Đề tài Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tôm

ymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các ñơn vị β-Dglucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1-4 glucoside. Công thức cấu tạo của chitosan -Công thức phân tử [C6H11O4N]n Phân tử lượng: MChitosan = (161,07)n I.2.2.2 Tính chất của chitosan Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hay hơi vàng. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, kiềm nhưng hòa tan trong acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhớt và trong suốt, nhờ ñó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 16 nặng như Pb, Hg… Chitosan còn ñược xem như là một polymecationic có khả năng bám dính vào bề mặt ñiện tích âm. Chitosan kết hợp với andehyde trong ñiều kiện thích hợp tạo thành gel, ñây là cơ sở ñể bẫy tế bào, enzyme. Loại chitosan có trọng lượng phân tử trung bình (M) từ 200.000 ñến 400.000 hay ñược dùng nhiều nhất trong y tế và thực phẩm. Nhiệt ñộ nóng chảy 3090C-3100C, trọng lượng phân tử trung bình 10.000- 500.000 dalton tuỳ loại Chitosan có nhiều tác dụng sinh học như: Khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng khuẩn, kháng nấm với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích tăng sinh ở người và ñộng thực vật, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong ñiều kiện nghèo dinh dưỡng. Chitosan phản ứng với axít ñậm ñặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với Iod trong môi trường H2SO4 phản ứng cho màu tím, phản ứng này có thể dùng ñể phân tích ñịnh tính chitosan. I.2.3 Ứng dụng của chitin và chitosan I.2.3.1 Trong công nghệ thực phẩm PGS-TS Trần Thị Luyến nghiên cứu vật liệu chitosan từ rất sớm. Các nghiên cứu về chitosan của cô ñược các doanh nghiệp áp dụng rộng rãi và ñã xuất khẩu chitosan, cùng các sản phẩm từ vật liệu này. Trong ñó nổi bật nhất là sản phẩm màng mỏng chitosan dùng ñể bao gói thực phẩm. Vật liệu chitosan còn ñược chế tạo thành thực phẩm bổ dưỡng, có tác dụng hạ huyết áp, giảm cholesterol và lipid trong máu, chống béo phì, phòng chống u và ung thư, ñặc biệt là tăng cường miễn dịch cho cơ thể, có thể dùng cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV/AIDS bị suy giảm hệ miễn dịch. Công trình tiêu biểu mới ñây là sản phẩm bột chitosan từ vỏ thủy hải sản dùng làm phụ gia thực phẩm an toàn, thay thế hàn the ñộc hại, ñược nhận giải thưởng VIFOTEC 2004 của PGS. TS. Nguyễn Thị Ngọc Tú và TS. Nguyễn Hồng Khánh cùng cộng sự, sử dụng trong chế biến giò chả, nem chua, thịt hộp, bún bánh, bảo quản sữa và nước giải khát. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 17 Các nhà khoa học Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh, khoa CNTP của Trường ðHNL TP Hồ Chí Minh ñã nghiên cứu tạo ra một lớp màng vỏ bọc chitosan, ñây ñược xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng như thực phẩm mà không hề ảnh hưởng ñến môi trường chung quanh. ðặc biệt sản phẩm có thể sử dụng ñể bọc các loại thực phẩm tươi sống giàu ñạm, dễ hư hỏng như cá, thịt... ðồng thời màng bọc chitosan từ vỏ tôm này ñể làm vỏ bọc xúc xích. Ngoài việc giúp cho sản phẩm xúc xích có hình dáng ñẹp, lớp vỏ màng chitosan này còn có tác dụng ñặc biệt là không làm mất màu và mùi ñặc trưng của hỗn hợp nguyên liệu xúc xích. Từ thành công này, các nhà khoa học tiếp tục nghĩ tới việc sử dụng vỏ bọcchitosan ñể bảo quản Thủy sản tươi và khô. Trong công nghệ thực phẩm, vật liệu chitosan ñược dùng ñể bảo quản ñóng gói thức ăn, ñể bảo quản hoa quả tươi vì nó tạo màng sinh học không ñộc. Chitosan là một polymer dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học ña dạng, chitosan ñã ñược ñưa vào thành phần trong thức ăn: Sữa chua, bánh kẹo, nước ngọt,…Nhật bản ñã có những sản phẩm ăn kiêng có chứa chitosan ñể làm giảm cholesterol và lipid máu, giảm cân nặng, chống béo phì, dùng ñể tránh nguy cơ mắc bệnh tim mạch, tiểu ñường (bánh mỳ, khoai tây chiên, dấm, nước chấm...) ñã có bán rộng rãi trên thị trường. Một liệu pháp y học ñể ñiều trị bệnh béo phì ñã ñược ñề xuất là chế ñộ ăn kiêng với các thức ăn có chitosan và acid Ascorbic ( vitamin C) cho kết quả giảm cân tốt. Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ ( USEPA ) ñã cho phép chitosan không những ñược dùng làm thành phần thức ăn, mà còn dùng cả trong việc tinh chế nước uống. Năm 1983 Bộ thuốc và thực phẩm ( USFDA) ñã chấp nhận chitosan ñược dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm. Chitin có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các thành phần khác, nên nó ñược ứng dụng vào việc khử màu thức uống (ñồ uống nước trái cây). Nghiên cứu của một nhóm sinh viên trường HCM cho thấy bảo quản bưởi bằng màng chitosan trong vòng 3 tháng, bưởi vẫn tươi, không bị úng vỏ. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 18 Ðặc tính diệt khuẩn của chitin ñược thể hiện trên các mặt sau ñây: Khi tiếp xúc với thực phẩm, chitosan sẽ: Lấy ñi từ các vi sinh vật này các ion quan trọng, như ion Cu2+. Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan ñến các ion quan trọng (Muzzarelli, 1977). Ngăn chặn, phá hoại chức năng màng tế bào. Gây ra sự rò rỉ các phần tử bên trong tế bào. Gây ra sự tổ hợp của polyelectrolyte với Polymer mang tính chất acid trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó. I.2.3.2 Trong y dược Tạo chỉ khâu phẫu thuật, tự hủy Trường Ðại học Delaware Mỹ ñã chế tạo thành công chỉ phẫu thuật tự hủy từ chitosan, nhờ phát hiện ra một dung môi ñặc biệt có khả năng hòa tan chitosan ở nhiệt ñộ thường mà không làm phá hủy cấu trúc polymer. Sản xuất thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng Khoa Dược của Trường ðại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ñã bước ñầu nghiên cứu thành công thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng từ chitosan. . Chống sự phát triển khối u Theo một số nhà khoa học thì chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư. Qua thí ngiệm thực hiện trên 60 bệnh nhân tuổi từ 35-76 của nhóm các bác sĩ Bệnh viện K Hà Nội vào năm 2003 ñã chứng minh, chitosan có tác dụng hỗ trợ ñiều trị bệnh ung thư. Sản xuất băng chống bỏng, da nhân tạo, chống viêm Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin ñược gọi là Beschitin, nó giống như một tấm vải và ñược bọc ốp lên vết thương, chỉ một lần ñến khi khỏi hẳn. Tấm Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 19 Beschitn bị phân hủy sinh học từ từ cho ñến khi hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm ñau, giúp các vết sẹo, vết bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng và chống nhiễm trùng. Thuốc kem Pokysan là một trong những công trình nghiên cứu, ứng dụng vật liệu chitin-chitosan từ dư phẩm của ngành chế biến thủy, hải sản (vỏ tôm, cua, mai mực) của tập thể cán bộ khoa học nữ Phòng Polymer dược phẩm (Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Thuốc kem Pokysan có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ñặc biệt là chủng nấm Candila albicans, không gây dị ứng và tác dụng phụ, có khả năng cầm máu, chống sưng u, kích thích tái tạo biểu mô và tế bào da ñể làm mau liền các vết thương, vết bỏng, chóng lên da non và giảm bớt ñau ñớn cho người bệnh. Ngăn ngừa bệnh tim Một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng ñã phát hiện, chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh ñột quỵ. Sản xuất thuốc chống nhiễm xạ Năm 1961, nhà khoa học Nga BousBeloisov ñã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ chitosan. Các nhà khoa học ñã tiến hành thử nghiệm tiêm thuốc cho ñộng vật là chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ, kết quả cho thấy, khả năng sống sót tới 45%. Chitosan ñã ñược sử dụng làm vật liệu kết cấu trong xây dựng các lò phản ứng nguyên tử và làm vỏ cách ngăn cho các con tầu nguyên tử. Sản xuất thuốc chữa bệnh khớp, bệnh béo phì ðiển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin ñang ñược thịnh thành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng, không ñộc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh. Một nhóm các nhà khoa học của Viện Vacxin Nha Trang ñã nghiên cứu, sản xuất ra 2 sản phẩm thuốc chitosan chữa béo phì và Glusivac chuyên ñặc trị Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 20 thoái hoá khớp. Cả hai sản phẩm thuốc này ñã ñược Bộ Y tế ñánh giá rất cao và cấp phép lưu hành trên toàn quốc ngay từ ñầu tháng 6 năm 2005. Dùng bào chế dược phẩm Trong công nghệ bào chế thực phẩm, chitosan có thể dùng làm các chất phụ gia như làm tá dược ñộn, tá dược dính, chế tạo màng viêm nang, chất mang sinh học dẫn thuốc… Viện hóa học thực phẩm trung TW2 ñã tiến hành nghiên cứu thực nghiệm ứng dung chitosan làm tá dược dính trong một số công thức thuốc viêm có ñược chất dễ bị tác ñộng bởi các ion loại nặng . ðặc tính làm giảm cholesterol Năm 1980, Sugano cùng cộng sự ñã chứng minh ñặc tính làm giảm cholesterol của chitosan trên chuột bạch và nó không gây tác dụng phụ. Khoa dược ðại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh ñã nghiên cứu sử dụng chitosan và olygomere chitin ñể sản xuất một số sản phẩm hạ cholesterol trong máu, có thể dùng riêng biệt hoặc kết hợp với một số chất khác dưới dạng chế phẩm như thuốc, thực phẩm, nước giải khát… I.2.3.3 Trong xử lý môi trường Chitosan dùng ñể xử lý màu trong nước thải (ñặc biệt là nước thải các nhà máy dệt nhuộm), thu hồi các ion kim loại do nó tạo phức với các kim loại nặng ñộc hại, xử lý chất huyền phù trong nước thải ñể giảm thể tích nước thải cần xử lý, ñể lọc trong nước sạch tiêu dùng. Nhờ khả năng là ñông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein, và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như: Pb, Hg…do ñó chitosan ñược sử dụng ñể tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm. Tại Nhật Bản, năm 1975, chitosan ñã ñược ñưa vào làm chất xúc tác ñể xử lý nước thải. Công nghệ xử lý nước thải bằng các vật liệu có sử dụng chitosan cũng ñang ñược một số nhà khoa học Trường Ðại học Nha Trang nghiên cứu và bước ñầu ñã có kết quả khả quan. I.2.3.4 Trong nông nghiệp Trong nông nghiệp Olygoglucosamin ảnh hưởng ñến sinh trưởng của một số loại rau củ, có tác dụng làm tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 21 chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, góp phần bảo vệ môi trường và thực hiện chương trình rau sạch, rau an toàn. Chitosan ñược sử dụng ñể bọc nang các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong ñất, ñồng thời nó còn có tác dụng cố ñịnh thuốc trừ sâu, phân bón, tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt. Hiện nay chế phẩm Olygoglucosamin và Olygochitin ñang ñược nghiên cứu tại ðại học Nha Trang. Ngày nay chitosan còn ñược sử dụng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cua, cá ñể kích thích sinh trưởng. Chimexla một sản phẩm sản xuất từ chitosan ñược sản xuất bởi tập thể cán bộ khoa học nữ Phòng Polymer dược phẩm (Viện Hóa học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) ñược dùng trong nông nghiệp, không ñộc hại, an toàn cho người nông dân và môi trường xung quanh, kích thích cây phát triển, nhanh ra rễ, hoa, lá, tạo nhiều diệp lục tố, chống bệnh ñạo ôn, khô vằn cho lúa. Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh. I.2.3.5 Trong công nghệ mỹ phẩm Chitosan ñược sử dụng ñể sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố ñịnh dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH4+. Trong mỹ phẩm chitosan ñược bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt ñể tăng ñộ bám dính, tăng ñộ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím… I.2.4 Phương pháp thu nhận chitin I.2.4.1 Phương pháp hóa học Quá trình khử khoáng ñược thực hiện bằng việc sử dụng HCl ở nhiệt ñộ phòng với cơ chế: CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 22 Quá trình khử khoáng chỉ nên thực hiện trong thời gian 2-3 giờ khi quá trình khuấy ñảo là ñúng cách. Tuy nhiên, thời gian phản ứng từ 30 phút ñến trên 2 ngày ñã ñược ghi nhận theo báo cáo của No & Mayer (1997). Qúa trình khử khoáng có thể ñạt ñược sau 1-3 h với nồng ñộ HCl 1- 8% tại nhiệt ñộ phòng (23,59). Chấp nhận quá trình khử khoáng ñược tiến hành với acid formic 90%, HCl 22%, HCl 6N, HCl 37% . ðể tránh quá trình depolymer chitin acid ethylenediaminetetra-acetic (EDTA) có thể sử dụng ñể khử muối khoáng. Qúa trình khử khoáng vỏ tôm sử dụng acid acetic hay acid sulfuric cũng ñã ñược công bố . Kéo dài thời gian phản ứng 24 giờ chỉ có một lượng nhỏ hàm lượng tro bị lấy ñi, nhưng có thể gây lên sự thủy phân chitin. Quá trình khử khoáng phụ thuộc vào nồng ñộ acid nhưng nói chung tổng số acid ñược sử dụng nên bằng hoặc lớn hơn mức cần ñể khử lượng khoáng có trong nguyên liệu ñể ñảm bảo phản ứng ñược hoàn toàn. Chitin có thể ñược sản xuất theo phương pháp hoá học như sau: Phế liệu tôm tươi Khử protein (NaOH 4%, τ = 24 giờ, t0= 3000C) Cao hơn 1% Kiểm tra hàm lượng protein Khử khoáng (HCl 4%, τ = 24 giờ, t0= 3000C) Cao hơn 1% Kiểm tra hàm lượng khoáng Chitin Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt ñộ, nồng ñộ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác. Nồng ñộ NaOH thường ñược sử Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 23 dụng trong khoảng 1-10% và ở nhiệt ñộ 65-1000C. Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể ñạt ñược bằng việc xử lý với dung dịch KOH. Hầu hết tất cả protein chứa trong phế liệu vỏ tôm và vỏ ghẹ bị tách loại ở 9000C với tỉ lệ 1/20 (w/v) khi sử dụng dung dịch KOH 1% hoặc 2%. Thời gian phản ứng thường trong dải 0,5-6,0 giờ phụ thuộc vào phương pháp chuẩn bị. Kéo dài thời gian xử lý kiềm sẽ gây ra sự depolymer và deacetyl hoá của polysaccharite làm ảnh hưởng ñến chất lượng sản phẩm chitin. I.2.4.2 Phương pháp cơ học Nguyên lý: Sử dụng các lực cơ học ñể tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ ñầu tôm. Quá trình ñược tiến hành như sau: ðầu tôm còn tươi ñem rửa sạch, sau ñó ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein ñem sấy khô và bảo quản. Hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này không cao. Tuy nhiên, quá trình này ñã loại bỏ một phần protein tự do trong ñầu tôm vì vậy giảm thiểu ñược hóa chất sử dụng cho các công ñoạn tiếp theo. I.2.4.3 Phương pháp hoá lý Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân của công nghệ sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dùng acid ñể ñiều chỉnh pH dung dịch chứa protein về ñiểm ñẳng ñiện của protein, sau ñó dùng các phương pháp lắng, lọc ñể thu hồi protein. Dịch protein → Kết tủa protein → Lắng, gạn → Lọc thu protein → Phơi,sấy ↑ ↓ Dùng axit ñể ñiều chỉnh pH Bột protein Phương pháp này có ưu ñiểm là ñơn giản, dễ làm, có thể thu hồi với hiệu suất cao. Cho phép thu ñược hầu hết các protein hoà tan do ñó có thể ứng dụng ñể thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thuỷ sản. I.2.4.4 Phương pháp sinh học Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại công ñoạn khử protein và deacetyl không sử dụng hoá chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 24 hoặc các enzyme ñể loại bỏ protein một cách triệt ñể. Sản phẩm chitosan thu ñược có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hoá chất. Các công ñoạn cơ bản của phương pháp này ñược thực hiện như sau: Nguyên liệu → Khử khoáng → Khử protein (bổ sung protease hoặc vi sinh vật có khả năng sinh protease). Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể ñạt ñược bằng phương pháp hoá học nhưng không thể ñạt ñược bằng phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược ñiểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khó khăn trong phương pháp hoá học ñể sản xuất chitin là thể tích chất thải có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý quá lớn. Những chất này là do trong công ñoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xứ lý trước khi thải ra môi trường và ñiều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hoá học có thể gây nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến ñổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) và gây ô nhiễm môi trường (Allan và cộng sự, 1978). ðiều này là do không xác ñịnh ñược bản chất hoạt ñộng của hoá chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu. Ngược lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme có thể ñược thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng ñược thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn chế ñược việc xử lý môi trường. Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có ñược sự ñồng nhất hơn về các ñặc tính lý hoá thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme. Legarraeta và cộng sự (1996) ñã sử dụng enzyme protease và vi khuẩn có khả năng tạo protease ñể tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hoá học. Quá trình này giúp tận dụng tối ña giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng ñến môi trường. Hall & De Silva (1994) ñã ñề xuất một phương pháp khử khoáng ñơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu. Phương pháp này là dạng ủ chua ban ñầu ñược phát triển cho bảo quản phế liệu tôm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt ñới. Ủ chua Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 25 là một quá trình ñơn giản của việc bảo quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và ñã ñược ứng dụng cho bảo quản cá trong nhiều năm (Hall & De Silva, 1994). I.3. Bacillus subtilis I.3.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis là loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus, họ Bacillaceae, bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes, giới Bacteria. Vi khuẩn này có thể phân lập ñược dễ dàng vì chúng tồn tại rất phong phú trong tự nhiên từ nhiều nguồn khác nhau như: ñất, nước, không khí, và các nguồn xác thực vật… B. subtilis có những ñặc ñiểm ñiển hình ñại diện cho các trực khuẩn Gram dương, ñặc biệt là quá trình hình thành nội bào tử, về khả năng di ñộng bằng tiên mao, về phương thức phân chia tế bào và hình thái, cấu trúc tế bào. ðặc ñiểm hình thái của B. subtilis là trực khuẩn hình que, có kích thước 0,7-0,8 x 2-3µm. Xung quanh tế bào có rất nhiều tiên mao tạo thành một nhóm giúp cho chúng chuyển ñộng trong môi trường dễ dàng. Bào tử của chúng có hình bầu dục, kích thước từ 0,9 x 0,6µm. Khuẩn lạc của B. subtilis mọc trên môi trường thạch ñặc có ñặc ñiểm khô ráo, màu trắng ñục hoặc màu kem xám nhạt, bề mặt khuẩn lạc bóng, trơn, mọc lan trên mặt thạch, có mép nhăn, lồi lõm. B. subtilis là vi khuẩn không gây bệnh cho người, ñộng thực vật và môi trường sinh thái, là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên trong quá trình nuôi cấy phải ñảm bảo cung cấp ñầy ñủ cho nhu cầu O2. Chúng sinh sản bằng phương thức nhân ñôi tế bào từ một tế bào mẹ cho hai tế bào con và có khả năng tạo nội bào tử giúp chúng chống chịu ñược với các ñiều kiện sống khắc nghiệt nhất như: nhiệt ñộ cao, ñộ khô hạn, pH quá cao hoặc quá thấp trong môi trường sống. I.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng của Bacillus subtilis I.3.2.1 Môi trường dinh dưỡng a, Nguồn C Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 26 B. subtilis là loài vi khuẩn có thể ñồng hoá tốt các nguồn C hữu cơ hoặc vô cơ, tuy nhiên với nguồn C hữu cơ thì chúng dễ dàng ñồng hóa hơn. Nó có thể sử dụng ñược các loại monosaccarit như Glucoza, Fructoza, các disaccarit như maltoza, sacaroza, ñường 5 C như pentoza, các polysaccarit như tinh bột… Nhưng nguồn tốt nhất cho sự ñồng hoá của chúng là ñường glucoza chính vì vậy trong quá trình tiến hành nghiên cứu glucoza thường ñược sử dụng là nguồn C chính cho sự phát triển sinh khối cũng như quá trình chuyển hoá thành các sản phẩm trao ñổi chất của vi khuẩn. b, Nguồn N N là cấu tử dinh dưỡng thứ hai sau C, là nguyên tố tham gia vào thành phần cấu tạo tế bào của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn B. subtilis. N là nguyên tố cấu tạo nên các axit amin cần thiết cho sự xây dựng các protein tạo nên tế bào. Như vậy, nếu trong môi trường dinh dưỡng cung cấp thiếu N thì chắc chắn vi khuẩn không thể phát triển tốt ñược, nó có thể sử dụng cả nguồn N dưới dạng vô cơ và hữu cơ. Nguồn N thường sử dụng ñể nuôi cấy vi khuẩn này là peptone, cao nấm men, casein… Lượng chất dinh dưỡng cung cấp ảnh hưởng ñến sinh trưởng của vi sinh vật, nếu cung cấp không hợp lý sẽ có tác dụng ngược gây ức chế sự phát triển bởi nồng ñộ cơ chất sẽ cản trở quá trình ñồng hoá và tốc ñộ trao ñổi chất của chúng. c, Các nguyên tố khoáng Trong quá trình phát triển của vi khuẩn chúng cũng cần ñược cung cấp các nguyên tố khoáng như P, S, Ca, K, Mg, Fe, Mn… các nguyên tố này có thể ñược cung cấp dưới dạng các muối ñể tạo các ion khoáng chất trong môi trường, cũng có thể cung cấp các nguyên tố khoáng này dưới dạng trực tiếp với lượng cần thiết ñể chúng tham gia vào vai trò chuyển hoá các chất giúp cho quá trình trao ñổi chất của vi khuẩn diễn ra thuận lợi. d, Vitamin Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 27 B. subtilis hầu như không có khả năng tổng hợp ra các chất vitamin, song chúng lại cần chúng mặc dù với lượng rất nhỏ. Các vitamin này thường tồn tại trong các hợp chất dinh dưỡng như: cao nấm men, cao thịt, dịch chiết khoai tây. Ngoài ra, các chất kích thích sinh trường cũng có ảnh hưởng dương tính ñến sự phát triển của vi sinh vật. I.3.2.2 Nhiệt ñộ Nhiệt ñộ có vai trò rất quan trọng ảnh hưởng trực tiếp ñến sự sinh trưởng và phát triển của chúng. B. subtilis là vi khuẩn có khoảng nhiệt ñộ tối ña là 45-550C, nhiệt ñộ tối thiểu là 5-200C. Khoảng nhiệt ñộ tối thích cho sự phát triển của B. subtilis thường trong khoảng 35-370C. Khi nhiệt ñộ vượt ra khỏi dải nhiệt ñộ chịu ñựng của loài thì quá trình phát triển của chúng bị ức chế ngay, số lượng tế bào giảm, tốc ñộ tăng sinh khối cũng giảm và tỷ lệ tế bào chết tăng lên. Tuy nhiên B. subtilis trong ñiều kiện không thuận lợi nó sẽ chuyển sang dạng bào tử ñể chống chịu và sống sót, thường là khi nhiệt ñộ tăng lên khoảng trên 80- 1000C. I.3.2.3 pH B. subtilis có thể phát triển ñược trong môi trường có pH từ 4,5-8,5. Tuy nhiên còngphụ thuộc vào ñặc ñiểm chủng và ñặc ñiểm của môi trường phân lập ra chủng. Nếu ñiều kiện pH không thích hợp thì tế bào sẽ chuyển từ dạng tế bào dinh dưỡng thành dạng bào tử, gặp ñiều kiện thuận lợi sẽ phát triển bình thường. I.3.2.4. Nguồn O2 B. subtilis là vi khuẩn sống hiếu khí bắt buộc nên thường ñược phân lập từ bề mặt của các môi trường ñất, nước, không khí,…do ñó, trong quá trình phát triển, B. subtilis cần cung cấp nhu cầu O2 ñầy ñủ. I.3.3Tình hình nghiên cứu quá trình khử protein phế liệu tôm bằng Bacillus subtilis tại Việt Nam và trên thế giới Việt Nam ñã có nhiều nghiên cứu ứng dụng thuỷ phân protein trong vỏ tôm ñể thu chitin bằng nhiều phương pháp khác nhau. Tuy nhiên cũng ñã có Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 28 một số nghiên cứu về vi khuẩn B. subtilis thuỷ phân protein nhằm khắc phục nhược ñiểm của các phương pháp khác. Trong ñó có một số ñề tài nghiên cứu ñã thu ñược kết quả khá khả quan như “Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis ñể loại protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm” của ðỗ Thị Bích Thuỷ - Trường ðH Nông Lâm, ðH Huế và Trần Thị Luyến - Trường ðại Học Thuỷ Sản. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 29 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 VẬT LIỆU II.1.1 Vi sinh vật 11 chủng thuộc loài Bacillus có trong bộ sưu tập của bộ môn công nghệ sinh học II.1.2. Vỏ tôm Vỏ tôm sú có nguồn gốc từ Quảng Ninh ñược ñem rửa loại bẩn, sấy tại 500C và xay nhỏ ñến kích thước 0,5cm rồi giữ ở tủ lạnh ở ñiều kiện 40C. II.1.3 Các loại thiết bị sử dụng a, Các thiết bị dùng trong nuôi cấy và giữ giống • Thiết bị thanh trùng • Tủ cấy • Tủ ấm • Tủ lắc • Tủ lạnh(giữ giống) b, Các thiết bị dùng trong phương pháp hoá sinh • Máy ño quang OD c, Các thiết bị khác • Máy ño pH • Máy khuấy từ • Lò vi sóng • Cân ñiện tử • Máy ly tâm • Tủ sấy • Máy votex • Bình ổn nhiệt Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 30 II.1.4 Các môi trường cơ bản sử dụng trong nghiên cứu Môi trường giữ giống(1): Cao nấm men 0,5%, Pepton 1%, Glucose 1% Môi trường xác ñịnh hoạt tính proteaza bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa thạch (2): Pepton 1%, NaCl 0,5%, Sữa gầy1%, Thạch 2%, chỉnh pH=7. Môi trường nhân giống ñem lên men(3): Glucose 0,5,%, Cao nấm men 0,75%, Dung dịch muối khoáng 5%(trong ñó gồm NaCl 0,5%, KH2PO4 0,5%, MgSO4.7H2O 0,5%, FeSO4.7H2O 0,01 %). Môi trường xác ñịnh hoạt tính proteaza bằng phương phápkhuyếch tán trên ñĩa thạch (4): Sữa gầy 1%, Thạch 2%, pH=7. II.1.5 Các hóa chất sử dụng a, Hoá chất chuẩn bị môi trường nuôi cấy • Cao nấm men • Pepton • NaCl • Glucoza • KH2PO4 • MgSO4.7H2O • FeSO4.7H2O • Sữa gầy • Thạch agar b, Hoá chất dùng trong các phương pháp hóa sinh • Albumin • Tyrozin • Casein • CH3COOH • H3BO3 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 31 • H3PO4 • NaOH • HCl • CCl3COOH • Na2CO3 • CuSO4 • KNaC4H4O6 • Dung dịch màu folin II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.2.1 Phương pháp vi sinh II.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng Lấy 1 vòng que cấy chuyển vào 10 ml môi trường 3 rồi tiến hành nuôi cấy tại nhiệt ñộ, pH và trong khoảng thời gian như chỉ ra trong phần kết quả trên máy lắc ổn nhiệt với tốc ñộ lắc 170 v/p II.2.1.2 Phương pháp lên men vỏ tôm Chủng nghiên cứu sau khi nuôi cấy lỏng ñược ñem trộn với vỏ tôm theo tỉ lệ xác ñịnh ñược chỉ rõ trong phần kết quả và ñem nuôi cấy tiếp tại nhiệt ñộ và pH xác ñinh trong khoảng thời gian xác ñịnh trên máy lắc ổn nhiệt với tốc ñộ lắc là 170 v/p II.2.2 Phương pháp hóa sinh II.2.2.1 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch II.2.2.1.1 Thu dịch proteaza Sau 24h ta tiến hành thu dịch proteaza, thu canh trường nuôi cấy vào các ống fancol, ñem ly tâm với tốc ñộ là 6000vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau khi ly tâm ta loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 32 II.2.2.1.2 Khuếch tán ñĩa thạch Môi trường (4) sau khi thanh trùng ñược phân phối vào trong hộp petri tương tự như môi trường (2). Ta tiến hành ñục lỗ thạch trong ñiều kiện vô trùng. Sử dụng ñầu côn loại 1ml ta ñục giếng thạch. Nhỏ vào trong giếng thạch vừa ñục 100µm dịch proteaza thu ñược. Sau ñó ñể vào tủ lạnh 1h ñể khuếch tán hết dịch vào trong thạch. Ủ trong tủ ấm 370C quan sát ñường kính vòng thuỷ phân. II.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza bằng phương pháp Anson cải tiến II.2.2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân protein cazeinat natri bằng chế phẩm enzyme có trong dung dịch nghiên cứu rồi tiếp ñó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng axit tricloaxetic. ðịnh lượng sản phẩm ñược tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào ñồ thị chuẩn của tyrozin ñể tính lượng sản phẩm tương ứug do enzyme xúc tác tạo nên. II.2.2.2.2 Cách tiến hành Cho vào 2 ống nghiệm , mỗi ống có 2ml cơ chất, rồi ñặt vào máy ñiều nhiệt ở 300C. Sau 10 phút, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch enzim, lắc trộn ñều và ñể cho thuỷ phân ñúng 10 phút ở 300C. ðể ñình chỉ phản ứng enzim bằng cách thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 4ml acixit tricloracetic 0,3M, khi ñó protein dư cũng như sản phẩm thuỷ phân cao phân tử sẽ bị kết tủa. Khuấy trộn nhanh hỗn hợp ñể kết tủa hoàn toàn protein rồi giữ các ống nghiệm ở 300C thêm 20 phút nữa. Sau ñấy lọc hỗn hợp qua giấy lọc khô trên phễu nhỏ vào các ống nghiệm khô khác, dịch lọc phải thật trong. Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm và thêm vào ñó 5ml dung dịch Na2CO30,5M, khuấy ñều liên tục và thêm 1ml thuốc thử folin phân tích. ðể yên hỗn hợp phản ứng 20 phút. Sau phản ứng dung dịch có màu xanh da trời. ðo cường ñộ màu của dung dịch trên máy so màu quang ñiện ñối ngược với mẫu kiểm chứng. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 33 Tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng bằng cách thêm các hoá chất khác theo thứ tự ngược lại : Thêm vào 2ml dung dịch enzim ( có ñộ pha loãng như ở mẫu thí nghiệm ) 4ml axit tricloaxetic 0,3M, giữ hỗn hợp trong máy ñiều nhiệt 10 phút ở 300C, sau ñó mới thêm vào 2ml dung dịch cơ chất và giữ 20 phút ở nhiệt ñộ này. Qua 20 phút, ñem lọc dung dịch. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm khô, thêm 5ml Na2CO3 0,5M, khuấy ñều liên tục và cho thêm 1ml thuốc thử folin phân tích. ðo cường ñộ màu của các dung dịch thí nghiệm bằng máy so màu với các cu-vet có chiều dày lớp hấp thụ ánh sáng là 1cm và ở bước sóng λ =656 – 670nm. II.2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret II.2.2.3.1 Chuẩn bị dung dịch màu Cân 1,5g CuSO4 và 6g KNaC4H4O6 rồi hoà tan trong 500ml dung dịch nước cất và khuấy ñều . Sau ñó thêm 300ml NaOH 10% vào dung dịch vừa pha. ðịnh mức dung dịch ñến vạch ngấn của bình 1000ml bằng nước cất. II.2.2.3.2 Xây dựng ñường chuẩn Hoà tan dung dịch phần trăm thể tích Albumin nguyên chất với nước cất sẽ ñược một dung dịch protein cô ñặc có nồng ñộ 10mg/ml. ðường chuẩn sẽ ñược xác ñịnh trong khoảng nồng ñộ từ 0 ñến 0,8 mg/ml ñược pha từ dung dịch mẹ vừa pha. Cho vào mỗi ống nghiệm khoảng 4ml thuốc thử, lắc ñều và ñể phản ứng trong 30 phút. Sau ñó, giá trị màu dung dịch hấp thụ ñược sẽ ñược ño ở bằng máy ño màu ở bước sóng là 570nm. II.2.2.3.3 Phương pháp tách chiết protein bằng NaOH Tất cả các thuốc thử ñược sử dụng trong phương pháp này là các hoá chất thuộc tính thử. Cân 1g vỏ tôm cho vào ống fancol thể tích 15ml. Sau ñó thêm vào trong ống nghiệm khoảng 10ml NaOH 3% ngâm qua ñêm ở nhiệt ñộ phòng. Sau ñó ta giữ ở bình ổn nhiệt ở 900C trong vòng 1h, tiếp tục làm nguội xuống nhiệt ñộ phòng rồi lọc thu dịch trong. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 34 Nồng ñộ protein chiết ñược sẽ ở trong phần dịch trong mà chúng ta lọc thu ñược. Dịch lọc mà ta thu ñược ñem ly tâm với tốc ñộ là 6000vòng/phút trong khoảng 20 phút ñể ñảm bảo là ñã loại bỏ hết các phần tử cặn còn lại trong dung dịch chiết. Sau khi ly tâm ta gạn bỏ phần cặn kết tủa chỉ thu dịch trong hoàn toàn. Pha loãng dịch ly tâm ñến nồng ñộ sao cho khi tiến hành phản ứng màu giá trị ño ñược phải nằm trong ñường chuẩn mà chúng ta ñã xây dựng. Sau khi pha loãng ta lấy 1ml dung dịch ñã pha loãng cộng với 4ml dung dịch màu Biuret, ñể phản ứng trong vòng 30phút rồi tiến hành ño giá trị màu bằng máy ño quang ở bước sóng là 570nm. II.2.3. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm bề mặt ñáp ứng Sử dụng thiết kế tâm xoay ñối xứng (central composite design CCD) của phương pháp bề mặt ñáp ứng Giá trị của các biến số thể hiện trong bảng 2 Bảng 2.1. Giá trị mã hóa và thực nghiệm Giá trị mã hóa Biến số -2 -1 0 +1 +2 CaCl2, A [mg/L] 0 0,5 1 1,5 2 Glucoza, B [mg/L] 0 0,5 1 1,5 2 Thời gian, C [h] 14 16 18 20 22 pH, D 7 8 9 10 11 Phương pháp CCD với 4 yếu tố ảnh hưởng với 24 thí nghiệm cộng với 8 ñiểm biên (α=2) và 6 ñiểm tâm (n0=6) tổng cộng là 30 thí nghiệm. Hoạt ñộ proteaza là biến phụ thuộc. Thí nghiệm và kết quả ñược bố trí theo ma trận trình bày ở bảng 1 phụ lục. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 35 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease cao III.1.1 ðịnh tính bằng phương pháp ño ñường kính vòng thuỷ phân Tiến hành cấy chấm ñiểm các chủng nghiên cứu trên môi trường 1 và nuôi cấy trong tủ ấm ở 370C. ðo ñường kính của khuẩn lạc và ñường kính vòng thủy phân 11 chủng sau 24 h nuôi cấy. Kết quả ñược thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. ðường kính khuẩn lạc và vòng thuỷ phân Chủng ðường kính khuẩn lạc d (mm) ðường kính vòng thuỷ phân D (mm) D-d (mm) Bacillus macerans 30 49 19 SD1 38 54 16 NTSA 10 18 18 BKH 30 48 18 M3 42 50 8 W1 48 59 11 W14 42 51 9 M1 40 45 5 B9 6 15 9 DT1 32 49 17 DT2 35 54 19 6 chủng có ñường kính vòng thuỷ phân lớn nhất theo phương pháp khuếch tán ñĩa thạch bằng phương pháp chấm ñiểm (bảng 3.1) ñem nuôi cấy trên môi trường lỏng 2. Dịch nuôi cấy sau 24 h ñem li tâm 6000 v/p tách sinh khối. 100 µl dịch nuôi cấy mỗi chủng ñem nhỏ vào hộp thạch chứa môi trường 4 và khuyếch tán theo Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 36 phương pháp II.2.2. 1. Kết quả ño ñường kính vòng thủy phân sau 48 h ñược thể hiện trên bảng 3.2. Bảng 3.2. ðường kính vòng thuỷ phân Chủng ðường kính vòng thuỷ phân (mm) SD1 12 NSTA 15,5 Bacillus macerans 18 BKH 15 DT1 20 DT2 21 Kết quả bảng 3.2 cho thấy chủng DT2 có ñường kính vòng thủy phân lớn nhất là 21 mm sau 48 h thủy phân trên môi trường 4. III.1.2 ðịnh lượng bằng phương pháp ño hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến ðể khẳng ñịnh chủng nào sinh tổng hợp proteaza có hoạt tính cao nhất, tiến hành xác ñịnh hoạt ñộ của 3 chủng có ñường kính vòng thủy phân lớn nhất là chủng Bacillus macerans, DT1 và DT2 bằng phương pháp Anson cải tiến. Ba chủng trên ñược nuôi cấy trên môi trường 1 trong khoảng thời gian 24 h. Dịch thu ñược ñem li tâm và xác ñịnh hoạt ñộ proteaza theo phươg pháp Anson cải tiến. Kết quả ñược thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Hoạt ñộ proteaza của 3 chủng nghiên cứu Chủng HdP (U/mL) DT1 0,584 DT2 0,684 Bacillus macerans 0,535 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 37 Kết quả bảng 3 cho thấy có sự tương ứng giữa hoạt ñộ proteaza với ñường kính vòng thủy phân, ñường kính vòng thủy phân lớn thì hoạt ñộ proteaza cũng cao. Qua kết quả của bảng 3.1,3.2 và 3.3 chúng tôi chọn chủng DT2 cho các nghiên cứu tiếp theo. III.2 Tối ưu hóa ñiều kiện sinh tổng hợp proteaza III.2.1 Chọn các yếu tố ảnh hưởng Ta tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp proteaza của B. subtilis bao gồm thành phần môi trường dinh dưỡng, pH, và thời gian nuôi cấy. III.2.1.1 Ảnh hưởng của pH pH có ảnh hưởng lớn ñến quá trình sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis cũng như hoạt ñộ của enzyme proteaza mà nó sinh ra. Vì vậy ảnh hưởng của pH ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược ñã ñược nghiên cứu. Tiến hành nuôi cấy chủng DT2 trên môi trường 3 với pH ban ñầu ñược ñiều chỉnh ñến giá trị 6, 8, 10 và 12 theo phương pháp nuôi cấy lỏng II.2.2.1. Dịch nuôi cấy sau 24 h ñem xác ñịnh hoạt ñộ proteaza theo phương pháp trình bày ở mục phương pháp nghiên cứu. Kết quả ñược thể hiện ở bảng 3.4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH ban ñầu ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược pH HdP (U/ml) 6 0,0003 8 0,02 10 0,110 12 0,006 Kết quả bảng 3.4 ñược biểu diễn trên hình 3.1 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 38 Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2 Kết quả bảng 3.4 và hình 3.1 cho thấy pH có ảnh hưởng lớn ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược. Hoạt ñộ proteaza ñạt giá trị cao nhất tại pH 10 và giảm 5,5 lần tại pH 8 và 18 lần ở pH 12. III.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCl2 Theo nhiều nghiên cứu trước nồng ñộ ion canxi có tác dụng tốt ñến hoạt ñộ proteaza tạo thành, chúng tôi tiến hành thay ñổi nồng ñộ ion Ca. Kết quả hình vẽ 3.2 cho thấy hoạt ñộ proteaza thu ñược có thể tăng ñến 5 lần nếu thêm 2 g/L CaCl2 vào thành phần môi trường. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2 0 0,04 0,08 0,12 0 1 2 Nồng ñộ CaCl2 (g/L) H dP (U /m L) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 pH6 pH8 pH10 pH12 H dP (U /m L) Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 39 III.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñường Tiếp theo ảnh hưởng của nguồn C glucoza ñến hoạt ñộ proteaza ñược nghiên cứu. Kết quả ñược biểu thị trên hình 3.3 cho thấy nồng ñộ glucoza cũng có ảnh hưởng ñến hạt ñộ proteaza thu ñược. Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza của chủng DT2 III.2.1.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ðộng học của quá trình sinh tổng hợp proteaza ñược nghiên cứu tại 370C. Kết quả ño hoạt ñộ proteaza tại các thời ñiểm chỉ ra trong bảng 3.5. Ta thấy hoạt ñộ proteaza thay ñổi theo thời gian, ñạt giá trị cao nhất sau 16 h nuôi cấy. 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0 1 2 Nồng ñộ glucoza (g/L) H dP (U /m L) Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thời gian(h) HpD(U/ml) 5 0,203 8 0,214 12 0,280 16 0,317 21 0,292 24 0,252 III.2.2 Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt ñáp ứng Kết quả thí nghiệm ñược ñem xử lí bằng chương trình Design-Expert 7.1 thu ñược phương trình ñáp ứng sau: Hoạt ñộ proteaza Y = 3.50 - 0.38*A - 0.41*B - 0.091*C + 0.83*D + 0.18*A*B + 0.10 *A*C- 0.038*A*D + 0.27*B*C + 0.034*B*D + 0.38*C*D - 0.34* A2 - 0.32* 2 - 0.20*C2 - 0.60*D2 Trong ñó Y là giá trị ñáp ứng hoạt ñộ proteaza, A, B, C và D là các giá trị của các biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian và pH tương ứng. Phân tích theo mô hình bậc 2 cho thấy mô hình là có nghĩa thể hiện ở chuẩn Fisher với giá trị xác suất rất thấp [(Pmô hình >F)=0.0001]. Hệ số hồi qui bội R2=0.8987 cho thấy sự lệch giá trị thực so với mô hình là rất nhỏ, chỉ có 10.13%. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thông số Tổng bình phương Chuẩn F Mức có nghĩa P>F Mô hình 41,420 19,380 < 0,0001 A-CaCl2 3,410 22,360 0,0001 B-Glucoza 4,090 26,790 0,0003 C-Thời gian 0,200 0,200 0,273 D-pH 16,420 107,610 < 0,0001 AB 0,530 3,490 0,081 AC 0,170 1,130 0,306 AD 0,023 0,150 0,701 BC 1,210 7,920 0,013 BD 0,018 0,120 0,735 CD 2,360 15,450 0,001 A^2 3,250 21,310 0,000 B^2 2,800 18,330 0,001 Các phân tích thống kê (bảng 3.5) cho thấy khi các biến thay ñổi trong khoàng biến thiên thì tất cả các biến khảo sát trừ thời gian ñều có ảnh hưởng nhiều ñến hoạt ñộ proteaza, thể hiện ở mức có nghĩa của P ñều nhỏ hơn 0.05. ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của từng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza khi cố ñịnh các yếu tố còn lại thể hiện trên hình 3.4. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 42 Hình 3.4. Ảnh hưởng của từng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza khi cố ñịnh các yếu tố còn lai. A, B, C và D là các giá trị của các biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian và pH tương ứng Kết quả cho thấy khi tăng nồng ñộ CaCl2 và glucoza từ 0.5 ñến 0.75 thì làm tăng hoạt ñộ proteaza lên, nhưng nếu tiếp tục tăng nồng ñộ 2 chất này ñến 1.5 g/l sẽ làm giảm hoạt ñộ proteaza thu ñược. Tương tự vậy thời gian tốt nhất cho hoạt ñộ proteaza là giữa khoảng nghiên cứu tức là 16h. Riêng pH tăng ñến hơn 9 vẫn làm tăng hoạt ñộ proteaza, nếu tăng tiếp giá trị pH ñến 10 thì hoạt ñộ proteaza sẽ giảm ñi một ít nhưng không ñáng kể. Ảnh hưởng của pH là lớn nhất thể hiện sự biến thiên lớn nhất của hoạt ñộ proteaza trong khỏang nghiên cứu và ảnh hưởng của thời gian là ít nhất. Hình ảnh không gian ba chiều của bề mặt ñáp ứng của hoạt ñộ proteaza ñược biêu diễn ở hình 3.4, 3.5 và 3.6. Perturbation Deviation from Reference Point (Coded Units) H o a t d o pr o te a za -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 0 0.975 1.95 2.925 3.9 A A B B C C D D Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 43 Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian và nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH và nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 1.3 1.95 2.6 3.25 3.9 H oa t d o pr ot ea za A: CaCl2 D: pH Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 44 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thòi gian và nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza Hoạt ñộ proteaza lớn nhất theo mô hình sẽ ñạt ñược tại nồng ñộ CaCl2 0,5g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 và thời gian nuôi cấy là 14h. III.3 Tìm ñiều kiện thích hợp cho quá trình lên men phế liệu tôm loại protein Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men và tỉ lệ vỏ tôm: dịch nuôi cấy Bacillus subtilis DT2 ñến khả năng loại protein trong phế liệu tôm. Bổ sung 50 ml dịch canh trường lên men ở ñiều kiện tối ưu như ñã nghiên cứu ở phần trên (nồng ñộ CaCl2 0,51g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 và thời gian nuôi cấy là 14h) vào bình tam giác chứa lượng vỏ tôm lần lượt là 5g, 10g, 20g. Lượng protein còn lại trong vỏ tôm ñược xác ñịnh bằng phương pháp Buiret sau các khoảng thời gian lên men là 12h, 24h, 36 h. Kết quả thể hiện ở hình 3.6: 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 2.3 2.675 3.05 3.425 3.8 Ho at do pr ot ea za B: Glucoza C: Thoi gian Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 45 0 1 2 3 4 5 6 7 12 24 36 Thời gian lên men(h) Hà m lư ợ n g pr o te in (% ) 5 g 10 g 20 g Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ và thời gian lên men ñến hiệu suất lên men Kết quả hình 3.7 cho thấy khi thời gian lên men kéo dài từ 12h, 24h, ñến 36h hàm lượng protein còn lại trong vỏ tôm là giảm ñối với cả 3 tỉ lệ khác nhau. ðồng thời khi lượng vỏ tôm tăng tức là tỷ lệ giữa nguyên liệu vỏ tôm và dịch nuôi cấy Bacillus subtilis giảm thì khả năng khử protein cũng tăng lên. ðiều này có thể giải thích là lượng vỏ tôm tăng sẽ tăng khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis và do vậy tăng khả năng sử dụng protein vỏ tôm dẫn ñến lượng protein khử tăng. Kết quả nghiên cứu thu ñược cho thấy tỷ lệ lên men là 20g/50ml và thời gian lên men là 36h thu ñược hiệu suất lên men là cao nhất, loại bỏ ñược 96,14% protein trong vỏ tôm (lượng protein còn lại là 3,86%). So với kết quả nghiên cứu của ðỗ Thị Bích Thuỷ - Trường ðH Nông Lâm, ðH Huế và Trần Thị Luyến - Trường ðại Học Thuỷ Sản thu ñược là sau 24h lên men thì % protein còn lại trong phế liệu so với mẫu chưa lên men là 12,99%. Sau 48h còn lại giảm khoảng 1% so với thời ñiểm 24h. Sau ñó thì sự giảm hàm lượng protein hầu như không ñáng kể( sau 96h là còn lại 11,25%). Như vậy hiệu suất lên men trong các thí nghiệm của chúng tôi tiến hành là cao hơn hẳn. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 46 IV. KẾT LUẬN Như vậy, qua quá trình nghiên cứu chúng tôi rút ra kết luận : 1. Trong số 11 chủng trong phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành ño ñường kính khuẩn lạc, ñường kính vòng thuỷ phân ñồng thời ño hoạt lực proteaza theo phương pháp Anson cải tiến tôi ñã chọn ra ñược chủng DT2 có hoạt lực là lớn nhất ñem ñi tối ưu hoá ñiều kiện sinh tổng hợp. 2. Sau khi tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng, rồi sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bề mặt ta thu ñược ñiều kiện tối ưu hoá của chủng Bacillus subtilis là nồng ñộ CaCl2 0,51g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 và thời gian nuôi cấy là 14h. 3. Tiến hành nhân giống môi trường vi sinh vật ñể lên men vỏ tôm, tìm ñiều kiện thích hợp cho quá trình lên men về tỷ lệ giữa lượng phế liệu và môi trường nhan giống, thời gian lên men. Chúng tôi ñã thu ñược kết quả là tỷ lệ là 20g/50ml và 36h. Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 47 V. PHỤ LỤC Bảng 5.1. Các thí nghiệm tiến hành trong qui hoạch tối ưu và kết quả Thí nghiệm A:CaCl2 g/l B:Glucoza g/l C:Thoi gian h D:pH Hoat do proteaza U/ml 1 1 1 16 9 3,504 2 0 1 16 9 2,961 3 1 1 16 9 3,484 4 1 1 16 9 3,379 5 0,5 0,5 14 8 3,202 6 1 1 12 9 3,138 7 0,5 1,5 14 8 0,76 8 1 1 16 9 3,502 9 1 1 16 9 3,549 10 1 1 20 9 2,873 11 1 1 16 9 3,554 12 1,5 0,5 14 8 1,321 13 1,5 1,5 14 10 1,325 14 1,5 1,5 18 8 0,347 15 2 1 16 9 1,872 16 0,5 1,5 18 8 0,5 17 1,5 1,5 18 10 2,73 18 1 0 16 9 3,399 19 0,5 1,5 14 10 2,617 20 1 1 16 7 0,08 21 0,5 0,5 18 8 0,997 22 1,5 1,5 14 8 0,558 23 1,5 0,5 18 8 0,103 24 1,5 0,5 14 10 2,617 25 0,5 0,5 14 10 3,507 26 0,5 0,5 18 10 3,878 27 0,5 1,5 18 10 3,059 28 1 1 16 11 2,711 29 1 2 16 9 1,634 30 1,5 0,5 18 10 2,647 Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= ============================================================== 48 Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt 1. ðặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh,1997. Thí nghiệm hoá sinh công nghiệp. Viện công nghệ sinh học và thực phẩm, bộ môn hoá sinh, trường ñại học Bách Khoa – Hà Nội. 2. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2005. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. NXB Khoa Học Kĩ Thuật, Hà Nội. 3. Viện công nghệ sinh học và thực phẩm, 2006. Thí nghiệm vi sinh vật công nghiệp. Trường ñại học Bách Khoa, Hà Nội. 4. sinhviendct..net/forum/showthread.php?t=1293 5. www.ific.org/nutrition/functional/upload/functionalfoodsbackgrounder.pdf 6. www.hoahocvietnam.com Tài liệu tiếng Anh 7. Peng, Y., X. Yang, Y. Zhang, 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl. Microbiol Biotechnol 69, 126-132. 8. Panuwan C., Anchalee O., Khanungkan K., Ekachai ., and Saisamom L., 2002. Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand. ScienceAsia, (28), 241-245. 9. www.beta-glucan-info.com/enzyme_facts.htm 10. www.functionalfoodnet.eu/images/site/asset/a-New%20FF%20Ingred- cardio%20health.pdf 11. en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis