Đồ án Công nghệ Protein enzyme và kỹ thuật gen

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, trước hết em xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS. Lê Quang Hòa người đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến đã toàn bộ cán bộ Viện CNSH và CNTP trường ĐHBK HN đã giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm :”công nghệ Protein enzyme và kỹ thuật gen“. Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã đọng viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2007 Sinh viên Trương Thị Thu Hiền MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt: Nghĩa tương ứng: VSV Vi sinh vật UHT(Ultra heat treatment) Xử lý tiệt trùng sữa PCR(Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp dNTP Deoxynucleotide-triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylendiamin etetraacetic acid TE TRIS-EDTA CFU( colony forming units) Đơn vị hình thành khuẩn lạc DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli. Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus. Hình 1 Hình thái Escherichia coli Hình 2. Hình thái Bacillus cereus. Hình 3. Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real-time PCR Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của Bacillus Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế bào vi sinh vật. MỞ ĐẦU Sản lượng sữa và nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trường Việt Nam đang tăng một cách đáng kể, trong 10 năm qua mức độ tiêu thụ là 15 lần. Ước tính đến năm 2010, nhu cầu về các sản phẩm sữa ở nước ta sẽ gia tăng khoảng 10-15% mỗi năm để đạt mức khoảng 10kg/đầu người /năm. Vốn là một thực phẩm bổ dưỡng, sữa cũng là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, công tác kiểm tra, và đảm bảo vệ sinh cho sản phẩm sữa là mối quan tâm hàng đầu của các nhà sản xuất sữa và người tiêu dùng. Tuy nhiên với các phương pháp phân tích hiện nay, một số hiện tượng nhiễm tạp vi sinh vật gây bệnh thường được phát hiện muộn, kết quả là các biện pháp xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất Việc xác định các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp trong các sản phẩm sữa bằng các phương pháp truyền thống thường ít chính xác, độ nhạy không cao và thời gian dài. Các kết quả phân tích hầu như không có tính ngăn ngừa chỉ là căn cứ để giải quyết hậu quả của sự nhiễm tạp. Sự chậm trễ của phương pháp này sẽ làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự cố nhiễm VSV Đề tài ”Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và Escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật Real Time PCR” được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế trên của việc phát hiện những vi sinh vật nhiễm tạp. Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài gồm các phần sau: Lựa chon thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật Lựa chọn một môi trường tăng sinh cho vi sinh vật. Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật B.cereus và E.Coli PHẦN I: TỔNG QUAN I. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt nam: Ngành công nghiệp Sữa Việt Nam là một ngành công nghiệp có nhiều triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nước mới chỉ đáp ứng được 11% nhu cầu tiêu thụ. Nhu cầu sữa trên thị trường cũng tăng không ngừng, năm 1990 tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 con số nằy đã tăng đến 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/ năm. Cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sản xuất sữa đã tăng lên đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2000, sản lượng sữa trong nước đạt 54.000 tấn, năm 2003 tăng hơn gấp hai lần(112000 tấn) và đến năm 2004 con số này đã tăng lên thành xấp xỉ 198000 tấn. Sản lượng sữa được dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn tới. mặc dù có sựu tăng trưởng tốt và sản lượng tiêu thụ và sản xuất nhưng ngành sữa Việt Nam vẫn còn rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân các nhà máy cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm và quyền lợi người tiêu dùng. Hiện nay, đã có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền tuy nhiên vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân như mức đầu tư chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng và quản lý chưa hiệu quả.Chính vì nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa còn vấp phải vòng luẩn quẩn đó là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất kỹ thuật tốt. II. Các vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình chế biến sữa 1. Các nhóm vi sinh vật thường gặp Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa được thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất đa dạng bao gồm nấm men, mấn mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong các đối tượng trên thì vi khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát triển vượt trội hơn. Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn lactic như Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum. [4] Nhóm vi khuẩn này dóng vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tươi tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ là tác nhân làm hỏng sản phẩm dưới dạng tạo kết tụ protein. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia các vi sinh vật thường nhiễm trong sữa thành các nhóm chính sau: 1.1 Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs) Là những vi sinh vật có khả năng phát triển được ở nhiệt độ dưới 7oC. Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong mẫu sữa hỏng là nhóm trực khuẩn Gram (-), thường được xác định thuộc loài Pseudomonas. hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh chóng làm hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10oC. Tuy nhiên nó lại bị tiêu diệt dễ dàng trong các quá trinh gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua gia nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không đảm bảo. 1.2 Vi sinh vật ưa ấm (Meso philic) Những vi khuẩn ưa ấm quan trọng nhất là Streptococci, Lactobacilli và Coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí và làm mất mùi sữa. Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt Pasteur. 1.3 Vi sinh vật chịu nhiệt (Thermoduric) Là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur hoặc các xử lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở nhiệt độ gia nhiệt Pasteur. Giống chịu nhiệt hay gặp nhất là Mcrobacterium, Corynebacterrium, Micrococos, Streptococcus và Bacillus 1.4 Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic) Là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ xử lý Pasteur. Loài ưa nhiệt thường thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium. 1.5 Nhóm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu nhiệt nên vẫn có thể sống sót sau khi gia nhiệt nhưng chúng cũng có khả năng phát triển được trong điều kiện lạnh. Nhóm này thường phát triển chậm sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. thường hay gặp nhất trong nhóm này là Bacillus.[16] 2.Tổng quan về Bacillus và E.coli E.coli và Bacillus là hai vi sinh vật gây bệnh thường gặp và phát triển tốt trong môi trường sữa, ngoài ra Bacillus còn là vi sinh vật dễ ràng sinh bào tử và bào tử rất dễ nảy mầm vì thế gây khó khăn trong quá trình bảo quản. 2.1 Escherichia coli E.coli là vi sinh vật hiếu khí tuỳ ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli O157:H7.[2] Hình 1 Hình thái Escherichia coli Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm hay phân chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối lọan đường tiêu hoá. Các triệu chứng lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người. 2.2 Bacillus cereus Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tuỳ tiện, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 5-50oC, tối ưu ở 35-40oC, pH dao động từ 4,5-9,3, dễ tạo bào tử và bào tửu nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, các loại sản phẩm khô...)[2] Hình 2 Hình thái Bacillus cereus Vi khuẩn này sinh ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng ngộ độc gây ra bởi B.cereus chủ yếu là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ III. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa khác nhau là khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng ở mỗi quốc gia khác nhau thì giới hạn này cũng khác nhau Tiêu chuẩn Việt Nam Hiện nay Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật trong các sản phẩm sữa theo quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Bảng 1)[8] Nhóm sữa    a. Sữa khô, sữa bột .... TSVKHK 5.104 Coliforms 10 E.coli 0 S.Aureus 0 Salmonella* 0 b. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur. TSVKHK 5.104 Coliforms 10 E.coli 3 Salmonella* 0 c. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.T. TSVKHK 10 Coliforms 0 E.coli 0 S.Aureus 0 Salmonella* 0 d. Sản phẩm chế biến của sữa : bơ, sữa chua, pho- mat, ...( - dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng ). (*) Salmonella : Không được có trong 25g thực phẩm TSVKHK 104 Coliforms 10 E.coli 0 S.Aureus 0 Salmonella* 0 Bảng 1 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa IV. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm Để kiểm soát vi sinh vật thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh. 1. Các phương pháp truyền thống Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa. 2. Các phương pháp phân tích nhanh Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia phương pháp này thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit . Phương pháp miễn dịch Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật. Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật mục tiêu sẽ xảy ra phản ứng kháng nguyên kháng thể và phản ứng này sẽ được phát hiện nhờ một kháng thể cộng hợp gắn enzym thứ hai làm biến màu cơ chất. Ngưỡng phát hiện của kĩ thuật này giao động từ 104-106 cfu/ml, do vậy trong phân tích phát hiện vi sinh vật thường phải qua giai đoạn tăng sinh. Tuy nhiên, giờ đây người ta đã có thể sử dụng bi từ có gắn kháng thể đặc hiệu để thu nhận trực tiếp vi sinh vật mục tiêu với một sốlượng lớn mà không cần giai đoạn tăng sinh. Kĩ thuật latex agglutination (LA), sử dụng các hạt cao su có mầu có đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủng vi khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng, quá trình kết tụ (agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặc dải có màu). Kĩ thuật này có thể sử dụng để xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm. Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization): Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác và độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ. Kỹ thuật PCR Về lý thuyết kỹ thuật này có thể nhân một đoạn ADN đích lên hàng triệu bản chỉ trong khoảng hơn một giờ vì vậy giảm được rất nhiều hoặc không cần thời gian tăng sinh cũng có thể xác định được sự có mặt của vi sinh vật đích. Tuy nhiên sự có mặt của các chất ức chế trong thực phẩm hoặc trong môi trường tăng sinh cũng có thể ức chế sự bắt cặp của mồi và làm giảm khả năng khuyếch đại đoạn ADN đích..Kỹ thuật này cho phép phát hiện được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh và độ nhạy khá cao. Phương pháp này có thể áp dụng trong các nhà máy trong công tác phòng ngừa và phát hiện. Kỹ thuật Microarray, Macroarray: Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo một trình tự xác định. Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp của AND có trình tự tương đồng mà sự có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào đó có thể được phát hiện và số copy có thể xác định chính xác. Với kỹ thuật này có thể xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng một thời điểm với mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác 3. Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR Nguyên tắc Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định lượng các đoạn DAN hình thành Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất nhuộm khác nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau.[10] Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green: Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ đính vào bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt. Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan: Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một oligonucleotit trong đó một đầu được gắn với chất nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang. Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme taq-polymerase mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5’ nuclease của taq-DNA polymerase.Sự phân giải mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm mầu có khả ăng phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được. Phương pháp đầu dò lai Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu 3’ và một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng 1-5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích thích chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang. Hình 3 Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR Ưu điểm Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau: -Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR -Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR thông thường việc phân biệt dựa trên độ lớn của vạch thu được sau điện di -Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn -Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Vật liệu và thiết bị 1. Chủng vi sinh vật STT Chủng chuẩn Nguồn gốc 1 Bacillus cereus ATCC 10876 2 Escherichia coli ATCC 25923 2. Mẫu sữa thí nghiệm -Mẫu sữa tươi tiệt trùng không có vi sinh vật của Vinamilk. 3. Hoá chất -Hóa chất dùng tách chiết DNA tổng số và hóa chất real time PCR được cung cấp bởi Amersham Pharmacia Biotech. -Các hóa chất phân tích DNA do Invitrogen và Applied Biosystem cung cấp -Hóa chất môi trương nuôi cấy do Merck và Difco cung cấp 4.Môi trường Các môi trường sử dụng trong đề tài gồm có Môi trường Violet Red Bile Agar (VRBA): Dùng để nuôi E.coli Môi trường Mannitol-Egg Yolk-polymyxin(MYP) agar (g/l):Dùng để nuôi Bacillus Môi trường LB(g/l) dùng trong tăng sinh vi khuẩn Trypticase soy broth yeast extract (TSBYE) Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth II. Phương pháp nghiên cứu 1. Xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định cần phải tiến hành nhiễm chủ động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật ở mật độ mong muốn phù hợp với yêu cầu thí nghiệm. Như vậy cần phải xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus, nhằm xác định được mật độ vi sinh vật của một dung dịch chứa vi sinh vật thông qua mật độ quang. 1.1. Nguyên tắc: Khi phát triển trong môi trường lỏng mật độ tế bào thay đổi theo thời gian. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canh trường phụ thuộc vào mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy. Ta sẽ tiến hành xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào 1.2. Cách tiến hành: -Cho 100µl chủng chuẩn vào trong 10ml môi trường tăng sinh TSBYE, nuôi lắc với vận tốc lác 200 vòng/phút ở 37oC -Sau các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ tăng sinh, đem mẫu đi đo giá trị mật độ quang so với môi trường TSBYE ở bước sóng 600nm - Pha loãng dung dịch tại các thời điểm tăng sinh, trải 100µl dung dịch đó trên môi trường đặc hiệu. -Đếm khuẩn lạc và xác định mật độ tế bào (N/ml) của các dung dịch đó tại các thời điểm khác nhau. -Tính các giá trị Log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biễu diễn của Log (N/ml) theo OD600nm. Xác định khoảng tuyến tính giữa log (N/ml) và OD. 2. Lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu cặn tế bào trong quá trình ly tâm Với mật độ vi sinh vật ban đầu rất thấp của mẫu thí nghiệm, ta cần tiến hành ly tâm để cô đặc mẫu và thu lại sinh khối tế bào. Tuy nhiên, với mật độ thấp như thế, nếu mang ly tâm 50 ml mẫu chỉ có thể thu được tối đa 4 CFU, như vậy xây dựng một chế độ ly tâm phù hợp là một việc rất quan trọng. 2.1.Nguyên tắc Ở cùng một vận tốc ly tâm, thời gian ly tâm càng lớn thì tế bào sống thu được trong cặn tế bào càng tăng, đồng thời tỷ lệ tế bào chết trong quá trình ly tâm cũng tăng lên. Nên nếu lựa chọn thời gian tăng sinh quá cao sẽ làm tỷ lệ vi sinh vật chết trong quá trình ly tâm tăng lên, tuy nhiên nếu thời gian ly tâm thấp sẽ không thu hết cặn tế bào sống từ mẫu sữa thí nghiệm. Vì vậy, phần này nhằm nghiên cứu thời gian tăng sinh phù hợp nhất cho cả hai vi sinh vật lựa chọn nhằm thu được tỷ lệ cao nhất tế bào vi sinh vật sống từ mẫu thí nghiệm có mật độ vi sinh vật ban đầu rất thấp 1CFU/25ml.Ta sẽ tiến hành xác định chế độ ly tâm thích hợp (cố định lực ly tâm, thay đổi thời gian ly tâm) để thu tế bào trước bước tăng sinh. 2.2. Cách tiến hành: Với một thời gian ly tâm nhất định, tiến hành các bước sau: Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml môi trường TSBYE nuôi lắc ở vận tốc lắc 200rpm trong 3-4h ở 37oC. Đo OD, dựa vào đường cong sinh trưởng của hai vi sinh vật đã xây dựng được để xác định độ pha loãng cần thiết để có thể tiến hành nhiễm chủ động. Nhiễm chủ động với nồng độ 300 CFU/ml vào 50ml sữa trong ống falcon 50ml ( Với nồng độ này khi trải 100µl trên đĩa thạch đặc hiệu thì sẽ dễ dàng đếm số khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật) + Thực hiện đồng thời trong 6 ống falcon. Để đảm bảo nồng độ vi sinh vật trong cả 6 ống falcon là như nhau hay quá trình nhiễm chủ động được chính xác ta tiến hành nhiễm chủ động 105CFU vào 300 ml sữa (tương ứng với 300CFU/50ml), chia đều vào 6 ống falcon 50ml (lắc đều trước mỗi lần rót từ bình Scort vào ống falcon). Ly tâm 3 ống ở các chế độ ly tâm 6000 rpm, trong 3 phút, 6 phút, 9 phút, 12 phút. 3 ống còn lại được dùng làm kiểm chứng. + Đổ dịch nổi sang ống falcon sạch. Chuyển các ống falcon vào giữ lạnh trong thùng đá để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật. + Hoà tan phần kết tủa sau ly tâm trong 10ml đệm. Xác định mật độ tế bào trong dịch kiểm chứng, dịch hoà tan kết tủa và trong dịch nổi sau ly tâm: +đối với dịch nổi: trải 100µl dịch nổi trên đĩa Petri có chứa môi trường đặc hiệu. + dịch kiểm chứng và dịch hoà tan kết tủa sau ly tâm: trải 100µl dịch và dịch pha loãng 10 lần(pha loãng bằng đệm photphat,pH=7.25,đã thanh trùng) lên đĩa Petri chứa môi trường đặc hiệu. Nuôi ở 37oC trong 24h sau đó đếm khuẩn lạc. Đánh giá kết quả Sau khi xác định được mật độ tế bào trong dịch kiểm chứng, dịch hoà tan kết tủa và trong dịch nổi sau ly tâm. Ta tiến hành xác định tỷ lệ tế bào sống còn lại trong dịch nổi và tỷ lệ tế bào sống thu được trong phần kết tủa sau ly tâm. Từ đó đánh giá hiệu quả ly tâm ở các thời gian ly tâm khác nhau. Lựa chọn khoảng thời gian ly tâm thích hợp nhất để thu được tỷ lệ tế bào sống trong cặn tế bào sau khi ly tâm là lớn nhất. 3. Lựa chọn môi trường tăng sinh thích hợp cho cả 2 vi sinh vật. Các môi trường dùng trong thí nghiệm: TSBYE Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth Milk ( sữa tươi tiệt trùng vinamilk) Với các môi trường trên, tiến hành các bước thí nghiệm như sau: Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml TSBYE trong 3-4h nuôi lắc với vân tốc lắc 200rpm. ở nhiệt độ 37oC Đo OD và dựa vào đường cong sinh trưởng đã xây dựng để xác định mật độ tế bào và độ pha loãng thích hợp. Nhiễm mẫu chủ động các mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật các vi sinh vật B.cereu E.Coli sao cho mật độ vi sinh vật đạt 10CFU/ml (Thực hiện đồng thời trong 6 ống : nhiễm khoảng 3.103 CFU vào 300ml sữa rồi chia đều vào 6 ống( lắc đều trước khi rót)) Ly tâm ở chế độ ly tâm thích hợp đã xác định ở trên.(giữ lạnh mẫu nếu cần thiết). Đổ dịch nổi. Cho vào mỗi ống 10 ml một loại môi trường ở trên. Lắc đều cho tan kết tủa mang nuôi ở 37oC, lắc 200rpm, trong 4h. Trải 100µl dịch pha loãng trên đĩa Petri có môi trường đặc hiệu. Mỗi nồng độ trải trên 3 đĩa. Nuôi ở 37oC trong 24h.. Đánh giá kết quả: -Đếm số lượng khuẩn lạc từ các đĩa peptri. So sánh và đánh giá hiệu quả tăng sinh giữa các môi trường đã chọn. -Lựa chọn ra một môi trường tăng sinh thích hợp nhất cho tất cả các vi sinh vật lựa chọn. 4. Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp: 4.1. Mục đích: Xác định được thời gian tăng sinh tối thiểu để thu được mật độ vi sinh vật đủ để thực hiện phản ứng Real time PCR từ mật độ vi sinh vật ban đầu là 1CFU/25ml 4.2. Cách tiến hành: Tăng sinh 100µl chủng chuẩn trong 10ml TSBYE trong 3-4h nuôi lắc với vân tốc lắc 200rpm. ở nhiệt độ 37oC Đo OD và dựa vào đường cong sinh trưởng đã xây dựng để xác định mật độ tế bào và độ pha loãng thích hợp. Nhiễm mẫu chủ động các mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật các vi sinh vật B.cereu, E.Coli sao cho mật độ vi sinh vật đạt 1CFU/25ml (Thực hiện đồng thời trong 3 ống ở 3 nồng độ 1 CFU/25ml, 1/3 CFU/25ml và 3CFU/25ml để đảm bảo chắc chắc thu đưựoc giá trị 1 CFU/25ml). Trải trên dĩa peptri để kiểm tra lại nồng độ vi sinh vật đã nhiễm vào. Ly tâm ở chế độ ly tâm thích hợp đã xác định ở trên.(giữ lạnh mẫu nếu cần thiết). Đổ dịch nổi. Cho vào mỗi ống 10 ml một loại môi trường ở trên. Lắc đều cho tan kết tủa mang nuôi ở 37oC, lắc 200rpm, trong 3 giờ ,4giờ, 5 giờ. Trải 100µl dịch pha loãng trên đĩa Petri có môi trường đặc hiệu. Mỗi nồng độ trải trên 3 đĩa. Nuôi ở 37oC trong 24h.. 4.3 Đánh giá kết quả -Đếm số lượng khuẩn lạc từ các đĩa peptri. Xác định ống có nồng độ nhiễm đúng 1 CFU/25ml -Xác định mật độ vi sinh vật thu được sau khi tăng sinh 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ -Dựa vào độ nhạy của phản ứng Real time PCR để xác định khoảng thời gian tăng sinh tối thiểu để có thể phát hiện sự nhiễm tạp của vi sinh vật 5. Tách chiết DNA tổng số 5.1. Nguyên tắc Thành tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng nhiệt độ cao, sau đó ly tâm loại xác tế bào. 5.2. Tiến hành -Sau khi nuôi cấy các VSV lựa chọn trong môi trường, pha loãng dịch nuôi cấy đến các nồng độ khác nhau, nhiễm chủ động vào 10 ml sữa. -Chuyển 1ml dịch nuôi cấy trong sữa sang ống eppendorf, thêm 0,3ml EDTA 0,25M ly tâm 13000vòng/phút trong 5 phút thu cặn tế bào -Rửa cặn tế bào hai lần bằng nước cất, ly tâm 13000 vòng/phút, đổ dịch nổi -Thêm 100µl nước khử ion. -Tách chiết DNA ở 99oC trong 15 phút -Xử lý dịch thu được để thu DNA tổng số ở phần dịch trong vào một eppendorf mới -Giữ ở -20oC cho phản ứng Real Time PCR 6. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose. 6.1. Nguyên tắc: Các axit nucleic (DNA, RNA) do chứa gốc phosphate trong phân tử nên ở pH kiềm hay trung tính chúng sẽ là những poly anion tích điện rất âm Trong diện trường chúng sẽ chuyển động về phía cực dương không phụ thuộc vào điện tích của phân tử DNA, mà phụ thuộc vào kích thước phân tử DNA và tính chất của gel agaroza. Sau điện di DNA có thể được phát hiện và phân tách bằng cách nhuộm gel bởi ethium bromide. Ethium bromide là chất có khả năng liên kết đặc hiệu với DNA và chất huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng tử ngoại. 6.2. Tiến hành: Cho agaroza vào dung dịch 1X đệm TAE để được nồng độ 1%. Dùng lò vi sóng đun đến khi agaroza nóng chảy. Để nguội bớt rồi đổ dịch vào khay để đông thạch. Pha loãng đệm 10X đệm TAE thành 1X TAE Trộn mẫu DNA cần điện di với đệm chấm mẫu. Tra mẫu vào giếng Cắm dây nối bình điện di vào nguồn một chiều ở 100 V cố định. Chờ thuốc nhuộm xanh trong mẫu chạy đến vạch cuối cùng. Nhuộm bản gel vào dung dịch ethium bromide 0.5µl/ml trong vòng 15 phút, nhấc khay thạch đựng mẫu và đổ agaroza lên giếng nilo soi lên máy soi gel và quan sát 7. Kỹ thuật Real time PCR 7.1. Nguyên tắc: Kỹ thuật Real Time PCR cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào cường độ phát huỳnh quang mà có thể định lượng được các đoạn DNA hình thành. Có 3 kỹ thuật được sử dụng cho real time PCR: SYBR Green, TaqMan (phương pháp 5’ nuclease), đầu dò lai. Trong đó phương pháp nhuộm màu SYBR Green là phương pháp đơn giản và kinh tế hơn cả cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm PCR trong phản ứng Real time. SYBR Green gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA mạch kép. Do vậy, khi sản phẩm PCR được tích lũy, cường độ phát huỳnh quang sẽ tăng lên . Ưu điểm của phương pháp SYBR Green: rẻ tiền, dễ sử dụng, nhạy. - Nhược điểm: do SYBR Green liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép nào trong phản ứng, bao gồm cả primer- dimers và những sản phẩm không đặc hiệu khác, dẫn tới kết quả cao hơn so với nồng độ đích. Trong đề tài này em tiến hành phát hiện đồng thời sự có mặt của E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tiệt trùng vì vậy sử dụng tác nhân gắn lên DNA SBYR Green. Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với sợi DAN kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận.. 7.2. Tiến hành: Lựa chọn các cặp mồi. Các cặp mồi được sử dụng ở đây được lựa chọn dựa trên nguyên tắc đã được thiết kế và nghiên cứu tính đặc hiệu, tính bao trùm với kết quả tương đối có thể chấp nhận được từ các tác giả đi trước trong lĩnh vực này Thực hiện phản ứng Real- time PCR với các thành phần cho một phản ứng là 50µl như sau: - Buffer: 5µl - Mg2+ : 5µl - dNTP : 2µl - Primer: 0.5µl - Taq : 3µl (5U/µl) -DNA: 5µl - DMSO/SYBR Green: 2.5µl - H2O cho tới 50µl 7.3 Đánh giá kết quả Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real-time PCR Cp: Cross point: Là số liệu thống kê sự gia tăng đáng kể của DR được phát hiện đầu tiên. Cp càng nhỏ thì gen biểu hiện càng mạnh. DR: hiệu số so sánh giữa kết quả phản ứng PCR có mẫu với kết quả phản ứng PCR không mẫu hoặc trong những chu kỳ đầu tiên dựa trên cường độ phát huỳnh quang của SYBR Green [5]. DCp: là chỉ số hiệu chỉnh chuẩn hóa Chọn mẫu có Cp của nhỏ nhất làm chuẩn, từ đó tính độ lệch theo chuẩn đối với các mẫu sẽ suy ra DCp của từng mẫu. Tính toán Cp của các gen sau phải trừ đi độ lệch chuẩn. Kiểm tra độ nhạy của phản ứng Real time PCR Nguyên tắc Để kiểm tra độ nhạy của phản ứng Real time PCR ta tiến hành xác định nồng độ thấp nhất các vi sinh vật lựa chọn cho ta kết quả của phản ứng Real Tima PCR rõ nét. Thí nghiệm tiến hành như sau: -Pha loãng dịch nuôi cấy để có các nồng độ khác nhau -Xử lý xốc nhiệt cho huyền phù để tách chiết DNA như trên làm khuôn cho phản ứng Real Time RCR - Tiến hành phản ứng Real time PCR theo đúng quy trình đã xây dựng với các mẫu có nồng độ khác nhau như trên. - Xác định nồng độ nhỏ nhất các vi sinh vật lựa chọn cho kết quả phản ứng Real time PCR rõ nét. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Đề xuất phương án hoàn thiện quy trình phát hiện B.cereus và E.coli trong sữa tiệt trùng 1. Quy trình đã được xây dựng Từ tài liệu tham khảo, em nhận thấy những người đi trước đã nghiên cứu và đưa ra quy trình phát hiện nhanh E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tươi tiệt trùng như sau [4]: Ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/1ml Lấy 40ml sữa 4ml EDTA 0,25M Ly tâm 9000 vòng/phút trong 10 phút Thu cặn tế bào 10ml đệm phosphat pH 7,2 Ly tâm 9000 vòng/phút, 5phút 10ml TSBYE Thu cặn tế bào Tăng sinh 4h (3h đối với E.coli) ở 37 độ, lắc 200 vòng/phút Lấy 1ml cho vào ống eppendoft Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút Thu cặn tế bào 1ml TE Ly tâm 100vòng/phút, 5 phút Thu cặn tế bào 200ml H2O Để vào tủ lạnh -20 oC trong 15 phút Lấy ra, phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch nổi cho phản ứng PCR Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml Ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/25ml Lấy 200ml sữa 20ml EDTA 0,25M Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút Thu cặn tế bào 10ml đệm phosphat pH 7,2 Ly tâm 10000 vòng/phút, 5phút 30ml TSBYE Thu cặn tế bào Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút Tăng sinh 5h ở 37 độ, lắc 200 vòng/phút Thu cặn tế bào 1ml TE Ly tâm 10000vòng/phút, 5 phút Thu cặn tế bào 200ml H2O Để vào tủ lạnh -20 oC trong 15 phút Lấy ra, phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch nổi cho phản ứng PCR Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml 2. Hạn chế của quy trình Đề tài trên đã đưa ra hai quy trình phát hiện Bacillus và E.coli [4]. Đối với quy trình phát hiện ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/1ml (Hình 5) đã thành công với cả Bacillus và E.coli. Độ nhạy của quy trình là 1CFU/1ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 4 giờ với Bacillus và 3 giờ với E.coli. Độ nhạy của quy trình này thấp (1CFU/1ml ), đối với một số tiêu chuẩn thì độ nhạy này yêu cầu cao hơn nữa. Đối với quy trình phát hiện ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/25ml (Hình 6) mới chỉ thành công với cả Bacillus mà chưa đưa ra được kết quả với E.coli. Độ nhạy của quy trình là 1CFU/25ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 5 giờ. Quy trình này tồn tại nhữung hạn chế sau: Quy trình tiến hành cồng kềnh, phức tạp qua nhiều bước, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dài. Quy trình thực hiện với một lượng mẫu lớn (200ml) nên rất khó khăn và phức tạp trong quá trình ly tâm và tách chiết DNA. Mất nhiều thời gian và dễ bị nhiễm. Không thể tiến hành phân tích đồng thời cả hai vi sinh vật E.coli và Bacillus trong một phản ứng PCR. Cần phải chạy điện di và việc phân biệt kết quả dựa vào độ lớn của vạch thu được sau điện di. Các bước tiến hành chưa được tối ưu. 3. Đề xuất phương án nghiên cứu hoàn thiện quy trình Với mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình phát hiện E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tiệt trùng và khắc phục những hạn chế của quy trình trên, em xin đề xuất phương phán nghiên cứu hoàn thiện quy trình như sau: Lựa chọn thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật nhằm mục đích thu đuợc tối đa lượng tế bào vi sinh vật sống trong cặn tế bào trong quá trình ly tâm. Lựa chọn một môi trường tăng sinh thích hợp nhất để tăng sinh cả E.coli và Bacillus nhằm giảm tối đa thời gian tăng sinh cho cho quy trình Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật để cho kết quả dương tính Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật B.cereus và E.Coli nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng và giảm thời gian cho quy trình Đề xuất một quy trình phát hiện nhanh E.coli và Bacillus đơn giản hơn, hiệu quả hơn và nhanh chóng hơn. I. Xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus. Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định và để xác định được mật độ vi sinh vật của một canh trường vi khuẩn nhằm tiến hành nhiễm chủ động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật ở mật độ mong muốn phù hợp với yêu cầu thí nghiệm, cần phải xây dựng đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus, nhằm xác định được mật độ vi sinh vật của một dung dịch chứa vi sinh vật thông qua mật độ quang 1.Nguyên tắc: Khi phát triển trong môi trường lỏng mật độ tế bào thay đổi theo thời gian. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canh trường phụ thuộc vào mật độ tế bào. Do đó giá trị OD600 biểu thị mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở hình 4 và hình 5 Log(N/ml) OD600 Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của Bacillus Log(N/ml) OD600 Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli Hai đồ thị trên biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ tế bào trong dung dịch và giá trị mật độ quang ở bước sóng 600nm. Khi giá trị OD600 càng cao thì mật độ tế bào vi sinh vật trong dung dịch càng lớn, tuy nhiên đến một giá trị nào đó thì mật độ tế bào vi sinh vật không tăng lên nữa mà bắt đầu giảm mặc dù gái trị mật độ quang không giảm. Khi đó sang giai đoạn vi sinh vinh vật bắt đầu chết nên độ đục không tăng nữa. Dựa vào đồ thị này ta sẽ xác định được mật độ tế bào của các dung dịch dựa vào mật độ quang. II. Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp thu sinh khối tế bào vi sinh vật 1. Mục đích: Để thu được lượng tế bào sống lớn nhất từ mẫu thí nghiệm ban đầu, ta cần tiến hành ly tâm để cô đặc mẫu. Bước nghiên cứu này nhằm tìm ra thời gian tăng sinh mang lại hiệu quả cao nhất, tức là thu được lượng tế bào sống lớn nhất từ mẫu ban đầu. 2. Kết quả và thảo luận: Từ các thí nghiệm ly tâm thu sinh khối vi sinh vật ở các thời gian ly tâm 3phút, 6 phút, 9 phút, 12 phút ở 6000 vòng/phút, thu được các kết quả như sau: Stt Thời gian ly tâm (phút) Tỷ lệ TB sống thu được trong cặn TB (%) Tỷ lệ tế bào sống trong dịch nổi (%) Tỷ lệ tế bào chết (%) 1 3 28,9 57 14,1 2 6 55,8 23 21,2 3 9 68,9 8,3 22,8 4 12 70,1 3,8 26,1 Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli Stt Thời gian ly tâm (phút) Tỷ lệ TB sống thu được trong cặn TB (%) Tỷ lệ tế bào sống trong dịch nổi (%) Tỷ lệ tế bào chết (%) 1 3 40,9 54,56 4,54 2 6 59,9 34 6,1 3 9 80,1 11,4 8,5 4 12 56,5 10,7 32,8 Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus Từ các kết quả trên, dễ dàng nhận thấy rằng, khi thời gian ly tâm tăng lên thì tỷ lệ tế bào sống thu được trong cặn tế bào sau khi ly tâm cũng tăng dần. Tuy nhiên, khi thời gian ly tâm tăng lên, đồng thời cũng làm tỷ lệ tế bào chết tăng dần. Khi thời gian ly tâm quá lớn, tỷ lệ tế bào chết tăng nhiều thì tỷ lệ tế bào sống thu được trong cặn tế bào bắt đầu giảm. Với mục tiêu thu được một lượng tế bào sống lớn nhất từ mẫu thí nghiệm sau quá trình ly tâm, ta đánh giá tỷ lệ tế bào sống thu được trong cặn tế bào, tỷ lệ tế bào còn lại trong dịch nổi và tỷ lệ tế bào đã bị chết. Từ đó so sánh được hiệu quả tăng sinh ở các thời gian ly tâm khác nhau và xác định được một thời gian ly tâm thích hợp nhất cho cả E.coli và Bacillus Để đánh giá được hiệu quả ly tâm với cả hai vi sinh vật và lựa chọn một chế độ ly tâm chung cho cả hai vi sinh vât ta có thể biểu kết quả này trên đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa thời gian ly tâm và mật độ tế bào sống thu được trong cặn tế bào sau quá trình ly tâm như sau: Tỷ lệ TB sống thu được (%) Thời gian ly tâm (phút) Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế bào vi sinh vật. Với mục đích thu được số lượng tế bào sống lớn nhất từ mẫu sữa thí nghiệm sau quá trình ly tâm, ta có thể chọn thời gian ly tâm phù hợp nhất cho cả 2 vi sinh vật E.Coli và Bacillus là 9 phút. Ở thời gian ly tâm này,tỷ lệ tế bào sống thu được trong cặn tế bào ở cả 2 vi sinh vật là lớn nhất. Hay ở thời gian ly tâm 9 phút và tôc độ ly tâm 6000 vòng/ phút sẽ cho hiệu quả ly tâm là lớn nhất. III. Lựa chọn môi trường tăng sinh thích hợp Để tiến hành phát hiện nhanh đồng thời các vi sinh vật lựa chọn trong thời gian ngắn nhất với độ nhạy cao của quy trình thì bước tăng sinh đồng thời các vi sinh vật là bước rất cần thiết. Tuy nhiên không phải bất cứ môi trường tăng sinh nào cũng phù hợp cho đồng thời các vi sinh vật lứa chọn. Vì vậy với mật độ tế bào vi sinh vật là 1CFU/25ml trong mẫu thí nghệm thì việc lựa chọn một môi trường tăng sinh thích hợp đồng thời cho các vi sinh vật chọn lọc rất quan trọng. Bước này giúp ta thu được mật độ tế bào các vi sinh vật đủ lớn để thực hiện phản ứng Real time PCR từ một mật độ rất thấp của mẫu thí nghiệm 1CFU/25ml. Thời gian tăng sinh là 4 giờ, tiến hành tăng sinh các vi sinh vật thu được sau khi ly tâm trong các môi trường đã lựa chọn. Tuy nhiên, với mật độ vi sinh vật ban đầu là 1 CFU/25ml, thì sau 4 giờ tăng sinh mật độ vi sinh vật vẫn còn thấp, nên việc xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống gặp khó khăn, bên cạnh đó cũng khó đánh giá sự khác nhau trong hiệu quả tăng sinh của các môi trường. Vì vậy, trong thí nghiệm lựa chọn môi trường này, em sẽ tiến hành với mật độ vi sinh vật ban đầu của mẫu thí nghiệm là 10 CFU/ml. Với 4 môi trường được lựa chọn để tăng sinh vi sinh vật TSBYE Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth Milk ( sữa tươi tiệt trùng) Mật độ vi sinh vật ban đầu trong mẫu thí nghiệm là 10CFU/ ml, sau 4 giờ tăng sinh trên các môi trường khác nhau, bằng phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống ta xác định được mật độ vi sinh vật như kết quả sau: Stt Môi trường E.Coli (CFU/ml) Bacillus (CFU/ml) 1 Trypticase soy broth yeast extract 21200 21600 2 Letheen Broth 25700 31500 3 Fluid Thioglycollate Medium 8300 18900 4 Nutrient Broth 23600 11200 5 Terrific Broth 13600 9800 6 Sữa tươi tiệt trùng 41000 30800 Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh Với mục đích thu được mật độ lớn vi sinh vật từ mẫu sữa có mật độ 1 CFU/25ml, phần nghiên cứu này nhằm tìm ra một môi trường tăng sinh phù hợp nhất cho đồng thời các vi sinh vật chọn lọc. Môi trường tăng sinh phù hợp được lựa chọn sẽ là môi trường tăng sinh thu được mật độ vi sinh vật cao nhất sau 4 giờ tăng sinh từ mẫu thí nghiệm ban đầu đối với cả hai vi sinh vật. Môi trường này sẽ được lựa chọn để tăng sinh đồng thời cả hai vi sinh vật trong các thí nghiệm sau. Từ kết quả trên, ta nhận thấy rằng sau 4 giờ tăng sinh thì mật độ vi sinh vật khi tăng sinh bằng sữa đối với cả hai vi sinh vật đều cao. Hay môi trường tăng sinh phù hợp nhất cho cả hai vi sinh vật là sữa tươi tiệt trùng. Như vậy, từ các thí nghiệm sau ta sẽ chọn sữa tiệt trùng làm môi trường tăng sinh cho cả hai vi sinh vật. IV. Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp Mục đích: Với mật độ vi sinh vật thấp của mẫu thí nghiệm 1 CFU/25ml, ta cần xác định khoảng thời gian tăng sinh tối thiểu, hay thời gian tăng sinh ngắn nhất trong môi trường đã lựa chọn ở trên để thu được một mật độ vi sinh vật đủ để có thể xác định bằng phương pháp real time PCR. 2. Kết quả và thảo luận: Mật độ vi sinh vật ban đầu trong mẫu thí nghiệm là 1CFU/ 25ml, sau 3giờ, 4 giờ v à 5 giờ tăng sinh trên môi trường sữa tiệt trùng, bằng phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống ta xác định được mật độ vi sinh vật. Sau đó ly tâm cặn dịch tế bào thu được sau các khoảng thời gian 3giờ, 4 giờ và 5 giờ tăng sinh, tiến hành tách chiết DNA từ cặn tế bào sau ly tâm và xác định khối lượng DNA thu được sau tách chiết ta thu được kết quả được tổng hợp trong bảng sau. Stt Thời gian tăng sinh (giờ) Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) 1 3 250 2 4 2100 3 5 12100 Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli. Stt Thời gian tăng sinh (giờ) Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) 1 3 110 2 4 1160 3 5 7480 Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus. Hai bảng trên đã thể hiện mật độ tế bào vi sinh vật sau 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ tăng sinh. Từ kết quả xác định độ nhạy cho phản ứng real time PCR ta nhận thấy ở thời gian tăng sinh 5 giờ thì mật độ tế bào đủ để thực hiện phản ứng Real time PCR đối với cả E.coli và Bacillus. Vậy lựa chọn được thời gian tăng sinh phù hợp là 4 giờ. Lấy 50ml mẫu sữa tiệt trùng VI. Đề xuất quy trình phát hiện nhanh Bacillus và E.coli nhiễm tạp trong sữa tiệt trùng Ly tâm ở 6000vòng/phút trong 9 phút thu sinh khối Tăng sinh trong 10ml sữa 3h, ở 37 oC, lắc 200 vòng/phút Lấy 1ml ly tâm 13000vòng/phút trong 5 phút (Bổ sung 0.3ml EDTA 0,25M) 1ml nước cất Lấy 1ml ly tâm 13000vòng/phút trong 5 phút Phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần Real time PCR (1,5 h) Quy trình phát hiện nhanh Bacillus và E.coli có độ nhạy 1 CFU/25ml và thời gian phát hiện của toàn bộ quy trình là 5,5 giờ. Quy trình có những ưu điểm so với những quy trình trước như sau: Đơn giản hơn, chính xác hơn Độ nhạy cao hơn 1CFU/25ml Có thể thực hiện được việc phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật với cùng một quy trình Thời gian của quy trình ngắn hơn Không cần chạy điện di để phân tích kết quả PHẦN IV: ĐÁNH GIÁ VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN CHO ĐỀ TÀI ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐỀ TÀI Đề tài đã thu được những kết quả sau: Đề tài đã xây dựng được quy trình ly tâm thu sinh khối vi sinh vật cho hiệu quả cao nhất Lựa chọn được môi trừơng tăng sinh hiệu quả nhất cho cả hai vi sinh vật lựa chọn. Xác định được thòi gian tăng sinh tối thiểu để có thể phát hiện 2 vi sinh vật E.coli và Bacillus ở độ nhạy 1 CFU/25ml Sử dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh hai vi sinh vật lựa chọn với độ nhạy 1 CFU/25ml Đã hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và Escherichia coli trong sữa tiệt trùng. HƯỚNG PHÁT TRIỂN CHO ĐỀ TÀI Xây dựng một quy trình phát hiện chung cho đồng thời một lượng lớn các loại vi sinh vật khác nhau Giảm bớt thời gian phát hiện và tăng độ nhạy của quy trình Khắc phục sai số dương do DNA từ tế bào chết TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hoà, Lê Thị Lan Chi (2003), Vi sinh vật nhiễm tạp trong công nghệ thực phẩm, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn thị Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Hà Nội. Lâm Xuân Thanh (2004), Giáo trình công nghệ các sản phẩm sữa, NXB KHKT, Hà Nội. Phùng Thị Thủy (2006) Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi sinh vật trong quá trình sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR, Luận văn thạc sỹ khoa học Tiếng Anh Applied Biosystems (AB). SYBR Green PCR and RT-PCR reagents. 2001 B.Janatova, J. Lukaaova(2001) heat resistaince of bacillus spp.Spore isolated from cow’s milk and farm ebvironment ” Acta Vet. .Brono,70 Candrian U,Furrer B, Hofelein C, Meyer R, jermini M, Luthy J.(1991), ”Detection of Escherichia coli and identification of enterrotoxigenic strains by primer-directed enzymatic amplification of specific DNA sequences” :39-51 asp .