Đề tài Phân lập các chủng nấm men có ý nghĩa trong quá trình sản xuất rượu cần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ----›¸š---- BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Cơ quan QUẢN LÝ: TrưỜng ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT Đà Lạt, tháng 05 năm 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ----›¸š---- BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài : Đỗ Bá Dương Lớp CSK32 – MSSV: 0810951 Thành viên tham gia – Lớp CSK32: Mã Phước Huyền Thanh An 0810928 Đặng Ngọc Nam 0811022 Lê Thị Thanh Nhi 0811037 Bùi Khắc Hoàng Vũ 0811122 Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Khoa Trưởng Đà Lạt, tháng 05 năm 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi. Những kết quả và số liệu nghiên cứu trong báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học chưa được ai công bố dưới bất cứ hình thức nào. Nhóm chúng tôi sẽ hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Đà Lạt, ngày 20 tháng 05 năm 2011 Người cam đoan LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, nhóm chúng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu Trường Đại học Đà Lạt, Khoa Sinh học tạo mọi điều kiện cho nhóm chúng tôi có cơ hội học tập và thực hiện đề tài này. Tất cả thầy cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt những năm học vừa qua. ThS. Nguyễn Khoa Trưởng, giảng viên Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Đà Lạt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cảm ơn gia đình, anh chị khóa trước, bạn bè đã giúp đỡ, động viên chúng tôi. Xin chân thành cảm ơn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập từ quả táo mèo 19 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men phân lập từ bánh men lá 20 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởngvà phát triển của nấm men sau 24h nuôi cấy 21 Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của các chủng giống đã phân lập 22 Bảng 3.5. Số lượng tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong khoảng thời gian từ 0h – 48h 23 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1. Biểu đồ sự ảnh hưởng của pH tới số lượng tế bào nấm men sau 24h nuôi cấy 21 Hình 3.2. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men tuyển chọn 24 Hình 3.3. Quy trình sản xuất rượu cần 25 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Việt Nam đang trong bước chuyển mình hội nhập, bên cạnh tiếp thu các thành tựu khoa học tiên tiến, việc bảo tồn, phát huy các truyền thống văn hóa dân tộc càng phải được chú trọng. Việt Nam có nền văn minh lúa nước lâu đời, các sản phẩm từ nông nghiệp đã xuất hiện lâu đời và trở thành các giá trị văn hóa ẩm thực cần lưu giữ trong đó có rượu. Trải dài trên đất nước Việt Nam mỗi mảnh đất là một hương vị riêng của rượu hòa quyện trong nét văn hóa bản địa như Rượu Mẫu Sơn – Lạng Sơn, rượu bản Phố - Bắc Hà, rượu Đao – Yên Bái, rượu cần Tây Bắc, Tây Nguyên… Như chúng ta đã biết, rượu cần là một đặc sản văn hóa của các dân tộc thiểu số Việt Nam nói chung và các dân tộc Tây Nguyên nói riêng, trong có các dân tộc ở tỉnh Lâm Đồng. Rượu cần là thứ đồ uống quý có trong tất cả các gia đình người Tây Nguyên, dùng trong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi khách. Người dân Tây Nguyên cho rằng, rượu của họ là do Giàng (trời) bày cho cách làm, mỗi khi cúng Giàng hoặc tế lễ thần linh phải có rượu cần thì lời cầu nguyện mới linh nghiệm. Hơn nữa, rượu cần được làm khá công phu bằng chất liệu là lương  thực - thứ sản phẩm nuôi sống con người. Tuy nhiên, các giá trị này đang ngày càng mai một, sản phẩm rượu cần đang bị thương mại hóa vì vậy chất lượng rượu đang dần mất đi giá trị truyền thống. Để tiếp tục góp phần lưu giữ và bảo tồn truyền thống sản xuất rượu cần thì việc nghiên cứu các loài cây và các chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất rượu cần đang được quan tâm. Xuất phát từ những lý do đó nhóm chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN”. Nội dung đề tài: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men. Đánh giá hoạt tính của các chủng nấm men phân lập được. Bước đầu xây dựng quy trình sản xuất rượu cần quy mô phòng thí nghiệm. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về rượu cần Hiện nay trên thế giới có rất nhiều sản phẩm rượu khác nhau. Mỗi quốc gia đều có những sản phẩm rượu đặc trưng, Nhật Bản có rượu sake, Hàn Quốc có Soju… Rượu phương đông với nôi văn hóa lớn như Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á hầu hết được sản xuất từ nguồn lương thực như các loại ngũ cốc. Rượu vang là sản phẩm nổi tiếng gắn liền với nét văn hóa phương tây thường lên men không qua chưng cất từ các loại trái cây mà đặc trưng là nho, Đây là sản phẩm nổi tiếng của Pháp, Ý. Ngoài ra ở phương tây còn có một số sản phẩm truyền thống nổi tiếng như: Mezcal (Tequila) của Mexico được làm từ cây Maguey (từ một loài xương rồng) đặc trưng cho Mexico, rượu Whisky là nước uống của nhà tu Ireland. Trên thế giới hiện không ngừng gia tăng về chủng loại rượu, số lương, chất lượng rượu. Vì vậy việc giữ gìn và phát triển sản phẩm rượu cần truyền thống của Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong việc đa dạng hóa sản phẩm rượu trên thế giới. Bên cạnh cây lúa nước là đặc trưng của Việt Nam thì sản phẩm rượu cần cũng được nhiều người, nhiều quốc gia biết đến như là sản phẩm truyền thống thứ hai của dân tộc Việt Nam. Rượu cần là cách gọi của người Việt đối với loại rượu đặc sản được một số dân tộc thiểu số Việt Nam ủ men trong hũ/bình/ché/chóe/ghè, không qua chưng cất, khi đem ra uống phải dùng các cần làm bằng tre/trúc đục thông lỗ để hút rượu. Rượu cần là đồ uống quý thường chỉ dùng trong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi khách. Từ thời xa xưa, các đồng bào dân tộc thiểu số ở nước ta đã biết lợi dụng các chủng vi sinh vật trong tự nhiên để thực hiện quá trình lên men rượu tự nhiên không qua chưng cất tạo thành sản phẩm rượu có tên gọi chung là rượu cần. Hầu hết các đồng bào dân tộc thiểu số của nước ta đều có nghề làm rượu cần. Các đồng bào dân tộc Thái ở Tây Bắc, đồng bào các dân tộc Xê - đăng, Cơ tu, H’Rê… ở miền trung. Đặc biệt đặc sắc là rượu cần của đồng bào các dân tộc thiểu số vùng Tây Nguyên như: Bana, Giarai, Mạ, Stiêng, K’ho,… Nguyên liệu làm rượu của đồng bào rất đa dạng từ hạt bo bo, ngô, gạo tẻ, gạo nếp cho đến củ khoai mì, củ dong. Các loài thực vật mà đồng bào sử dụng làm rượu cần cũng rất đa dạng thay đổi tùy theo đồng bào dân tộc. Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu thực vật để làm men phải vào rừng sâu và quá trình làm rượu mất rất nhiều thời gian, công sức. Vì vậy, hiểu biết về làm rượu cần truyền thống ngày càng giảm làm cho tri thức dân gian không được kế thừa mà dần mất đi bản sắc độc đáo riêng. Chính vì thế, việc bảo tồn văn hóa dân tộc, đang rất cần được chú trọng trước khi bị mất hoàn toàn. Mặc dù sản phẩm rượu cần đã được sản xuất từ lâu đời nhưng hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về rượu cần chỉ có một số nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Huệ (1996), từ bánh men của người dân tộc K’Ho, Nguyên liệu để làm bánh men là gạo và một số loại cây lá đặc trưng ở mỗi dân tộc như cây đòng và cây me kà zút (tên gọi của người dân tộc K’Ho), đã phân lập được: Hai chủng nấm mốc thuộc chi Mucor và Rhizopus. Hai chủng này có khả năng đường hóa Hai chủng nấm men (chưa định danh), một trong hai chủng này vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa. Một số chủng vi sinh vật tạp nhiễm khác (chưa định danh) và chưa rõ chức năng. Với cách làm bánh men của người K’Ho nói trên ta thấy thành phần vi sinh vật trong bánh men là không ổn định. Do vậy ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượu được tạo thành. Trong quá trình sản xuất rượu cần, việc dùng bánh men là còn phụ thuộc vào mùa. Trong năm có mùa thích hợp cho sự thu hái của cây để làm men lá, có mùa không thu hái được vì chúng không mọc. Vì vậy, không chủ động được nguồn men lá nên dần thay thế bằng men nhân tạo (Nguyễn Thị Kim Huệ, 1996, Trần Thị Thanh, 2003). Hiện nay, rượu cần đã được thương phẩm hóa từ lâu với một số hãng sản xuất rượu cần nổi tiếng như: Rượu cần Y Miên, Rượu cần Y Pao, Rượu cần Hòa Bình. Nhưng thực tế, trước thời buổi kinh tế thị trường, rượu cần dã bị thay đổi bản chất thực của men lá. Hiện nay các nơi sản xuất rượu cần không sử dụng cây tự nhiên mà sử dụng men công nghiệp hoặc men thuốc bắc để thay thế làm mất đi hương vị và làm giảm chất lượng sản phẩm. Quá trình làm rượu diễn ra nhanh nhưng rượu không ngon, không đậm đà và có vị chua nhiều. Trong khi đó, rượu cần truyền thống có vị ngọt, độ cồn nhẹ, giàu dinh dưỡng, không gây phản ứng phụ. Như vậy, với nguồn tài nguyên thực vật làm rượu cần phong phú, kinh nghiệm sản xuất rượu lâu đời của đồng bào dân tộc Tây nguyên và nhu cầu sử dụng rượu ngày càng cao chúng ta cần phải tiếp tục có những nghiên cứu để phát triển bền vững nghề sản xuất rượu cần ở địa phương. Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kJ Các phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, nó phải trải qua 10 phương trình phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzyme xúc tác, kết quả cho ra rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác. Nấm men là cơ thể hiếu khí, chúng hô hấp như cơ thể bậc cao, khi trong môi trường hết oxy phân tử (oxy không khí hòa tan trong môi trường lên men), chúng mới tiến hành lên men, tức là chuyển sang hô hấp kỵ khí. Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn như glucose, fructose sẽ được phân giải theo con đường EMP và chu trình axit tricacboxylic (ATC) lúc đầu được thực hiện, tiếp theo là chuỗi hô hấp hoạt động, nấm men thu nhiều năng lượng, sinh khối dịch lên men tang. Môi trường sẽ dần chuyển sang lên men, sau đó sản phẩm sẽ hình thành Etanol, CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và sản phẩm phụ như Glyserin. Quá trình lên men rượu có 5 quá trình chủ yếu: Biến đồi glucose thành fructose-1,6-phosphate. Biến đổi fructose-1,6-phosphate thành 3-phospho glyceraldehyde và phosphodioxy-acetone. Biến đổi phosphodioxy-acetone thành 2- phospho glycerate rồi thành axit pyruvic. Axit pyruvic bị loại 1 phân tử CO2 để thành acetaldehyde. Hình thành etanol do acetaldehyde lấy hydro từ NADH. Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên là nấm men, nấm mốc có sẵn từ các bánh men. Vì vậy bánh men có tính địa phương và không thuần khiết, nhưng nói chung hệ vi sinh vật ở đây thường là: Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii, A. usami, A. niger (giống Aspergillus chiếm phần lớn), Mucor (M. Circinilloides), Rhizopus, Penicillium và Amylomyces rouxii... Nấm mốc sinh enzyme amylaza đường hóa tinh bột. Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida...những men này coi như là men dại, men tạp có lẫn trong bánh men và chúng ta không mong muốn. Nấm men rượu chuyển hóa đường thành rượu. Trong bánh men ta còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger. Giống Endomycopsis tương tự như nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh glucoamylaza và thủy phân tinh bột thành đường glucoza. Vì vậy trong nghề làm rượu người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh bột. Vi khuẩn: thường thấy có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic... Nói chung, vi khuẩn có mặt ở đây đều là vi khuẩn tạp nhiễm, ta không mong muốn. Các giống nấm mốc Aspergillus, Mucor và Rhizopus đóng vai trò sinh enzyme amylaza đường hóa tinh bột. Khi đường hóa hệ enzyme trong nấm mốc thường ít α- amylaza và nhiều β-amylaza, vì vậy đường tạo thành chủ yếu là maltoza và các dextrin cuối (cũng có thể lên men được). Một số chủng nấm mốc thuộc loài Aspergillus awamorii, A. usami sinh ra nhiều glucoamylaza, khi đường hóa cho sản phẩm là glucoza. Hai loài này sinh bào tử có màu đen nhìn thấy bằng mắt thường như các đầu kim nhỏ. Về hình thức A. awamorii và A. usami khá giống nhau, chúng thường có mặt trong bánh men. Aspergillus oryzae và A. flavus cũng rất giống nhau, sinh bào tử khi già có màu vàng hoa cau, vì vậy chúng được gọi là mốc vàng hoa cau. Chúng có khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza. Trong nghề làm tương, làm xì dầu và làm rượu rất hay gặp các mốc vàng. Aspergillus niger, bào tử thương đối lớn và rất đen, được gọi là mốc đen, có khả năng sinh ra nhiều enzyme amylaza, nhưng đồng thời có thể tạo ra acid citric từ dịch đường. Vì vậy người ta cũng không mong muốn sự có mặt của mốc này trong bánh men, nhưng đây là một điều khó khăn vì mốc này rất phổ biến trong tự nhiên. Việc sử dụng mốc vàng hoa cau trong nghề làm tương, nước chấm xì dầu và trong nghề làm rượu cũng cần lưu ý: A. flavus có khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza dùng để thủy phân tinh bột thành đường, thủy phân protein thành peptide và acid amin, nó còn sinh ra độc tố aflatoxin khi môi trường nuôi cấy có chất béo. Độc tố này ảnh hưởng nhiều tới gan. Mucor và Rhizopus có hình dạng rất giống nhau, chỉ khác nhau phần hệ sợi cơ chất. Trong nghề làm rượu rất gặp hai giống này, đặc biệt là Mucor rouxii, M. mucedo, M. japanicus. ở nước ta hay gặp M. rouxii (phát triển tốt trên môi trường czapek và trên gạo). Một số chủng Mucor có khả năng sinh tổng hợp hai hệ enzyme diastaza (amylaza) đường hóa tinh bột và zymaza lên men rượu từ đường. Vì vậy chúng có thể lên men trực tiếp từ tinh bột thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số loài khác và được dùng nhiều trong men rượu. Hơn nữa khi có mặt Rhizopus và Mucor lên men rượu có mùi thơm rất dễ chịu. Cơ chế của mùi thơm ở đây của hai mốc này như thế nào đến nay hoàn toàn chưa rõ. Penicilium là mốc sinh bào tử có màu xanh thường gọi là mốc xanh. Tuy nó có khả năng sinh ra hệ enzyme đường hóa mạnh, nhưng nó thường cho mùi vị mốc rất khó chịu như nhiều mốc khác. Nhưng mốc sinh “mùi đặc trưng” của mốc thường không được hoan nghênh trong nghề chế biến thực phẩm. Giống Endomycopsis được gọi là giả nấm men. Khi trưởng thành có hệ sợi giả cùng với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phấn hoặc bào tử phân đôi bằng vách ngăn hoặc nảy chồi ở nhiều phía. Endomycopsis có khả năng sinh nhiều glucoamylaza và đặc biệt trong hệ enzyme do giống này sinh ra ưu việt hơn nấm mốc là có ít enzyme transglucosidaza. Có mặt enzyme này một phần glucoza chuyển thành acid glconic. Hơn nữa, enzyme lấy từ chế phẩm nuôi Endomycopsis không có mùi mốc làm cho hương vị của rượu thành phẩm thơm ngon. Nấm men có trong bánh men chủ yếu là men rượu Saccharomyces cerevisiae. Ngoài men rượu ra thì các giống men khác có trong bánh men đều coi là men dại. Phần dưới bánh men thường lót trấu, tạo điều kiện thoáng khí. Tổng quan nấm men Hình thái và kích thước Nấm men thường có hình trứng hay hình bầu dục. Kích thước thay đổi từ 2,5μm-21µm, do đó có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học. Để quan sát hình thái nấm men và đo được kích thước người ta thường sử dụng môi trường thạch, mạch nha dịch thể với nồng độ đường là 10-15 baling, hoặc môi trường thạch, mạch nha, thời gian nuôi cấy 3 ngày, nhiệt độ là 25-300C. Cấu tạo của tế bào nấm men Vách tế bào: Khi còn non vách tế bào nấm men tương đối mỏng, tùy theo thời gian nuôi cấy mà vách tế bào nấm men dày lên, vách tế bào nấm men dày khoảng 25nm (chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có vách tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Một số loại nấm men có vách tế bào cấu tạo bởi mannan và kitin, phần còn lại chứa 10% protein (tính theo trọng lượng cơ thể). Một ít lipid, đôi khi có cà poliphosphat, enzyme, sắc tố và một số ion vô cơ. Màng nguyên sinh chất: màng nguyện sinh chất có chiều dày khoảng 7-8Mm, cấu tạo chủ yếu là protein chứa 50% trọng lượng khô. Chức năng màng giống như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Thông qua màng nguyên sinh chất mà thực bào cũng như thải bỏ các sản phẩm trao đổi chất. Tế bào chất: tế bào chất nấm men là hệ keo bán lỏng chứa các loại protein, axit amin, ARN, glucid, lipid và các loại hạt nucleotid chứa 42% ARN và 50% protit, và các loại hợp chất phân tử nhỏ, chứa các cơ quan con, các vật thể và các chất dự trữ khác. Ribosome: số lượng ribosome thay đổi tùy từng loại, tùy từng giai đoạn phát triển và điều kiện nuôi cấy. Có 2 loại ribosome là loại 70S và 80S. Ty thể: là những ty thể hình cầu, hình que, hình sợi kích thước khoảng 0,2-1Mm. Ty thể gồm 2 lớp là màng trong và màng ngoài. Màng trong có hình lượn sóng hay hình răng lược. Để tăng thêm diện tích tiếp xúc, giữa hai màng có các hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản, bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ. Màng ngoài của tế bào nấm men khác với màng ty thể là màng ty thể có rất nhiều đơn vị, hình thái dạng nấm và mũ nấm có đường kính khoảng 80-100A. Màng ngoài của ty thể có chứa các loại enzyme của chuỗi hô hấp, enzyme phosphorin hóa, và trên đó cư trú một số men không có trong màng trong như mono aminoxydaza, NAD-xytocrom, C-seductase. Trong ty thể người ta tìm thấy tất cả các yếu tố của hệ thống tổng hợp protein. Người ta tách ra từ cơ quan này các loại ribosome “VK”. Tức là những hạt ribosome 70s của ribosome này cũng giống như ARN, thông tin của ty thể được tổng hợp dưới sự kiểm soát của ADN ty thể. ADN của ty thể nấm men là ADN dạng vòng, có khối lượng phân tử là 50x60 Ra, gấp 5 lần so với động vật bậc cao. ADN ty thể nấm men chiếm 15-23% tổng lượng ADN của toàn tế bào nấm men. Có một loại plasmid được phát hiện năm 1967 ở nấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo). Ty thể được coi là trạm năng lượng của tế bào nấm men. Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra khỏi cơ chất làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP, giải phóng năng lượng ATP và chuyển hóa năng lượng đó thành năng lượng có ích cho hoạt động sống của tế bào. Ngoài ra ty thể còn chứa nhiều loại enzyme khác như: oxidase, xitocromoxidase, peoxydase… Các thể ăn nhập khác: Không bào có chứa enzyme thủy phân, polyphosphate, lipid, ion kim loại, các phẩm trao đổi chất, điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men. Ngoài ra còn chứa các hạt dự trữ tinh bột khác như: hạt lipid dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt glucogen, một ít hạt tinh bột. Nhân: nhân tế bào nấm men là nhân thật, có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh và ổn định, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân chia tế bào theo hình thức giảm phân. Màng nhân của tế bào nấm men có cấu trúc hai lớp và có lỗ thủng. Nhân của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 14 cặp nhiễm sắc thể. ADN trong nhân tế bào nấm men đơn bội có trọng lượng phân tử 4x10 Da (Dalton). Sinh sản của nấm men Sinh sản vô tính Sinh sản bằng phương pháp nảy chồi Phương pháp nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến của nấm men. Khi nấm men trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi sẽ lớn dần lên, một phần nhân của tế bào mẹ được chuyển sang chồi sau đó tách ra một nhân mới rồi hình thành vách ngăn để ngăn cách với tế bào mẹ hoặc đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới. Hình thành sinh sản này xảy ra đối với tất cả nấm men. Sinh sản bằng phân cắt: một số ít nấm men như Sporobolomyces sinh sản bằng phương pháp cắt ngang như vi khuẩn, tế bào dài ra rồi sau đó sinh ra những vách ngăn đặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào. Sinh sản bằng bào tử Bào tử đốt: ở chi Geotrichum. Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces. Bào tử áo: ở nấm Candida albicans. Sinh sản hữu tính Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng nang hay túi bào tử, trong mỗi túi có 2-4 hoặc 8 bào tử. Túi bào tử được sinh ra do sự tiếp hợp của hai tế bào nấm men. Khi tê bào khác giới đứng gần nhau, ở mỗi đầu của hai tế bào sẽ hình thành mấu lồi và tiến sát nhau, hai tế bào sẽ tiếp hợp với nhau và hình thành một hợp tử, sau đó sẽ có quá trinh phân phối nguyên sinh chất và nhân. Nhân của hợp tử phân chia thành 2,4,8 nhân mới, mỗi nhân con cùng với một phần nguyên sinh chất tạo thành một túi bào tử. Túi bào tử gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới. Các enzyme của nấm men Để sinh trưởng và phát triển, nấm men phải sử dụng enzyme phân giải các nguồn dinh dưỡng phức tạp như tinh bột, rỉ đường, dầu mỏ… thành đường và chuyển hóa vào trong cơ thể dưới dạng cacbon và năng lượng duy trì sự sống, đồng thời tạo ra sản phẩm sinh học trong sản xuất. Enzyme Protease Protease là một nhóm enzyme gồm hai loại peptidase và proteinase, chúng phân hủy các liên kết phân tử protein thành polypeptide, pepton. Sau đó peptide phân tử nhỏ này thủy phân thành các acid amin tự do có dưới tác dụng của peptidase. Các peptidase có đặc hiệu hơn proteinase, chúng chỉ tác dụng lên peptide ở những vị trí nhất định. Enzyme Amylase Là hệ enzyme được chiết ra sớm nhất và được nghiên cứu nhiều từ trước đến nay. Amylase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp và trong y học để tạo ra đường glucose, dextrin thực phẩm, thành phần bổ sung vào khẩu phần thức ăn trong chăn nuôi, các thuốc hỗ trợ tiêu hóa, thủy phân đường để lên men sản xuất mì chính và các sản phẩm khác. Amylase thuộc nhóm enzyme hydrolase xúc tác thủy phân lên kết glucoside trong tinh bột và các sản phẩm tạo thành mà người ta chia nhóm thủy phân tinh bột ra làm nhiều loại, trong đó có ba loại enzyme phổ biến: α-amylase (α-1,4glucan, 4-glucanhydrogenase) β-amylase (α-1,4glucan maltohydrolase) Gluco-amylase (γ-amylase) Các enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một số tính chất khác. Tùy thuộc vào mục đích thành phần mà người ta có thể sử dụng các loại enzyme khác nhau. Những ứng dụng của nấm men Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, các đặc điểm sinh lý phù hợp với sản xuất công nghiệp. Trong tế bào nấm men chứa hầu hết các sản phẩm cần cho sự sống (protein, glucide, lipid, enzyme và các vitamine, các acid nucleid, các chất khoáng). Từ những đặc điểm trên nấm men có rất nhiều vai trò và được ứng dụng rộng rãi trong tất cả các lĩnh vực của đời sống. Nhiều loại nấm men được sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, sản xuất cồn, glicerine và điều chế một số hóa chất khác. Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng chứa nhiều protein và vitamine. Vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn cho người và gia súc. Nấm men được sử dụng làm nở bột mì, gây hương vị nước chấm, sản xuất một số dược phẩm. Tuy nhiên bên cạnh những nấm men có ích còn có những nấm men có hại cho người và gia súc, hoặc có thể làm hư hỏng lương thực, thực phẩm. PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng Các chủng nấm men phân lập được từ quả táo mèo (Docynia indica) và bánh men lá của người dân tộc Churu. Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ 11/2011 – 05/2011 tại phòng thí nghiệm vi sinh – Khoa Sinh học, trường Đại học Đà Lạt. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dụng cụ và thiết bị Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri. Tủ cấy, que cấy, đèn cồn, dao cắt (loại nhỏ), kéo. Tủ ấm. Tủ sấy. Máy lắc ổn nhiệt. Nồi hấp autoclave. Nhiệt kế. Cân kỹ thuật. Máy đo pH, giấy quỳ tím. Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy báo,vòng thun. Túi dựng mẫu. Hóa chất Đường glucose Pepton KH2PO4 MgSO4 NaCl H2SO4 Agar Thuốc nhuộm Xanh methylene Thuốc nhuộm Fuchsin Cồn 900, cồn 700, cồn 330. Phương pháp phân lập nấm men Môi trường phân lập nấm men Môi trường Hansen (xem phần phụ lục). Phân lập mẫu Lấy một ít mẫu quả táo mèo, mẫu bánh men rượu cần của người dân tộc Churu nghiền nhỏ. Hòa loãng mẫu trong nước muối sinh lý theo thang bậc 10. Các bước pha loãng mẫu: Chuẩn bị các ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự, hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm thứ 1 thu được dung dịch có độ pha loãng là 10-1. Hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2 thu được dung dịch có độ pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục hút 1 ml dung dịch ở độ pha loãng trước cho vào 9ml nước muối sinh lý ta được dung dịch có độ pha loãng cao hơn. Đảo trộn dung dịch nhiều lần bằng micropipet trước khi hút để đồng nhất mẫu. Sau đó cấy ria trên mặt thạch môi trường Hansen trong tủ cấy vô trùng rồi đem nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C. Sau thời gian từ 24 – 72 giờ các khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên mặt thạch. Sau đó tiến hành tách các khuẩn lạc khác nhau cấy truyền sang đĩa thạch petri khác tạo giống thuần chủng. Giống thuần được cấy giữ giống trong thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh. Các thao tác luôn được đảm bảo vô trùng. Phương pháp phân loại nấm men Phân loại nấm men dựa theo các đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm tế bào và sinh hóa của chủng giống. Sử dụng khóa phân loại nấm men đến giống của Kudriavtxev, 1954. Quan sát hình thái khuẩn lạc Mô tả hình thái, kích thước, màu sắc, tính chất của khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa phân lập. Quan sát hình thái tế bào, cách thức sinh sản của nấm men Làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm Xanh methylene 0,1% , mẫu là chủng giống đã phân lập được nuôi cấy trong môi trường Hansen lỏng sau khoảng thời gian 20 – 24 giờ. Quan sát trên kính hiển vi. Xác định bào tử của nấm men Nuôi cấy tạo bào tử Từ ống giống lỏng sau 24 giờ nuôi cấy, cấy giống trên môi trường thạch tạo bào tử. Môi trường tạo bào tử nấm men (xem phần phụ lục). Mẫu cấy được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C trong 2 ngày, sau đó đem sốc nhiệt ở nhiệt độ 400C trong 18 giờ. Nhuộm và quan sát bào tử nấm men Các dung dịch thuốc nhuộm Thuốc nhuộm Fuchsin Thuốc nhuộm Xanh methylene Cách làm tiêu bản nhuộm bào tử nấm men Cố định vết bôi: chuẩn bị vết bôi của nấm men trên lam kính, hơ nóng nhẹ để cố định vết bôi (cố định bằng nhiệt). Nhuộm Fuchsin: đặt phiến kính lên thanh đỡ ngang trên cốc đong có chứa nước đang sôi. Đậy lên vết bôi một mẫu giấy thấm có kích thước vừa với phiến kính. Phủ thuốc nhuộm Fuchsin lên phiến kính. Để yên 5 phút. Lấy mẫu giấy ra, rửa thuốc nhuộm dư bằng nước và khử màu vết bôi bằng dung dịch cồn 330C hoặc H2SO4 1 % trong khoảng thời gian 1 phút sau đó rửa lại bằng nước trong 5 giây. Nhuộm với Xanh methylene trong vòng 30 – 45 giây. Rửa lại với nước, thấm khô vết bôi nhẹ nhàng với giấy thấm rồi quan sát dưới vật kính dầu của kính hiển vi. Bào tử sẽ bắt màu đỏ, còn tế bào sẽ bắt màu xanh. Phương pháp nhân giống Chuẩn bị môi trường nhân giống là môi trường Hansen lỏng (xem phần phụ lục), cho vào các bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình 100 ml môi trường. Sau đó đem hấp khử trùng. Dùng que cấy lấy một vòng que cấy nấm men đã phân lập được trong ống thạch nghiêng cho vào trong bình tam giác nhân giống đã chuẩn bị, khuấy cho tan. Thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau đó đem đi nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện nhiệt độ 290C, tốc độ lắc 100 vòng/ phút. Tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ. Phương pháp tạo bánh men rượu Nguyên liệu: Gạo lức, rễ cây ”đoòng”, rễ cây vấn vương, thân cây gối hạc. Dụng cụ: Dao, cối giã, khay đựng. Phương pháp: Bước 1: Rễ cây ”đoòng”, rễ cây vấn vương, thân cây gối hạc được cạo vỏ, đập dập, phơi khô. Tất cả nguyên liệu được cho vào cối giã nhuyễn. Hỗn hợp này gọi là bột tạo men. Bước 2: Gạo lức đem ngâm (khoảng 2 giờ), vớt, để ráo đem xay nhỏ. Bột tạo men, các chủng nấm men đem trộn với bột gạo bằng nước nóng (700 – 800C). Sau đó vo thành viên như quả trứng gà rồi bỏ lên khay đựng có lót một lớp trấu ở dưới (3 cm). Đậy lại ủ 2 ngày ở nhiệt độ 300C cho đến khi xuất hiện nấm mốc trắng đều trên men. Bước 3: Viên men được đem hong khô ở nhiệt độ 370C trong thời gian 3 ngày. Phương pháp lên men rượu Nguyên liệu: Men rượu cần tự nhiên, một trong các loại ngũ cốc sau: gạo, ngô (bắp), củ sắn được nấu chín. Dụng cụ: Chóe rượu cần 4 lít, 6 lít, khay, nong, nia, trấu sạch. Phương pháp: Bước 1: Nguyên liệu nấu chín sau đó dỡ, tải ra nong, nia, khay để nguội tới khoảng 300C. Bước 2: Trộn đều men vào nguyên liệu với tỷ lệ men : nguyên liệu là 0,8 : 10 Bước 3: Lót trấu xuống đáy chóe khoảng 3 – 4 cm rồi cho nguyên liệu đã trộn men vào cho tới cổ chóe thì cho thêm một lớp trấu ở trên. Bước 4: Dùng bao nhựa, túi nilon buộc thật kín. Đem ủ chỗ tối, sau một tháng là dùng được. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của nấm men Tiến hành nuôi cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường Hansen lỏng ở các khoảng pH từ 3.0 ® 7.0, nhiệt độ 280C, trong thời gian 24 giờ , xác định số lượng tế bào của các chủng nấm men ở các khoảng pH đó. Xác định khả năng đồng hóa và lên men các nguồn đường của nấm men Dựa vào nguyên lý của Kluyver và Dekker [1]: Những loài nấm men không lên men được glucoza thì không lên men được các loại đường khác. Những loài nấm men lên men được glucoza thì sẽ lên men đường mannoza. Vì vậy chỉ cần thử với đường glucoza. Không có nấm men nào đồng thời lên men được maltoza và lactoza. Thông thường, người ta chỉ cần thử với các loại đường như sau: glucoza, sacaroza, maltoza, galactoza, rafinoza. Những loại đường này phải tinh khiết và không bị phân hủy khi đun nóng. Cách tiến hành như sau: Pha dịch đường 20%, khử khuẩn (nếu lọc qua vô khuẩn Xaizo là tốt nhất). Lấy 0,5ml dịch đường này cho vào ống nghiệm có sẵn môi trường (pepton – 0,5%, cao men 0,5% trong nước cất đã khử khuẩn). Trong ống nghiệm đã có sẵn 1 ống Durham. Cấy 1 vòng que cấy giống, lắc đều và giữ ở nhiệt độ 25 – 30oC. Nếu nấm men lên men được đường trong môi trường sẽ sinh ra CO2 và đẩy ống Durham nổi lên. Nếu sinh ra CO2 thì ta kết luận được chủng nấm men đồng hóa được loại đường nghiên cứu và qua cảm quan hoặc phân tích có tích tụ rượu etylic hay không ta kết luận được nấm men có lên men được đường đó hay không. Tiến hành thực nghiệm với hai nguồn đường: glucose và saccharose. Phương pháp xác định độ cồn Dựa theo phương pháp chưng cất. Tiến hành chưng cất bằng hệ thống chưng cất cồn và đo độ cồn của mẫu chưng cất được bằng cồn kế. Cách tiến hành: Dịch lên men xong, đem chưng cất. Nhiệt độ sôi của Ethanol là 78,40C, hỗn hợp đẳng phí sôi ở 78,150C, thường còn nhiều tạp chất và nước. Có thể định lượng Ethanol trong dung dịch chưng cất bằng cồn kế. Chưng cất cồn: Dùng bình định mức đong chính xác 100 ml dịch lên men, rót cẩn thận vào bình cầu của bình chưng cất cồn. Lấy 40 ml nước cất tráng qua lại bình định mức vài lần và chuyển vào bình cầu. Lắp hệ thống chưng cất, trong bình hứng chứa sẵn 5 ml nước cất. Sau khi cất được 3/4 bình thì dừng lại, tháo bình hứng ra, chuyển dịch cất sang binh định mức, tráng bình hứng vài lần với nước cất và chuyển vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch, lắc đều, để nguội đến nhiệt độ phòng. Đổ dịch chưng cất vào ống đong 100 ml. Thả từ từ cồn kế vào. Để cồn kế đứng yên, cân bằng, không chạm vào thành và đáy ống đong. Nhìn mặt tiếp giáp dung dịch với cồn kế, đọc kết quả qua nhiệt độ và độ cồn. Tra bảng hiệu chỉnh % thể tích cồn ở nhiệt độ tiêu chuẩn 200C. Xử lý số liệu Các kết quả nghiên cứu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng nấm men phân lập được Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào từ chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ quả táo mèo. Chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn được 2 chủng nấm men phân lập từ quả táo mèo. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập từ quả táo mèo Chủng nấm men Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào Q1.3 Khuẩn lạc hình tròn đều, màu trắng đục, bề mặt nhẵn, đường kính 2 – 2,5mm. Tế bào hình bầu dục. Sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh bào tử. Q1.4 Khuẩn lạc hình tròn đều, màu trắng trong, bóng, bề mặt nhẵn, đường kính 1,5 – 2mm. Tế bào hình tròn. Sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh bào tử. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào từ chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ bánh men lá Chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn được 3 chủng nấm men phân lập từ bánh men lá. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.2. Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men phân lập từ bánh men lá Chủng nấm men Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào M0 Khuẩn lạc màu trắng đục, hình tròn, bề mặt bóng nhầy, viền không nhăn. Tế bào hình bầu dục. Sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh bào tử. M1.1 Khuẩn lạc màu trắng đục bóng, nhầy hình tròn, viền không nhăn, đường kính 0,8 - 1mm. Tế bào hình tròn. Sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh bào tử. M1.2 Khuẩn lạc màu trắng trong hình tròn, bề mặt bóng nhầy, viền không nhăn, đường kính khoảng 2 - 3 mm. Tế bào hình bầu dục. Sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh bào tử. Qua bảng 3.1 và bảng 3.2 khi so sánh với khóa phân loại nấm men của Kudriavtxev, 1954 và các tài liệu về nấm men khác chúng tôi đi đến kết luận các chủng Q1.3, Q1.4, M0, M1.1, M1.2, thuộc giống Saccharomyces. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Sau khi nuôi cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường Hansen lỏng ở các khoảng pH từ 3.0 ® 7.0, nhiệt độ 280C, trong thời gian 24 giờ , xác định số lượng tế bào của các chủng nấm men ở các khoảng pH đó. Kết quả được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởngvà phát triển của nấm men sau 24h nuôi cấy (Đơn vị: tế bào / ml) pH Chủng 3 4 5 6 7 Q1.3 2.1x108 3.4x108 5.4x108 5.5x108 2.8x108 Q1.4 3.5x108 5.1x108 5.5x108 5.6x108 4.5x108 M0 2.4x108 4.5x108 5.9x108 4.3x108 2.2x108 M1.1 5.3x108 6.2x108 6.5x108 6.7x108 5.5x108 M1.2 1.5x108 2.0x108 2.7x108 2.3x108 2.0x108 Hình 3.1. Biểu đồ sự ảnh hưởng của pH tới số lượng tế bào nấm men sau 24h nuôi cấy Qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 chúng tôi nhận thấy: pH tối thích cho nấm men phát triển là pH = 5 – 6. Hai chủng nấm men Q1.4 và M1.1 phát triển mạnh hơn các chủng còn lại. Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn đường của nấm men Tiến hành thực nghiệm sau 72h nuôi cấy trên môi trường Hansen lỏng ở điều kiện 280C, pH = 5 và quan sát chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của các chủng giống đã phân lập Chủng nấm men Khả năng đồng hóa và lên men đường Saccharose Glucose Q1.3 Sinh bọt khí, tạo váng. Sinh bọt khí, tạo váng. Q1.4 Sinh bọt khí rất mạnh, tạo váng. Sinh bọt khí, tạo váng. M0 Sinh bọt khí, tạo váng nhiều. Sinh bọt khí, tạo váng. M1.1 Sinh bọt khí, không tạo váng. Sinh bọt khí mạnh, không tạo váng. M1.2 Sinh bọt khí, tạo váng nhiều. Sinh bọt khí, tạo váng. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi có nhận xét sau: Khả năng sinh bọt khí khi lên men đường saccharose theo thứ tự giảm dần là: Q1.4, M1.2, M1.1, Q1.3, M0 Khả năng sinh bọt khí khi lên men đường glucose theo thứ tự giảm dần là: M1.1, M0, Q1.4, M1.2, Q1.3 Qua bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy tất cả các chủng nấm men đã phân lập được đều có khả năng đồng hóa và lên men được đường saccharose và glucose. Qua đánh giá ảnh hưởng của pH, khả năng lên men đường chúng tôi nhận thấy chủng nấm men Q1.4 và M1.1 có hoạt tính mạnh hơn so với các chủng khác. Chúng tôi dùng hai chủng này để đưa vào sản xuất rượu cần. Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men đã tuyển chọn được Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lên men đường thì thấy chủng nấm men Q1.4 và M1.1 có hoạt tính mạnh nên chúng tôi tiến hành nuôi cấy và khảo sát đường cong sinh trưởng của hai chủng nói trên trong môi trường Hansen lỏng với các điều kiện thời gian từ 0h – 48h, pH = 5, nhiệt độ 290C. Bảng 3.5. Số lượng tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong khoảng thời gian từ 0h – 48h (Đơn vị: tế bào/ml) Thời gian . (h) Chủng 0 3 6 9 18 21 24 27 30 33 48 M1.1 0.1 x108 0.2 x108 0.3 x108 0.5 x108 5.0 x108 6.0 x108 7.0 x108 7.6 x108 7.9 x108 8.0 x108 8.0 x108 Q1.4 0.4 x108 0.7 x108 0.8 x108 1.0 x108 2.5 x108 4.4 x108 6.0 x108 7.9 x108 8.2 x108 8.3 x108 8.3 x108 a) b) Hình 3.2. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men tuyển chọn a) Chủng nấm men Q1.4 b) Chủng nấm men M1.1 Sau khi đã xác định số lượng tế bào từ 0h – 48h của hai chủng trên, chúng tôi nhận thấy rằng: pha sinh trưởng của hai chủng nấm men Q1.4 và M1.1 trong khoảng 10h – 30h (từ 20h – 24h nấm men phát triển mạnh nhất). Do đó chúng tôi tiến hành nhân giống trong khoảng thời gian từ 20h – 24h để thu sinh khối làm bánh men và lên men. Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu cần Qua quá trình nghiên cứu và tham khảo một số quy trình sản xuất rượu cần khác chúng tôi đề xuất một quy trình sản xuất rượu cần như sau: a) b) Hình 3.3. Quy trình sản xuất rượu cần Quy trình sản xuất bánh men rượu cần Quy trình lên men rượu cần Thành phần dùng sản xuất cho chóe rượu cần 6 lit: Gạo lức : 2kg Bánh men lá : 160g Sau khi tiến hành làm bánh men và lên men rượu cần từ những nguồn nguyên liệu trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ cồn, một số chỉ tiêu chỉ vi sinh trong rượu và thu được kết quả như sau: Độ cồn đạt: 13% Chỉ tiêu vi sinh: Tổng số vi khuẩn hiếu khí : 10 khuẩn lạc / ml Tổng số tế bào nấm men và nấm mốc : 1,44x106 tế bào / ml Coliforms : 0 vi khuẩn / ml E.coli : 0 vi khuẩn / ml Staphylococcus aureus : 0 vi khuẩn / ml KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã phân lập được 5 chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces. Pha logarit của hai chủng nấm men kéo dài từ 10h – 30h. pH tối thích cho sự phát triển của các chủng nấm nem đã tuyển chọn được là pH= 5 – 6. Từ thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của pH, khả năng lên men đường chúng tôi nhận thấy chủng nấm men Q1.4 và M1.1 có hoạt tính mạnh hơn so với các chủng khác. Hoàn thiện được một quy trình lên men rượu cần quy mô phòng thí nghiệm. Kiến nghị Nên tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất rượu cần sử dụng bánh men lá và các chủng vi sinh vật thuần khiết. Phân lập và tuyển chọn thêm các chủng nấm men có ý nghĩa từ các loại thực vật dùng trong sản xuất rượu cần của cộng đồng dân tộc khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp (2009). NXB Khoa học kỹ thuật. Trần Thị Thanh, Công nghệ vi sinh (2002). NXB Giáo dục. Hoàng Thanh Trường, Điều tra cây làm rượu cần của đồng bào dân tộc thiểu số ở Lâm Đồng (2010). Khóa luận tốt nghiệp Đại học Đà Lạt K30. Nguyễn Khoa Trưởng, bài giảng tóm tắt môn vi sinh vật học (2009). Khoa sinh học – Trường Đại học Đà Lạt. Nguyễn Khoa Trưởng, bài giảng tóm tắt môn công nghệ vi sinh (2011). Khoa sinh học – Trường Đại học Đà Lạt. ượu_cần ệ-vi-sinh-vật-trong-bánh-men-rượu PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG Môi trường Hansen đặc Đường glucose: 50g Pepton: 10g KH2PO4: 3g MgSO4: 2g Agar: 20g Nước cất: 1000ml ở pH= 5.8 Môi trường được hấp khử trùng ở 1120C, 20 phút trong autoclave. Môi trường Hansen lỏng Đường glucose: 50g Pepton: 10g KH2PO4: 3g MgSO4: 2g Nước cất: 1000ml ở pH= 5.8 Môi trường được hấp khử trùng ở 1120C, 20 phút trong autoclave. Nước muối sinh lý NaCl : 8,5g Nước cất: 1000ml Môi trường được hấp khử trùng ở 1120C, 20 phút trong autoclave. PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Hình 1: Bánh men lá Hình 2: Quả táo mèo (Docynia indica) II. CÁC CHỦNG GIỐNG PHÂN LẬP ĐƯỢC 1. Hai chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ quả táo mèo Khuẩn lạc b) Tế bào Hình 4: Chủng giống Q1.3 a) Khuẩn lạc b) Tế bào Hình 5: Chủng giống Q1.4 Ba chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ bánh men lá a) Khuẩn lạc b) Tế bào Hình 6: Chủng giống M0 a) Khuẩn lạc b) Tế bào Hình 7: Chủng giống M1.1 a) Khuẩn lạc b) Tế bào Hình 8: Chủng giống M1.2 III. NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BÁNH MEN a) Gối hạc (thân) b) Cây “đoòng” (rễ) c) Cây vấn vương (rễ) d) Gạo lức Hình 9: Nguyên liệu sản xuất bánh men IV. SẢN XUẤT RƯỢU CẦN Hình 10: Bánh men lá và rượu cần thành phẩm PHỤ LỤC 3: BẢNG CHUYỂN ĐỔI ĐỘ RƯỢU Bảng phụ lục 1: Bảng chuyển đổi độ rượu ở những nhiệt độ khác nhau về 200C (từ 0 – 5.0%) Nhiệt độ (0C) Thông số đo được trên rượu kế 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Độ rượu tính theo thể tích ở 200C +30 +29 +28 +27 +26 +25 +24 +23 +22 +21 +20 +19 +18 +17 +16 +15 +14 +13 +12 +11 +10 +9 +8 +7 +6 +5 +4 +3 +2 +1 +0 3.5 3.5 3.7 3.9 4.0 4.2 4.4 4.6 4.7 4.8 5.0 5.1 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.0 6.0 6.1 6.1 6.2 6.2 6.2 6.2 6.1 6.1 6.1 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 6.7 6.9 4.1 4.2 4.4 4.5 4.6 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.4 5.5 5.5 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.5 5.5 2.4 2.5 2.7 2.9 3.1 3.2 3.4 3.6 3.7 3.9 4.0 4.1 4.2 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.8 4.9 5.0 5.0 5.0 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1 5.0 5.0 4.9 1.9 2.1 2.2 2.4 2.6 2.8 2.9 3.1 3.2 3.4 3.5 3.6 3.7 3.9 4.0 4.1 4.2 4.2 4.3 4.4 4.4 4.5 4.5 4.5 4.6 4.6 4.5 4.5 4.5 4.4 4.1 1.4 1.6 1.8 1.9 2.1 2.3 2.4 2.6 2.7 2.9 3.0 3.1 3.2 3.4 3.4 3.6 3.6 3.7 3.8 3.9 3.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 3.9 3.9 0.9 1.1 1.3 1.4 1.6 1.8 1.9 2.1 2.2 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.3 3.4 3.4 3.4 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.4 3.4 3.3 0.4 0.6 0.8 1.0 1.1 1.3 1.4 1.6 1.7 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.8 2.9 2.9 2.9 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 2.9 2.9 2.8 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 0.9 1.1 1.2 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.2 2.3 2.4 2.4 2.4 2.4 2.5 2.5 2.4 2.4 2.4 2.4 2.3 0.0 0.1 0.3 0.4 0.6 0.7 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.7 1.8 1.8 1.9 1.9 1.9 2.0 2.0 1.9 1.9 1.9 1.8 1.8 0.0 0.1 0.2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.2 1.3 1.5 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.3 1.3 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.7 0.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 Bảng phụ lục 2: Bảng chuyển đổi độ rượu ở những nhiệt độ khác nhau về 200C (từ 5.5 – 10.0%) Nhiệt độ (0C) Thông số đo được trên rượu kế 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5. Độ rượu tính theo thể tích ở 200C +30 +29 +28 +27 +26 +25 +24 +23 +22 +21 +20 +19 +18 +17 +16 +15 +14 +13 +12 +11 +10 +9 +8 +7 +6 +5 +4 +3 +2 +1 +0 7.9 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.7 9.8 10.0 10.2 10.4 10.5 10.7 10.8 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.6 11.8 11.8 11.9 12.0 12.0 12.0 12.0 7.5 7.7 7.9 8.1 8.3 8.6 8.8 8.9 9.1 9.3 9.5 9.7 9.8 10.0 10.2 10.3 10.4 10.6 10.7 10.8 10.9 11.0 11.1 11.0 11.2 11.3 11.4 11.4 11.4 11.4 11.4 7.0 7.2 7.7 7.7 7.9 8.1 8.3 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.3 9.5 9.6 9.8 9.9 10.0 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.6 10.7 10.7 10.8 10.8 10.8 10.8 6.6 6.9 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.3 8.5 8.7 8.8 9.0 9.1 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10.0 10.0 10.1 10.1 10.2 10.2 10.2 10.2 10.2 6.1 6.3 6.5 6.7 6.9 7.1 7.3 7.5 7.7 7.8 8.0 8.2 8.3 8.5 8.6 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.3 9.4 9.5 9.5 9.6 9.6 9.6 9.6 9.69.6 5.9 5.8 6.1 6.1 6.3 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.3 7.5 7.6 7.8 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 8.9 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.3 6.5 6.7 6.8 7.0 7.2 7.3 7.4 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.2 8.3 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 4.7 4.9 5.1 5.3 5.5 5.7 5.8 6.0 6.2 6.3 6.5 6.6 6.8 6.9 7.0 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.6 7.7 7.7 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.5 5.7 5.8 6.0 6.1 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.1 7.2 7.2 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.4 7.4 3.8 4.0 4.2 4.3 4.5 4.7 4.9 5.0 5.2 5.4 5.5 5.6 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.5 6.6 6.6 6.7 6.7 6.7 6.7 6.7 6.7 6.6 6.6 Bảng phụ lục 3: Bảng chuyển đổi độ rượu ở những nhiệt độ khác nhau về 200C (từ 10.0 – 15.5%) Nhiệt độ (0C) Thông số đo được trên rượu kế 15.0 14.5 14.0 13.5 13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 Độ rượu tính theo thể tích ở 200C +30 +29 +28 +27 +26 +25 +24 +23 +22 +21 +20 +19 +18 +17 +16 +15 +14 +13 +12 +11 +10 +9 +8 +7 +6 +5 +4 +3 +2 +1 +0 12.5 12.7 13.0 13.2 13.5 13.8 14.0 14.3 14.5 14.8 15.0 15.2 15.5 15.7 15.9 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.3 18.5 18.6 18.8 19.0 12.0 12.3 12.6 12.8 13.0 13.3 13.5 13.8 14.0 14.3 14.5 14.7 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.3 17.5 17.7 17.8 17.9 18.1 18.2 11.6 11.8 12.1 12.3 12.6 12.8 13.113.3 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.7 14.9 15.1 15.3 15.5 15.7 15.8 16.0 16.2 16.4 16.5 16.7 16.8 17.0 17.1 17.2 17.3 17.5 11.1 11.4 11.6 11.9 12.1 12.4 12.6 12.8 13.1 13.3 13.5 13.7 13.9 14.1 14.3 14.5 14.7 14.9 15.1 15.3 15.4 15.6 15.8 15.9 16.1 16.2 16.3 16.4 16.6 16.8 16.7 10.7 10.9 11.2 11.4 11.7 11.9 12.1 12.312.6 12.8 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.5 14.7 14.9 15.0 15.2 15.3 15.4 15.6 15.7 15.8 15.9 15.9 16.0 10.2 10.5 10.7 10.9 11.2 11.4 11.6 11.8 12.1 12.3 12.5 12.7 12.9 13.1 13.3 13.5 13.6 13.8 14.0 14.1 14.3 14.4 14.6 14.7 14.8 14.9 15.0 15.1 15.2 15.3 15.3 9.8 10.0 10.3 10.5 10.7 10.9 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 12.9 13.1 13.2 13.4 13.6 13.7 13.8 14.0 14.1 14.2 14.3 14.4 14.2 14.5 14.6 14.6 9.3 9.5 9.8 10.0 10.2 10.4 10.7 10.9 11.1 11.3 11.5 11.7 11.9 12.1 12.2 12.4 12.5 12.7 12.8 13.0 13.1 13.2 13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 13.8 13.9 13.9 14.0 8.9 9.1 9.3 9.5 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0 11.2 11.4 11.5 11.7 11.9 12.0 12.2 12.3 12.4 12.6 12.7 12.8 12.9 13.0 13.0 13.1 13.2 13.2 13.3 13.3 8.4 8.6 8.9 9.1 9.3 9.5 9.7 9.9 10.1 10.3 10.5 10.7 10.9 11.0 11.2 11.3 11.5 11.6 11.8 11.9 12.0 12.1 12.2 12.3 12.4 12.4 12.5 12.6 12.6 12.6 12.7