Đề tài Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan

dạng đột biến khác nhau có thể tạo những mức độ thiếu hụt G6PD khác nhau và gây ra những biểu hịên lâm sàng khác nhau. Đây là bệnh di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X không có alen tương ứng trên Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ,bệnh mang tính di truyền do đó biểu hiện khác nhau ở những dân tộc khác nhau. Các nghiên cứu gần đây cho thấy những biểu hiện lâm sàng của bệnh cũng đa số xuất hiện do sử dụng các biện pháp điều trị như thuốc hay sử dụng thức ăn có tính oxy hoá, do vậy ở vùng lãnh thổ khác nhau do tập quán sinh hoạt, thói quen và đặc điểm bệnh tật khác nhau nên tỷ lệ thiếu hụt của enzym này cũng thay đổi. Việt Nam là một trong những nước nằm trong bản đồ thiếu hụt G6PD, với tỷ lệ mắc bệnh tương đối cao. Thiếu G6PD thường có những biểu hiện tan máu gây vàng da, đái huyết sắc tố, thiếu máu, suy thận cấp và trường hợp nặng là tử vong. Bệnh xuất hiện khi tiếp xúc với các tác nhân gây oxy hoá như vi sinh vật, hoá chất (thuốc, thực phẩm). Người bình thường với số lượng và chất lượng G6PD đảm bảo thì khi tiếp xúc với hàm lượng cao chất oxy hoá thì vẫn có khả năng sản xuất ra đủ NADPH để loại bỏ tác động của chúng và sẽ không có những biểu hiện lâm sàng trên. Trưòng hợp thiếu hụt nặng enzym thì hay gây ra những cơn tan máu cấp kể cả khi sử dụng rất ít chất õy hoá, nhưng cũng có trưòng hợp do sử dụng một lượng chất oxy hoá tuy ít nhưng kéo dài sẽ dẫn đến hiện tưọng không đủ enzym để tham gia quá trình khử, đây chính là hiện tượng thiếu enzym thứ phát. Bởi vậy việc phát hiện ra sự thiếu hụt G6PD là rất quan trọng. Qua sự phát hiện bằng những phưong pháp định tính, định lượng chúng ta có thể biết được mức độ suy giảm để có được kế hoạch điều trị cũng như cách thức sinh hoạt hợp lý nhằm hạn chế thấp nhất sự biểu hiện của bệnh. Sử dụng phương pháp bán định lượng tạo vòng Formazan với ưu điểm nhanh chóng, đơn giản sẽ giúp cho chúng ta phát hiện được sự thiếu hụt này một cách đồng loạt và có hiệu quả. Tôi tiến hành làm khoá luận tốt nghiệp về đề tài: "Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan." Với hai mục tiêu sau đây: - Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan. - Sử dụng kỹ thuật bán định lượng Formazan để phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và Nùng. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Những hiểu biết về G6PD: 1.1.Đại cương: G6PD được Warburg và Christan phát hiện năm 1931 ở hồng cầu ngưạ, động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người. Năm 1936 G6PD đã được nghiên cứu và tiến hành chiết suất làm sạch nhưng phải 25 năm sau mới thành công. Bước đầu nghiên cứu enzym đã đựơc tìm hiểu về cấu trúc phân tử, dạng có hoạt tính sinh học, các dạng biến thể của enzym. Quá trình tách chiết enzym ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được độ tinh sạch cao hơn, trải qua các bước như điện di, phương pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực độ tinh sạch của enzym đã đạt đựơc tới 1448,2 lần [2]. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử các dạng đột biến của G6PD ngày càng được phát hiện nhiều, các phương pháp phát hiện thiếu hụt từ định lượng, định tính, bán định lượng, test nhanh ngày càng được phát triển chính xác hơn và áp dụng rộng rãi hơn trong cộng đồng. 1.2.Cấu trúc: Cấu trúc bậc một (monomer): là chuỗi polypeptid gồm 515 acid amin liên kết với nhau bằng những liên kết peptid (nhóm cacboxyl(-C00H) của acid amin trước sẽ liên kết với nhóm amin (-NH2) của acidamin sau bằng cách chung nhau mất đi một phân tử nước). Trọng lượng phân tử của enzym nặng 59265 Daltons. Trình tự acid amin đã được giải mã, tính đồng nhất của trình tự này thay đổi tuỳ theo từng vùng. Vùng có tính đồng nhất cao được cho là vùng có chức năng quan trọng (hay còn gọi là trung tâm hoạt động) của enzym, ở người vùng này thuộc acidamin 188-291. Cấu trúc bậc cao hơn: G6PD có cấu trúc không gian là pôlymer, đó là các dạng dimer, tetramer, hexamer. Dạng cấu trúc không gian mới đảm bảo cho enzym hoạt động được. Trong hồng cầu người thì dạng dimer chiếm ưu thế hơn. Các cấu trúc bậc 1, bậc cao hơn có sự chuyển dạng lẫn nhau tuỳ vào điều kiện của môi trường, như ở pH thấp thì chủ yếu là dạng tetramer, pH gần trung tính thì là dạng dimmer, ở pH trung tính thì hai dạng đó gần bằng nhau. G6PD là một enzym không đồng nhất và đa dạng phân tử, bằng phương pháp hoá sinh WHO đã mô tả có 442 dạng khác nhau [1,3]. Hình 1: cấu trúc bậc bốn của G6PD 1.3.Chức năng: G6PD là một enzym oxy hoá khử xúc tác phản ứng chuyển hoá đầu tiên của chu trình Pentose( chu trình Hexomonophosphate), có ký hiệu quốc tế là: 1.1.49. Chức năng quan trọng của nó là tạo ra NADPH để chống lại các tác nhân oxy hoá và vì vậy trong hồng cầu nó ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ màng hồng cầu đươc bền vững, đảm bảo thời gian tồn tại trong máu ngoại vi của hồng cầu là khoảng 120 ngày nhằm đáp ứng nhu cầu ôxy của cơ thể. Chu trình Hexomonophosphate ( pentosephosphat) Sự oxy hóa glucose theo con đường Hexomonophosphate xảy ra ở các mô song song với con đường đương phân song chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều (7%-10%). Tuy nhiên ở một số tế bào như: hồng cầu, gan, tuyến mỡ, tuyến sữa thời kì hoạt động ... Sự thoái hóa glucose theo con đường này chiếm ưu thế xảy ra trong phần dịch bào của tế bào. + G6P được tạo ra qua sự phosphorin hóa Glutathion dưới tác dụng của enzym Hexokinase + G6P bước vào con đường Pentose qua 2 giai đoạn: Giai đọan 1: khử cacboxyl oxy hóa G6P thành pentose phosphat, quá trình này tạo ra NADPH ở một số tổ chức con đường pentose dừng tại đây và phương trình tổng quát là: G6P + 2NADP+ + HO --> R5P + CO + 2NADPH + 2H NADPH dùng cho các phản ứng sinh tổng hợp, còn R5P là tiền chất tổng hợp Nucleotid. Giai đoạn 2: biến hóa tiếp tục của pentose phosphat có sự vận chuyển các đơn vị 2C hoặc 3C dưới tác dụng của các enzym tương ứng là fructose 6 phosphat và 1 phân tử phospho glyconat: 6 G6P + 12NADP+ + 6 HO --> 5G6P +12 NADPHH+ + 6CO + Pi Đây là giai đoạn oxy hóa ở những tổ chức cần nhiều NADPH hơn R5P thì các pentose phosphat được đi vào chu trình biến hóa thành G6P để tiếp tục oxy hóa nhờ sắp xếp lại khung C mà 6 phân tử pentosephosphat trở thành 5 Hexo phosphat. Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glucose-6-phosphat 6-phosphogluconolacton Mg2+ NADP+ NAPDH +H+ Lactonase 6-phosphogluconat NADP+ Mg2+ 6-phosphogluconate dehydrogenase NADPH+ H+ Ribulose-5-phosphat Phosphopentose isomerase D-Ribose-5-phosphat ( 5C) Hình 2: giai đoạn 1 của chu trình Hexomonophosphate 5C 7C 6C 5C 3C 4C 6C 5C 3C 6C 5C 3C 5C 3C 4C 6C 5C 7C 6C Hình 3: giai đoạn 2 của chu trình Hexomonophosphate Hb MetHb Glutathion peroxydase Hexokinase Glucose Glucose 6 phosphate NADP+ ADP ATP G6PD NADPH++hHHHHH Glutathion dạng OXH(G-S-S-G) 6phosphogluconat Glutathion reductase Glutathion dạng khử (2G-SH) Hình 4: Sơ đồ hoạt động của G6PD Thông qua quá trình photphoryl hóa tạo thành G6P qua xúc tác của G6PD để tạo ra sản phẩm 6PG đồng thời tạo thành NADPH từ NADP+ là chất cung cấp H+ để khử Glutathion dạng oxy hóa thành dạng khử thông qua enzym Glutathion reductase để từ đó trực tiếp bảo vệ hồng cầu chống lại các tác nhân gây oxy hóa ngoài ra còn khử MetHb thành Hb do đó tránh được sự biến tính Hb.Nếu không đủ G6PD thì lượng NADPH không đủ dẫn đến màng hồng cầu diễn ra quá trình peroxy hóa lipit dẫn đến hiện tượng vỡ hồng cầu gây ra tan máu và Hemoglobin sẽ bị kết tủa thành thể Heinz 1.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt động sinh lý của G6PD: Một số tính chất chung của enzym: Enzym là những chất xúc tác sinh học bản chất là prôtêin do cơ thể sống sinh ra nhờ đó mà các phản ứng hóa học trong cơ thể sống xảy ra với tốc độ rất nhanh trong điều kiện sinh lý bình thường: nhiệt độ, áp suất không cao, pH môi trường gần như trung tính. Có những enzym chỉ là những prôtêin đơn thuần nhưng cũng có những enzym có thành phần cấu tạo gồm có 1 thành phần là prôtêin đơn thuần (Apoenzym) và một thành phần là chất hữu cơ đặc biệt (chất cộng tác cofactor hay coenzym). Ngoài ra còn cần đến sự có mặt của các ion kim loại trong cấu trúc của enzyme, là thành phần để liên kết enzym và cơ chất, liên kết apoenzym và coenzym. Vị trí diễn ra phản ứng của enzym là trung tâm hoạt động có tính chất đặc hiệu đối với từng cơ chất cấu trức và hoạt tính của enzym chịu tác động của rất nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, pH muối kim loại nặng, chất hoạt hóa và ức chế hay các dung môi hữu cơ như rượu, axeton... Mỗi một cơ chất enzym có một Km xác định, đây chính là hằng số Michailis-Menten: là nồng độ của cơ chất (mol/lit) đủ làm cho tốc độ phản ứng enzym đạt tới một nửa tốc độ cực đại (Vmax). Km thể hiện ái lực của enzym tới cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn và ngược lại. Có 6 loại enzym: enzym oxy hoá -khử (oxidoreductase), enzym vận chuyển nhóm (Transferase), enzym thuỷ phân (Hydrolase), enzym phân cắt (lyase), enzym chuyển đồng phân (Isomerase), enzym tổng hợp (Ligase). G6PD là enzym oxy hoá khử. Những điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của G6PD: + Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40C, đến 60C thì hoạt tính của enzym còn lại không đáng kể. + Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiêù và enzym sẽ hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO3 sẽ giúp enzym phản ứng tốt hơn. pH tối ưu của G6PD là 8,0 [2] + Nồng độ của của các chất nội bào như cơ chất, cofactor, chất tạo thành: tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác. Sự trùng hợp của enzym từ dạng monomer sang dạng dimer và các cấu trúc bậc cao hơn cần có sự có mặt của NAPD+, chất vừa là cơ chất vừa là cofator. Mỗi dimer có 2 vị trí gắn NADP+, đó là NADP+ xúc tác, gắn lỏng lẻo và dễ dàng bị khử thành NADPH, còn lại là NAPD+ chức năng gắn chặt chẽ hơn cần thiết để duy trì cấu trúc hoạt động của enzym. +Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động được tốt thì vấn đề bảo quản là hết sức quan trọng G6PD là một enzym mất nhạy cảm, không bền vững, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt dộ lạnh (40C) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym chưa bị thay đổi. Trái lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn máu thì sau 24h sẽ giảm 17% hoạt tính. +Ion Mg2+ là ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thì hoạt độ enzym là 100%[2], theo nghiên cứu thì ion kim loại này đóng vai trò tạo phức hợp giữa enzym và cơ chất. 1.5 Cơ sở di truyền học của G6PD Gen quy định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài, locus q28 của nhiễm sắc thể X (vùng 2, băng 8) không có alen tương ứng trên Y. Vùng 2 là vùng mang thông tin di truyền mã hóa khá nhiều tính trạng khác như: nhìn màu, hemophilia A. Gen G6PD gồm có 13 exon và 12 intron. Dài khoảng 18,5 kilobases. Chức năng của từng exon khác nhau, và kích thước của các exon mã hóa thay đổi rất nhiều từ 38 - 236 bp. Trong đó exon 1 không mã hoá [12], exon 6 mã hoá sản phẩm là nơi gắn cơ chất G6P [6]. mARN G6PD gồm 2269 ribonucleotid, m RNA của G6PD có một đoạn đầu 3' không mã hóa dài 655 bp và đoạn đầu 5' không mã hóa dài 69 bp. Gen G6PD có sự điều hòa và kiểm soát chặt chẽ. Vùng promotor của G6PD kéo dài khoảng 300 nucleotid giầu GC và nhiều GC không bị methyl hóa. 2. Bệnh lý thiếu hụt G6PD. 2.1.Cơ chế bệnh sinh và cơ sở di truyền học: 2.1.1. Cơ chế bệnh sinh : Giảm G6PD sẽ giảm lượng Glutathione dạng khử không đủ để khử HbHOtạo thành Met Hemoglobin và Choleglobin do đó Hemoglobin bị biến tính và kết tủa thành thể Heinz [2][9]. Cơ chất tạo ra là NADPH còn có tác dụng bảo vệ nhóm -SH (nhóm chức năng hoạt động) của enzym phosphoglyceral-dehydrogenase, đây là 1 enzym quan trọng trong chuỗi phản ứng xúc tác NAD+ thành NADH (một chất khử quan trọng chống lại sự ôxy hóa của hồng cầu [2]). Ngoài ra giảm NADPH dẫn đến hồng cầu phải sử dụng nhiều NADHlàm giảm lượng ATP cần thiết và lượng Na+ trong tế bào bị ứ đọng, nước vào trong hồng cầu nhiều cộng với sự bền vững của màng hồng cầu bị yếu dẫn đến hồng cầu bị hủy hoại. 2.1.2 Bệnh lý gen học của thiếu hụt G6PD: Giảm G6PD là bệnh di truyền gen hoặc nằm trên nhiễm sắc thể X không alen tương ứng trên Y do vậy tỷ lệ bị bệnh gặp ở nam giới là nhiều hơn và thường nặng hơn. Nam giới XY: giả sử a là gen quy định tính trạng giảm G6PD sẽ có kiểu gen là XaY: ở nam giới chỉ cần người alen a ở X là có biểu hiện bị bệnh. Nữ giới XX: có 3 dạng XA XA: bình thường. XAXa: có thể bình thường hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình, hiếm khi thiếu hụt nặng (trừ phi ở vùng trung tâm hoạt động). Nguyên nhân là do sự bất hoạt nhiễm sắc thể từ trong bào thai, trong quá trình phát triển của phôi tạo ra thể khảm giữa dòng tế bào lành và dòng tế bào bệnh, tỷ lệ giữa 2 loại tế bào này thay đổi rất lớn: tế bào giảm G6PD chiếm từ 1% -> 90%. XaXa: biểu hiện kiểu hình thiếu nặng nhưng tần suất gặp kiểu gen này rất nhỏ. Gen cấu trúc đột biến sẽ bây biến đổi về mặt chất lượng ngược lại gen điều hòa bị đột biến gây thiếu G6PD về mặt số lượng, nhưng biến đổi ở intron không gây biến đổi cấu trúc và sản lượng G6PD. Hoạt tính G6PD phụ thuộc vào cả chất lượng và số lượng. Ngày nay đã phát hiện được hơn 140 dạng đột biến khác nhau đại diện cho 442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và phân biệt bằng các chỉ số sinh hóa. Do 1 axit amin có thể được quy định bởi người bộ ba nên có khi 2 biến đổi khác nhau trên AND chỉ gây nên một loại đột biến. Ví dụ như: - Dạng đột biến Aaches: đột biến nucleotid 1089C -> G - Dạng đột biến Loma Linda: 1089C -> A hai loại này đều làm thay đổi acid amin 363 Asn -> Lys. Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những bệnh nhân lâm sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp: + Lớp 1: thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu, hồng cầu hình không trò người mạn tính. + Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym < 10% so với bình thường + Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ. (Hoạt độ từ 10 - 60% so với bình thường). + Lớp 4: thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (60 - 100%). Tuy vậy nhưng sự phân biệt này là không rõ ràng giữa các phân lớp. Lớp 1, lớp 2 là gây nguy hiểm nhất vì thường có tan máu cấp diễn. Hiện nay ở Việt Nam đã tìm thấy được các dạng đột biến khác nhau, trong đó có một dạng không làm ảnh hưởng đến sự mã hóa acid amin trong cấu trúc G6PD đó là dạng Silent tồn tại dạng còn lại đều là những dạng hay gặp ở các dân tộc châu Á. Dạng Silent xuất hiện là do đột biến thay nucleotid C thành nucleotid T dẫn đến bộ ba mã hoá TAC chuyển thành TAT vẫn mã hoá acid amin Tyrosin, đây cũng chính là một ví dụ cụ thể biểu thị tính bảo thủ của thông tin di truyền. Bảng 1: Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á STT Dạng đột biến Vị trí biến đổi Acid amin tương ứng Exon Nucleocid 1 Gaoha 2 95A - G 32 His -> Arg 2 Viangchan 9 871G -> A 291 Val -> Met 3 Chatham 9 1003G -> A 335 Sla -> Thr 4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe 5 Union 11 1360 -> T 454 Arg -> Cys 6 Canton 12 1376 G -> C 459 Arg -> Leu 7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His 8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil 2.2. Dịch tế học. Năm 1996 Blood Ernest Beutler đã phát hiện có 400 triệu người thiếu máu G6PG gặp ở tất cả các dân tộc. Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ thiếu hụt G6PD khác nhau tùy từng vùng và tùy từng dân tộc. Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân thiếu G6PD hồng cầu, có tỉ lệ cao tại một số vùng Sốt Rét Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân (19,7%), tỷ lệ thiếu lại thường thấp ở nơi không có lưu hành bệnh sốt rét. ở dân tộc Mường (tỉ lệ cao nhất 31%) tiếp đến là dân tộc Thổ (19,3% dân tộc Thổ, dân tộc Thái 19,3%) rất thấp ở dân tộc kinh 0,5%. Hình 5: phân bố thiếu hụt G6PD trên thế giới 2.3. Biểu hiện lâm sàng Thường biểu hiện khi tiếp xúc với chất oxi hóa đó là những cơn tan máu. Primaquine là một loại thuốc có tính o xi hoá cao nhưng rất hay được sử dụng trong điều trị sốt rét vì đây là thuốc duy nhất được sử dụng để diệt thể ẩn trong gan với bệnh nhân nhiễm P.vivax và thể giao bào với bệnh nhân nhiễm P.falciparum [6]. Tùy thuộc vào dạng thiếu hụt G6PD tùy vào tính chất hay nồng độ của tính chất hay nồng độ của các chất oxi hóa sẽ dần dần tan máu nhiều hay ít từ đó dần đến bệnh thiếu hụt nặng hay nhẹ. 2.3.1. Vàng da sơ sinh. Vàng da sơ sinh là một triệu chứng của nhiều nguyên nhân khác nhau, là do trong máu có sự gia tăng chất bilirubin, một sán phẩm dị hoá của hemoglobin.Vàng da xuất hiện khi định lượng bilirubin trong máu ở người lớn là >2mg%, trẻ em là >7mg%[8]. Dị hoá Hb ở hệ liên võng nội mô (75%) và từ nguồn khác(25%) Hemoxygen Hệ liên võng nội mô Biliverdin Bilirubin+albumin (máu) Bilirubin+ligandin (gan) Glucuronyl transferase Bilirubin glucuronid (trực tiếp) Bài tiết xuống ruột Stercobiline, urobilinogen Hình 6: Sơ đồ chuyển hoá của bilirubin. Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý. Vàng da sinh lý thường diễn ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ, hiện tưọng này là do sự suy giảm nhất thời chức năng chuyển hoá bilirubin của gan do tăng quá trình táI hấp thu bilirubin tại ruột, tăng thấm vào tổ chức. Trong khi đó chất này được sản sinh hàng ngày ở giai đoạn sơ sinh nếu tính trên cân nặng lớn gấp đôi người lớn.Vàng da bệnh lý thấy xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl. Hậu quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng nhân não. Trẻ sơ sinh sẽ có biểu hiện là những cơn tăng trương lực cơ, xoắn văn, mất các phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái và rất dễ tử vong. Nếu trẻ qua khỏi thì sẽ để lại những di chứng nặng nề như rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngôn ngữ…) hoặc bất thường thính lực, thị giác và thiểu sản phát triển răng. Vàng da nhân não ảnh hưởng đến khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ. Việc phát hiện ra bệnh lý này không khó và việc đIệu trị có kết quả rất nhanh chóng và dễ dàng bằng phương pháp chiếu đèn, thuốc làm giảm nồng độ bilirubin trong máu và hiệu quả nhất là phương pháp chiếu đèn. Nhưng nếu để lâu, Bilirubin đã ngấm và các nhân xám của não thì sẽ để lại hậu quả nặng nề không thể hồi phục lại được do tổn thương các tế bào thần kinh như đã nêu trên. Thiếu G6PD như một yếu tố nguy cơ dẫn đến vàng da bệnh lý. Do đó việc phát hiện thiếu hụt G6PD sẽ giúp cho quá trình phát hiện những triệu chứng nặng giúp cho quá trình theo dõi tốt hơn tránh bỏ sót đáng tiếc. Tỷ lệ vàng da dẫn đến vàng nhân não ở nước ta còn rất cao. Năm 1996 - 2000: tại Viện Nhi Trung ương tỷ lệ này khoảng 25%, tại bệnh viện Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh phát triển từ 147 trường hợp (1995) đến 238 trường hợp (1997). Ở những trẻ em bị thiếu hụt G6PD thì Bilirubin huyết thanh cao hơn đáng kể so với nhóm chứng, cao hơn vào ngày thứ 3 sau sinh. Loại thiếu hụt G6PD lớp 3 thường biểu hiện vàng da sau sinh. Ví dụ: G6PD Aures thường gây vàng da với đột biến cao. Thiếu G6PD được di truyền đồng thời với đột biến gen VGI1A1 (Gilbert) thì nguy cơ cao dẫn đến vàng da nhân. 2.3.2. Tan máu do dùng thuốc và do sử dụng một số thực phẩm. Ernet Beutler phát hiện ra hiện tượng tan máu sau khi nghiên cứu một số bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là Primaquin. Sau đó qua nghiên cứu người ta đã khám phá ra rằng không chỉ pnimaquin mà sau sử dụng một số thuốc khác cũng gây nên hiện tượng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau), Procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (diệt khuẩn)... Triệu chứng tan máu dẫn đến vàng da thường xảy ra vào ngày thứ 2,3 sau khi dùng thuốc. Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân sử dụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao như long não, rượu vang đỏ, các sản phẩm từ đậu tương, đậu nành và đặc biệt là các loại đậu Fava dẫn đến hội chương Favism. Hội chứng favism: là bệnh lý thiếu máu tan máu đã được biết đến từ thời Pythagoras. Người ta nhận thấy rằng sau khi ăn đậu Fava, thì một số người 24giờ sau có thể xuất hiện hiện tượng tan máu có khi rất dữ dội. Sau đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này liên quan đến thiếu hụt G6PD. Đa số các trường hợp xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhưng đôi khi cũng thấy ở thiếu hụt nhẹ. Ngược lại cũng có trường hợp thiếu mà không có bệnh sinh lý sau khi ăn đậu Fava. Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra hiện tượng tan máu là glucosidevicine và dividine. Aglycone của chúng được thay thế bởi prymidune đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ở những bệnh nhân này thường thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày. Về sau phát hiện được người do có giảm G6PD. Giảm G6PD nhẹ thường bệnh sinh lý nhẹ hơn do chỉ ở những hồng cầu già (do khối lượng enzyen G6PD ở hồng cầu non). Ở bệnh nhân nặng thì cả những hồng cầu non cũng không có đủ hàm lượng G6PD, không có khả năng tự bảo vệ trước các tác nhân oxi hóa gây nên hiện thượng tan máu nặng dẫn đến đái ra huyết sắc tố có thể gây viêm thận hay suy thập cấp mà biểu hiện lâm sàng là thoạt đầu có đái đỏ, về sau đau vùng thắt lưng hố thận dẫn đến vô niệu. Các triệu chứng cận lâm sàng của bệnh nhân: Hemoglobin giảm dần đến ngày 7 - 8 sau đó phục hồi dần đến ngày thứ 10 xuất hiện thể Heinz gắn trên bề mặt hồng cầu đó là phần Protein và Hemoglobin bị biến chất gắn vào màng hồng cầu gây nên hình thái bất thường của hồng cầu và dẫn đến tan máu. Hình7: Đậu fava 2.3.4.Các triệu chứng khác: Tan máu do nhiễm trùng – đái tháo đường Quá trình nhiễm trùng thường kích hoạt tan máu. Đái tháo đường giai đoạn toàn phát sẽ khởi phát những đợt tan máu ở bệnh nhân. Tan máu mạn tính hồng cầu hình không tròn di truyền. Năm 1958 người ta tìm thấy rằng thiếu G6PD cũng có thể dẫn đến tan máu mạn tính. Loại tan máu này thì thường không xảy ra ở những loại đột biến hay gặp như G610A - G6PD med nhưng lại hay gặp ở những đột biến có tần suất xuất hiện nhỏ. 2.4. Biểu hiện cận lâm sàng 2.4.1 Ở cơn tan máu cấp Xét nghiệm máu: hồng cầu giảm, Hematocrit giảm, Hemoglobin giảm, soi hồng cầu không cần nhuộm phát hiện được thể Heinz. Chính những tế bào này chỉ nhìn thấy sau cơn tan máu cấp sau đó nó sẽ rời tuần hoàn nhanh, không nhìn thấy sau 3 - 4 ngày, có vài tế bào đoạn và đã nhiễm sắc (hồng cầu lớn xanh nhạt), có tế bào lưới (thường không đáng kể), 5 - 15%. Định lượng bilirubin qua da, trong máu tăng. Xét nghiệm nước tiểu: Hemoglobin niệu (+), trụ hồng cầu (-) 2.4.2 Kỹ thuật tế bào: Nghiên cứu sâu hơn bằng xét nghiệm hồng cầu có thể phát hiện 2 dòng hồng cầu ở những người nữ dị hợp tử định lượng erzym ở 2 dòng hồng cầu thấy khác nhau, một dòng thiếu hoàn toàn, một dòng không thiếu hoàn toàn đó là kết quả của hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể. Ví dụ: Ditk Roos nghiên cứu một bệnh nhân thiếu G6PD Vonledam đã phát hiện 94% hồng cầu hoạt độ G6PD bằng không và 6% hồng cầu còn lại thì hoạt độ chỉ còn 5% so với bình thường. 2.5. Chẩn đoán. - Dịch tễ và tiền sử: trẻ bịcác bbệnh nhiễm trùng,đẻ non ,thiếu thánggia đình đã có trẻ bị vàng da,hay trong vùng sốt rét,vùng có tỷ lệ thiếu hụt G6PD,hay sau khi sử dụng một số thuốc và thực phẩm có tính oxy hoá. - Lâm sàng - Cận lâm sàng - Chẩn đoán nguyên nhân: Cụ thể như do thiếu hụt G6PD, định lượng G6PD bằng phưong pháp quang phổ hấp thụ, bán định lượng như phương pháp Formazan hay test nhanh. Việc định lượng G6PD ngay khi tan máu, lượng hồng cầu non và lưới chiếm khá cao những tế bào này có hoạt động enzym cao hơn tế bào già. Vì vậy xét nghiệm cần phải được trì hoãn sau đợt tan máu đến khi mức enzym thấp xuống rồi mới xét nghiệm đến chẩn đoán. Tuy vậy có nghiên cứu cho rằng dù vậy thì G6PD cũng không đạt được tới mức bình thường. Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật phân tích gen (phương pháp PCR) để phát hiện được nguyên nhân và dạng đột biến gen từ đó có hướng tiên lượng và dự phòng. Tuy độ chính xác của kỹ thuật này cao nhưng lại tốn kém. 2.6. Điều trị và phòng. 2.6.1 Phòng bệnh: giữ một vai trò quan trọng vì giúp tránh xảy ra triệu chứng và biến chứng. + Với những bệnh nhân đã biết trước là thiếu hụt G6PD thì cần tránh những thực phẩm và thuốc có tính chất oxi hóa. + Với những bệnh nhân khi có chỉ định dùng những thuốc có tính chất oxi hóa (primaquiu) aspirin...) cần xét nghiệm en zym G6PD trước khi dùng. + Với bệnh nhân đã xét nghiệm triệu chứng cần phòng biểu hiện biến chứng: xét nghiệm máu, xét nghiệm nước tiểu, theo dõi triệu chứng tan máu (đái máu, vàng da, suy thận và vàng da đa nhân). 2.6.2 Điều trị: + Ngừng thuốc + Truyền dịch, truyền máu, lợi tiểu. Chú ý không được truyền cho bệnh nhân loại máu thiếu G6PD. 3. Kỹ thuật phát hiện thiếu hụt G6PD 3.1.Các mức độ phát hiện thiếu hụt G6PD: Phương pháp định tính: Phương pháp phát quang (Beutler và Mitchelt-1968), phương pháp được tiến hành bằng cách lấy máu từ đầu ngón tay sau đó dùng thuốc chống đông. Trộn đều máu đã chống đông bằng dung dịch đã chuẩn bị sẵn gồm NADP và G6P, sau đó nhỏ vào giấy Whatman số 1 vào thời điểm 0 phút, 5 và 10 phút. Để khô, đọc kết quả dưới ánh sáng đèn cực tím. Nếu hàm lượng G6PD đủ thì các giọt dung dịch và máu sẽ phát quang và không phát quang khi không đủ lượng G6PD. Đây là một phương pháp đã được uỷ ban quốc tế về các tiêu chuẩn trong huyết học đề nghị sử dụng trong phát hiện sàng lọc các đối tượng thiếu men G6PD. Tuy vậy phương pháp này có giá thành cao do cần phải có các thiết bị chuyên dụng như đèn chiếu tia tử ngoại [12], ngoài ra phương pháp này khó phát hiện trường họp thiếu men G6PD ở nữ dị hợp tử [6]. Phương pháp nhanh của AkiraHirono-1998: là phương pháp tiến hành dựa trên nguyên lý G6P được chuyển thành 6GP thông qua sự xúc tác của enzym G6PD, từ đó tạo ra NADPH là một chất khử tham gia phản ứng chuyển MTT thành Formazan, chuyển từ màu vàng sang màu xanh thẫm( hình minh hoạ cho nguyên lý xin xem ở kỹ thuật Formazan). - Trường hợp không thiếu G6PD lượng NAPDH tạo ra đủ thì sản phẩm tạo ra có màu xanh thẫm của Formazan. Đọc kết quả (-) - Trường hợp thiếu G6PD thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, sản phẩm tạo ra có màu xanh nhạt, đọc kết quả (+) : bán thiếu. - Trường hợp không có G6PD : phản ứng không xảy ra , sản phẩm tạo ra chỉ có màu hồng ( màu của Hb ) đọc kết quả (++) ( +++) thiếu hoàn toàn. Đây là một phương pháp đọc kết quả ngay sau 30 phút, đọc kết quả bằng mắt thường dễ nhận biết vvà không đòi hỏi thiết bị tốn kém. Phương pháp này đã được các tác giả như Akira Hirono, Kuni Iwai áp dụng ở một số nứơc Đông Nam A để điều tra hàng loạt [6]. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Minh Hùng độ nhạy của phương pháp này ở trường hợp thiếu hoàn toàn là 97,9%, ở trường hợp bán thiếu là 61,5%, độ đặc hiệu là 100%.Ta có thể thấy độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao, có thể áp dụng cho test sàng lọc. Phương pháp định lượng Nguyên tắc: Tiến hành chống đông máu sau đó tách hồng cầu rồi tách enzym G6PD. Xác định hoạt độ G6PD do sự thay đổi phổ hấp thụ tại bước sóng 340 mm do coenzym NAPDH sinh ra trong quá trình phản ứng. Hoạt độ G6 PD tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của NADPH. Sơ đồ minh họa Tính kết quả: A: độ thay đổi mật độ quang học. + Hoạt độ G6PD (UI/ml = A/phút x 30476. + Hoạt độ G6PD (UI/1012HC) = A/phút x 30476 Sản lượng hồng cầu trong 1 lít + Hoạt độ G6PD UI/gHb = A/phút x 30476 Nồng độ Hb. Đọc kết quả Bình thường 10 UI/1012 HC. Thiếu G6PD nhẹ và trung bình: 40 - 100 UI/1012HC. Thiếu G6PD nặng: 10 UI/1012 HC. Phương pháp gen học Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích đột biến gen, thông thường phản ứng PCR được thực hiện qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: gây biến tính để tháo xoắn và làm đứt các liên kết Hiđro của chuỗi xoắn kép AND Giai đoạn 2: là giai đoạn ủ mồi, ứng với mỗi exon thì có một đoạn mồi khác nhau. Giai đoạn 3: là tổng hợp chuỗi đích ADN. Đoạn mồi được kéo dài nhờ enzym nối, từ đó khuyếch đại nên những đoạn khuôn. Dựa trên sản phẩm khuyếch đại tương ứng với cặp mồi bình thường hay đột biến sẽ nhận biết được vị trí đột biến Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao cho biết vị trí đột biến , dạng đột biến, từ đó biết được độ thiếu hụt G6PD. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại do đó giá thành cao.  3.2. Kỹ thuật bán định lượng tạo vòng Formazan. Cơ sở khoa học G6 PD G6P (Cơ chất) NAD PH (Dạng khử) 6 - GP (sản phẩm) NADP+ (dạng OXH) Formazan (màu xanh) MTT (màu vàng) PMS Nguyên tắc nhận định kết quả: sản phẩm Formazan của phản ứng tạo ra có màu xanh tím. Diện tích và độ đậm của vòng màu sản phẩm sau một thời gian nhất định tỷ lệ với hoạt tính của enzym trong mẫu thử. Đọc kết quả: ngoài kích thước thì màu sắc quan trọng, màu đậm chứng tỏ hoạt tính enzym trong máu cao, nhạt chứng tỏ hoạt tính enzym trong máu thấp. Kỹ thuật này không chỉ là định tính mà còn là bán định lương. - Đường kính vòng xanh > 7 mm: (- ) - Đường kính vòng xanh 5mm - 7mm. Màu xanh nhạt hơn chứng (- ): (+) - Đường kính màu xanh 3mm - 5mm (+ +) rất nhạt màu. - Đường kính < 3mm không có màu xanh mà là màu vàng (+++). CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng Người Tày: 130 người Người Nùng: 71 người Tất cả các đối tượng trên là sinh viên trường trung học Y tế Cao Bằng, đã được điều tra chính xác là có 3 đời là người dân tộc Tày (hoặc Nùng), trong đó có 162 nữ và 39 nam. Sở dĩ số lượng nam ít hơn nữ là do đề tài của tôi được tiến hành trên cơ sở cộng tác với đề tài “ Lưu giữ DNA người ” do giáo sư Vũ Triệu An làm chủ nhiệm nên không có điều kiện chọn mẫu thích hợp. - Thời gian lấy mẫu: Tháng 5 năm 2004. - Địa điểm lấy mẫu: Trường trung học Y tế Cao Bằng. 2. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang 2.1. Các bước tiến hành Thu thập mẫu: lấy máu tĩnh mạch ở đối tượng nghiên cứu thấm vào giấy Whatman số 3 là loại giấy dầy có thể lấy đủ lượng hồng cầu cần thiết. Để giấy thấm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng lưu trữ dưới 7 ngày để làm xét nghiệm (tốt nhất là giữ lạnh ở 4oC) Bảo quản máu khô: ở -30oC, đây là điều kiện kỹ thuật đảm bảo để Protêin không bị biến tính đối với trường họp không làm dược xet nghiệm ngay. Tiến hành làm Formazan Thu thập và xử lý số liệu 2.2 Kỹ thuật tạo vòng Formazan : 2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ: Cho lấy mẫu : - Giấy Whatman số 3, có đánh dấu các vòng tròn đường kính 1cm - Xilanh lấy máu tĩnh mạch , bông cồn sát trùng. Cho xét nghiệm: - Dụng cụ: cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, đũa khuấy, bình định mức, khay nhựa có kích thước 12,5 x 8,5 x 1cm đã xác định 40 vị trí (8 chiều ngang và 5 chiều dọc) các vị trí này cách đều nhau. - Trang thiết bị : Cân phân tích Sartorinol sai số 0,01 mg Tủ ấm 37oC Bể ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ 55 oC Lò vi sóng (Samsung) Máy đo pH Kìm bấm mẫu Hóa chất: sử dụng hóa chất của hãng G6P - : Glucose -6- Phosphat MTT : chất có màu vàng tươi PMS : phenazin Methosulfat MgCl2 NADP Thạch Agar Mẫu (- ) (mẫu đủ): lấy máu của người bình thường, là người không sống trong vùng dịch tễ, người đã được xét nghiệm định lượng G6PD ít nhất 2 lần ( ≥ 100 UI / 10 hồng cầu) mẫu ( +) (mẫu thiếu): là mẫu máu lấy ở những người đã được xác định là thiếu hoàn toàn G6PD ( ≤ 40 UI / 10 hồng cầu ) 2.2.2 Quy trình Formazan: - Chuẩn bị Gel: Pha đệm Tris - HCl 0,1 M - pH = 6,5 có chứa MgCl2 0,01M (Mg là ion cần thiết cho sự gắn enzym và cơ chất, theo Phạm Thị Lý) Ví dụ: ứng 150ml dung dịch cần 1,425 g MgCl2 sau đó chia dung dịch đệm làm 4 phần, 1 phần để vào cốc pha với hóa chất, 3 phần còn lại cho vào lọ pha với Agar. Cho Agar vào lọ lắc đều, đun cho tan trong lò vi sóng, để nguội đến 55 oC trong bể ổn nhiệt - Lần lượt cân các hóa chất sau vào cốc: + Theo nồng độ ứng với kỹ thuật ở bộ môn Miễn dịch sinh lý bệnh trường Đại học Y : G6P: 0,625 mg/ml NADP : 0,125 mg/ml MTT: 0.125 mg/ml PMS : 0,125 mg/ml + Theo nồng độ ứng với kỹ thuật của Viện Sốt Rét : gấp 2 lần so với kỹ thuật trên G6P: 1.25 mg/ml NADP : 0,25 mg/ml MTT: 0.25 mg/ml PMS : 0,25 mg/ml Ví dụ : pha trong 150ml dung dịch, kĩ thuật bộ môn Miễn dịch sinh lý bệnh trường Đại học Y cần: 93,75 mg G6P; 18,75 mg NADP; 18,75 mg MTT; 18,75 mg PMS. - Lắc đều hồng cầu dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan rồi đun nóng tới 55 oC - Trộn đều 2 dung dịch trong lọ và cốc tạo thành 1 hỗn hợp gel để trong bể ổn nhiệt 55oC lắc đều - Đổ hỗn hợp gel trên vào khay nhựa với luợng gel 30ml / 1khay - Đổ nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí - Đặt khuôn nhựa trên mặt phẳng, chú ý chọn khuôn nhựa phẳng không bị cong vênh để đọc kết quả chính xác , gel dàn đều - Sau khi đổ xong đặt lên khay nhựa 1 tấm kính phẳng bọc giấy để tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, gel sẽ đông. Ví dụ: ứng 150ml hỗn hợp gel đổ được 5 khay. 1 khay gel đạt tiêu chuẩn bề dày gel đạt 3 mm, có màu vàng nhạt trong suốt, không có bọt khí, mặt gel phẳng. - Đặt mẫu: - Đặt khay gel chồng lên thước đo định vị, đồng thời đánh dấu vị trí sẽ đặt chứng (+) và chứng (-) - Dùng kìm bấm các mẫu máu đã thấm giấy Whatman tạo thành các vòng tròn đường kính 3mm. - Đặt mẫu lên 3 mặt gel: ứng với 40 vị trí có 1 chứng (-), 1 chứng (+), 38 mẫu máu. Chú ý đặt mặt trên của mẫu giấy thấm tiếp xúc với mặt gel , dùng Pince gắp các mẫu giấy đặt nhẹ nhàng ấn đều cho mẫu máu dính chặt vào gel, tránh vỡ mặt gel - Bọc khay gel đã tra mẫu bằng giấy nến (tránh khô mẫu máu) ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 oC trong 8 giờ, 24 giờ - Đọc kết quả : - Mẫu đủ lượng G6PD đọc là xét nghiệm (-) sẽ có phản ứng tạo vòng Formazan mầu xanh thẫm, đường kính vòng dung huyết rộng > 7mm - Mẫu thiếu nhẹ đọc là xét nghiệm (+): phản ứng xảy ra không hoàn toàn, vòng dung huyết có màu xanh đậm, đường kính 5-7mm. - Mẫu thiếu vừa đọc là xét nghiệm (++) phản ứng xảy ra không hoàn toàn, vòng dung huyết màu xanh nhạt, đường kính nhỏ hơn 5mm. - Mẫu thiếu nặng đọc là xét nghiệm(+++): phản ứng không xảy ra, vòng dung huyết mầu vàng nhạt hoặc hồng nhạt là mầu của bản gel hoặc màu của Hemoglobin. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Khi đọc kết quả phản ứng tạo vòng Formazan căn cứ vào các tiêu chuẩn sau: 3.1.1. Màu sắc của vòng dung huyết: vòng dung huyết có màu xanh đậm của Formazan chứng tỏ cơ chất tham gia phản ứng đã phản ứng hết .nghĩa là hoạt độ của enzym là bình thường.Vòng dung huyết có màu xan nhạt hơn là hoạt độ của enzym giảm nhẹ, trường hợp thiếu hoàn toàn thì vòng dung huyết sẽ có màu của môi trưòng thạch Agar hay màu của Hemoglobin, màu vàng nhạt hay màu đỏ nâu nhạt. 3.2.2. Kích thước của vòng dung huyết xanh: - Lớn hơn 7 mm được đánh giá là (-): bình thưòng - Từ 5 mm đến 7 mm được đánh giá là(+): bán thiếu - Từ 3mm đến 5mm được đánh giá là (++): bán thiếu - Nhỏ hơn 3mm được đánh giá là (+++): thiếu hoàn toàn. 3.2. Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan Chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện của phản ứng Formazan với 95 mẫu thử, là những mẫu được chọn ngẫu nhiên trong tổng số đối tượng nghiên cứu trên. Những điều kiện của phản ứng Formazan là thời gian diễn ra phản ứng, nhiệt độ tiến hành của phản ứng và nồng độ cơ chất tham gia phản ứng: - Thời gian: 8 giờ, 12 giờ, 24 giờ. - Nhiệt độ: 250C ( nhiệt độ phòng), 370C (nhiệt độ sinh lý của cơ thể). - Nồng độ cơ chất: tiến hành với hai nồng độ ở khoa sinh lý bệnh trường Đại học Y và ở Viện Ký sinh trùng sốt rét. Nồng độ ở Viện Ký sinh trùng sốt rét gấp đôi ở Đại học Y ( xin xem phần đối tượng và phương pháp nhiên cứu). Bảng 2: Kết quả thiếu hụt G6PD sau 8h đọc kết quả Kết quả 37oC 25oC Viện sốt rét Đại học Y Viện sốt rét Đại học Y Bình thường 78 82 90 90 Bán thiếu 12 8 0 0 Thiếu 5 5 5 5 Nhận xét: Sau 8h ở 25oC thì tất cả các mẫu thiếu hoàn toàn đều đọc rõ ở cả hai nồng độ. Các mẫu bán thiếu ở cả hai nồng độ đều không đọc rõ, các quầng dung huyết chỉ hơn nhạt mầu hơn so với chứng (-) mà đường kính không nhỏ hơn hoặc ngược lại đường kính có nhỏ hơn nhưng màu xanh vẫn đậm vì vậy những mẫu này vẫn được đọc là bình thường. Sau 8h ở 37oC ta thấy ở nồng độ thấp có 8 mẫu bán thiếu và 4 mẫu nghi ngờ. ở nồng độ cao có 12 mẫu bán thiếu (bao gồm cả 4 mẫu nghi ngờ trên vì sự so sánh với chứng (-) là rõ ràng hơn). Bảng 3: Kết quả thiếu hụt G6PD sau 12h và 24h đọc kết quả Kết quả 37 oC 25 oC Viện sốt rét Đại học Y Viện sốt rét Đại học Y Bình thường 78 78 78 78 Bán thiếu 12 12 12 12 Thiếu 5 5 5 5 Kết quả ở hai nồng độ và hai nhiệt độ đều tương đương nhau, tuy vậy cũng có thể rút ra nhận xét như sau: Sau 12 giờ - ở 25 oC hầu hết các mẫu bán thiếu đều có đường viền của vòng dung huyết không rõ ràng ở cả hai nồng độ. - ở 37 oC các mẫu bán thiếu ở nồng độ thấp phân biệt rõ hơn. Sau 24giờ - ở 25 oC các mẫu bán thiếu có màu nhạt hơn hẳn so với thời điểm 8h và 12h. - ở 37 oC các mẫu bán thiếu ở nồng độ thấp có màu nhạt hơn do đó dễ phân biệt hơn. 3.3. Tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng Bảng 3: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD ở dân tộc Tày và Nùng Dân tộc N Thiếu hoàn toàn Bán thiếu Tổng Tày 130 7/130 (5,385%) 9/130 (6,923%) 12,308% Nùng 71 6/71 (8,451%) 1/71 (1,14%) 9,861% 2 dân tộc 201 13/201 (6,467%) 10/201 (4,975%) 11,442% Biểu đồ 3: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD ở dân tộc Tày và Nùng Nhận xét: tần suất thiếu hụt enzym chung ở cả hai dân tộc trong quần thể là 11,442%, tần suất thiếu hụt enzym của người Tày là 12,308% cao hơn ở người Nùng là 9,861% nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê ( p > 0,05 ). Bảng 4: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD theo giới ở dân tộc Tày và Nùng Giới tính n Nam Nữ p ( Q ) Tày 130 6/19 ( 31,58% ) 10/111 ( 9,01% ) < 0,01 ( 7,657 ) Nùng 71 4/20 ( 20% ) 3/51 ( 5,882% ) < 0,1 (3,22 ) 2 dân tộc 201 10/39 ( 25,64% ) 13/162 (8,025%) <0.01 (9,626 ) Biểu đồ 4: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD ở dân tộc Tày và Nùng theogiới Nhận xét: ở dân tộc Tày: tần suất thiếu hụt G6PD ở nam là 31,58% cao hơn nữ là 9,01%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01. ở dân tộc Nùng: tần suất thiếu hụt G6PD ở nam là 20% cao hơn nữ là 5,882%, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p < 0,1. ở hai dân tộc: tần suất thiếu hụt G6PD ở nam là 25,64% cao hơn nữ là 8,025%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN. 4.1.Đánh giá kỹ thuật của phương pháp Formazan ở các điều kiện khác nhau: 4.4.1. Về thời gian khác nhau: Với thời gian 8 giờ thì khi tiến hành xét nghiệm vào đầu buổi sáng (7 giờ) thì có thể trả kết quả vào buổi chiều cùng ngày là 15 giờ. Với thời gian 12 giờ thì khi tiến hành xét nghiệm vào 7 giờ sáng thì sẽ trả kết quả vào 19 giờ cùng ngày. Với thời gian 24 giờ thì khi tiến hành xét nghiệm vào buổi sáng hay buổi chiều thì sẽ trả kết quả cùng giờ vào ngày hôm sau. Như vậy thời gian 8 giờ và 24 giờ thì sẽ thuận tiện hơn vì ở trong giờ hành chính. Tất cả các mẫu thiếu hoàn toàn (5 mẫu) đều được nhận định ngay ở 8h ngay cả ở 25oC và cả ở nồng độ thấp. Đồng thời các mẫu này dễ dàng đọc được ở thời điểm 12h và 24h do thời gian đủ để phản ứng diễn ra, mức độ thiếu hụt enzym giữa những mẫu này và các mẫu còn lại có sự chênh lệch lớn. Do vậy việc nhận định màu vàng của vòng dung huyết rõ ràng hơn, từ đó ta đo đường kính của vòng dung huyết chính xác hơn. Đối với các mẫu bán thiếu Thời gian 8h với nồng độ thấp và nhiệt độ thấp thì sự nhận định sẽ không rõ do ở thời điểm đó sẽ chưa đủ thời gian để quá trình phản ứng chưa diễn ra hết và cũng không có đủ lượng enzym để xúc tác phản ứng bởi vậy sản phẩm tạo ra là Formazan có mầu xanh tạo ra còn ít dẫn đến vòng dung huyết có màu vàng nhạt ở tất cả các mẫu trong khay nhựa. Chính vì vậy mà việc so sánh và nhận định kết quả ở các mẫu bán thiếu là rất khó do đó ở thời điểm này không phát hiện được mẫu máu nào thiếu enzym. Thời gian 12h và 24h thì các mẫu bán thiếu (12 mẫu ) đều được đọc rõ ràng ở cả hai nồng độ, nhưng ở 12h các mẫu này có đường viền của vòng dung huyết không rõ ràng ở cả hai nồng độ. Từ những phân tích trên ta thấy thời điểm thích hợp hơn cả là 24h do thuân tiện cho việc trả kết quả và phát hiện được cả những mẫu bán thiếu. 4.1.2. Về hai điều kiện nhiêt độ khác nhau: Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng 25 oC, đây là nhiệt độ có thể áp dụng được ở những nơi không có tủ sấy. Đồng thời tiến hành ở nhiệt độ sinh lý của cơ thể là 37 oC, áp dụng ở nơi có tủ sấy. Nhiệt độ 25 oC: ở 8h và ở cả hai nồng độ tất cả các mẫu thiếu hoàn toàn đều được phát hiện, không phát hiện được mẫu bán thiếu nào do việc nhận định màu sắc giữa các mẫu trong khay thấy giống nhau nhiều. Ở 12h, 24h các mẫu bán thiếu đều đựơc phát hiện (12 mẫu ) nhưng ở 12h các mẫu này có đường viền của vòng dung huyết không rõ ràng ở cả hai nồng độ. Nhiệt độ 37 oC: phát hiện 8 mẫu bán thiếu ở nồng độ thấp và 12 mẫu ở nồng độ cao ngay tại thời điểm 8h do sự so sánh với các mẫu còn lại dễ dàng hơn. Các mẫu thiếu hụt hoàn toàn thì đều được phát hiện ở cả hai nhiệt độ. Từ những phân tích trên ta thấy: nhiệt độ 37 oC là thích họp hơn so với nhiệt độ phòng vì ngay ở thời điểm 8 h đã phát hiện được, điều này có thể đựoc giải thích là do enzym sẽ phản ứng mạnh hơn ở nhiệt độ cơ thể. Tuy vậy nếu thời gian của phản ứng kéo dài 12h đặc biệt là 24h thì ở nhiệt độ 25oC đều có thể nhận định các mẫu bán thiếu đó ở cả hai nồng độ, do vậy ở những nơi không có tủ sấy vẫn có thể tiến hành thí nghiệm nếu đảm bảo đủ thời gian của phản ứng. 4.1.3. Về hai nồng độ khác nhau: Ở nồng độ cao: sau 8h ta thấy có 12 mẫu bán thiếu đựơc phát hiện, nồng độ thấp chỉ phát hiện được 8 mẫu bán thiếu, như vậy là có 4 mâu bán thiếu không được phát hiện ở nồng độ thấp. Do việc đọc kết quả ở nồng độ cao dễ hơn nên so sánh giữa các mẫu bán thiếu với chứng (-) và chứng (+) rõ hơn. Đến sau 12h và 24 h thì cả 12 mẫu bán thiếu này cũng phân biệt rõ hơn do màu của vòng dung huyết nhạt hơn nhiều ở cả hai nồng độ, tuy vậy ở nồng độ thấp thì màu của các mẫu bán thiếu lại có sự phân biệt rõ hơn. Điều này có thể giải thích là do ảnh hưởng của màu nền màu của thạch agar, nồng độ cao sẽ làn cho màu nền sẫm lại khiến các mẫu bán thiếu có vòng dung huyết đậm hơn. Các mẫu thiếu hụt hoàn toàn thì đều được phát hiện ở cả hai nồng độ. Từ những phân tích trên ta thấy ở 8h thì nồng độ cao là thích hợp, nhưng nếu ở 12h, 24h, thì nồng độ thấp lại có tính ưu việt hơn. Hơn nữa việc nhận định kết quả còn phụ thuộc vào kinh nghiệm của người đọc. 4.2.Tần suất thiếu hụt G6PD. 4.2.1. Tần suất thiếu hụt G6PD giữa các dân tộc trong đó có dân tộc Tày và Nùng. Theo kết quả nghiên cứu gần đây nhất thì tần suất thiếu hụt G6PD ở các dân tộc khác nhau ở nước ta có sự khác biệt nhiều: Bảng 8: Tần suất thiếu hụt G6PD ở các dân tộc ở các tỉnh khác nhau Dân tộc Địa điểm n Thiếu hụt G6PD n % Kinh+ Hà Nội 1819 19 1,04 Mường+ Hoà Bình 250 65 26,0 Racley+ Khánh Hoà 720 21 2,92 Tày+ Khánh Hoà 82 14 17,04 Thái++ Sơn La 144 34 23,6 Bana++ Gia Lai 300 5 1,7 Tày+++ Cao Bằng 130 16 12,308 Nùng+++ Cao Bằng 71 7 9,861 Ghi chú: A+: theo nghiên cứu của Trần Thị Chính, Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng tác viên ( 2003 ) [13]. A++: theo nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh, Lê Minh Đạo, Đoàn Hạnh Nhân và cộng tác viên ( 2004 ) [12]. A+++: theo bảng 3. Qua bảng trên ta thấy, nhóm có tần suất thiếu enzym hụt lớn nhất là dân tộc Mường tỉnh Hoà Bình (26%) và ở dân tộc Thái tỉnh Sơn La (23,6%). Nhóm Tày ở Khánh Hoà, Tày ở Cao Bằng và Nùng ở Cao Bằng có tần suất thiếu hụt enzym trung bình. Ba nhóm còn lại là dân tộc Kinh ở Hà Nội, Racley ở Khánh Hoà, Bana ở Gia Lai có tần suất thiếu hụt enzym ít nhất tương ứng là 1,04%; 2,92%; 1,7%. Hoà Bình và Lai Châu là hai tỉnh nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng (Mai Châu 20%)[14]và có tỉ lệ thiếu men G6PD rất cao như trên. Tuy nhiên do công tác phòng dịch tốt nên 10 năm trở lại đây sốt rét đã bị đẩy lùi khỏi những vùng này và theo nghiên cứuu của Đoàn hạnh Nhân thì không có mối liên hệ sốt rét và thiếu G6PD ở hai tỉnh Sơn La và Lai Châu. (p > 0,05) [14]. Gia Lai có tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét rất cao là 13,6% [14] nhưng ỉ lệ thiếu G6PD lại rất thấp chỉ chiếm 1,7%. Dân tộc Racley ở Khánh Hoà có tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét cao nhưng tỷ lệ thiếu G6PD cũng thấp. Hà Nội là tỉnh không nằm trong vùng sốt rét và cũng có tỷ lệ thiếu G6PD thấp. Cao Bằng và Khánh Hoà cũng là hai tỉnh núi rừng nước chảy nằm trong vùng sốt rét nặng và có tỷ lệ thiếu hụt G6PD cao. Như vậy các dân tộc ở tỉnh khác nhau có tỷ lệ thiếu hụt men rất khác nhau. Tỷ lệ thiếu hụt cao đa số nằm trong vùng sốt rét nặng. Tỷ lệ thiếu hụt thấp như ở Hà Nội thì không có sốt rét lưu hành, tuy nhiên cũng có tỉnh tỷ lệ sốt rét dương tính cao nhưng tỷ lệ thiếu hụt G6PD lại rất thấp. Phải chăng sự khác nhau này liên quan đến dịch tễ học sốt rét, mặc dù vậy vấn đề này vẫn còn đang được thảo luận nhiều và vẫn chưa có ý kiến thống nhất. Có tác giả cho rằng đây là kết quả của quá trình chọn lọc tự nhiên, những hồng cầu thiếu G6PD không sản xuất đủ năng lượng để cung cấp cho ký sinh trùng sốt rét. Những hồng cầu đó sẽ chết trước khi ký sinh trùng kịp thời phân chia và xâm nhập vào những hồng cầu khác, và các cá thể sống trong vùng sốt rét ngẫu nhiên có sức đề kháng tốt với bệnh này. Các cá thể này sẽ có sức sống tốt hơn và được chọn lọc tự nhiên giữ lại . Bảng 9: Tần suất thiếu hụt G6PD ở các dân tộc Nhóm dân tộc Địa điểm lấy mẫu n Thiếu hụt G6PD p n % Thái+ Mai Châu ( Hoà Bình ) 211 43 20,4 > 0,05 Mai Sơn ( Sơn La ) 165 25 15,2 Mường La (Sơn La ) 144 34 23,6 Như Xuân ( Thanh Hoá ) 55 9 16,4 Thị xã Sơn La 45 10 22,2 Mường+ Thị xã Hoà Bình 196 51 26,0 > 0,05 Như Xuân (Thanh Hoá) 52 9 17,3 Khánh Vĩnh (Khánh Hoà) 11 2 18,2 Tày+ Thị xã Cao Bằng 19 4 21,1 > 0,05 Khánh Vĩnh (Khánh Hoà) 124 17 13,7 Lắc (Đắc Lắc) 15 2 13,3 ? (Cao Bằng) ++ 130 16 12,3 Nùng ? (Cao Bằng)++ 71 7 9,9 > 0,05 # Cao Bằng+ 192 15 7,8 Kinh Hà Nội+++ 1819 19 1,04 > 0,05 Q = 0,552 Kim Bôi4+ (Hoà Bình), Nga Sơn4+ (Thanh Hoá 202 1 0,5 Kinh Hà Nội+++ 1819 19 1,04 < 0,01 Mường Hoà Bình5+ 250 65 26 Ghi chú: A+: theo nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh, Lê Minh Đạo, Đoàn Hạnh Nhân và cộng tác viên ( 2004 ) [12]. A++: theo bảng 3. A+++: theo nghiên cứu của Trần Thị Chính, Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng tác viên ( 2003 ) [13]. A4+: theo nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân (1997) [14]. A5+: theo nghiên cứu của Trần Thị Chính, Vũ Triệu An và cộng tác viên (2002) [15]. Qua bảng trên ta thấy ở cùng một dân tộc tuy ở những địa điểm khác nhau nhưng sự khác biệt về tỷ lệ thiếu hụt G6PD không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Như vậy phải chăng yếu tố môi trường không ảnh hưởng nhiều đến sự thiếu hụt enzym này. số liệu ở bảng 9 cho ta thấy nhóm dân tọc Tày không có sự khác biệt về tính trạng này ở các tỉnh khác nhau (p > 0,05), qua nghiên cứu người ta thấy rằng nhóm dân tọc Tày ở Lắc và Khánh Vĩ đa số là từ Cao Bằng di cư vào trong những năm 1990, cũng như vậy ở dân tộc Mường ở Khánh Vĩnh đa số là từ Thanh Hoá di cư vào. Điều này cho ta thấy hệ số di truyền của bệnh cao và điều quan trọng quyết định ở đây là yếu tố gen học. Hơn nữa ở các nhóm dân tộc thiểu số Việt Nam thì sự kết hôn trong cùng mọt dân tộc là phổ biến, bởi vậy mà vốn gen của từng dân tộc thường không thay đổi nhiều. Tuy nhiên chính yếu tố môi trường (thói quen sử dụng thực phẩm, thuốc và tình trạng bệnh tật…) mới quyết định mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh, người ta đã phát hiện ra rằng G6PD trên cùng một cá thể biểu hiện ra nhiều biến thể thực nghiệm rất khác nhau và có hoạt độ xúc tác khác nhau.[16] Vì vậy việc đánh giá về sự ảnh hưởng của môi trường đến tính trạng này là rất cần thiết và cần phải có thêm nhiều nghiên cứu nữa về vấn đề này mới kết luận được chính xác.[12,6] Theo một số tác giả đã đặt ra vấn đề rằng sự thiếu hụt G6PD có liên quan đến HLA (kháng nguyên bạch cầu người) [15,3]. Số liệu ở bảng 9 ta thấy người Kinh ở Hà Nội có tỷ lệ thiếu hụt G6PD thấp hơn rất nhiều so với người Mường p < 0,01. Theo nghien cứu của Trần Thị Chính và cộng sự nhận thấy rằng người Mường hay gặp đột biến dạng Union và có tần suất HLA DQB1 0502 cao (chiếm 87,5%) trong khi ở người Kinh thì không gặp alen này. [15]. 4.2.2. Tần suất thiếu hụt G6PD theo giới. Tần suất thiếu hụt G6PD ở trẻ nam là 25,64% cao hơn ở trẻ nữ là 8,025%, (theo bảng ?). Các mẫu nghiên cứu được tiến hành trên cơ sở kết hợp với một đề tài khác nên số lượng nam thấp hơn nữ, tuy vậy sự chênh lệch về thiếu hụt giữa nam và nữ đã được kiểm định và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (p <0,05). Kết quả này phù hợp với đặc tính di truyền của tính trạng do gen lặn liên kết với giới tính quy định, ở nữ giới để biểu hiện tính trạng thiếu hụt hoàn toàn G6PD phải ở thể đồng hợp lặn mà tỷ lệ xuát hiện đồng hợp lặn trong quần thể là rất hiếm (chiếm q2/1 trong quần thể, với q là tần số tương đối của alen đột biến). Việc phát hiện nữ dị hợp tử còn khó bằng một số các phương pháp định tính, ngoài ra ở nữ giới còn có tính trạng bất hoạt hoá của một nhiễm sắc thể X trong quá trình phát triển của tế bào dẫn đến tạo ra dòng tế bào mang gen đột biến trên nhiễm sắc thể X được hoạt hoá và những dòng tế bào mang nhiễm sắc thể X bình thường. Từ đó tạo ra hai quần thể hồng thể hồng cầu bình thường và thiếu hụt với tỷ lệ phân bố khác nhau gây ra những biểu hiện lâm sàng ở các mức độ khác nhau. 4.2.2. Ý nghĩa của việc phát hiện thiếu hụt G6PD. Các cá thể có tỷ lệ thiếu hụt G6PD thường ở những vùng có sốt rét, việc sử dụng các thuốc sốt rét có tính oxi hoá cao là điều không thể tránh khỏi. Chính bởi vậy trước khi điều trị cũng như quá trình theo dõi kết quả điều trị và tiên lượng cần hết sức cẩn thận ở những cá thể này đặc biệt là ở giới tính nam KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được và những phân tích ở trên có thể rút ra những kết luận sau: 1. Phương pháp Formazan là một phương pháp dễ làm, các điều kiện để diễn ra phản ứng đều đơn giản và không có sự chênh lệch quá lớn khi tiến hành xét nghiệm ở những điều kiện khác nhau. Với điều kiện phản ứng tốt nhất là nhiệt độ 370 C, thời gian từ 12 – 24 giờ, hai nồng độ ở Viện Sốt Rét ký sinh trùng và Đại học Y đều thích hợp. 2. Tần suất thiếu hụt G6PD ở hai dân tộc Tày, Nùng là cao, cả hai dân tộc này nằm trong vùng sốt rét nặng. 3. Sự thiếu hụt G6PD ở nam là cao hơn nữ. Kiến nghị 1. Đưa xét nghiệm này trở thành một xét nghiêm thường quy cho tất cả những người sẽ sử dụng thuốc có tính oxy hoá (đặc biệt là thuốc chống sốt rét) ở những người nằm trong vùng có nguy cơ cao. 2. Đưa xét nghiệm này vào test sàng lọc cho trẻ sơ sinh ở vùng có nguy cơ cao.