Định vị các gen kháng rầy nâu BPH4 và BPH6 trên nhiễm sắc thể lúa

ĐỊNH VỊ CÁC GEN KHÁNG RẦY NÂU BPH4 VÀ BPH6 TRÊN NHIỄM SẮC THỂ LÚA Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang Viện Di truyền Nông nghiệp, Từ Liêm, Hà Nội Thiều Văn Đường Trường Cao đẳng Sư phạm Cần Thơ, Cần Thơ MỞ ĐẦU Rầy nâu là côn trùng gây hại lớn nhất đối với cây lúa ở nước ta cũng như các nước trồng lúa khác. Sử dụng giống lúa kháng rầy là biện pháp quan trọng được các nhà chọn giống quan tâm. Việc sử dụng giống kháng một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết kiệm chi phí phòng trừ, mặt khác hạn chế được việc dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường và góp phần ổn định môi trường sinh thái. Do vậy việc chọn tạo nhanh chóng những giống lúa vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, lại mang nhiều gen kháng là công việc được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia khác. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. Như vậy việc tìm các chỉ thị phân tử liên kết gần với gen quan tâm và lập bản đồ các gen đó trên nhiễm sắc thể mang ý nghĩa lý thuyết và thực tiễn sâu sắc. Đối với đặc tính kháng rầy, đến nay người ta đã tìm được khoảng trên 10 gen kháng chính (major genes) và một số gen kháng phụ khác (minor genes hay QTLs) dựa vào sự khảo sát phản ứng của các giống lúa đối với các biotype rầy nâu cũng như các thí nghiệm phân tích di truyền và lập bản đồ phân tử (Sidhu and Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii et al., 1994; Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv, 2001). Trong công trình trước (Thiều Văn Đường và ctv, 2000) đã xác định các gen kháng rầy nâu bph4 ở dòng lúa DG5 và Bph6 ở dòng lúa GC9 kháng khá hiệu quả đối với quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Cho đến nay vẫn chưa có công trình nào xác định xem gen Bph6 nằm trên nhiễm sắc thể nào. Còn việc định vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể thì lại không có sự thống nhất giữa các nhà khoa học: gen bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 qua phân tích di truyền (Sidhu and Khush, 1978), hoặc trên nhiễm sắc thể số 6 dựa theo phương pháp chỉ thị phân tử (Kawaguchi et al, 2001). Công trình này được đặt ra với mục đích định vị các gen bph4 và Bph6 trên nhiễm sắc thể của lúa, sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử vi vệ tinh (SSR). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu - DG5: dòng lúa kháng rầy nâu mang gen kháng bph4; GC9: dòng lúa kháng rầy nâu mang gen kháng Bph6; TN1: giống lúa nhiễm rầy nâu. - Quần thể F2 và F3 từ 2 tổ hợp lai TN1xDG5 và TN1xGC9. - Mồi SSR đặt từ hãng Genset của Mỹ. - Hoá chất nhuộm bạc của hãng Promega. - Các vật liệu hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu được mua từ các hãng Sigma, Biorad (Mỹ), Pharmacia (Thụy điển), Boehringer (Đức). Phương pháp - ADN của TN1, DG5, GC9 và các cá thể F2 được tách và tinh sạch theo phương pháp CTAB (Phòng Thí nghiệm Di truyền học, Trường ĐHTH Ghent, Bỉ). - Kiểu gen kháng nhiễm rầy nâu của các cá thể F2 (kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp) được xác định dựa theo kết quả thử rầy trên các họ F3. - Phân tích thể phân ly nhóm theo Michelmore và ctv (1991). - Kỹ thuật SSR được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Khoa học Thực vật và Thổ nhưỡng, Trường ĐHTH Texas Tech, Hoa Kỳ. - Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel polyacrylamide 4,5%. Phát hiện băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc. - Các dữ liệu kiểu gen kháng nhiễm rầy được kết hợp với dữ liệu SSR để phân tích nhóm liên kết và lập bản đồ phân tử theo chương trình MapMaker. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân tích thể phân ly nhóm a/ Quần thể TN1xDG5 Từ thí nghiệm sử dụng 108 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 6 dòng, giống lúa trong công trình trước (Thiều Văn Đường và ctv, 2001), chúng tôi chọn ra được 50 chỉ thị SSR (bảng 1) được xác định là cho đa hình SSR giữa TN1 và DG5 để sử dụng trong thí nghiệm xác định nhóm liên kết của gen bph4. Phương pháp phân tích thể phân ly nhóm (BSA) kết hợp với phương pháp phân tích SSR được áp dụng. Từ thí nghiệm đánh giá tính kháng rầy ở các họ F3, chúng tôi suy ra các kiểu gen kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp đối với từng cá thể F2. Từ đó chọn ra 20 cây kháng đồng hợp và 20 cây nhiễm đồng hợp. Tiếp theo, 40 cây này (gồm 20 cây nhiễm hoàn toàn và 20 cây kháng hoàn toàn) được sử dụng để lập thành hai nhóm kháng hoàn toàn R1, R2 và hai nhóm nhiễm hoàn toàn S1, S2. Sau đó, ADN của TN1, DG5 và 4 nhóm này đã được làm phản ứng PCR với 50 cặp mồi SSR, chạy gel polyacrylamide và nhuộm bạc. Kết quả phân tích thể phân ly nhóm với 50 cặp mồi SSR cho thấy chỉ có 1 số chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể số 4 như RM335, RM261, RM185, RM273... dường như có liên kết với lôcut gen bph4 (2 nhóm kháng có băng ADN gần tương tự như DG5, còn 2 nhóm nhiễm có băng ADN gần tương tự như TN1). Còn tất cả các chỉ thị còn lại trên các nhiễm sắc thể khác đều không liên kết với lôcut gen bph4 do tất cả 4 nhóm kháng nhiễm đều cho 2 băng (dị hợp tử) - 1 băng đặc thù cho cây bố, còn băng kia đặc thù cho cây mẹ. b/ Quần thể TN1xGC9 Tương tự như đối với quần thể TN1xDG5, trong trường hợp quần thể TN1xGC9 chúng tôi chọn ra 51 chỉ thị SSR (bảng 2) được xác định là cho đa hình SSR giữa TN1 và GC9 để sử dụng trong thí nghiệm xác định nhóm liên kết của gen Bph6. Phương pháp phân tích thể phân ly nhóm kết hợp với phương pháp phân tích SSR được áp dụng. Cũng giống như thí nghiệm trên, chúng tôi chọn ra 20 cây kháng đồng hợp và 20 cây nhiễm đồng hợp. Tiếp theo 40 cây này (gồm 20 cây nhiễm hoàn toàn và 20 cây kháng hoàn toàn) được sử dụng để lập thành hai nhóm kháng hoàn toàn R1, R2 và hai nhóm nhiễm hoàn toàn S1, S2. Sau đó, ADN của TN1, DC9 và 4 nhóm này đã được làm phản ứng PCR với 51 cặp mồi SSR (bảng 2), chạy gel polyacrylamide và nhuộm bạc. Kết quả phân tích thể phân ly nhóm với 51 cặp mồi SSR cho thấy chỉ có 1 số chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể số 4 như RM185, RM119, RM317... dường như có liên kết với lôcut gen Bph6 (2 nhóm kháng có băng ADN gần tương tự như GC9, còn 2 nhóm nhiễm có băng ADN gần tương tự như TN1). Còn tất cả các chỉ thị còn lại trên các nhiễm sắc thể khác đều không liên kết với lôcut gen Bph6 do tất cả 4 nhóm kháng nhiễm đều cho 2 băng (dị hợp tử). 2. Phân tích SSR với các cá thể F2 a/ Quần thể TN1xDG5 Tiếp theo, chúng tôi làm thí nghiệm phân tích SSR cho 108 cá thể F2, sử dụng các cặp mồi PCR là các chỉ thị RM335, RM261, RM185, RM119 trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa. Kết quả cho thấy đa số các cá thể kháng có băng ADN tương tự như băng ADN có ở cây DG5, và đa số các cá thể nhiễm có băng ADN tương tự như băng ADN ở cây TN1, còn các cây dị hợp cho 2 băng ADN giống như ở DG5 và TN1 (hình 1). b/ Quần thể TN1xGC9 Tương tự như trên, các phân tích SSR cho 110 cá thể F2 đã được tiến hành, sử dụng các cặp mồi PCR là các chỉ thị RM185, RM119, RM317, RM349 trên nhiễm sắc thể số 4. Kết quả cho thấy đa số các cá thể kháng có băng ADN giống như băng ADN có mặt ở cây GC9, và đa số các cá thể nhiễm có băng ADN giống như băng ADN có ở cây TN1, còn các cây dị hợp cho 2 băng ADN giống như ở GC9 và TN1 (hình 2). 3. Định vị các gen kháng rầy nâu bph4 và Bph6 trên nhiễm sắc thể lúa a/ Định vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể lúa Các dữ liệu kiểu gen theo các chỉ thị RM335, RM261, RM185 và RM119 được phối hợp với dữ liệu kiểu gen kháng nhiễm (kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp) ở 108 cá thể F2 của tổ hợp lai TN1xDG5 rồi được đưa vào chương trình MapMaker trên máy tính để phân tích. Với LOD = 3 và Max. distance = 50, các chỉ thị RM335, RM261, RM185 và RM119 đều liên kết với lôcut bph4. Như vậy nhóm liên kết của gen kháng rầy nâu bph4 bao gồm 4 chỉ thị SSR: RM335, RM261, RM185 và RM119 với tổng chiều dài là 87,1 cM trên nhiễm sắc thể số 4. Lôcut bph4 nằm giữa 2 chỉ thị RM335 và RM261 (gần với RM261 hơn). Vị trí lôcut gen bph4 cách chỉ thị RM335 là 32 cM, và cách chỉ thị RM261 là 11,1 cM. (Chú ý: chỉ thị RM335 nằm không xa đầu mút trên của NST số 4). Từ các kết quả trên chúng tôi xác định được vị trí của gen kháng rầy nâu bph4 trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa (xem hình 3). b/ Định vị gen Bph6 trên nhiễm sắc thể lúa Các dữ liệu của 110 cá thể F2 của tổ hợp lai TN1xGC9, bao gồm kiểu gen theo các chỉ thị RM185, RM119, RM317 và RM349 được phối hợp với kiểu gen kháng nhiễm (kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp) rồi đưa vào chương trình MapMaker trên máy tính để phân tích. Với LOD = 3 và Max. distance = 50, các chỉ thị RM185, RM119, RM317 và RM349 đều liên kết với lôcut Bph6. Như vậy nhóm liên kết của gen kháng rầy nâu Bph6 bao gồm 4 chỉ thị SSR (RM185, RM119, RM317, RM349) với tổng chiều dài là 125,2 cM trên nhiễm sắc thể số 4. Lôcut Bph6 nằm giữa 2 chỉ thị RM119 và RM317. Vị trí lôcut gen Bph6 cách chỉ thị RM119 là 24,4 cM, và cách chỉ thị RM 317 là 21,1 cM. (Chú ý: chỉ thị RM119 nằm không xa tâm động của NST số 4). Từ các kết quả trên chúng tôi xác định được vị trí của gen kháng rầy nâu Bph6 trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa (xem hình 4). KẾT LUẬN Như vậy, theo kết quả nêu trên, cả 2 gen kháng rầy nâu bph4 và Bph6 đều được định vị trên nhiễm sắc thể số 4. Trong trường hợp gen bph4, kết quả này phù hợp với kết luận của Sidhu và Khush (1978), nhưng mâu thuẫn với kết luận của Kawaguchi và cộng sự (2001) vốn cho rằng bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 6. Còn đối với gen Bph6, công trình này là công trình đầu tiên định vị nhiễm sắc thể cho gen này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ikeda R. (1985). Studies on the inheritance of resistance to the rice brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) and the breeding of resistant rice cultivars. Bull. Natl. Agric. Res. Cent. 3, pp. 1-54. 2. Ishii T., Brar D.S., Multani D.S. and Khush G.S. (1994). Molecular tagging of genes for brown planthopper resistance and earliness introgressed from Oryza australiensis into cultivated rice O. sativa. Genome 37, pp 217-221. 3. Kawaguchi M., Murata K., Ishii T., Takumi S., Mori N. and Nakamura C. (2001). Assignment of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance gene bph4 to the rice chromosome 6. Breed. Sci. 51, pp. 13-18. 4. Lưu Thị Ngọc Huyền, Lưu Minh Cúc, Nguyễn Thị Tân Phương, Trần Duy Quý và Vũ Đức Quang (2001). Lập bản đồ phân tử gen kháng rầy nâu ở giống lúa CR203, sử dụng chỉ thị phân tử vi vệ tinh. Thông tin Công nghệ Sinh học Ứng dụng, số 4, tr. 29-33. 5. Michelmore R.W., Pran I. and Kesseli V. (1991). Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis. A rapid method to detect markers in spesific genomic regions by using segregeting populations, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 88, pp. 9828- 9832. 6. Sidhu G.S. and Khush G.S. (1978). Genetic analysis of brown planthopper resistance in twenty varieties of rice, Oryza sativa L. Theor. Appl. Genet., 53, pp. 199-203. 7. Thiều Văn Đường, Lưu Thị Ngọc Huyền, Phạm Thị Mùi, Vũ Thị Chại và Vũ Đức Quang (2000). Khảo sát tính kháng rầy nâu ở các dòng chỉ thị và một số dòng, giống lúa. Thông tin Công nghệ Sinh học Ứng dụng, số 4, tr. 67-72. 8. Thiều Văn Đường, Lưu Thị Ngọc Huyền, Lê Công Tuấn, Lê Thị Kim Dung, Vũ Đức Quang và Đặng Hữu Lanh (2001). Khảo sát đa dạng di truyền ở một số dòng, giống lúa kháng/nhiễm rầy nâu bằng chỉ thị vi vệ tinh. Thông tin Công nghệ Sinh học Ứng dụng, số 4, tr. 24-29. Bảng 1 Danh sách 50 chỉ thị SSR (cho đa hình đối với cặp bố mẹ) được sử dụng trong thí nghiệm phân tích thể phân ly nhóm (tổ hợp lai TN1xDG5) Bảng 2 Danh sách 51 chỉ thị SSR (cho đa hình đối với cặp bố mẹ) được sử dụng trong thí nghiệm phân tích thể phân ly nhóm (tổ hợp lai TN1xGC9) SUMMARY Chromosomal localization of the rice brown planthopper resistance genes bph4 and Bph6 This research is dealing with identification of SSR markers linked to and chromosomal assigment of the two effective brown planthopper (BPH) resistance genes bph4 and Bph6 for the further use in rice breeding. Two mapping populations were developed from the crosses of TN1xDG5 and TN1xGC9, where DG5 and GC9 were Babawee- and Swarnalata-derived breeding lines, respectively, in which the genetic segregation analyses confirmed that DG5 and GC9 possessed recessive (bph4) and dominant (Bph6) resistance genes, respectively. Phenotyping analyses were carried out in F3 generations, based on that each of F2 individuals were judged for homozygous resistance, homozygous susceptibility, or heterozygosity. Bulk segregant SSR analyses were performed using 4-5 SSR polymorphic loci per chromosome. As results, only the SSR loci of the chromosome 4 seemed to co-segregate with the bph4 or Bph6 genes. Afterwards, more than a hundred of F2 individual plants of each mapping population were surveyed with SSR markers of the chromosome 4. Then linkage analyses were accomplished using the MapMaker programme. It showed that the both bph4 and Bph6 loci were located on the chromosome 4, where the bph4 was close to the marker RM261 and the Bph6 was located between the markers RM119 and RM317. Identification of closer markers and detailed mapping of the resistance genes are underway. Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương