Đề tài Thực hành công nghệ hóa sinh

Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. PAGE  PAGE 1 SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. Bài 1: Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh. I.Tiến hành thí nghiệm. Mẫu phân tích: Kháng sinh chuẩn : 10 µl Mẫu HT28: 50 µl 2 mẫu : 10µ/ 1 mẫu II. Kết quả thí nghiệm. Sau thực hiện các bước thí nghiệm ta thu được các kết quả như sau; Quãng đường di chuyển của dung môi: 13cm Quãng đường di chuyển của mẫu; Mẫu 1: 10 cm Mẫu 2: 8 cm Mẫu 3: 11,5 cm III. Tính toán kết quả. Hệ số di chuyển Rf = a/b Trong đó: a là quẫng đường di chuyển của mẫu. b là quãng đường di chuyển của dung môi. Ta có: Hệ số di chuyển của mẫu 1: Rf = 10/13 = 0,77 Hệ số di chuyển của mẫu 2 : Rf = 8/13 = 0,62 Hệ số di chuyển của mẫu 3: Rf = 11,5/13 = 0,88 IV. Nhận xét: Kết quả thí nghiệm có 1 bản sắc ký với kết quả không tốt vì: * Lượng mẫu ít. * Hệ dung môi chưa phải là hệ dung môi thích hợp. * Mẫu hiện vết không rõ ràng do mẫu kháng sinh lẫn tá dược. V. Định lượng đánh giá kháng sinh. Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh là kỹ thuật chỉ thực hiện trong nghiên cứu, không áp dụng nhiều trong công nghiệp. Bản sắc ký sau khi kết thúc thí nghiệm ta sẽ tiếp tục sử dụng để: + Khoang vùng và cạo lấy phần kháng sinh ta quan tâm. + Thử hoạt tính kháng khuẩn. + Kết tinh, tinh sạch thu sản phẩm. + Xác đinh cấu trúc và 1 số hệ số lý hóa. Bài 2: Tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel. I. Nguyên tắc. Dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thước khác nhau trong hệ thống phân tử gel sắc ký hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau đi qua cột gel dưới tác dụng của lực kéo pha động. Các phân tử có kích thước lớn sẽ chui ra trước, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui ra sau. Thu sản phẩm theo phương pháp phân đoạn. Khi chuẩn bị cột sắc ký cần cân bằng cột để cho cấu trúc hạt gel ổn định, kích thước lỗ đồng đều. II. Kết quả thí nghiệm & nhận xét. Thu được 18 phân đoạn. Sau khi kết thúc thí nghiệm ta thu được 18 phân đoạn chứa trong các ống nhỏ có bịt giấy bóng kín miệng và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Bài 3: Xác định hoạt độ Enzyme Amilase theo phương pháp phân tích lượng đường khử tạo thành. I. Nguyên tắc. Xác đinh hoạt độ thông qua phân tích sản phẩm đường khử tạo thành bằng phương pháp xác định hoạt độ amilase nhờ DNS. Đơn vị của hoạt độ là lượng enzyme làm thủy phân tinh bột thành sản phẩm tương đương 1µmol glucose ở điều kiện thí nghiệm trong 1 phút. II. Kết quả. Sau khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 575nm trên máy quang phổ ta thu được kết quả ở bảng sau. STTống kiểm tra (giá trị OD)Hàm lượng đường ống kiểm tra(b)Ống thí nghiệm (OD)Hàm lượng đường ống thí nghiệm(a)Đơn vị hoạt dộHoạt độ riêng1- 0.179- 1.6776010.1931.808810.4648542- 0.172- 1.6119960.1841.7244610.44486030.0830.7966260.1801.6869730.11871240.1880.7619490.2091.9588760.15957550.1581.4807870.2532.3711340.11871260.2862.68041270.2562.3992580.2522.36176290.2051.921275100.0040.0374880.1971.8462980.241174110.0483.8238050.1351.26523-0.34114312- 0.016- 0.149950.2242.0993440.299905130.0740.6935330.2852.671040.263667140.0670.6279290.4784.479850.31358915- 0.021- 0.196810.1881.7619490.261167160.1751.6401120.2402.2492970.081224170.1881.7619490.1611.508903-0.033739180.0740.6935330.2011.8837860.1587004190.0830.7778820.4484.1986880.456107 Phương trình đồ thị chuẩn y = 0.1067x (1) Với y là giá trị của OD x là hàm lượng đường µmol/ml Từ (1) suy ra x = y/ 0.1067 (2) Ta có công thức đơn vị hoạt độ ((a-b).c)/ (0.25.t) (3) Trong đó: a số µmol đường trong ống thí nghiệm b số µmol đường ở ống kiểm tra c độ pha loãng dung dịch (1) t thời gian phản ứng (30 phút). Dựa vào phương trình (2) ta tính được hàm lượng đường ở ống kiểm tra (a,b) dựa vào phương trình (3) ta tính được hoạt độ của từng phân đoạn. Vậy qua bảng kết quả ta tính được đơn vị hoạt độ của phân đoạn 14 là cao nhất . Ở phân đoạn 14 có đơn vị hoạt độ là cao nhất có nghĩa là lượng enzyme làm thủy phân tinh bột thành sản phẩm tương đương 1 µmol glucose điều kiện thí nghiệm là 1 phút là cao nhất so với các phân đoạn khác. Bài 4. Định lượng protein tan theo phương pháp lowry. I. Nguyên lý. Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden-photphovonphramat. Để xác định hàm lượng của protein..phức chất màu xanh da trời có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 750nm. II. Kết quả thí nghiệm & nhận xét. a, Phương trình đồ thị chuẩn: y = 0.001x (1) Trong đó y là giá trị OD x là hàm lượng protein (mg/ml) b, Thí nghiệm: Sau khi cho thuốc thử Foling, các ống nghiệm xuất hiện màu xanh da trời đậm nhạt khác nhau. Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng – protein khử hỗn hợp photphomolipden-photphovonphramat để xác định hàm lượng protein. Hỗn hợp có màu xanh là do: + Phức chất màu xanh là phức chất của đồng-protein thuốc thử Foling. + Thuốc thử Foling tác dụng với gốc Tỷ, Try..trong phân tử protein tạo phức chất màu xanh. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường có chứa muối amon, phenol, các ion kim loại…sau khi đo OD ở bước sóng 750nm ta thu được kết quả: STTODSTTOD10.018100.3992-0.005110.41830.045120.47340.096130.52350.190140.54860.173150.54170.170160.50680.245170.42090.260180.239Và ống kiểm tra (dịch enzyme thô) 0.571 có giá trị cao nhất vì là dịch có hoạt tính enzyme cao hơn các mẫu khác. Từ phương trình (1) ta có x = y/ 0.001(mg/ml) hàm lượng protein. STT10399118114182-5124733461352349614548519015541617316506717017420825418239926019571Như vậy ta thấy ống thu ở phân đoạn thứu 14 cho hàm lượng protein cao nhất so với các mẫu ở các phân đoạn khác. Ống 19 là dịch enzyme thô cho hàm lượng protein cao nhất. STTOD (750nm)Hàm lượng proteinHoạt độ riêng10.0181825.825>1 loại2-0.005-5-88.9721 loại40.096961.662>1 loại50.1901900.624860.17317370.17017080.24524590.260260100.3993990.604110.418418-0.816<0 loại120.4734730.634130.5235230.504140.5485480.937150.5415410.482160.5065060.1605170.420420-0.080<0 loại180.2392390.661957120Kết luận: Đánh giá độ sạch thu được ở các phân đoạn bằng cách: Đánh giá qua hoạt độ riêng Kiểm tra đánh giá bằng phương pháp điện di tren gel Hoạt độ riêng = ( số đơn vị hoạt độ enzyme)/ ( đơn vị khối lượng protein)