Đề tài Thịt nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 1 PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO 1. ðặc ñiểm tế bào ñộng vật 1.1 Sự ñiều hòa trao ñổi chất Quá trình trao ñổi chất của cơ thể ñược tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết ñịnh ñến sự tồn tại của cơ thể sống. Ở tế bào ñộng vật, ngoài tác ñộng của hoạt ñộng enzyme, hệ dịch quanh tế bào, chúng còn bị tác ñộng rất mạnh bởi hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, ñiều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao ñổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao ñổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ ñến sự ñiều khiển của hệ thần kinh. Do ñó, việc trao ñổi chất của tế bào ñộng vật ở cơ thể sống là hết sức phức tạp. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao ñổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các ñặc ñiểm của một tế bào ñộc lập, giống như quá trình trao ñổi chất ở tế bào vi sinh vật. Khi ñó, tế bào ñộng vật trở thành một thực thể ñộc lập không tuân theo các qui luật của mô và qui luật của cơ thể ña bào. Việc nuôi cấy tế bào ñộng vật ñược thực hiện trên cơ sở ñiều khiển quá trình tổng hợp enzyme và ñiều khiển các hoạt ñộng của enzyme. Sự hoạt ñộng của enzyme cũng như quá trình tổng hợp enzyme sẽ quyết ñịnh khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao ñổi chất của tế bào cũng như khả năng phân chia tế bào. Hai vấn ñề mang tính chất quyết ñịnh trong việc ñiều khiển quá trình tổng hợp và hoạt ñộng của tế bào: Bản chất tự nhiên – nguồn gốc – của tế bào giúp ñịnh hướng sản phẩm cuối. Yếu tố môi trường quyết ñịnh tính trạng riêng biệt của tế bào giúp tính trạng ñó ñược biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy. Mọi tác ñộng của môi trường ñến tế bào nuôi cấy in vitro ñều là những tác ñộng trực tiếp, xảy ra rất nhanh và rất mãnh liệt; do ñó khi tiến hành kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần tạo ra sự hài hòa trong mọi tác ñộng ñến sự trao ñổi chất của tế bào ñược nuôi cấy. 1.2 Tính chất cơ học yếu Tế bào ñộng vật không có thành tế bào, chúng chỉ ñược bao bọc bởi một màng tế bào. Màng tế bào như một thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô. Các tế bào ñộng vật trong mô liên kết với nhau qua gian bào. Sự liên kết các tế bào trong mô này thường ở những vị trí ñặc biệt. Trong những ñiểm kết nối chứa ñầy các phân tử protein có tên khoa học là glycoprotein. Các protein này kết nối với sợi actin trong tế bào chất. Kích thước tế bào ñộng vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10µm, lại không có vách tế bào nên có tính chất cơ học yếu. Do ñó, nên khi thiết kế các thiết bị lên men hay trong quá trình vận hành nuôi cấy cần phải sử dụng máy mắc hay cánh khuấy có tốc ñộ rất thấp ñể tránh sự phá vỡ tế bào. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 2 1.3 Khả năng phân chia và tốc ñộ tăng trưởng chậm Ở ñộng vật, một chu trình tế bào thường kéo dài khoảng 20 – 70 giờ. Thời gian phân chia của tế bào có liên quan ñến sự ñấu tranh sinh tồn và sự bảo toàn tính di truyền của một loài; do ñó nó mang tính chất loài. Các yếu tố môi trường bên ngoài thường tác ñộng gián tiếp ñến tế bào ñộng vật. Sự phát triển của tế bào trong các mô của ñộng vật thường xảy ra một cách hài hòa giữa các mô trong toàn bộ cơ thể, giúp tạo ra hình thái riêng biệt cho từng loài và từng cá thể. Nếu trong một ñiều kiện nào ñó, một loại tế bào trong cơ thể ña bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý. Ngoài khả năng tăng chậm về số lượng tế bào, sự phát triển của tế bào ñộng vật xảy ra cũng rất chậm, gây khó khăn cho việc nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro. 1.4 Nhân ñôi trong quá trình phát triển cần giá ñỡ Trong cơ thể người và ñộng vật tồn tại hai loại tế bào: Loại tế bào tự do: tế bào máu, tế bào sinh dục. Loại tế bào ở dạng liên kết trong các mô. Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn tự do, tồn tại trong hệ tuần hoàn. Nhờ trạng thái tự do này mà tế bào máu có chức năng rất riêng biệt. Tế bào sinh dục thuộc loại tế bào bán tự do. Có nghĩa chỉ tồn tại tự do ở trạng thái sinh lý nhất ñịnh. Các tế bào còn lại tồn tại trong mô, chúng chỉ có thể tăng số lượng và phát triển trên một giá ñỡ nào ñó. 1.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao ñổi chất của tế bào Các nhà khoa học gọi cơ chế này là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (feed back). Thực ra, bất kỳ tế bào sinh vật nào ñều cũng biểu hiện cơ chế này. ðiểm khác biệt của tế bào ñộng vật là ở chỗ quá trình tổng hợp thừa ít xảy ra và hiện tượng các sản phẩm trao ñổi chất từ trong tế bào thoát ra khỏi tế bào thường rất chậm. 1.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ Xét về cấu trúc tế bào, tế bào ñộng vật ñược xem như một loại tế bào trần tự nhiên. Chúng ñược bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do ñó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus…) hoặc khi cho những tế bào ñộng vật có thông tin di truyền khác nhau (nhân khác nhau) ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tượng trao ñổi vật chất di truyền. Hiện tượng này tạo ra các tế bào lai (hybridoma). Hiện tượng lai này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra dòng lai mới. 1.7 Khả năng bảo quản trong ñiều kiện nhân tạo Tế bào ñộng vật cần phải ñược bảo quản trong những ñiều kiện hết sức ñặc biệt mới có thể giữ ñược những ñặc tính riêng của nó. Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng hoặc bơm những chất phụ gia vào các dòng tế bào ñộng vật và bảo quản chúng ở nhiệt ñộ - 70oC. Bằng biện pháp này, tế bào ñộng vật vẫn duy trì ñược ñặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Khi sử dụng, tế bào ñộng vật ñược Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 3 tiến hành giải ñông và ñược hoạt hóa ñể phục hồi lại khả năng tăn trưởng và phân chia như trước khi ñem bảo quản. Ngoài ra, tế bào ñộng vật rất kém thích nghi với ñiều kiện môi trường, rất nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone. 2. Tế bào mầm (Stem Cell) Trong cơ thể ñộng vật có một loại tế bào luôn luôn sẵn sàng bù ñắp những mất mát, tổn thương bất kỳ nào ñó của cơ thể: sự tạo máu, liền cơ, xương, da, mọc tóc,… nhưng trước ñây người ta không chú ý ñến tiềm năng và vai trò của tế bào này. Tế bào mầm là những tế bào có khả năng phân chia ở những giai ñoạn không xác ñịnh trong quá trình nuôi cấy và có thể biệt hóa tạo ra những tế bào chuyên biệt. ðịnh nghĩa tương ñối về tế bào mầm như sau: tế bào mầm là những tế bào có khả năng cho sự tái tạo kéo dài vô hạn, và vì vậy, có thể giúp tạo ra ít nhất là một kiểu tế bào hậu duệ có khả năng biệt hóa cao. Thông thường còn có một loại tế bào trung gian giữa tế bào mầm và tế bào ñã biệt hóa (tế bào ñích): Một số ñặc ñiểm sinh học của tế bào mầm 2. 1 ðặc ñiểm chức năng Luôn phân chia ñể tạo ra tế bào mới. Là nguồn gốc của sự gia tăng số lượng tế bào trong cơ thể. Có khả năng tạo nhiều kiểu tế bào ñích khác nhau. Có cơ chế ñiều hòa gen ñặc biệt. Dễ dàng thích nghi. 2.2 ðặc ñiểm tiến hóa Các nhà khoa học cho rằng tế bào mầm là nguồn gốc của sự tiến hóa, tuy nhiên người ta vẫn chưa xác ñịnh ñược thời ñiểm xuất hiện của các tế bào mầm trong các tổ chức sinh học, cũng như những yếu tố ñiều khiển sự khác biệt ñó. 2.3 Hai phương thức tái tạo và biệt hóa của tế bào mầm. Sự tái tạo trực tiếp xảy ra bằng cách phân chia bất ñối xứng: một tế bào gốc ra hai tế bào con, trong hai tế bào con ñó sẽ có một tế bào gốc và một tế bào tiền biệt hóa, và chỉ có tế bào tiền biệt hóa mới tiếp tục phân chia hoặc biệt hóa tiếp theo. Cơ chế ñiều hòa mức ñộ cao: o Tế bào mầm tạo ra hai tế bào con ñều có khả năng tiền biệt hóa như nhau. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 4 o Các tế bào tiền biệt hóa ñều có khả năng biệt khóa theo các con ñường khác nhau và ở nhiều giai ñoạn khác nhau. 3. Sinh học của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy. 3.1 Môi trường nuôi cấy Trạng thái của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy tương tự như một kiểu chức năng sinh lý thường xuyên tồn tại trong cơ thể ñộng vật. Trong quá trình nuôi cấy, khi có sự biến ñổi ñiều kiện môi trường thì ñặc tính của tế bào sẽ thay ñổi theo. Những tế bào không tăng sinh bình thường in vivo (trong cơ thể) có thể tăng sinh trong in vitro; hơn nữa trong ñiều kiện in vivo, những tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với chất gian bào giảm xuống vì chúng ñồng dạng với nhau và không có ñược một cấu trúc 3 chiều, ñồng thời, hormone và các chất dinh dưỡng cung cấp dễ bị biến ñổi. Lý do này khiến các nhà khoa học tập trung nghiên cứu xây dựng một môi trường phù hợp cho sự tăng trưởng, chuyển ñộng ñến vị trí cơ chất, tăng sinh của những tế bào không chuyên biệt hơn là môi trường cần thiết cho sự biểu hiện các chứ năng khác nhau của tế bào. Việc sử dụng môi trường thích hơp, cung cấp dưỡng chất, hormone và cơ chất là những vấn ñề cơ bản cho sự biểu hiện những chức năng chuyên biệt của tế bào. Trước khi duy trì những ñiều kiện chuyên biệt như vậy, cần phải kiểm tra trong những trường hợp có thể xảy ra khi tiến hành nuôi cấy sơ khởi cũng như nuôi cấy dòng tế bào sau ñó. 3.2 Khởi ñầu việc nuôi cấy (nuôi cấy sơ khởi) Việc nuôi cấy ñược bắt ñầu tiến hành khi tế bào ñược tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp. Cho dù tế bào ñược tách ra bằng bất kỳ phương pháp vào thì ñây vẫn là giai ñoạn chọn lọc ñầu tiên của quá trình nuôi cấy ñể cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương ñối ñồng dạng. Bảng 1: Những yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của dòng tế bào Giai ñoạn Yếu tố ảnh hưởng lên sự chọn lọc Mẫu cấy sơ khởi Tách tế bào bằng enzyme Cô lập Tách tế bào bằng phương pháp cơ học Tách tế bào bằng enzyme. Nuôi cấy sơ khởi Tăng trưởng nhanh Bám vào cơ chất và tăng kích thước. Cấy chuyền Nhạy cảm với trepsin Sự hạn chế dưỡng chất, hormone, cơ chất. ðược nhân lên như một dòng Tốc ñộ tăng trưởng tương ñối của các tế bào khác nhau. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 5 tế bào Ảnh hưởng của mật ñộ tế bào lên sự vượt trội của các kiểu hình bình thường hay kiểu hình biến ñổi. Sự hạn chế dưỡng chất, hormone và cơ chất. Lão suy, biến ñổi gen Các tế bào thường chết. Các tế bào biến ñổi tăng trưởng mạnh. Trong giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi (primary culture) (giai ñoạn từ khi tế bào ñược tách ra khỏi mô và ñược nuôi cấy in vitro), sự chọn lọc dựa vào ñặc tính của tế bào như tế bào có thể ñược tách ra khỏi mẫu cấy ban ñầu một cách dễ dàng. ðối với những tế bào phân tán, chỉ có những tế bào nào còn sống sau khi tách rời khỏi nhau và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại ñược trong dịch huyền phù thì sẽ trở thành ñối tượng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ khởi. Nếu giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi kéo dài ñược hơn vài giờ ñồng hồ thì bước chọn lọc tiếp theo sẽ xảy ra. Những tế bào có khả năng tăng sinh sẽ tăng lên, một vài loại tế bào sẽ sống nhưng không tăng sinh, một số khác sẽ không sống ñược trong ñiều kiện nuôi cấy này. Vì lý do này, sự phân bố của các loai tế bào sẽ tiếp tục thay ñổi cho ñến khi bề mặt của cơ chất hoàn toàn ñược bao phủ bởi tế bào (trong trường hợp tế bào nuôi cấy tạo thành từng lớp ñơn). Khi ñó, tỷ lệ tế bào nhạy cảm với mật ñộ tới hạn sẽ từ từ giảm xuống, còn tỷ lệ những tế bào không nhạy cảm với mật ñộ tới hạn sẽ tăng lên. Việc giữa cho mật ñộ tế bào thấp, ví dụ như cấy chuyền thường xuyên, sẽ giúp duy trì kiểu hình bình thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy như trường hợp nguyên bào sợi của chuột, và những tế bào biến ñổi tự phát có khuynh hướng tăng trưởng mạnh khi mật ñộ tế bào cao (Tadaro và Green, 1963; Brouty – Boyé và cộng sự, 1979) Một vài khía cạnh của các chức năng chuyên biệt của tế bào có thể có biểu hiện mạnh hơn trong giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi, ñặc biệt là khi tất cả các bề mặt của cơ chất ñều ñược tế bào bám vào và các tế bào tạo ra môi quan hệ gần với nhau. Tế bào thu ñược trong giai ñoạn này ñược gọi là tế bào sơ khởi (primary cell). Các tế bào sơ khởi không ñồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ con cháu của nhiều loại tế bào ban ñầu khác nhau. Ở giai ñoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần giống với mô cha mẹ nhất. 3.3 Sự phát triển của dòng tế bào Sau lần cấy chuyền ñầu tiên các tế bào sơ khởi ñược thu nhận ổn ñịnh và trở thành dòng tế bào (cell line), lúc này tế bào có thể ñược nhân lên và cấy chuyền vài lần. Qua mỗi lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ bị phân tán. ðây là ñiểm nổi bật nhất sau lần cấy chuyền ñầu tiên khi có sự khác nhau về khả năng tăng sinh cùng với khả năng biến ñổi ñể chịu ñựng ñược những tác ñộng của trypsin và sự cấy chuyền tế bào. Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và sự tiến triển về hình thái, nhưng lần cấy chuyền thứ ba trở nên ổn ñịnh hơn, ñiển hình là tế bào có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Những tế bào này thường có nguồn gốc từ trung mô, xuất phát từ những mô liên kết với Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 6 nguyên bào sợi và các yếu tố mạch. Hiện tượng ñược biết ñến là sự tăng trưởng mạnh của nguyên bào sợi và trở thành những dòng tế bào hữu dụng ví dụ như W138 – nguyên bào sợi của phôi phổi người, BHK21 – nguyên bào sợi của thận chuột ñồng con và có lẽ nổi bật hơn hết là tế bào L – nguyên bào sợi dưới dạng da ñược xử lý với methylcholanthrene. ðó là một trong những thách thức chủ yếu của lĩnh vực nuôi cấy mô từ khi lĩnh vực này mới ñược khởi ñầu: làm cách nào ñể ngăn cản sự tăng trưởng quá mức của những tế bào yếu hoặc sự tăng trưởng quá chậm của những tế bào như tế bào nhu mô gan hoặc những tế bào biểu bì hóa sừng. Nguyên nhân là do ñiều kiện môi trường không phù hợp và vấn ñề ñáng chú ý hiện nay là xây dựng ñược môi trường và chọn lọc ñược cơ chất thích hợp ñể có thể duy trì ñược nhiều dòng tế bào chuyên biệt. 3.4 Sự phát triển của những dòng tế bào liên tục Hầu hết các dòng tế bào ñều có thể sinh sản theo một kiểu không ñổi trong một số thế hệ giới hạn, ngoài ra chúng có thể chết hoặc chuyển thành dòng tế bào liên tục (continuous cell line). ðó là một số dòng tế bào có khả năng thích ưng với môi trường nuôi cấy, giữa ñược khả năng phân chia tốt và có thể cấy chuyền vĩnh viễn. Khả năng dòng tế bào tăng trưởng liên tục có lẽ phản ánh sự thay ñổi kiểu di truyền cho phép sự chọn lọc xảy ra sau ñó. Nguyên bào sợi của người có tính ưu thế, có số lượng bội thể không bị thay ñổi trong suốt thời gian sống của chúng và không tạo thành dòng tế bào liên tục, trong khi ñó các nguyên bào sợi của chuột và các tế bào ñược tách ra từ các khối u của người và ñộng vật thường bị thay ñồi số lượng bội thể trong quá trình nuôi cấy và trở thành dòng tế bào liên tục với tần số cao. Những biến ñổi trong quá trình nuôi cấy làm tăng sự biến ñổi dòng tế bào thành dòng tế bào liên tục ñược gọi là “sự biến ñổi in vitro” và có thể tự xảy ra hoặc do sự cảm ứng của hóa chất và virus. Các dòng tế bào liên tục thường có số lượng bội thể thay ñổi và số bội thể ở giữa mức nhị bội và tứ bội. Cũng chưa rõ ràng hoặc những tế bào có khả năng trở thành các dòng tế bào liên tục hiện diện sẵn trong mô nuôi cấy với số lượng rất nhỏ hoặc sau ñó những tế bào này ñược tạo ra do sự biến ñổi của một hay nhiều tế bào. Lý do thứ hai có khả năng xảy ra cao hơn, do các dòng tế bào liên tục thường xuất hiện rất trễ trong quá trình nuôi cấy, sau giai ñoạn tăng trưởng mạnh của các tế bào có trước. Tuy nhiên, khả năng còn lại có thể là do có một quần thể tế bào thứ cấp có khuynh hướng biến ñổi không giống với các tế bào còn lại. Thuật ngữ “biến ñổi” (transformation) ñược sử dụng cho quá trình hình thành dòng tế bào liên tục bởi vì các tế bào nuôi cấy phải trải qua những sự biến ñổi về hình thái và vận ñộng. Sự hình thành dòng tế bào liên tục thường diễn ra cùng với sự gia tăng phát sinh các khối u. Một số dòng tế bào liên tục hình thành cùng những biến ñổi theo các hướng không tốt như giảm nhu cầu về huyết thanh, giảm mật ñộ giới hạn của sự tăng trưởng, tăng trưởng trong môi trường bán lỏng, và bộ nhiễm sắc thể có số lượng bội thể biến ñổi… Những thay ñổi về hình thái và bản chất tương tự có thể quan sát thấy ở các tế bào biến ñổi do sự cảm ứng của hóa chất hoặc virus. Nhiều tế bào bình thường không thể biến ñổi thành dòng tế bào liên tục. Nguyên bào sợi của người có số lượng nhiễm sắc thể ổn ñịnh trong suốt ñời sống cảu nó và khi gặp một biến ñổi lớn nào ñó thì sẽ ngừng phân chia, mặc dù vẫn có thể tiếp tục sống thêm 18 tháng. Tế bào thần kinh ñệm của người và nguyên bào sợi của gà con cũng có ñặc ñiểm tương tự Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 7 như vậy. Mặt khác, tế bào biểu bì sẽ từ từ tăng thêm thời gian sống nếu như kỹ thuật nuôi cấy ñược cải tiến và còn có thể tăng khả năng tăng trưởng liên tục. ðiều này có lẽ liên quan ñến khả năng tự ñổi mới của mô in vitro. Việc nuôi cấy liên tục các nguyên bào bạch huyết cũng ñược tiến hành, mặc dù trong trường hợp này có thể sử dụng virus Epstein Barr ñể cảm ứng sự biến ñổi. Có thể ñiều kiện mở ñường cho sự phát triển của một dòng tế bào liên tục là sự thay ñổi kiểu gen vốn có của tế bào, vì vậy không có gì ngạc nhiên khi kiểu gen trong dòng tế bào liên tục khôn ổn ñịnh. Bảng 2: Những ñặc tính của dòng tế bào giới hạn và dòng tế bào liên tục Dòng tế bào giới hạn Dòng tế bào liên tục Thuận lợi Kiểu gen và kiểu hình ñiển hình gần với loại in vivo. Thường có số bội thể ổn ñịnh. Tăng trưởng nhanh. Thời gian sống không bị hạn chế. Dễ nhân dòng. Có thể nhân lên trong dịch huyền phù. Tế bào chắc. ðòi hỏi môi trường ñơn giản. ðòi hỏi lượng huyết thanh thấp. Bất lợi Thời gian sống bị hạn chế Tăng trưởng chậm. Hiệu quả bám trên cơ chất thấp. Kiểu gen không ổn ñịnh. Biến ñổi. Thường là có số bội thể không bình thường. 3.5 Sự phản phân hóa Sự phản phân hóa bao hàm ý nghĩa là những tế bào ñã phân hóa bị mất ñi tính chuyên biệt in vitro, nhưng cũng chưa rõ là: • Có thể những tế bào chưa phân hóa (trong cùng một dòng với những tế bào ñã phân hóa) tăng trưởng mạnh. • Hoặc do sự vắng mặt của các chất cảm ứng thích hợp (hormone, sự tương tác qua lại của tế bào hoặc chất gian bào) gây ra sự mất khả năng thích nghi. Trong thực tế, cả hai nguyên nhân cùng có thể xảy ra. Sự tăng sinh liên tục có thể do các tế bào chưa phân hóa không gặp ñược sự cảm ứng phù hợp của ñiều kiện môi trường ñể phân hóa. Có một sự khác biệt quan trọng giữa phản phân hóa, mất khả năng thích nghi và sự chọn lọc. • Sự phản phân hóa ñược cho là bản chất chuyên biệt của các tế bào ñã phân hóa bị mất ñi và không thể ñảo ngược ñược, ví dụ như tế bào gan sẽ mất enzyme của nó (arginase, aminotransferase,…), không thể dự trữ glycogen hoặc tạo ra protein huyết thanh, và những ñặc tính này không thể ñược cảm ứng trở lại một khi ñã bị mất ñi. • Sự mất khả năng thích nghi là sự tổng hợp các sản phẩm chuyên biệt hoặc một chức năng chuyên biệt dưới sự ñiều hòa của những hormone (hormone: tương tác giữa tế bào với tế bào, tương tác giữa tế bào và chất gian bào,…) có thể ñược tái cảm ứng khi ñiều kiện nuôi cấy thích hợp; ví dụ như cảm ứng enzyme tyrosine aminotransferase trong gan chuột bình thường ñòi hỏi phải có hormone (insulin, hydrocortisone) và sự Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 8 tương tác chính xác của các chất cơ bản, khi ñiều kiện nuôi cấy thích hợp các chức năng của tế bào ñã phân hóa có thể ñược biểu hiện ở một số dòng tế bào khác. • Sự phản phân hóa là sự mất ñi chức năng chuyên biệt ñược xem như là một sự giải thích không hoàn toàn chính xác. ðể ñiều kiện cảm ứng chính xác có hiệu lực, cần phải có ñược những tế bào thích hợp. Trong những thí nghiệm nuôi cấy tế bào gan trước ñây, sự biểu hiện các ñặc tính của tế bào gan không xảy ra, phần nào là do sự tăng trưởng quá mức của các nguyên bào sợi của mô liên kết hoặc nội mô của mạch máu hoặc các thể xoang. Bằng cách sử dụng kỹ thuật tách tế bào và ñiều kiện nuôi cấy thích hợp các tế bào gan có thể ñược chọn lọc một cách phù hợp hơn. Tương tự, các tế bào biểu bì có thể tăng trưởng nhờ sử dụng phương pháp lớp nuôi hoặc môi trường chọn lọc phù hợp. 4. Nuôi cấy tế bào ñộng vật 4.1 ðiều kiện nuôi cấy 4.1.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 4.1.1.1 Thiết bị Tủ ấm thường, tủ ấm CO2. Tủ lạnh và tủ ñông. Tủ sất ñối lưu. Bể ñiều nhiệt. Kính hiển vi thường. Kính hiển vi soi ngược. Ống hút tự ñộng, ống hút Pateur. Máy khuấy từ. Máy ño mật ñộ quang. Bơm chân không. Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh. Nồi hấp vô trùng môi trường nuôi cấy. pH kế. Cân phân tích Máy cất nước hai lần Tủ cấy vô trùng 4.1.1.2 Dụng cụ Hộp plastic nuôi cấy loại giếng Bình nuôi cấy ðĩa petri plastic Hộp plastic nuôi cấy hình chữ nhật Bình nuôi cấy bằng thủy tinh Ống nghiệm có nắp ñậy Ống làm lạnh + hộp ñựng. Dụng cụ thủy tinh ñể pha môi trường. Màng lọc ñã khử trùng. 4.1.2 Môi trường nuôi cấy Từ khi khám phá ra các tế bào từ các mô có thể nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học cố gắng tìm ra những môi trường xác ñịnh từ môi trường cơ bản ñơn giản của Eagle (1955; 1959) ñể duy trì sự tăng trưởng liên tục của tế bào. ðó là những môi trường có thành phần phức tạp hơn như môi trường 199 của Morgan, môi trường CMRL 1066 của Parker. Mặc dù hầu hết các môi trường hiện nay ñã ñược xác ñịnh thành phần nhưng chúng vẫn cần phải bổ sung 5 – 20% huyết thanh. Người ta muốn không lệ thuộc vào huyết thanh trong quá trình nuôi cấy tế bào nên ñã xây dựng những môi trường phức tạp hơn ñể thay thế cho huyết thanh như trong môi trường NCTC 109, Waymouth’s MB, Ham’s F12, Birch & Pirt, MCDB. Một phương pháp ñể tạo ra môi trường mới là bắt ñầu từ một môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường Ham’s F12 hoặc môi trường 199 có bổ sung huyết thanh với Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 9 nồng ñộ cao (20%), cố gắng từ từ giảm nồng ñộ huyết thanh bằng cách tăng nồng ñộ các chất ñã có trong môi trường và thêm vào những chất mới. ðây là một phương pháp khó, nhưng kết quả là tạo ra ñược những mội trường khác nhau ñể nuôi cấy tế bào cơ của người và các loại tế bào khác mà không cần huyết thanh hoặc chỉ cần ñến huyết thanh với nồng ñộ thấp. Bảng 3: Môi trường cơ bản ñơn giản của Eagle’MEM (1956, 1959) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Muối vô cơ Amino acid CaCl2 200 L – arginine.HCl 126 KCl 400 L – cystine 24 MgSO4.7H2O 200 L – glutamine 292 NaCl 6800 L – histidine.HCl.H2O 42 NaHCO3 2200 L – isoleucine 52 Na2HPO4.H2O 140 l – leucine 52 Vitamin L – lysine.HCl 73,1 D – panthothenate calcium 1 L – methionine 15 Choline chloride 1 L – phenylalanine 33 Acid folic 1 L – threonine 48 I – inositol 2 L – tryptophan 10 Nicotiamide 1 L – tyrosine 36 Pyridoxal.HCl 1 L – valine 47 Riboflavine 0,1 Các thành phần khác Thiamine.HCl 1 D – glucose 1000 ðỏ phenol 10 Bảng 3: Môi trường Waymouth’s MB17,50 752/1 Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Muối vô cơ Amino acid CaCl2.2H2O 120 L – arginine.HCl 75 KCl 150 L – aspartic acid 60 KH2PO4 80 L – cystein 61 MgCl2.6H2O 240 L – cystine 15 MgSO4.7H2O 200 L – glutamic acid 150 NaCl 6000 L – glutamine 350 NaHCO3 2240 Glycine 50 Na2HPO4.7H2O 566 L – histidine 123 Vitamin L – isoleucine 25 L – ascorbic acid 17,5 L – leucine 50 Biotin 0,02 L – lysine.HCl 240 D – panthothenate calcium 1 L – methionine 50 Choline chloride 250 L – phenylalanine 50 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 10 Acid folic 0,4 L – proline 50 I – Inositol 1 L – threonine 75 Nicotiamide 1 L – tryptophan 40 Riboflavine 1 L – tyrosine 40 Thiamine.HCl 10 L – valine 65 Vitamin B12 0,2 Các thành phần khác Pyroxine.HCl 1 D – Glucose 5000 ðỏ phenol 10 Glutathione 15 Hypoxanthine 25 4.1.2.1 Các yếu tố vật lý tác ñộng ñến môi trường. a. pH: hầu hết các dòng tế bào tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4. ðộ pH tối thích ñối với mỗi dòng tế bào sẽ khác nhau. Một số dòng tế bào như nguyên bào sợi tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4 – 7,7 và những dòng tế bào biến ñổi sẽ tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,2 – 7,4 (Eagle, 1973). Theo Eisinger và cộng sự (1979), tế bào biểu bì có thể sống ở pH 5,5. Sự thay ñổi pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn ñến sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào. ðánh giá pH môi trường thông qua ñỏ phenol thường mang tính chủ quan, do ñó cần phải làm một thang chuẩn mới với muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) và ñỏ phenol với nồng ñộ chính xác. b. ðệm: môi trường nuôi cấy cần phải có dung dịch ñệm trong hai trường hợp: ♣ Khi mở ñĩa nuôi cấy tế bào, CO2 khí quyển sẽ làm tăng pH. ♣ Lượng CO2 và acid lactic ñược sinh ra quá mức từ các dòng tế bào biến ñổi (khi mật ñộ tế bào cao) làm pH môi trường giảm. Dung dịch ñệm bổ sung vào môi trường giúp ổn ñịnh ñộ pH trong những trường hợp sau: ♠ Một số dòng tế bào ñòi hỏi phải có CO2 dạng khí, ñặc biệt là khi mật ñộ tế bào thấp. Dung dịch ñệm ngăn cản sự thất thoát CO2 và từ môi trường nuôi cấy. ♠ Khi không ñậy chặt nắp bình nuôi cấy (nắp bình ñược cuốn bằng giấy nhôm) hoặc sử dụng những bình nuôi cấy mà CO2 có thể xuyên qua nắp bình vào môi trường nuôi cấy thì dung dịch ñệm sẽ thúc ñẩy sự giải phóng CO2. ♠ Dung dịch ñệm thường ñược sử dụng hơn các dung dịch ñệm khác, mặc dù khả năng ñệm tương ñối yếu ở pH sinh lý, bởi vì nó ít ñộc với mẫu nuôi cấy, giá thành thấp và thành phần khoáng thích hợp với thành phần môi trường. HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulfonic Acid) có tác dụng ñệm mạnh hơn ở pH 7,2 – 7,6 và nó thường ñược sử dụng vớ nồng ñộ 10 hoặc 20mM. Khi HEPES ñược sử dụng với CO2 ngoại sinh thì nồng ñộ của HEPES phải tăng lên gấp 2 lần so với ñệm thông thường. c. Áp suất thẩm thấu Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 11 Hầu hết các tế bào nuôi cấy ñều có thể chịu ñược biên ñộ áp suất thẩm thấu tương ñối rộng. Áp suất thẩm thấu thích hợp cho sự tăng trưởng của tế bào những loài ñộng vật khác nhau sẽ khác nhau. Trong trường hợp nuôi cấy tế bào trong môi trường nhược trương thì nên nuôi trong ñĩa petri ñể cho có sự thoát bớt hơi nước trong quá trình nuôi. Việc ño áp suất thẩm thấu rất cần thiết trong quá trình pha môi trường ñể tránh không xảy ra sai sót trong lúc cân hóa chất và pha loãng. d. Nhiệt ñộ Ngoại trừ những ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào, nhiệt ñộ còn ảnh hưởng ñến pH của môi trường: nhiệt ñộ thấp sẽ làm tăng sự hòa tan CO2 vào môi trường, do sự thay ñổi khả năng ion hóa và pK2 của dung dịch ñệm. e. ðộ nhớt của môi trường ðộ nhớt của môi trường chủ yếu bị ảnh hưởng bởi thành phần của huyết thanh, và trong hầu hết các trường hợp, sự thay ñổi ñộ nhớt môi trường sẽ ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của tế bào. Nếu huyền phù tế bào bị lay ñộng khi ñược khuấy hoặc khi tế bào tách khỏi nhau sau khi ñược trypsin hóa mà có tế bào bị tổn thương thì số lượng tế bị tổn thương sẽ giảm xuống khi tăng ñộ nhớt môi trường với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl pyrrolidone. f. Sức căng bề mặt và sự tạo bọt Sức căng bề mặt của môi trường có thể ñược lợi dụng ñể cho mẫu cấy sơ khởi bám vào bề mặt cơ chất nhưng hiếm khi thực hiện ñược. Trong huyền phù tế bào, nếu 5% CO2 trong không khí ñược sục vào môi trường có huyết thanh thì có thể sẽ tạo ra bọt. Silicon ñược bổ sung vào môi trường ñể chống tạo bọt do làm giảm sức căng bề mặt. Tốc ñộ biến tính protein có thể tăng lên, và mức ñộ nhiễm cũng gia tăng nếu như bọt khí chạm vào cổ bình nuôi cấy. 4.1.2.2 Thành phần môi trường a. Dung dịch muối cân bằng Dung dịch muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) là một hỗn hợp muôi vô cơ, trong ñó thường có bicarbonate sodium và glucose, mặc dù khi sử dụng người ta thường bò bớt bicarbonate và glucose. ðệm HEPES (5 – 20mM) có thể ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nếu cần thiết và NaCl với một lượng tương ñương có thể ñược bỏ ñi ñể duy trì áp suất thẩm thấu chính xác của môi trường. BBS ñược sử dụng như một dung dịch pha loãng những môi trường phức tạp, môi trường dùng ñể rửa mẫu, môi trường phân chia hoặc dùng trong những mục ñích khác nhau và không cần ñến một môi trường nhược trương không nhất thiết phải có ñầy ñủ các khoáng chất. Sự chọn lựa dung dịch muối cân bằng phụ thuộc vào: ♥ Áp lực CO2. ♥ Mục ñích sử dụng: tách các tế bào từ mô hoặc trải các tế bào thành lớp ñơn. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 12 ♥ Sử dụng trong các huyền phù tế bào có các tế bào chỉ có thể tăng trưởng khi bám vào cơ chất. Hiện nay, HEPES là dung dịch có hiệu quả nhất ở pH 7,2 – 7,8 và TRICINE có hiệu quả ở pH 7,4 – 7,8. b. Các môi trường xác ñịnh ðược xây dựng bằng cách thay ñổi các thành phần trong môi trường tối thiểu của Eagle (MEM) (1959) - trong ñó có chứa các amino acid cần thiết, vitamin và muối – thành những môi trường phức tạp như môi trường 199, CMRL 1066, RPMI 1640 và F12. Những môi trường phức tạp có chứa một lượng lớn các amino acid và các vitamin khác nhau và thường ñược bổ sung với các chất biến dưỡng như các nucleoside và khoáng Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không ñược không ñược tổng hợp trong cơ thể nên cần bổ sung từ môi trường nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay ñổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Nồng ñộ của amino acid thường hạn chế mật ñộ tối ña của các tế bào và sự cân bằng amino acid sẽ ảnh hưởng ñến sức sống và tốc ñộ tăng trưởng của tế bào. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào và chỉ một dòng tế bào có thể sử dụng ñược glutamate. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng glutamate ñược sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon. Vitamin: khi tăng thành phần môi trường lên (mục ñích ñể giảm hàm lượng huyết thanh xuống) thì danh sách các vitamin trong môi trường cũng phải tăng theo. Khi mật ñộ tế bào trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai ñoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng vitamin cho dù trong môi trường ñã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chết về vitamin có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc ñộ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật ñộ tế bào. Muối: các loại muối chủ yếu là là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trường. Trong huyền phù tế bào, lượng thường ñược giảm xuống ñể hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng ñộ ñược xác ñịnh bằng nồng ñộ CO2 ở dạng khí. Glucose: ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñể cung cấp năng lượng. Glucose ñược chuyển hóa chủ yếu bởi chu trình ñường phân (glycoside) tạo ra acid lactic ñể ñi qua chu trình Krebs giải phóng CO2. Trong in vitro, chu trình Krebs hoạt ñộng không trọn vẹn, carbon trong acid lactic ña số từ glutamine, chỉ một phần nhỏ từ glucose. ðiều này giải thích cho nhu cầu glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy. Dung dịch ñệm: khi torng môi trường có dung dịch muôi cân bằng thì khả năng ñệm của dung dịch ñệm bị hạn chế, ñó là do sự hiện diện của phospahte. Trong những môi trường ñòi hỏi cần phải có dun dịch ñệm thì lượng phải tương ñương với lượng CO2 ở dạng khí khi bình nuôi cấy mở nắp. Khoáng chất: cũng như một vài loại vitamin, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào ñược cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ sung các chất nay vào môi trường nói chung không cần thiết làm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường. Trong môi trường có Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 13 hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc ñó cần phải bổ sung sắt, ñồng, kẽm, selenium và các nguyên tố dạng vết khác vào môi trường nuôi cấy. Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau như nucleoside, các chất trung gian của chu trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trường nuôi cấy phức tạp. Những hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy. Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng chuyên biệt. c. Huyết thanh Huyết thanh ñược sử dụng hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô là huyết thanh bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người. Huyết thanh bê thường ñược sử dụng nhiều nhất, kế ñến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết thanh người ñược sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào người. Mặc dù hầu hết các dòng tế bào ñều cần có huyết thanh trong môi trường nuôi cấy, nhưng hiện nay người ta thấy cũng có những dòng tế bào có thể ñược duy trì và tăng sinh trong môi trường không có huyết thanh. Các chủng tế bào liên tục (continuous cell) như L929 và tế bào Hela là những chủng ñầu tiên ñược nuôi cấy và tăng trưởng trong môi trường không có huyết thanh. Tuy nhiên, ở phòng thí nghiệm Ham và một số phòng thí nghiệm khác (Carney) ñã chứng minh rằng có thể giảm lượng huyết thanh hoặc bỏ hẳn mà không ảnh hưởng ñến tế bào nếu như các chất khoáng và hormone bổ sung vào môi trường thích hợp với dòng tế bào ñược nghiên cứu. Protein: mặc dù protein là thành phần chính trong huyết thanh nhưng vai trò của một số loại protein vẫn còn chưa ñược chứng minh rõ ràng: một số loại protein có lẽ có vai trò chuyên chở các chất khoáng, acid béo, hormone hoặc bản thân chúng cũng là hormone. Các loại protein hữu dụng là albumin và globulin. Fibronectin (globulin không tan) ñiều khiển sự kết hợp α 2-macroglobulin hạn chế hoạt ñộng của trypsin. Fetuin trong huyết thanh bò làm tăng tính bám của tế bào và transferrin liên kết với sắt làm giảm ñộc tính của sắt ñể phù hợp với nhu cầu của tế bào. Có thể có những loại protein khác chưa biết ñược ñặc tính cũng cần thiết cho khả năng bám và tăng trưởng của tế bào. Polypeptide: những huyết thanh có dạng ñóng cục tự nhiên sẽ kích thích sự tăng sinh của tế bào nhiều hơn là những huyết thanh ở dạng khác. ðiều này xảy ra là do có sự phóng thích ra một loại polypeptide từ tiểu cầu trong quá trình trong quá trình ñóng cục của huyết thannh. Polypeptide này ñược gọi là yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu. ðây là một nhóm các polypeptide gây ra hoạt ñộng phân chia tế bào và có lẽ là yếu tố tăng trưởng chính trong huyết thanh. Những yếu tố khác như yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi (fibroplast growth factor FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì tế bào (epidermal growth factor EGF), yếu tố tăng trưởng nội bì và hoạt ñộng kích thích sự nhân dòng (Multiplication-Stimulating Activity MSA) ñược cô lập từ mô hoặc tế bào phóng thích ra môi trường trong quá trình nuôi cấy với các mức ñộ chuyên biệt khác nhau và có lẽ chúng có mặt với một lượng nhỏ trong huyết thanh. Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường khó có thể nhận ra ñược những tác ñộng chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose và Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 14 amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó ñã ảnh hưởng ñến thuộc tính này. Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, ñặc biệt là huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng lên sự phân bào. Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lượng thay ñổi, kích thích sự bám dính của tế bào; nhưng trong những ñiều kiện nhất ñịnh (khi có mật ñộ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cám ứng biệt hóa tế bào. Các thí nghiệm giàm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cấy cho thấy các hormone cần thiết cho việc nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết. Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có amino acid, glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian. Những chất này quan trọng trong môi trường ñơn giản nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp, ñặc biệt là những môi trường có các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng ñộ cao. Khoáng chất: các nguyên tố dạng vết như sắt, ñồng, kẽm có thể ñược cung cấp bởi huyết thanh và chúng liên kết với các protein của huyết thanh. Các yếu tố kìm hãm: huyết thanh có thể có chứa các cơ chất có tác dụng kìm hãm sự tăng sinh của tế bào. Một số chất có thể ñược tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trường như ñộc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân ñoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trợ ngại cho việc nuôi cấy. Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính ñộc của immunoglobulin mà không gây hại ñến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có thể phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống trước khi xử lý. 4.1.2.3 Ảnh hưởng cuả oxygen, carbon dioxide dạng khí và nhiệt ñộ trong quá trình nuôi cấy. a. Oxygen Tùy theo mục ñích sử dụng mà nhu cầu O2 của mẫu cấy thay ñổi: ñó là sự khác nhau giữa cơ quan và môi trường nuôi cấy. Trong khi O2 không khí hoặc một lượng O2 thấp hơn nồng ñộ O2 không khí phù hợp hơn với hầu hết các tế bào nuôi cấy thì có vài loại cơ quan, ví dụ như phôi của các giai ñoạn sau (phôi mới hình thành hoặc phôi trưởng thành) lại cần ñến 95% O2 ở dạng khí. Hầu hết các tế bào tách rời nhau cần lượng O2 thấp hơn và sẽ tăng trưởng tốt hơn khi lượng O2 thấp hơn O2 không khí. Sự có mặt selenium làm giảm bớt lượng O2 hòa tan trong môi trường. Vai trò của O2 hòa tan ngày càng giữ vai trò quan trong và phải cung cấp O2 trong suốt giai ñoạn nuôi mẫu. ðộ sâu của môi trường có thể ảnh hưởng ñến sự khuếch tán của O2 vào ñến mẫu nuôi cấy, vì vậy người ta khuyên rằng nên ñổ môi trường vào bình nuôi cấy dày khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong bình nuôi cấy. b. Carbon Dioxide (CO2) CO2 có vai trò phức tạp hơn O2 vì có sự tương quan giữa mọi hoạt ñộng của nó, ví dụ CO2 hòa tan, pH và nồng ñộ . Khó có thể xác ñịnh ñược tác dụng chính của nó. Áp lực Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 15 của CO2 không khí sẽ ñiều hòa trực tiếp nồng ñộ CO2 hòa tan trong môi trường tương tự như vai trò của nhiệt ñộ. Sự hòa tan CO2 trong nước sẽ tạo ra acid: (1) có ñộ hòa tan thấp và không kết hợp với các cation hiện diện trong môi trường. Nó có khuynh hướng tái hợp ñể tạo ra acid. Kết quả cuối cùng của sự tăng CO2 không khí là sự giảm pH môi trường. Ảnh hưởng này có thể giải quyết bằng cách tăng nồng ñộ bicarbonate trong môi trường nuôi cấy: (2) Sự tăng nồng ñộ bicarbonate sẽ ñẩy phương trình (1) lệch sang trái và sự cân bằng chỉ ñạt ñược khi pH = 4. Nếu sử dụng một chất kiềm khác như NaOH thay cho NaHCO3 thì kết quả cuối cùng cũng tương tự: (3) Mỗi môi trường ñòi hỏi một nồng ñộ và áp lực CO2 ñể ñạt ñược pH và áp suất thẩm thấu chính xác. Tuy nhiên, vẫn có những thay ñổi tối thiểu xảy ra trong các phương pháp chuẩn bị môi trường khác nhau. Tóm lại, khi tế bào ñược nuôi cấy với mật ñộ trong bình có nắp cho phép không khí lưu thông thì cẩn phải ñược nuôi trong ñiều kiện có CO2 không khí, nồng ñộ của CO2 phải cân bằng với nồng ñộ bicarbonate sodium trong môi trường. Khi mật ñộ tế bào nuôi cấy thấp (trong quá trình nhân dòng) thì cần phải ñưa CO2 dạng khí quá nắp bình trong hầu hết các thí nghiệm. Khi mật ñộ tế bào cao thì thao tác này không cần thiết nhưng cần phải nuôi tế bào trong các dĩa ñể mở dễ trao ñổi khí. Trong trường hợp tế bào tạo ra nhiều acid và CO2 nội sinh thì cần phải nới lỏng nắp bình ñể CO2 thoát ra ngoài. Trong những trường hợp này cần phải bổ sung dung dịch ñệm HEPES (20mM) vào môi trường ñể ổn ñịnh pH. c. Nhiệt ñộ nuôi cấy Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp của tế bào phụ thuộc vào: Thân nhiệt của loài ñộng vật cần thu tế bào ñể nuôi cấy. Tế bào ñó thuộc vùng nhiệt ñộ nào trên cơ thể (ví dụ nhiệt ñộ ở da thấp hơn nhiệt ñộ bên trong cơ thể) Có sự kết hợp của một yếu tố an toàn cho phép những sai sót tối thiểu có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy. Nhu vậy nhiệt ñộ cần thiết ñể nuôi cấy hầu hết tế bào người và ñộng vật máu nóng là 36,5oC, gần với thân nhiệt, nhưng ñể an toàn nên nuôi cấy nhiệt ñộ thấp hơn một chút ít. ðối với các loài chim, vì thân nhiệt của chúng cao nên tế bào của chúng tăng trưởng tốt nhất ở nhiệt ñộ 38,5oC nhưng chúng vẫn có thể tăng trưởng ở nhiệt ñộ 36,5oC. Ở nhiệt ñộ này, sự tăng trưởng của tế bào chậm hơn. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào ñộng vật có thể chịu ñược sự giảm nhiệt ñộ, chúng có thể sống vài ngày ở nhiệt ñộ 4oC và có thể chịu ñược sự ñông lạnh ở –196oC, nhưng chúng không thể chịu ñược nhiệt ñộ tăng cao hơn mức bình thường khoảng 2oC (chúng chỉ có thể chịu ñựng ñược nhiệt ñộ 39,5oC trong vài giờ) và sẽ chết rất nhanh khi nhiệt ñộ tăng lên 40oC hoặc trên nữa. Tế bào biểu bì của ñộng vật ñẳng nhiệt có thể tăng trưởng tốt hơn ở 33oC. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 16 ðối với ñộng vật không xương sống, phạm vi nhiệt ñộ có lẽ hẹp hơn. ðối với những ñộng vật có thân nhiệt thay ñổi, tế bào của chúng có thể chịu ñược một biên ñộ cao nhưng tốt hơn nên nuôi chúng ở một nhiệt ñộ trung bình trong biên ñộ nhiệt ñó. Nhiệt ñộ nuôi nên ñược giữ ổn ñịnh, sự chênh lệch nhiệt ñộ có thể xảy ra tối ña là ± 0,5oC. Tế bào có thể tăng trưởng hoàn toàn bình thường ở trong khoảng nhiệt ñộ 33 ÷ 39oC nhưng tốc ñộ tăng trưởng và khả năng biến dưỡng trong tế bào sẽ thay ñổi tùy theo nhiệt ñộ. Bình nuôi cấy ñược giữ trong tủ ấm, phải ñảm bảo nhiệt ñộ ñều và ổn ñịnh ở mọi nơi trong tủ ấm. Bể ñiều nhiệt cũng có thể ñược sử dụng ñể giữ mẫu nhưng mẫu cũng sẽ dễ bị nhiễm hơn là khi ñược nuôi trong tủ ấm vì bình thường nuôi cấy phải giữa ngập trong nước. Do ñó bể ñiều nhiệt ít ñược sử dụng. Phải sử dụng tủ ấm có không khí ñối lưu cho mục ñích này. 4.1.3 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Thiết bị Khử trùng Cách bố trí Rửa các dụng cụ thủy tinh An toàn phòng thí nghiệm 4.2 Các bước thực hiện nuôi cấy tế bào ñộng vật 4.2.1 Chuẩn bị tế bào ðể có thể nuôi cấy tế bào cô lập, việc trước tiên là phải tách tế bào ra khỏi mô. Tế bào ñược tách ra khỏi mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp enzyme và trở thành huyền phù tế bào. Các tế bào sau ñó sẽ bám vào bề mặt cơ chất ñể sống và tăng sinh. Enzyme thường ñược sử dụng ñể tách tế bào là trypsin, collagenase, elastase, hyaluronidase, Dnase,pronase, dispase hoặc là hỗn hợp các enzyme. Trypsin và pronase có thể tách rời tế bào hoàn toàn nhưng có thể gây tổn thương cho tế bào. Collagenase và dispase không tách tế bào ñược hoàn toàn nhưng không gây tổn thương ñến tế bào. Hyaluronidase có thể ñược sử dụng phối hợp với collagenase và Dnase ñể phân tán DNA và phóng thích từ những tế bào bị vỡ vì nó có khuynh hướng kích thích tế bào kết cụm lại với nhau và làm suy yếu quá trình phân giải protein. Mặc dù mỗi loại mô có thể có những ñòi hỏi ñiều kiện nuôi cấy khác nhau nhưng những yêu cầu thông thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy sơ khởi thường giống nhau: • Chất béo và mô bị hoại tử thường bị bỏ ñi trong quá trình giải phẫu mô. • Mô nên ñược cắt ra trong tình trạng ít bị tổn hại nhất. • Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào nên ñược loải bỏ bằng cách ly tâm sau khi ñã tách xong tế bào. • Mật ñộ tế bào trong môi trường nuôi cấy ñầu tiên thường cao hơn nhiều so với những lần cấy chuyền kế tiếp, bởi vì khả năng phân chia của tế bào vừa mới tách khỏi mô rất thấp trong môi trường nuôi cấy sơ khởi. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 17 • Môi trường giàu chất dinh dưỡng như F10, F12 của Ham thường ñược sử dụng hơn là môi trường cơ bản như môi trường EME của Eagle, và nếu tế bào có nhu cầu về huyết thanh thì huyết thanh phôi bò cần cho sự sống của tế bào hơn là huyết thanh ngựa. • Các cụm tế bào phôi cô lập thường dễ tạo ra nhiều tế bào sống và tăng sinh nhanh chóng trong môi trường khởi ñầu hơn là tế bào trưởng thành. 4.2.2 Cấy chuyền lớp mỏng các dòng tế bào tăng trưởng liên tục Tùy vào từng loại tế bào mà phải xây dựng môi trường cấy chuyền phù hợp. Kết quả chỉ ñạt ñược bằng thực nghiệm. 4.2.3 ðếm số tế bào có sử dụng thuốc nhuộm – Phương pháp sử dụng buồng ñếm Việc ñếm số tế bào ñược thực hiện trong một thể tích nhỏ huyền phù tế bào dưới kính hiển vi. Buồng ñếm là một lame kính ñể quan sát dưới kính hiển vi, ñược chia thành 9 ô vuông lớn cách nhau bằng 3 ñường gạch. Mỗi ô vuông lớn có diện tích 1mm2. ðộ sâu của lame kính ở vị trí chia ô là 0,1mm; như vậy tổng số thể tích của chất lỏng trong mỗi ô vuông lớn là . Tế bào có thể ñược ñếm bằng máy ñếm tế bào ñiện tử. Dung dịch: tryptophan xanh 0,4% trong HBSS: trữ ở 4oC. Các bước tiến hành:
ðậy lên trên buồng ñếm bằng một kính ñậy mẫu và ấn nhẹ ñến khi có thể thấy rõ ñược vòng Newton. Cho một giọt huyền phù tế bào (thường pha loãng với tỉ lệ 1:5 có nghĩa là cho 0,2ml tế bào vào cùng với 0,3ml HBSS và 0,5ml trypan xanh 0,4%) ở cạnh (bìa) của kính ñậy mẫu.
ðặt buồng ñếm vào bàn ñể mẫu của kính hiển vi soi ngược và ñếm tất cả các tế bào bị nhuộm màu xanh trong bốn ô vuông lớn ở mỗi góc của vùng trung tâm (S1 ñến S4) và cả ô vuông trung tâm S5. ðếm các tế bào nằm ở cạnh bên phải và cạnh trên nhưng không ñếm tế bào ở cạnh trái và cạnh dưới. Các tế bào chết bắt màu và có màu xanh. Hệ thống nuôi cấy tốt là hệ thống nuôi cấy có hơn 90% tế bào sống. 4.2.4 Cấy chuyền các dòng tế bào liên tục trong dịch huyền phù tế bào Các tế bào tăng trưởng liên tục trong môi trường nuôi cấy ñược cấy chuyền bằng cách pha loãng. Lấy ví dụ ñối với tế bào bạch cầu Molt-4 của người, ñó là một dòng tế bào tăng trưởng liên tục có thể nhân giống vô hạn ñịnh trong dịch huyền phù. Dung dịch nuôi cấy: giống dung dịch dùng cho cấy chuyền lớp mỏng. Các bước tiến hành
Lấy bình nuôi cấy mô có chứa tế bào Molt-4 ra khỏi tủ ấm CO2 37 o, ñộ ẩm 5%. ðóng nắp và lắc nhẹ. ðốt nắp bình nuôi cấy trước khi mở và lấy một phần nhỏ huyền phù tế Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 18 bào cho vào một ống hình nón bằng nhựa. Pha loãng nếu cần thiết và ñếm bằng buồng ñếm.
Lấy một phần nhỏ huyền phù tế bào và pha loãng với môi trường DMEM hoàn chỉnh ñể ñạt ñến mật ñộ tế bào thích hợp ( ). Mở lỏng nắp ra và ñặt bình thẳng ñứng trong tủ ấm CO2. Quan sát thường xuyên, lắc nhẹ và thêm môi trường cần thiết. 4.2.5 Bảo quản và lưu trữ tế bào sống Vì không thể duy trì ñược các dòng tế bào trong quá trình nuôi cấy vô hạn ñịnh và vì chúng có thể thay ñổi các ñặc tính trong suốt quá trình nuôi cấy, do ñó cần phải lưu trữ tế bào ñang ở các giai ñoạn tăng trưởng khác nhau ñể sử dụng trong tương lai. Phương pháp bảo quản ở nhiệt ñộ thấp rất ñơn giản và không ñòi hỏi các thiết bị mắc tiền. Gồm các bước chính như sau: • Bảo quản ở nhiệt ñộ thấp. • ðưa mẫu ra khỏi ñiều kiện tồn trữ. • Gửi và nhận tế bào nuôi cấy. 5. Tách tế bào bằng phương pháp sữ dụng máy ly tâm 5.1 Giới thiệu Sự phân tách tế bào nhờ máy ly tâm là phương pháp mà các quần thể tế bào khác nhau nằm lẫn với nhau sẽ ñược chia thành hai nhóm ñối lập ñể dễ dàng tách chúng ra thành những quần thể nhỏ hơn dựa vào kích thước của tế bào. Phương pháp này ñã ñược sử dụng thành công ñể tách nhiều loại tế bào khác nhau từ huyền phù tế bào và các hệ thống nuôi cấy phụ thuộc vào cơ chất, hoặc ñể phóng thích trực tiếp các quần thể tế bào cố ñịnh trong các mô hoặc trong các dịch cơ thể. Phương pháp ly tâm ñược chứng minh là có hiệu quả ñể tách tế bào dựa vào những khác biệt rất nhỏ về kích thước tế bào và số lượng tế bào mà không thể thực hiện bằng các phương pháp khác. Hơn nữa, phương pháp tách tế bào nhờ ly tâm có thể thực hiện nhanh chóng, chỉ cần ít thời gian (20 – 120 phút) ñể có ñược kết quả, và quá trình này xảy ra trong môi trường bổ sung các chất ñặc biệt ñể ảnh hưởng ñến áp suất thẩm thấu hoặc ñộ nhớt của môi trường. Vì vậy, nếu như có một sự thay ñổi rất nhỏ làm ảnh hưởng ñến sinh lý của tế bào thì sự tách tế bào này có thể ảnh hưởng rất nhanh chóng. Trong hầu hết các trường hợp, có một vài ảnh hưởng tác ñộng lên tế bào trong suốt quá trình phân chia nhưng những tác ñộng này không ảnh hưởng ñến sự sống cũng như những phản ứng của tế bào. So sánh với các phương pháp tách tế bào khác nhu: phân loại tế bào nhờ sự phát huỳnh quang hoặc tác tế bào nhờ vào trọng lượng của tế bào thì phương pháp ly tâm là phương pháp ñơn giản và nhanh nhất. Phương pháp ly tâm có thể khắc phục một số hạn chế như số lượng tế bào trong quần thể cần tách mà yếu tố này có thể có ảnh hưởng rất lớn ñến phương pháp tách tế bào nhờ sự phát huỳnh quang, hoặc yếu tố thời gian trong phương pháp tách tế bào nhờ sự kết tủa theo trọng lượng tế bào cũng như các vấn ñề có liên quan ñến stress thẩm thấu trong môi trường ly tâm. 5.2 Sự phát triển phương pháp tách tế bào nhờ máy ly tâm Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 19 Phương pháp tách tế bào nhờ ly tâm ñược phát triển bởi Lindahl (1948) ñể tách các tế bào và các phân ñoạn của tế bào (Lindahl và Nyberg, 1955; Lindahl, 1986) dựa vào sử khởi ñầu của Lindbergh vào năm 1932. Phương pháp ly tâm ngược dòng ñược các nhà nghiên cứu sử dụng ñể tách các dạng tế bào khác nhau, nhưng nói chung, những phương pháp này khó thực hiện cho ñến khi Beckman Instrument giới thiệu một thiết bị phân tách tế bào bằng cách ly tâm vào năm 1973. Khi thiết bị này ñượ