Đề tài Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, xác định LD50 và tác dụng lên thần kinh trung ương trên thực nghiệm của siro laroxen

Nghiªn cøu x©y dùng tiªu chuÈn chÊt l­îng, x¸c ®Þnh LD50 vµ t¸c dông lªn thÇn kinh trung ­¬ng trªn thùc nghiÖm cña siro laroxen  C¸n bé h­íng dÉn: TS. NguyÔn Minh ChÝnh Bé Quèc Phßng HäcViÖn Qu©n Y ****** Ph¹m v¨n V­îng (Kho¸ luËn tèt nghiÖp d­îc sÜ ®¹i häc kho¸ 1999 – 2005) Néi dung tr×nh bµy gåm: 1. §Æt vÊn ®Ò2. Tæng quan tµi liÖu3. VËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu4. KÕt qu¶ vµ bµn luËn5. KÕt luËn §Æt vÊn ®Ò - Thuèc t©m thÇn kinh ®ãng vai trß quan träng- Thuèc cã nguån gèc ho¸ d­îc cã nhiÒu t¸c dông phô - GÇn ®©y, Häc ViÖn Qu©n Y ®· ®iÒu chÕ ®­îc Rotundin sulfat. §©y lµ nguyªn liÖu cho nhiÒu d¹ng thuèc nh­: thuèc tiªm, viªn nÐn, viªn nang, siro... Trong ®ã d¹ng siro ®­îc bµo chÕ t¹i Trung t©m nghiªn cøu øng dông s¶n xuÊt thuèc - Häc viÖn Qu©n Y cã tªn lµ siro Laroxen. - So víi d¹ng bµo chÕ kh¸c, siro lµ d¹ng thuèc phæ biÕn vµ nã thÝch hîp víi ng­êi giµ vµ trÎ nhá.Tõ nh÷ng ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn nãi trªn, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi nh»m môc tiªu sau: 1. X©y dùng tiªu chuÈn chÊt l­îng siro Laroxen. 2. X¸c ®Þnh LD50  3. x¸c ®Þnh t¸c dông gi¶m ®au, g©y ngñ, trÊn tÜnh vµ chèng co giËt cña thuèc trªn ®éng vËt thùc nghiÖm. PhÇn i - Tæng quan1.1. C©y b×nh v«i (stephania lour - Menispermaceae). 1.1.1. §Æc ®iÓm thùc vËt. D©y leo, th©n xo¾n nh½n, th­êng xanh, sèng l©u n¨m, rÔ cñ ph×nh to ¶nh 1: C©y B×nh v«i ( Stephania glabra (Roxb) – Menispermaceae) 1.1.2. Ph©n bè, trång h¸i vµ chÕ biÕn.- ViÖt Nam ph©n bè ë c¸c tØnh nh­: Hµ T©y, Hoµ B×nh, Hµ Giang, Tuyªn Quang, Phó Thä, Phó Yªn, Ninh ThuËn v.v... [17], [7], [6]. - B×nh v«i b»ng h¹t hoÆc b»ng phÇn ®Çu cña cñ. - Khi thu cñ vÒ ®em c¹o s¹ch vá n©u ®en, th¸i l¸t máng, ph¬i hoÆc sÊy kh« hoÆc ®em chiÕt Rotundin.1.1.3. Bé phËn dïng vµ thµnh phÇn ho¸ häc.- Bé phËn dïng: D­îc liÖu lµ cñ b×nh v«i ®· ®­îc ph¬i hoÆc sÊy kh«. [7], [6]. - Thµnh phÇn ho¸ häc: Cñ b×nh v«i cã nhiÒu alcaloid trong ®ã cã Rotundin (L-tetrahydropalmatin) vµ c¸c alcaloid kh¸c nh­: Stepharin, Cycleanin,... Ngoµi ra cßn cã tinh bét, ®­êng khö..  1.2. Hîp chÊt Rotundin vµ Rotundin sulfat.1.2.1. Hîp chÊt Rotundin. 1.2.1.1. §Æc ®iÓm cÊu tróc ho¸ häc.[3], [7], [23], [7]. CTPT: C21H25NO4 CTCT: KLPT: 355,43 TKH: 5,8,13,13-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- 6H dibenzo [a,g] quinolizine (CÊu tróc nhãm isoquinolin). 1.2.1.2. C¸c th«ng sè ho¸ lý. [23], [7].- Bét kÕt tinh tr¾ng hoÆc h¬i vµng, kh«ng mïi kh«ng vÞ.- §é tan: Kh«ng tan trong n­íc, tan trong Cloroform, dÔ tan trong acid lo·ng.- §iÓm ch¶y (mp): 141- 1440 C.- - Phæ tö ngo¹i: cã ®Ønh hÊp thô t¹i 281nm. 1.2.1.3. ChiÕt xuÊt vµ tinh chÕ RotundinChiÕt xuÊt, tinh chÕ Rotundin ®¹t hµm l­îng 90 - 95% trong s¶n phÈm trung gian vµ tinh chÕ Rotundin tinh khiÕt ®¹t hµm l­îng trªn 99% .[7], [20], [31].1.2.1.4. T¸c dông sinh häc. Rotundin (L- tetrahydropalmatin) cã t¸c dông an thÇn, g©y ngñ v.v.... [20], [27].1.2.2. Hîp chÊt Rotundin sulfat.2.2.2.1. §Æc ®iÓm cÊu tróc ho¸ häc. [7], [9], [10], [8]. - CTPT: C21 H25 NO4.H2 SO4- CTCT:  - KLPT: 453,51 1.2.2.2. C¸c th«ng sè lý, ho¸. [7], [9], [10], [8].- Tinh thÓ mµu tr¾ng hoÆc h¬i ¸nh vµng, kh«ng mïi vÞ h¬i ch¸t. - §é tan: dÔ tan trong n­íc, tan trong Methanol, Ýt tan trong Ethanol cao ®é, kh«ng tan trong Ether, Chloroform.- §iÓm ch¶y ( t c) : 213  221 C- N¨ng xuÊt quay cùc riªng (25D): kh«ng d­íi - 210 --- T¹p chÊt liªn quan: kh«ng qu¸ 0,5%.- pH (dung dÞch 1% trong n­íc): 1,5  2,5.- Phæ tö ngo¹i: cã ®Ønh cùc ®¹i t¹i 281nm.- §Þnh l­îng: Rotundin sulfat ph¶i chøa tõ 98,0 % ®Õn 101,0% C24H25NO4.H2SO4 1.2.2.3. §iÒu chÕ Rotundin sulfat. [7], [9], [10], [8]LÇn ®Çu tiªn, qui tr×nh s¶n xuÊt Rotundin sulfat ®­îc Häc viÖn Qu©n Y c«ng bè (2001):Nguyªn t¾c:Rotundin + Acid sulfuric Muèi Rotundin sulfat. S¬ ®å qui tr×nh: HÖ dung m«i H2 SO4 L¹nh, kÕt tinh  Rotundin dd ®ång tan Ph¶n øng ®un nãng xóc t¸c, nhiÖt ®é Läc  röa, lo¹i t¹p Tinh thÓ 1 Tinh thÓ 2 SÊy nhÑ 1.2.2.3. T¸c dông sinh häc.Rotundin sulfat cã t¸c dông an thÇn, lµm dÞu thÇn kinh, g©y ngñ, lµm gi¶m vËn ®éng, chèng co giËt (trªn ®éng vËt thùc nghiÖm). [7].1.3. D¹ng thuèc siro 1.3.1. §Þnh nghÜa:  Siro thuèc lµ dung dÞch ®Ëm ®Æc cña ®­êng tr¾ng (succarose) trong n­íc, cã chøa c¸c d­îc chÊt hoÆc dÞch chiÕt tõ d­îc liÖu vµ c¸c chÊt th¬m.1.3.2. Thµnh phÇn cña siro thuèc. Thµnh phÇn chÝnh cña siro thuèc bao gåm c¸c d­îc chÊt, dung m«i n­íc vµ ®­êng. Ngoµi ra cßn cã mét sè thµnh phÇn kh¸c: C¸c chÊt lµm t¨ng ®é tan, t¨ng sinh kh¶ dông vµ ®é æn ®Þnh...vv 1.3.3. KÜ thuËt ®iÒu chÕ..1.3.3.1. §iÒu chÕ siro thuèc b»ng c¸ch hoµ tan d­îc chÊt, dung dÞch d­îc chÊt vµo siro ®¬n. C¸c giai ®o¹n tiÕn hµnh nh­ sau:- §iÒu chÕ siro ®¬n:- ChuÈn bÞ dung dÞch d­îc chÊt (nÕu cã): - Hoµ tan d­îc chÊt, phèi hîp dung dÞch d­îc chÊt vµ siro ®¬n.- Hoµn chØnh thµnh phÈm  Siro thuèc ®­îc läc trong (läc nãng), kiÓm nghiÖm ph¶i ®¹t c¸c chØ tiªu ®Ò ra tr­íc khi ®ãng gãi thµnh phÈm1.3.3.2. §iÒu chÕ siro thuèc b»ng c¸ch hoµ tan ®­êng vµo dung dÞch d­îc chÊt C¸c giai ®o¹n tiÕn hµnh nh­ sau: ChuÈn bÞ dung dÞch d­îc chÊt:- Hoµ tan ®­êng vµo dung dÞch d­îc chÊt:- §­a nång ®é ®­êng ®Õn giíi h¹n qui ®Þnh.§Ó ®­a ®­êng ®Õn nång ®é qui ®Þnh, dùa vµo nhiÖt ®é s«i hoÆc tû träng nh­ b¶ng: ®Ó tÝnh l­îng n­íc cÇn thªm vµo siro cã nång ®é cao qu¸ quy ®Þnh, ta cã thÓ sö dông c¸c c«ng thøc sau (tÝnh ra gam).[1]: a.d2(d1 - d2)X =  d1 (d - d2) Khi dïng phï kÕ Baume, l­îng n­íc cÇn dïng ®Ó pha lo·ng siro ®Õn nång ®é qui ®Þnh ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: X = E = 0,033 a.D - Lµm trong siro 1.4. kiÓm nghiÖm thuèc d¹ng siro.  - TÝnh chÊt - ®é trong - ThÓ tÝch. - pH - ®é nhiÔm khuÈn. - Tû träng. - ®é ®ång ®Òu hµm l­îng. - ®Þnh tÝnh - ®Þnh l­îng.   PhÇn ii  vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. Nguyªn vËt liÖu, ®èi t­îng vµ thiÕt bÞ 2.1.1. Nguyªn liÖu: - Siro Laroxen, c«ng thøc bµo chÕ nh­ sau: Rotundin sulfat: 600 mg DÇu th¬m v® Siro ®¬n v® : 100 ml. - Thuèc chuÈn lµ Seduxen, thuèc g©y co giËt Corazon 0,5%. 2.1.2. §èi t­îng: Chuét nh¾t tr¾ng, kh«ng ph©n biÖt gièng, ®¹t tiªu chuÈn, träng l­îng trung b×nh 20  2g/ con 2.1.3. Ho¸ chÊt, thuèc thö vµ dung m«i - C¸c thuèc thö: Kali dicromat (K2Cr2O7), Kali fericianid (K3Fe(CN)6) 5%, Natri clorid b·o hoµ (NaCl), Bari clorid (BaCl2) 5%, dung dÞch HCl, H2SO4 lo·ng - Dung m«i: Cån 600, 900, 950, n­íc cÊt. C¸c hãa chÊt, thuèc thö, dung m«i nãi trªn ®Òu ®¹t tiªu chuÈn ghi trong D§VN III, 2002. 2.1.4. Trang thiÕt bÞ vµ dông cô nghiªn cøu.- C©n ph©n tÝch ®iÖn tö Mettler AE240 (§øc) - M¸y ®o pH Hana Instrument 8417 (Singapore) - M¸y ®o quang phæ tö ngo¹i UV-Visible Spectrometer - Cintra 40 (Australia) - B×nh ®Þnh møc, pipet chÝnh x¸c lo¹i 1, 2, 5 ml, b¬m tiªm vµ mét sè dông cô kh¸c.  TÊt c¶ c¸c thiÕt bÞ vµ dông cô nµy ®Òu ®¹t tiªu chuÈn D§VN III. 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu2.2.1. Ph­¬ng ph¸p x©y dùng tiªu chuÈn chÊt l­îng. Dùa vµo c¸c th«ng sè ho¸ lý, sinh häc nh­: TÝnh chÊt, tû träng, phæ UV, pH, ®Þnh tÝnh, ®Þnh l­îng, ®é nhiÔm khuÈn, sai sè ®ãng gãi, cô thÓ ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tõng th«ng sè ®ã nh­ sau: 2.2.1.1. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tÝnh chÊt cña Siro Laroxen.Mµu s¾c, mïi vÞ: x¸c ®Þnh b»ng c¶m quan.2.2.1. 2. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tû träng (d2020) X¸c ®Þnh tû träng cña Siro Laroxen b»ng ph­¬ng ph¸p dïng picnomet, theo D§VN III, cô thÓ nh­ sau:  d2020 = Khèi l­îng n­íc cÊt 2.2.1.3. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh. Dùa vµo c¸c ph¶n øng ®Æc tr­ng cña Rotundin sulfat: - ph¶n øng víi dd BaCl2 5%.  - ChiÕt lÊy tña b»ng NaOH 0,01N, hoµ tan ®un nãng tña thu ®­îc b»ng 15ml dung dÞch H2SO4 0,01 N. Dung dÞch thu ®­îc, tiÕn hµnh c¸c ph¶n øng víi dung dÞch K2Cr2O7 5%, dd NaCl b·o hoµ, K3Fe(CN)6 5% (®un nãng nhÑ). Khèi l­îng Siro Laroxen a) Kh¶o s¸t sù hÊp thô UV cña dung dÞch ®­êng b) X©y dùng ®­êng chuÈn: - C©n chÝnh x¸c kho¶ng 0,5g Rotundin sulfat, pha d·y c¸c nång ®é 20g/ml, 30g/ml, 40g/ml, 50g/ml, 60g/ml, 70g/ml trong siro ®¬n pha lo·ng. - §o d·y nång ®é trªn ë b­íc sãng  = 281nm. MÉu tr¾ng lµ siro ®¬n pha lo·ng. b) §Þnh l­îng Siro Laroxen.- LÊy chÝnh x¸c 1ml Siro Laroxen cho vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, thªm n­íc cÊt võa ®ñ ®Õn v¹ch ®Ó ®­îc dung dÞch A.- §o mËt ®é quang cña dung dÞch A ë  = 281nm. MÉu tr¾ng lµ siro ®¬n pha lo·ng kh«ng cã ho¹t chÊt Rotundin sulfat.TÝnh hµm l­îng Rotundin sulfat cã trong Siro Laroxen dùa vµo ®­êng chuÈn ®· x©y dùng ë trªn.  2.2.1.4. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng. 2.2.1.5. Ph­¬ng ph¸p ®o pH: B»ng m¸y ®o pH vµ dùa theo D§VN III, môc 5.9, phô lôc 5. 2.2.1.6. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ®é nhiÔm khuÈn: Theo D§VN III, môc 10.8, phô lôc 10. 2.2.1.7 Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ®é trong: Theo D§VN III, môc 5.12, phô lôc 5. 2.2.1.8. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh sai sè l­îng ®ãng gãi: Theo D§VN III, môc 1.5, Phô lôc 1. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp (LD50): - Dùa theo ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ®éc tÝnh cÊp cña Abraham W.B. vµ Turner.R 1965 vµ theo qui ®Þnh cña Bé y tÕ vÒ nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp cña c¸c thuèc y häc cæ truyÒn d©n téc. Chuét thÝ nghiÖm ®­îc chia lµm 5 l«, mçi l« 10 con. Tõng l« chuét ®ù¬c uèng Siro Laroxen víi liÒu cña Rotundin sulfat t¨ng dÇn: 120 mg; 240 mg; 360 mg; 480 mg; 600mg. Theo dâi t×nh tr¹ng chung cña chuét trong thêi gian thÝ nghiÖm (72 giê).Ghi sè chuét chÕt vµ sèng cña tõng l« kÓ tõ thêi ®iÓm sau khi uèng Siro Laroxen ®Õn hÕt 72 giê (3 ngµy).TÝnh to¸n kÕt qu¶ theo ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn cña Livschitch P.Z.(1986).2.2.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh c¸c t¸c dông d­îc lý.2.2.3.1. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu t¸c dông g©y ngñ cña Siro Laroxen trªn chuét nh¾t tr¾ng. §­îc thùc hiÖn theo ph­¬ng ph¸p cña Ruhn vµ Vamaanen (1961). Chuét nh¾t tr¾ng ®­îc chia lµm 3 l«:- L« chøng: 10 con: cho uèng n­íc muèi sinh lý.- L« nghiªn cøu: 12 con: cho uèng Siro Laroxen 20ml/kg - L« chuÈn: 12 con: cho uèng Seduxen 15mg/kg  Theo dâi thêi gian sau uèng thuèc ®Õn khi chuét ngñ (mÊt ph¶n x¹ lËt sÊp) vµ thêi gian kÐo dµi gi¸c ngñ. 2.2.3.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu t¸c dông cña Siro Laroxen lªn tr¹ng th¸i hung h·n cña chuét nh¾t tr¾ng. - §­a chuét ra ngoµi vµ cho uèng: + L« thö: Siro Laroxen víi liÒu 20mg/kg + L« so s¸nh: Seduxen víi liÒu 5 mg/kg + L« chøng: n­íc muèi sinh lý (NMSL). Sau khi uèng 30 phót, lÇn l­ît ®­a c¸c cÆp chuét l¹i m¸y kÝch thÝch ®au. Quan s¸t tr¹ng th¸i cña chuét vµ ghi sè trËn ®¸nh nhau trong 1 phót. TÝnh tû lÖ øc chÕ hµnh vi hung h·n cña chuét chÞu t¸c ®éng cña Siro Laroxen sau khi uèng 2.2.3.3. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu t¸c dông gi¶m ®au cña Siro Laroxen. G©y ®au, x¸c ®Þnh thêi gian xuÊt hiÖn c¶m gi¸c ®au b»ng chØ tiªu: chuét liÕm ch©n sau. ChØ lùa chän nh÷ng chuét cã thêi gian tõ 6 ®Õn 24 gi©y.  - L« thö: cho uèng Siro Laroxen víi liÒu 30mg/kg.- L« so s¸nh : cho uèng Seduxen víi liÒu 10 mg/kg.- L« chøng: cho uèng n­íc muèi sinh lý.2.2.3.4. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu t¸c dông chèng co giËt trªn m« h×nh g©y co giËt b»ng corazon 0,5 % cña Siro Laroxen.Chuét nh¾t tr¾ng 30 con, chia lµm 2 l«:- L« chøng: 10 con, g©y co giËt b»ng Corazon 0,5 % b»ng tiªm phóc m¹c víi liÒu 0,1 ml/10g thÓ träng chuét. Ghi kÕt qu¶ thÝ nghiÖm cña tõng chuét nghiªn cøu.- L« thö: 20 con, mçi con ®­îc uèng 60 mg/kg thÓ träng chuét. Sau 30 phót g©y co giËt b»ng Corazon 0,5 % víi liÒu 0,1 ml/10g thÓ träng. Theo dâi thêi gian biÓu hiÖn tr¹ng th¸i co giËt cña chuét thÝ nghiÖm.2..2.4. Ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu:C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu ®­îc xö lý b»ng ph­¬ng ph¸p thèng kª Y häc nh­: T-test, TuyÕn tÝnh håi qui. PhÇn III: KÕt qu¶ vµ bµn luËn 3.1. KÕt qu¶ x©y dùng tiªu chuÈn chÊt l­îng 3.1.1. TÝnh chÊt: NhËn xÐt: Siro Laroxen lµ siro thuèc d¹ng láng, s¸nh cã mµu vµng n©u, mïi th¬m chanh, vÞ ngät ®¾ng. 3.1.2. KÕt qña x¸c ®Þnh tû träng cña Siro Laroxen b»ng picnomet. Víi 3 mÉu 3 l« s¶n xuÊt kh¸c nhau, mçi tiÕn hµnh ®o 5 lÇn kÕt qu¶ ®­îc thÓ hiÖn ë b¶ng 2: NhËn xÐt: Qua bang cho thÊy tû träng cña Siro Laroxen lµ 1,3261 0,0052. Kháang tû träng tõ 1,31 ®Õn 1,33 dïng ®Ó x©y dùng tiªu chuÈn chÊt l­îng Siro Laroxen. 3.1.3. pH NhËn xÐt: pH cña Siro Laroxen lµ: 2,1 - 2,5. 3.1.5. Ph¶n øng ®Ýnh tÝnh Siro Laroxen Nh­ vËy c¸c mÉu ®Òu cã chøa ho¹t chÊt Rotundin sulfat vµ c¸c ph¶n øng 1, 2, 3, 4 ®­îc dïng ®Ó ®Þnh tÝnh c¸c ho¹t chÊt cã trong Siro Laroxen. B¶ng 5: KÕt qu¶ ®Þnh tÝnh Siro Laroxen KÕt qu¶ quÐt phæ tö ngo¹i tõ b­íc sãng 200 - 800 nm cña Siro Laroxen pha lo·ng nh­ sau: 3.1.6. Phæ [UV] cña Siro Laroxen. 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Quang Pho 281.2 3.1.7. KÕt qu¶ ®Þnh l­îng Siro Laroxen. 3.1.7.1. X©y dùng ®­êng chuÈn. H×nh 2: Phæ tö ngo¹i [UV] cña Siro Laroxen B¶ng 6: ®é hÊp thô E cña c¸c dung dÞch Rotundin sulfat trong siro pha lo·ng. Tõ kÕt qu¶ nµy, tiÕn hµnh x©y dùng ®­êng chuÈn ®Þnh Rotundin sulfat cã trong Siro Laräxen Hinh 3: ®­êng chuÈn Rotundin sulfat trong siro pha lo·ng KÕt qu¶ ë b¶ng 6 vµ h×nh 3 cho thÊy: §é hÊp thô vµ nång ®é dung dÞch Rotundin sulfat trong siro pha lo·ng (kho¶ng nång ®é tõ 20 ®Õn 70 g/ml) cã mèi t­¬ng quan tuyÕn tÝnh chÆt chÏ víi hÖ sè t­¬ng quan r b»ng 0,998. 3.1.7.2. KÕt qña ®Þnh l­îng.  3.1.8. KÕt qña x¸c ®Þnh sai sè ®ãng gãi. 3.1.9. ®é trong. KÕt qu¶: C¸c mÉu ®Òu cã ®é trong t­¬ng ®­¬ng víi hçn dÞch chuÈn ®èi chiÕu sè I NhËn xÐt: Kh«ng cã chuét nµo bÞ chÕt trong c¶ 5 l« nghiªn cøu 3.3. K£T qña x¸c ®Þnh c¸c t¸c dông d­îc lý cña Siro Laroxen 4.3.2 T¸c dông chèng hung h·n. NhËn xÐt 3.3.4. T¸c dông chèng co giËt trªn m« h×nh g©y co giËt b»ng corazon 0,5% PhÇn iv - KÕt luËn 4.1.2. LD50 4.2. kiÕn nghÞ