o¹n F4.17. S¬ ®å ph©n lËp chÊt 2 ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 2.3 d−íi ®©y. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 36 TLC điều chế EtylOAc/ MeOH Silicagel 60 0.04-0.063mm 100% MeOH SepHDAex LH 20,25 – 100 mm Sắc kí cột (DCM/MeOH) H×nh 2.3: S¬ ®å ph©n lËp chÊt 2 * D÷ kiÖn phæ cña chÊt 2 ESI-MS m/z: 427 [M+Na]+, 403,36 [M-H]-, 404,8 [M+H]+, KÕt qu¶ tÝnh to¸n lÝ thuyÕt cho c«ng thøc ph©n tö lµ C20H20O9. Rf = 0,55 (TLC, silicagel, hÖ dung m«i diclometan – metanol (9:1, v/v)) 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): δ 5,33 (dd, 5 Hz; 10 Hz, H-2), δ 2,70 (dd, 5 Hz; 15 Hz, H-3A), δ 3,01 (dd, 15 Hz; 20 Hz; H-3B), δ 6,34 (d, 2,2 Hz; H-6), δ 6,11 (d; 2,2 Hz; H-8), δ 7,30 (d; 8,8; H-2’), δ 6,80 (d; 8,8; H-3’), δ 4,88 (d; 5,0 Hz; H-1”); δ 3,44 (dd; 5,0 Hz; 15Hz; H-2”); δ 3,30 (dd; H-3”); δ 3,42 (dd; H-4”); δ 4,0 (dd; 5,0 Hz; 10 Hz; H-5”). F1 F2 F3 F4 F5 chất 2 DC Phấn hoa (MeOH) 3,2 gam F1 F2 (12 – 17) F3 F4 (28-32) F5 DC Phấn hoa (MeOH) 10 gam F6 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 37 Ch−¬ng 3: KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. KÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ S÷a ong chóa 3.1.1. Hµm l−îng protein trong s÷a ong chóa Tõ kÕt qu¶ OD cña mÉu s÷a ong chóa là 0,636 ta cã gi¸ trÞ: X = (0,636 - 0,0069 - 0,1842)/0,0034 = 131 µg/ml. Nång ®é protein trong s÷a ong chóa là: % pr = (131x 6)/ 6000x 100 = 13.1% S÷a ong chóa chøa hàm l−îng protein chiÕm kho¶ng 13,1%. Trong khi ®ã hµm l−îng protein trong mËt ong chØ lµ 0,2% [45]. Protein lµ chÊt dinh d−ìng quan träng, lµ c¬ së sinh häc cña sù sèng, lµ nguyªn liÖu cÊu thµnh nªn c¸c tæ chøc, ®ãng vai trß quan träng trong sù sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña c¬ thÓ. Chóng tån t¹i trong tÊt c¶ c¸c tÕ bµo, ph©n bè rÊt réng trong c¬ b¾p, da, x−¬ng, m¸u, tãc, mãng tay, dÞch tiªu ho¸… Nã cã rÊt nhiÒu chøc n¨ng nh− lµm xóc t¸c cho c¸c ph¶n øng; vËn chuyÓn c¸c chÊt trong c¬ thÓ; tham gia vµo qu¸ tr×nh chuyÓn ®éng cña c¸c c¬, chuyÓn vÞ trÝ cña nhiÔm s¾c thÓ trong qu¸ tr×nh ph©n bµo; b¶o vÖ c¬ thÓ b»ng c¸ch ph¸t hiÖn vµ lo¹i trõ nh÷ng chÊt l¹ x©m nhËp vµo c¬ thÓ; ®iÒu hoµ qu¸ tr×nh truyÒn th«ng tin, trao ®æi chÊt. Ngoµi ra, protein cßn cã chøc n¨ng dù tr÷ dinh d−ìng [4]. Nhê c¸c chÊt ®ång vÞ phãng x¹ mµ ng−êi ta x¸c ®Þnh lµ mét nöa l−îng protein trong c¬ thÓ ®−îc ®æi míi trong vßng 80 ngµy. NÕu l−îng protein c¬ thÓ hÊp thô kh«ng ®ñ th× c¸c c¬ quan trong c¬ thÓ dÔ suy yÕu vµ m¾c bÖnh. V× thÕ trªn thùc tÕ, t×nh h×nh cung cÊp protein cho c¬ thÓ lµ tiªu chÝ c©n b»ng kÕt cÊu thùc phÈm vµ t×nh tr¹ng dinh d−ìng cña con ng−êi. Do ®ã mµ chóng ta lu«n ph¶i cung cÊp ®Çy ®ñ protein. Nh− vËy víi hµm l−îng protein kh¸ cao (13,1%), s÷a ong chóa cã thÓ ®−îc sö dông nh− mét trong c¸c nguån cung cÊp protein cho c¬ thÓ con ng−êi. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 38 3.1.2. KÕt qu¶ ph©n tÝch thành phÇn axÝt amin tõ s÷a ong chóa Sau khi tiÕn hµnh ch¹y mÉu b»ng chÕ ®é ch¹y tù ®éng trªn m¸y ta thu ®−îc s¾c ký ®å ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 3.1: H×nh 3.1. S¾c ký ®å thành phÇn axit amin trong s÷a ong chóa Qua s¾c ký ®å ta thÊy axÝt aspartic cã chiÒu cao pic lµ cao nhÊt ®ång nghÜa víi diÖn tÝch pic cña nã lín nhÊt nªn hµm l−îng cña axÝt nµy trong s÷a ong chóa so víi c¸c axÝt amin kh¸c lµ cao nhÊt. TiÕp theo axÝt aspartic lµ axÝt glutamic, tiÕp ®Õn lµ c¸c pic cña c¸c axit min cã chiÒu cao pic h¬n kÐm nhau kh«ng nhiÒu lµ valin, leucin, lysin, phenylalanin… vµ pic thÊp nhÊt lµ histidin. Qua viÖc sö dông c¸c phÇn mÒm trªn m¸y tÝnh ta thu ®−îc b¶ng gi¸ trÞ hµm l−îng c¸c axÝt amin cã trong s÷a ong chóa nh− b¶ng 3.1. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 39 Bảng 3.1: Hàm lượng c¸c axÝt amin trong sữa ong chóa ( g axÝt amin/ 100g mẫu) Tõ b¶ng trªn, ta x©y dùng ®−îc biÓu ®å sau: Stt AxÝt amin % Stt AxÝt amin % 1 AxÝt Aspartic 5.54 10 Cystein + cystin 0.45 2 AxÝt Glutamic 3.39 11 Valin 2.14 3 Serin 1.25 12 Methionin 0.60 4 Histidin 0.21 13 Phenylalanin 1.73 5 Glycin 1.30 14 Isoleucin 1.64 6 Threonin 1.54 15 Leucin 2.74 7 Alanin 1.15 16 Lysin 2.90 8 Arginin 1.64 17 Proline 0.97 9 Tyrosin 1.20 Tổng số 30.39 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 40 Axit Aspartic Axit Glutamic Serine Histidine Glycine Threonine Alanine Arginine Tyrosine Cysteine + cystine Valine Methionine Phenylalanine Isoleucine Leucine Lysine Proline other H×nh 3.2: BiÓu ®å biÓu thÞ hµm l−îng axÝt amin trong s÷a ong chóa AxÝt amin chÝnh lµ s¶n phÈm ph©n gi¶i cña protein, lµ ®¬n vÞ c¬ b¶n t¹o nªn protein. Môc tiªu cuèi cïng cña qu¸ tr×nh con ng−êi hÊp thô protein lµ cã ®−îc c¸c axÝt amin cÇn thiÕt cho c¬ thÓ. Dùa vµo b¶ng 3.1 vµ biÓu ®å biÓu thÞ hµm l−îng axÝt amin trong s÷a ong chóa ta thÊy tæng sè axÝt amin cã trong s÷a ong chóa t−¬ng ®èi cao, chiÕm kho¶ng 30,39 %. Trong sè ®ã cã chøa nh÷ng axÝt amin thiÕt yÕu ®èi víi c¬ thÓ con ng−êi nh−: valin (2.14%), leucin (2.74%), methionine (0.6%), threonin (1,54 %), phenylalanin (1.73%), lysin (2.90%), arginin (1.64%). TÊt c¶ c¸c axit amin nµy ®Òu cã hµm l−îng t−¬ng ®èi cao. Nh− vËy, víi viÖc x¸c ®Þnh ®−îc hµm l−îng c¸c axÝt amin nãi chung vµ c¸c axÝt amin thiÕt yÕu nãi riªng th× ta thÊy r»ng s÷a ong chóa còng lµ mét nguån cung cÊp c¸c axÝt amin quan träng cho c¬ thÓ ng−êi. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 41 3.1.3. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh cÊu tróc hîp chÊt 1 (10-HDA) Hîp chÊt 1: axÝt 10 – Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) ®−îc ph©n t¸ch tõ dÞch chiÕt CH2Cl2: MeOH d−íi d¹ng bét v« ®Þnh h×nh mµu tr¾ng. Trªn phæ 1H - NMR cho thÊy c¸c tÝn hiÖu rÊt ®Æc tr−ng cña mét axÝt bÐo cã mét nèi ®«i t¹i δ 5.81 ( dt, 1.5 Hz; 17Hz) vµ δ 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) lµ cña H-2 vµ H-3 d¹ng trans. Ngoµi ra tÝn hiÖu triplet t¹i δ 3.56 (t, 6,5 Hz) là cña proton H-10. Hai proton H-4 cã tÝn hiÖu céng h−ëng t¹i δ 2,25 trong khi H-9 cã tÝn hiệu céng h−ëng t¹i δ 2,30. Bèn cÆp proton H-5, H-6, H-7 và H-8 cã c¸c tÝn hiệu trïng lÆp t¹i δ 1,55 ppm và δ 1,50 ppm .Phæ 1H –NMR cña chÊt 1 ®−îc m« t¶ ë h×nh 3.3 d−íi ®©y. H×nh 3.3: Phæ 1H-NMR cña chÊt 1 (10-HDA) Ngoµi ra, dùa vµo phæ khèi bôi electron (ESI-MS) cho pÝc ion ph©n tö gi¶ ®Þnh [M+H]+ t¹i m/z 186.8 øng víi c«ng thøc ph©n tö C10H18O3. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 42 H×nh 3.4: Phæ ESI-MS cña chÊt 1 (10-HDA) Dùa vµo phæ khèi l−îng ph©n tö vµ c¸c tÝn hiÖu trªn phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n 1H-NMR, kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu vÒ phæ, hîp chÊt 1 ®−îc x¸c ®Þnh là axit 10-Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) phï hîp víi c¸c sè liÖu cña t¸c gi¶ Naoki Noda vµ céng sù ®· c«ng bè vµo n¨m 2005 [46]. D−íi ®©y lµ c«ng thøc cña hîp chÊt 1. H×nh 3.5: CÊu tróc hîp chÊt 1 (axit 10-Hydroxy - 2- decenoic) D−íi ®©y lµ b¶ng sè liÖu phæ 1H - NMR cña chÊt 1 so víi c¸c d÷ liÖu cña Naoki Noda [46]. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 43 B¶ng 3.2: Sè liÖu phæ 1H –NMR cña chÊt 1 C Sè nguyªn tö H δHa,c, ppm (J, Hz) theo tµi liÖu [28,46] δHa,c, ppm (J, Hz) 1 - 2 1H 5,87(dt, 1.5Hz;15,6Hz) 5,81(dt,1,5Hz, 17Hz) 3 1H 6.94 (dt, 7.1Hz; 15.6 Hz) 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) 4 2H 2.22(ddt, 1.5Hz; 7.1 Hz; 7.6 Hz) 2,25 (m) 5 2H 1,48(m) 1,55 (m) 6 6H 1,35(m) 1,55 (m) 7 1,35 (m) 1,50 (m) 8 1,35(m) 1,50 (m) 9 2H 2,22 (m) 2,25(m) 10 2H 3,53(t, 6.6 Hz) 3.56 (t, 6,5 Hz) 10 - HDA lµ mét axÝt bÐo cã nhiÒu ho¹t ®éng d−îc lý quan träng ®· ®−îc c«ng bè nh− cã kh¶ n¨ng chèng ung th−, lµm t¨ng kh¶ n¨ng miÔn dÞch, kÝch thÝch sù sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña c¬ thÓ... Do vËy viÖc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh ®−îc cÊu tróc cña 10 - HDA lµ cã ý nghÜa chøng minh trong s÷a ong chóa cã chøa thµnh phÇn quan träng nµy. So víi c¸c tµi liÖu kh¸c, 10-HDA ®−îc ph©n lËp tõ s÷a ong chóa ®Òu sö dông m¸y HPLC. Cßn víi nghiªn cøu nµy chØ cÇn dïng c¸c ph−¬ng ph¸p ch¹y cét s¾c ký th«ng th−êng ®· ph©n lËp NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 44 ®−îc 10-HDA tõ s÷a ong chóa. §iÒu ®ã sÏ gióp chóng ta gi¶m rÊt nhiÒu chi phÝ khi ph©n lËp hîp chÊt nµy. 3.1.4. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh ®éc tÕ bµo KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh g©y ®éc lªn tÕ bào ung th− biÓu m« cña dÞch chiÕt s÷a ong chóa ®−îc tr×nh bµy trong bảng 3.3. Bảng 3.3 Kết quả thö ®éc tÝnh víi tÕ bào ung th− biểu m« cña s÷a ong chóa STT Ký hiệu mẫu IC50 ( µg/ml) 1 Sữa ong chóa > 256 2 Elipticin 0,31- 0,62 Elipticin lµ chÊt ®· ®−îc thÕ giíi c«ng nhËn cã kh¶ n¨ng øc chÕ sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo ung th− biÓu m« víi gi¸ trÞ IC50 ë nång ®é kho¶ng 0,5 µg/ml. cßn s÷a ong chóa chØ cã kh¶ n¨ng øc chÕ sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo ung th− biÓu m« ë nång ®é 256 µg/ml trë lªn. §iÒu nµy cã thÓ gi¶i thÝch lµ do hµm l−îng 10-HDA chiÕm kho¶ng 1-2% trong s÷a ong chóa, do ®ã c¸c ph©n ®o¹n 10- HDA sau ®ã ®−îc ph©n tÝch vµ lµm giµu tõ mÉu s÷a ong chóa sÏ cã kh¶ n¨ng øc chÕ sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo ung th− biÓu m« ë nång ®é thÊp h¬n hµng tr¨m lÇn; hoÆc dßng tÕ bµo nµy ch−a ph¶i lµ ®Ých cña c¸c ho¹t chÊt trong s÷a ong chóa. V× vËy s÷a ong chóa chØ cã t¸c dông phßng hoÆc hç trî ®iÒu trÞ víi dßng ung th− biÓu m«. Tuy nhiªn, c¸c nghiªn cøu tiÕp theo trªn c¸c dßng tÕ bµo ung th− m¸u, ung th− gan... cã thÓ ph¶i dùng víi nång ®é cao h¬n hoÆc thö víi c¸c dÞch chiÕt thµnh phÇn. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 45 3.2. KÕt qu¶ nghiªn cøu tõ phÊn hoa 3.2.1. Ph©n lËp c¸c dÞch chiÕt Sau khi chiÕt mÉu phÊn hoa cã khèi l−îng lµ 450 gam trong c¸c dung m«i cã ®é ph©n cùc t¨ng dÇn ta thu ®−îc kÕt qu¶ nh− sau: - DÞch chiÕt phÊn hoa trong n-hexan víi khèi l−îng lµ 5,6 gam. - DÞch chiÕt phÊn hoa trong etylaxetat víi khèi l−îng lµ 2,1388 gam. - DÞch chiÕt phÊn hoa trong metanol víi khèi l−îng lµ 152,16 gam. 3.2.2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh cÊu tróc hîp chÊt 2 (7-O- β – Xyloside- naringenin) Hîp chÊt 2 (7-O- β - Xyloside-naringenin) ®−îc ph©n lËp tõ dÞch chiÕt phÊn hoa trong metanol d−íi d¹ng tinh thÓ mµu tr¾ng. D−íi ®©y lµ s¾c ký ®å HPLC vµ phæ UV cña hîp chÊt 2. H×nh 3.6: S¾c ký ®å HPLC cña chÊt 2 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 46 H×nh 3.7: Phæ UV – pic 1 H×nh 3.8: Phæ UV – Pic 2 Trªn phæ 1H-NMR cho thÊy tÝn hiÖu rÊt ®Æc tr−ng cña hÖ vßng th¬m AA’BB’ cña vßng B ®−îc quan s¸t t¹i δ 7,30 (d; 8,8 Hz) vµ 6,80 (d; 8,8 Hz) lµ t−¬ng øng cña hai cÆp proton H-2’/H-6’ vµ H-3’/H-5’. Hai proton t−¬ng t¸c meta – cña vßng A céng h−ëng t¹i δ 6,34 (d; 2,2 Hz); 6,11 (d; 2,2 Hz) lµ thuéc vÒ H -6 vµ H-8. Proton H-2 cã tÝn hiÖu céng h−ëng t¹i δ 5,33 d−íi d¹ng douplet cã h»ng sè t−¬ng t¸c spin 5Hz vµ 10Hz. Hai proton H-3A vµ H-3B ®−îc quan s¸t t¹i δ 2,07 vµ δ 3,01 cã h»ng sè t−¬ng t¸c spin 15Hz vµ 20 Hz. Trªn phæ 1H-NMR còng cho thÊy sù cã mÆt cña phÇn ®−êng do xuÊt hiÖn tÝn hiÖu céng h−ëng cña proton anomeric t¹i δ 4,88 (1H; d; 5,0 Hz) bÞ khuÊt bëi pic n−íc vµ c¸c proton cña phÇn ®−êng céng h−ëng t¹i δ 3,61; δ 3,56 vµ δ 3,42. Phæ 1H- NMR cña hîp chÊt 2 ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 3.9. P e a k # 21 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 3 2 0 2 . 4 2 8 2 . 4 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d ! P e a k # 11 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 1 2 8 2 . 3 5 6 3 . 6 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d ! NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 47 H×nh 3.9: Phæ 1H-NMR cña chÊt 2 Trªn phæ khèi bôi ®iÖn tö (positive mode) cho ion pic gi¶ ®Þnh ph©n tö t¹i m/z 404,8 [M+H]+, (negative mode) t¹i m/z 403.0 [M-H]-, t¹i m/z 427 [M+Na]+, chØ ra khèi l−îng ph©n tö cña hîp chÊt 2 là 404 øng víi c«ng thøc C20H20O9. Phæ khèi bôi ®iÖn tö cña chÊt 2 ®−îc thÓ hiÖn ë h×nh 3.10. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 48 H×nh 3.10: Phæ ESI – MS cña chÊt 2 Dùa vµo phæ khèi l−îng ph©n tö vµ c¸c tÝn hiÖu céng h−ëng tõ h¹t nh©n, kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu vÒ phæ, hîp chÊt 2 ®−îc x¸c ®Þnh lµ 7-O- β - Xyloside-naringenin. C«ng thøc cuña chÊt 2 ®−îc x¸c ®Þnh nh− sau: H×nh 3.11: CÊu tróc cña chÊt 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin) D−íi ®©y lµ b¶ng sè liÖu c¸c d÷ kiÖn phæ 1H - NMR cña chÊt 2 so víi c¸c tµi liÖu. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 49 B¶ng 3.4: Sè liÖu phæ 1H –NMR cña chÊt 2 VÞ trÝ δH(ppm), J (Hz) *δH(ppm),J Hz) [49,57] Aglycon 2 5,33 (dd; 5;10) 5,98 (dd; 5,25, 12) 3A 3B 2,70 (dd; 5; 15) 3,01 (dd; 15; 20) 2,80 (d; 17) (eq) 3,31 (q; 2,0) (ax) 4 5 6 6,34 (d; 2,2) 6,42(d; 2,5) 7 8 6,11(d; 2,2) 6,84(d; 2,5) 9 10 1´ 2´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d; 8,5) 3´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8.5) 4´ 5´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8,5) 6´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d;8,5) Xylose 1´´ 4,88 (d; 5,0) 4,85 (d;7,8)) 2´´ 3,44 (dd; 5,0; 15) 3,40 (m) 3´´ 3,30 (dd) 3,29 (ddd; 8,7; 8,7; 4,2) NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 50 4´´ 3,42 (dd) 3,42 (m) 5´´ 4,0 (dd; 5,0; 10) 3,81 (dd; 4,0; 10,8) Hîp chÊt 2 x¸c ®Þnh ®−îc lµ mét glycozit flavonoit, theo nhiÒu c«ng bè líp chÊt nµy cã ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ m¹nh, nªn viÖc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc cña hîp chÊt 2 lµ rÊt cã ý nghÜa. §iÒu nµy kh¼ng ®Þnh thªm r»ng trong phÊn hoa chøa flavonoit lµ nh÷ng t¸c nh©n cã ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸. Flavonoit lµ mét líp chÊt kh¸ phæ biÕn xuÊt hiÖn trong thùc vËt d−íi d¹ng tù do hoÆc glycozit. Chóng lµ nh÷ng s¶n phÈm ®−îc thiÕt lËp tõ mét ®¬n vÞ gèc cinnamoyl-CoA, víi sù kÐo d·n m¹ch dïng ba ph©n tö malonyl-CoA. Flavonoit gãp phÇn cÊu thµnh mµu s¾c cña thùc vËt vµ hÊp thô m¹nh tia UV. Tuy nhiªn mét sè flavon kh«ng mµu nh−ng vÉn hÊp thô rÊt m¹nh c¸c tia UV. Sau ®©y lµ s¬ ®å sinh tæng hîp c¸c chÊt flavonoit. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 51 OH CoAS O + 3 Malonyl-CoA -3 CO2 -3 CoASH OH OO OO SCoA OH OO OO - CoASH OH OOH OHHO Chalcone OH OOH OHO Naringenin (Flavanone) OH OOH OHO OH Dihydrokaempferol (Flavanonol or Dihydroflavonol) OH OHOH OHO OH Leukopelargonidin (Flavan-3,4-diol) OH OOH OHO OH Kaempferol (Flavonol) OH OOH OHO Apigenin (Flavon) Red. Oxi. Oxi. Enzymmatic Chalcone-Flavone- isomerase Spontan H×nh 3.12: S¬ ®å qu¸ tr×nh sinh tæng hîp c¸c Flavonoit Ngoµi ra, 7 - O - β - Xyloside - naringenin cã thÓ ®−îc sinh tæng hîp theo s¬ ®å sau nhê sù cã mÆt cña E .coli [18]. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 52 H×nh 3.13: S¬ ®å sinh tæng hîp cña 7 – O - β– Xyloside – naringenin [18] 3.2.3. KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng oxy ho¸ KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng oxy ho¸ (peroxydaza) ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.5 nh− sau: NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 53 B¶ng 3.5: KÕt qu¶ thö ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ cña phÊn hoa STT MÉu IC50 (µg/ml) 1 DÞch chiÕt phÊn hoa trong etylaxetat 65,88 2 DÞch chiÕt phÊn hoa trong metanol 46,0 3 DÞch chiÕt phÊn hoa trong n-hexan 104,8 4 Resveratrol 5,24 KÕt qu¶ ë b¶ng 3.5 ®−îc biÓu diÔn ë h×nh 3.19. 0 20 40 60 80 100 120 P_H(etylaxetat) P_H (metanol) P_H (n-hexan) Resveratrol H×nh 3.14: BiÓu ®å ho¹t tÝnh cña phÊn hoa Theo b¶ng 3.5 vµ h×nh 3.14 cho thÊy resveratrol lµ mét chÊt cã kh¶ n¨ng chèng oxi ho¸ tèt ®· ®−îc thÕ giíi c«ng nhËn vµ ®−îc sö dông nh− lµ ®èi chøng d−¬ng cã gi¸ trÞ IC50 ë nång ®é 5,24 µg/ml. Trong ba dÞch chiÕt cña phÊn hoa th× dÞch chiÕt phÊn hoa trong metanol lµ cã kh¶ n¨ng chèng oxi ho¸ cao nhÊt víi gi¸ trÞ IC50 ë nång ®é 46,0 µg/ml, tiÕp ®ã lµ dÞch chiÕt phÊn hoa trong etylaxetat cã gi¸ trÞ IC50 ë nång ®é 65,88 µg/ml. Cßn dÞch chiÕt phÊn NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 54 hoa trong n-hexan víi gi¸ trÞ IC50 ë nång ®é 104,8 µg/ml cã ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ kÐm nhÊt. §iÒu nµy ®−îc gi¶i thÝch lµ trong phÊn hoa chøa c¸c flavonoit. Flavononit lµ nh÷ng chÊt cã ®é ph©n cùc trung b×nh nªn tan ®−îc trong c¸c dung m«i ph©n cùc võa vµ t−¬ng ®èi ph©n cùc. ChÝnh v× thÕ mµ l−îng flavonoit cã trong phÊn hoa tËp trung ë dÞch chiÕt metanol vµ l−îng Ýt h¬n ë trong dÞch chiÕt etylaxetat, vµ hÇu nh− kh«ng cã ë dÞch chiÕt n-hexan. Kh¶ n¨ng chèng oxi ho¸ cã thÓ m¹nh h¬n nÕu hµm l−îng flavonoit cao h¬n. Do ®ã c¸c ph©n ®o¹n chøa nhiÒu flavonoit sÏ cã kh¶ n¨ng chèng oxi ho¸ tèt h¬n. Nh− vËy, phÊn hoa cã kh¶ n¨ng chèng oxi ho¸ kh¸ tèt. Con ng−êi cã thÓ sö dông phÊn hoa cho môc ®Ých chèng oxi ho¸ nh− mét thùc phÈm chøc n¨ng. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 55 KÕt luËn Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu vµ thùc hiÖn ®Ò tµi “nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña s÷a ong chóa vµ phÊn hoa” ®· thu ®−îc c¸c kÕt qu¶ nh− sau: 1. X¸c ®Þnh ®−îc hµm l−îng protein cã trong s÷a ong chóa lµ 13,1% t−¬ng ®èi cao so víi c¸c thµnh phÈm kh¸c thu ®−îc tõ ong. 2. X¸c ®Þnh ®−îc 17 axÝt amin cã mÆt trong s÷a ong chóa bao gåm nhiÒu axÝt amin thiÕt yÕu. 3. Ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc ®−îc 2 hîp chÊt, trong ®ã chÊt 1 ®−îc ph©n lËp tõ s÷a ong chóa lµ 10-HDA (axÝt 10 - Hydroxy - 2- decenoic) vµ hîp chÊt 2 ®−îc ph©n lËp tõ phÊn hoa lµ 7 - O - β- Xyloside - naringenin. 4. §· thö ®−îc ho¹t tÝnh ®éc tÕ bµo víi s÷a ong chóa cho kÕt qu¶ s÷a ong chóa cã kh¶ n¨ng øc chÕ c¸c tÕ bµo ung th−. 5. §· thö ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ cña phÊn hoa cho kÕt qu¶ lµ phÊn hoa cã ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸ tèt, vµ cã ho¹t tÝnh tèt nhÊt lµ dÞch chiÕt cña phÊn hoa trong metanol. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 56 KiÕn NghÞ 1. TiÕp tôc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c hîp chÊt kh¸c cã ho¹t tÝnh cã trong s÷a ong chóa vµ phÊn hoa. 2. TiÕp tôc nghiªn cøu s©u h¬n c¸c ho¹t tÝnh sinh häc nh− ho¹t tÝnh g©y ®éc lªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c, ho¹t tÝnh chèng oxi ho¸, thö c¸c ho¹t tÝnh trªn chuét, vi sinh vËt... cña s÷a ong chóa, phÊn hoa, c¸c dÞch chiÕt tõ hai ®èi t−îng trªn. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 57 Tµi liÖu tham kh¶o tiÕng viÖt 1. NguyÔn B¸, (2007), “H×nh th¸i häc thùc vËt”, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o dôc. 2. §ç Huy BÝch, §Æng Quang Trung, Bïi Xu©n Ch−¬ng, NguyÔn Th−îng Dong, §ç Trung §µm, Ph¹m V¨n HiÓn, Vò Ngäc Lé, Ph¹m Duy Mai, Ph¹m Kim M·n, §oµn ThÞ Thu, NguyÔn TËp vµ TrÇn Toµn, (2004), C©y thuèc vµ ®éng vËt lµm thuèc ë ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc vµ Kü thuËt Hµ Néi, tËp I, trang 827-828. 3. NguyÔn H÷u §Ýnh, §ç §×nh R·ng, (2003), “Ho¸ häc h÷u c¬ 1”, Nhµ xuÊt b¶n Gi¸o dôc. 4. Ph¹m ThÞ Tr©n Ch©u, TrÇn ThÞ ¸ng, (2009), Ho¸ Sinh häc, Nhµ xuÊt b¶n gi¸o dôc ViÖt Nam. tiÕng anh 5. Agrawal P.K., (1989), “Carbon - 13 NMR of flavonoids”, Elsevier Science Pub.B.V,. 6. Anna Gloria Sabatini, Gian Luigi Marcazzan1, Maria Fiorenza Caboni, Stefan Bogdanov, Ligia Bicudo de Almeida-Muradian, (2009), “Quality and standardisation of Royal Jelly”, Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 1(1): 16-21. 7. Antinelli, J. F., Zeggane.S., Davico.R., Rognone.C., Faucon.J P., Lizzani.L., (2003), “Evaluation of (E)-10-hydroxydec-2- enoic acid as a freshness parameter for royal jelly”. Food Chemistry 80: 85-89. 8. Aziza A. El-Nekeety, Wafaa El-Kholy, Naglaa F. Abbas, Ahmad Ebaid, Hassan A. Amraa, Mosaad A. Abdel-Wahhaba, (2007), “Efficacy of NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 58 royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats”, Toxicon 50, p. 256–269. 9. Barth, O.M, Luz, C.F.P., (1998). “Melissopalynological data obtained from a mangrove area near to Rio de Janeiro”, Brazil. Journal of Apicultural Research 37 (2), 155–163. 10. Benfenati, L; Sabatini, A G; Nanetti, A (1986) “Composizione in sali minerali della gelatina reale”, Apicoltura 2: 129-143. 11. Boselli. E., Caboni. M F., Sabatini. A G., Marcazzan. G L., Lercker. G., (2003), “Determination and changes of free amino acids in royal jelly during storage”. Apidologie 34: 1-7. 12. Campos M, Cunha A and Markham KR. (1996). “Beepollen composition, properties, and applications. In: Mizrahi A AND LENSKY Y (Eds), Bee products”. Plenum Press: New York. 13. Campos M, Markham KR, Mitchell KA and Da Cunha A, (1997), “An approach to be properties of bee pollen via flavonoid/phenolic profiles” Phytochem Anal 8: 181-185. 14. Chen, C., Chen, S., (1995), “Changes in protein components and storage stability of royal jelly under various conditions”. Food Chemistry 54, 195–200. 15. Cheng PC., Wong G., (1996) “Honey bee propolis: prospects in medicine”. Bee World; 77:8-14. 16. Colin C.Lucas, (1942), “Chemical Fxamination of Royal jelly”, The Canadian medical association journal, 406-409. 17. Crane, E., (1990), “Bees and Beekeeping—Science, Practice and World Resources”, Heinemann Newnes, Oxford, UK. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 59 18. Dinesh Simkhada, EuiMin Kim, Hei Chan Lee, and Jae Kyung Sohng, (2009), “Metabolic Engineering of Escherichia coli for the Biological Synthesis of 7-O-Xylosyl Naringenin”, Mol. Cells 28: 397-401 19. Dragana Vucevic , Eleni Melliou, Sasa Vasilijic, Sonja Gasic, Petar Ivanovski ,Ioanna Chinou , Miodrag Colic, (2007), “Fatty acids isolated from royal jelly modulate dendritic cell-mediated immune response in vitro”, International Immunopharmacology. 20. Dutra, V.M.L., Barth, O.M., (1997). “Anlalise palinol ogica de amostras de mel da regiao de Bananal (SP/RJ)”, Brasil. Revista Universidade de Guarulhos, Geociencias II, Numero especial: 174–183. 21. Erem C, Deger O, Ovali E, Barlak Y, (2006) , “The effects of royal jelly on autoimmunity in Graves' disease”. Endocrine 30(2):175-83. 22. Ferioli, F; Marcazzan, G L; Caboni, M F, (2007), “Determination of (E)- 10-hydroxy-2-decenoic acid content in pure royal jelly: a comparison between a new CZE method and HPLC”, Journal of separation Science 30: 1061 – 1069 23. Gohan Eraslan, Murat Kanbur, Sibel Silici, (2009), “Effect of carbaryl on some biochemical changes in rats: The ameliorative effect of bee pollen”, Food and Chemical Toxicology 47: 86–91. 24. Graham, J. (ed.) (1992), “The Hive and the Honey Bee” (Revised Edition). Dadant & Sons. 25. Harborn J.B., (1994), “The flavonoids advance in research since 1986”, Chapman & Hall,. 26. Hattori N, Nomoto H, Fukumitsu H, Mishima S, Furukawa S, (2007) , “Royal jelly and its unique fatty acid, 10-hydroxy-trans-2-decenoic acid, NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 60 promote neurogenesis by neural stem/progenitor cells in vitro”. Biomed Res. 28(5):261-6. 27. Hayerman A.E., Butler I.G., (1994), “Assay of caondensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant”, Meth, Enz, 234: 249. 28. Hiroko Tani, Shunya Takahashi, Keiko Hasumi, Tomoki Tatefuji, Yayoi Hongo, Hiroyuki Koshino, (2009), “Isolation of (E)-9,10-dihydroxy-2- decenoic acid from royal jelly and determination of the absolute configuration by chemical synthesis”, Tetrahedron: Asymmetry 20: 457– 460. 29. Iannuzzi J.,(1990), “Royal Jelly: mystery food, in three parts”. Am Bee J , 8:532-4, 587-9, 659-62. 30. Illana Louise Pereira de Melo; Ligia Bicudo de Almeida – Muradian, (2010), “Stability of antioxidants vitamins in bee pollen samples”’ Faculdade de Ciencias Farmacouticas. Universidade se Soo paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bl. 14, 05: 508-900 Sao Paulo - SP, Brasil. 31. Iwao Okamoto, Yoshifumi Taniguchi, Toshio Kunikata, Keizo Kohno, Kanso Iwaki, Masao Ikeda, Masashi Kurimoto, (2003), “Major royal jelly protein 3 modulates immune responses in vitro and in vivo” , Life Sciences 73: 2029–2045. 32. Jean-Claude Dauguet, Maryse Bert, Jean Dolley, Anain bekaer, Guy Lenwin, (1993), “8-Methoxykaempferol 3-neohesperidoside and other flavonoids from bee pollen or crataegus monogyna” , Phytochemistr Vol 33,(6): 1503-1505. 33. Krell R. (1996) “Value-added products from bee keeping”. FAO Agricultural Services Bulletin 124. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 61 34. Krell, R., (1996). “Value-added products from beekeeping”. FAO Agricultural Services Bulletin 124, Food and Agriculture Organization, Rome: 87–113. 35. L.A. Salazar-Olivo, V. Paz-Gonzalez, (2005), “Screening of biological activities present in honeybee (Apis mellifera) royal jelly”, Toxicology in Vitro (19): 645–651. 36. L.B. Almeida-Muradian, Lucila C. Pamplonaa, S!ılvia Coimbra, Ortrud Monika Barth, (2005) “Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets”, Journal of Food Composition and Analysis 18: 105–111. 37. Laura silvia G. V.,Norma A. A., et al, (2007), “Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybeecollected pollen from mesquite (Prosopis juliflora, Leguminosae)”, Journal of Food Composition and Analysis 20: 119–124 38. Lecker G, et al. (1982), “Components of royal jelly II: the lipid fraction, hydrocarbons and sterols”. J Apic Res 21:178-84. 39. Lercker. G., Caboni. M F., Vecchi. M A., Sabatini. A G., Nanetti. A., (1993), “Caratterizzazione dei principali costituenti della gelatina reale”, Apicoltura 8: 27-37. 40. Lercker, G., Capella, P., Conte, L.S., Ruini, F., Giordani, G., (1981). “Components of royal jelly”, I. Identification of the organic acids. Lipids 12: 912–919. 41. Liang Guang-Yi, Alexander I. Gray and Peter G. Waterman, (1989), “Pentacyclic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis”, Journal of Natural Products, Vol. 52(1): 162-167. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 62 42. Liviu A. Marghitas, Oltica G. Stanciu, Daniel S. Dezmirean, Otilia Bobis, Olimpia Popescu, Stefan Bogdanov, Maria Graca Campos, (2009), “In vitro antioxidant capacity of honeybee-collected pollen of selected floral origin harvested from Romania”, Food Chemistry 115: 878–883. 43. Luz, C.F.P., Barth, O.M., (2001). “Melissopalynological observations in a mangrove area next to Rio de Janeiro, Brazil”. In: Goodman, D.K., Clarke, R.T. (Eds.), Proceedings of the IX Palynological Congress. American Association of Stratigraphic Palynologists Foundation, Houston, pp. 489–492. 44. Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., (1970), “The syrematic identification of flavonoids”, Springer Verlag - Berlin - Heidelberg - New York. 45. Murat Kucuk, Sevgi Kolayl, Sengul Karaoglu, Esra Ulusoy, Cemalettin Baltacı, Ferda Candan, (2007), “Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia”, Food Chemistry 100 (2007): 526–534. 46. Naoki Noda, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kazumoto Miyahara, and Kaori Ishiyama, (2005), “Isolation and Characterization of Some Hydroxy Fatty and Phosphoric Acid Esters of 10-Hydroxy-2- decenoic Acid from the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera)” , Lipids 40: 833–838. 47. Pleasants, Jm; Hellmich, Rl; Dively, Gp; Sears, Mk; Stanley-horn, De; Mattila, Hr; Foster, Je; Clark, P et al. (October 2001). "Corn pollen deposition on milkweeds in and near cornfields" , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (21): 11–24. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 63 48. S. B. Mahato and A. P. Kundu, (1994), “13C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-A compilantion and some salient features”, Phytochemistry, Vol. 37: 1517-1575. 49. S. P. Shrivastava, (1982), “A flavanone glycoside from PR Unus Cerasoides”, Phytochemistry Vol. 21, No. 6: 1464-1465. 50. Shougo Tamura, Toru Kono, Chika Harada, Kikuji Yamaguchi, Takanori Moriyama, (2009), “Estimation and characterisation of major royal jelly proteins obtained from the honeybee Apis merifera” , Food Chemistry 114: 1491–1497 51. Takashi Echigo, Tetsuo Takenaka and Kazuhisa Yatsunami, (1986), “Comparative Studies on chemical composition of Honey, Royal Jelly and Pollen Loads”, Bull. Fac. Agr., Tamagawa. No.26: 1-12. 52. Tania Maria Sarmento Silva, Celso Amorim Camara, Antonio Claudio da Silva Lins, Jose Maria Barbosa-Filho, Eva Monica Sarmento da Silva, Breno Magalhaes Freitas, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), “Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke”, Journal of Food Composition and Analysis 19: 507–511. 53. Tania Maria Sarmento Silvaa, Celso Amorim Camaraa, Antonio Claudio da Silva Linsa, Jose´ Maria Barbosa-Filhoa, Eva Moˆ nica Sarmento da Silvab, Breno Magalha˜ es Freitasb, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), “Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke”, Journal of Food Composition and Analysis 19: 507–511. 54. Ternai B., Markham K.R., (1976), “C13 - NMR of flavonoids - I – Flavones and flavonols”. Tetrehedron 32:pp 565. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 64 55. Tomaslorente. F., Garciagrau MM, Nieto JL and Tomasbarberan FA, (1992). “Flavonoids from CistusLadanifer bee pollen” , Phytochemistry 31: 2027-2029. 56. Tetsuya Kodai, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kaori Ishiyama, and Naoki Noda, (2007), “Compositions of Royal Jelly II. Organic Acid Glycosides and Sterols of the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera)” , Chem. Pharm. Bull. 55(10) 1528—1531. 57. Tsutomu Nakanishi, Naoki Iida, Yuka Inatomi, Hiroko Murata, Akira Inada, Jin Murata, Frank A. Lang, Munekazu Iinuma, Toshiyuki Tanaka, (2004), “Neolignan and flavonoid glycosides in Juniperus communis var. depressa”, Phytochemistry 65: 207 -213. 58. Vittek J. (1995) , “Effect of royal jelly on serum lipids in experimental animals and humans with atherosclerosis”. Experientia 51:927-35. 59. Wu.G., Li .Y., Liu. G., (1991), “The immunoregulative effect of royal jelly acid”, Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao 22 (2): 117-118. 60. Xin-Yu Yang, De-sheng Yang, Wei-Zhang, Jian-Min Wang, Chun-Yang Li , Hui-Ye, Kang-Fu Lei , Xiu-Fang Chen, Nian-Han Shen, Li-Qin Jin , Jian-Guang Wang, (2010) , “10-Hydroxy-2-decenoic acid from Royal jelly: A potential medicine for RA” , Journal of Ethnopharmacology 128: 314–321. Tµi liÖu trang WEB 61. 62. 63. grain. NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 65 Phô lôc 1 : HPLC & ESI-MS cña chÊt 1 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 66 Phô lôc 2: Phæ 1H-NMR cña chÊt 1 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 67 Phô lôc 3: Phæ 1H-NMR cña chÊt 2 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 68 Phô lôc 4: Phæ 13C-NMR cña chÊt 2 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 69 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 70 Phô luc 5: Phæ dept cña chÊt 2 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 71 phô lôc 6: Phæ EI-ms CñA CHÊT 2 NguyÔn ThÞ ThiÒu - K19 Chuyªn ngµnh: Ho¸ H÷u c¬ LuËn v¨n th¹c sü khoa häc 72