Đồ án Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea (pinus caribaea)

Đồ án tốt nghiệp QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THÔNG CARIBAEA (Pinus caribaea) QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THÔNG CARIBAEA (Pinus caribaea) Kiều Phương Nam, Cao Quốc Liêm, Trần Trung Hiếu, Bùi Văn Lệ Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM Kiều Thanh Tịnh Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Bài báo đề cập 3 yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình nhân giống vô tính cây thông Caribê: 1. Tiền xử lý mẫu với acid benzoic, citric acid sẽ gia tăng hiệu quả khử trùng (93,33%); 2. Chồi con có mang các búp chồi ngủ là vật liệu phù hợp cho quá trình khởi đầu quy trình nhân giống. Ở điều kiện in vitro có thẻ tạo ra vật liệu này trên môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA; 3. Phương pháp shock hoomone có tác dụng gia tăng tỉ lệ chồi ra rễ (80%). Từ khóa: Nhân giống vô tính, Pinus caribaea ĐẶT VẤN ĐỀ Thông Caribê (Pinus caribaea) là một loài thực vật nhập nội, có nguồn gốc từ phía Tây Cuba, một số đảo thuộc vùng Caribean và Trung Mỹ. Chúng được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng từ năm 1965. Với nhiều ưu điểm về thích nghi, sinh trưởng ở điều kiện Việt Nam cây cho nhựa, gỗ tốt,…. nên hiện nay thông Caribê được quan tâm và trồng ở nhiều nơi: Quảng Bình, Huế, Đà Nẵng, Đồng Nai….. (Trần Văn Minh 2003; Phạm Thị Kim Thanh 2007). Tuy nhiên, nguồn cây giống chủ yếu là từ gieo hạt có một số bất lợi như giá thành cao, tỷ lệ nảy mầm thấp (45 – 50%), rừng trồng thường bị phân hóa và quan trọng là rừng thông Caribê trồng tại Đông Nam Bộ không có khả năng kết hạt. Vì vậy, phương pháp nhân giống vô tính in vitro là phương pháp tiềm năng nhất cho quá trình sản xuất cây con có chất lượng cao và là phương pháp nền tảng cho việc cải tiến giống thông bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu cấy Đoạn chồi non có mang búp chồi của 8 cây thông Pinus caribaea var hondurensis tại vườn thông khảo nghiệm của Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ, thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, có trụ sở tại Thống Nhất, Đồng Nai. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường Schenk & Hildebrandt (1972), ký hiệu SH. Môi trường SH có khoáng đa lượng giảm một nửa ký hiệu là SH1/2; Đường sucrose hay glucose với nồng độ 30g/l; Agar: 7g/l; Than hoạt tính: 1g/l; pH 5,7 0,1; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày; Cường độ: 2500 – 3000lux; Nhiệt độ: 25 20C; Độ ẩm trung bình: 70 – 80%. Khử trùng mẫu cấy Thí nghiệm được thực hiện để tìm thời gian xử lý citric acid và benzoic acid thích hợp trong quá trình khử mẫu. Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần là tỷ lệ mẫu sống khỏe mạnh và không nhiễm. Tiền xử lý: các đoạn chồi non (3–4cm) 3 tuần tuổi mang búp chồi được ngâm trong citric acid 0,5%, thời gian từ 0–60 phút. Sau đó, các đoạn chồi này được rửa sạch với xà phòng và nước máy. Tiếp theo các đoạn chồi này được ngâm trong benzoic acid 0,25%, từ 0 – 60 phút. Rửa sạch mẫu b”ng nước máy. Bước kế tiếp mẫu cấy được khử trùng trong tủ cấy với javel (1 javel: 3 nước), cồn 700, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Các đoạn chồi được cắt bỏ phần mô chết, cấy vào môi trường. Khảo sát sự hình thành cụm chồi từ chồi ngủ Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố chất điều hòa tăng trưởng thực vật (BA, IBA), đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi. Đánh giá dựa trên phần trăm mẫu cấy tạo cụm chồi, số chồi hình thành mỗi mẫu và chiều cao chồi. Các đoạn chồi ngọn vô trùng sau 3 tuần khử mẫu được sử dụng cấy vào môi trường SH bổ sung BA (0; 2; 3 và 4mg/l) và IBA (0; 0,2 và 0,5mg/l). Sau 8 tuần quan sát và ghi nhận kết quả, chọn nghiệm thức tạo cụm chồi tối ưu để tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa. Sự kết hợp của một trong hai loại đường glucose (0 và 30g/l) hoặc sucrose (0 và 30g/l) với nước dừa (0 và 10% V/V) (Bảng 1). Bảng 1. Sự kết hợp giữa các yếu tố: sucrose, glucose và nước dừa Nghiệm thức Glucose (g/l) Sucrose (g/l) Nước dừa (CW) % S 0 30 0 SCW 0 30 10 G 30 0 0 GCW 30 0 10 Khảo sát sự tăng trưởng chồi Chồi non in vitro cao 1–1,5cm được cấy lên môi trường SH dạng bán rắn và lỏng, bổ sung 30g/l đường glucose, 10% nước dừa và BA (0; 0,1; 0,2 và 0,5mg/l). Theo dõi sự gia tăng chiều cao của chồi. Tạo rễ in vitro và chuyển cây ra vườn ươm Chồi non in vitro cao 4–6cm, không có nốt chồi, lá mọc đều, xanh tốt được cấy vào môi trường bán rắn SH1/2 bổ sung IBA (0; 0,2; 0,5; 1; 1,5 và 3mg/l), ủ tối 2 tuần. Tiếp theo chuyển mẫu cấy sang môi trường SH1/2 bổ sung 0,1 mg/l IBA, đặt trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 25 20C, độ ẩm 70 – 80%, thời gian là 6 tuần. Chuyển cây từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Trên giá thể là xơ dừa, tro trấu, đất rừng thông theo tỷ lệ 1: 2: 1. Theo dõi thời gian xuất hiện rễ, phần trăm chồi tạo rễ, số lượng và chiều dài rễ mỗi chồi. Tỷ lệ sống ngoài vườn ươm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khử trùng mẫu cấy Kết quả khử mẫu (Bảng 2) tốt nhất thu được từ nghiệm thức K8, thời gian ngâm mẫu trong citric acid 0,5% và benzoic acid 0,25% lần lượt là 60 và 30 phút; 93,33% mẫu sống và không nhiễm. Số lượng mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm benzoic acid và ngược lại số mẫu chết lại tỷ lệ thuận. Các nghiệm thức kết hợp thêm việc ngâm trong citric acid cũng có vai trò làm giảm số mẫu bị nhiễm. Bảng 2. Tỷ lệ phần trăm mẫu sống khoẻ mạnh, không nhiễm sau 3 tuần Thời gian ngâm mẫu (phút) Nghiệ m thức Citric acid (0,5%) Benzoic acid (0,25%) Số mẫu không nhiễm Số mẫu nhiễm Số mẫu chết Tỉ lệ phần trăm mẫu sống không nhiễm K1 0 0 12 10 8 40,00 K2 0 30 17 4 9 56,67 K3 0 60 16 2 12 53,33 K4 30 0 21 6 3 70,00 K5 30 30 20 5 5 66,67 K6 30 60 23 1 6 76,67 K7 60 0 24 5 1 80,00 K8 60 30 28 1 1 93,33 K9 60 60 16 0 14 53,33 Như vậy, việc kết hợp tiền xử lý citric acid và benzoic acid trước khi xử lý với javel cho hiệu quả khử trùng tốt hơn, tỷ lệ đạt 93,33%, so với sử dụng chỉ một mình javel, tỷ lệ đạt cao nhất chỉ là 86,67% (Trần Trung Hiếu và cộng sự, 2003). Phương thức khử mẫu này vừa cho kết quả cao, vừa đảm bảo an toàn vì không sử dụng HgCl2 như quy trình của Trần Văn Minh và cộng sự, 2003. Benzoic acid có vai trò diệt nấm và loại bỏ bớt vi sinh vật trước khi xử lý với javel, citric acid có tác dụng làm tan nhựa thông, tránh sự hóa nâu của mẫu giúp khử mẫu tốt hơn. Kh¶o s¸t sù h×nh thµnh côm chåi tõ chåi ngñ Sau 10 tuÇn nu«i cÊy trªn m«i tr­êng kho¸ng SH, bæ sung c¸c nång ®é kh¸c nhau cña BA vµ IBA, kÕt qu¶ (B¶ng 3) cho thÊy sè l­îng chåi ®¹t cao nhÊt (37,60 0,81 chồi/mẫu) trong nghiệm thức C4 (3mg/l BA: 0,2mg/l IBA). Kết quả này cao hơn so với quy trình của tác giả Trần Văn Minh và cộng sự, 2003 (8 – 10 chồi/ đỉnh sinh trưởng). Sự kết hợp của auxin và cytokinin tạo nên một thế cân bằng mới phá vỡ trạng thái ngủ của chồi. Đồng thời cytokinin phối hợp với auxin nồng độ thấp giúp cho sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Nhưng ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phác thể chồi vừa mới thành lập và kích thích sự tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000). Cũng chính vì vậy mà ở nghiệm thức C5 (3mg/l BA: 0,5mg/l IBA) xuất hiện mô sẹo ở gốc của chồi con. Môi trường khoáng SH bổ sung 2mg/l BA kết hợp với 0,2mg/l IBA giúp chồi tăng trưởng tốt (1,82 0,04cm). Bảng 3. Sự tạo cụm chồi ngủ trên môi trường SH, sau 10 tuần nuôi cấy Nghiệm thức BA (mg/l) IBA (mg/l) Phần trăm mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) C0 0 0 13,33 2,20±0,45 1,24±0,05 C1 2 0 40,00 5,40±0,55 1,34±0,05 C2 2 0,2 50,00 6,80±0,84 1,82±0,04 C3 3 0 56,67 22,00±1,58 0,52±0,04 C4 3 0,2 60,00 37,60±0,81 0,82±0,08 C5 3 0,5 53,33 4,00±0,71* 0,56±0,09 C6 4 0 43,33 7,40±0,55 0,64±0,05 C7 4 0,2 46,67 11,00±0,79 1,04±0,09 (*) Chỉ tính số chồi trước khi mô sẹo hình thành chồi Môi trường C5 (3mg/l BA + 0,5mg/l IBA) có sự hình thành mô sẹo từ phần gốc của chồi con. Sau 10 tuần mô sẹo có đường kính 1,96 0,15cm. Chúng được cấy chuyền sang môi trường SH bổ sung 30g/l glucose, 10% nước dừa và 3mg/l BA kết hợp với 0,2mg/l IBA. Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình thành chồi, sau 6 tuần đạt 20,25 1,5 chồi, có chiều cao 0,63 0,02cm. Dựa trên môi trường C4 (SH bổ sung 3mg/l BA với 0,2mg/l IBA) cho sự hình thành chồi tốt, chúng tôi tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo chồi thông Caribê. Bảng 4. Ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi thông Caribê trên môi trường SH bổ sung 3mg/l BA và 0,2mg/l IBA, sau 10 tuần nuôi cấy Nghiệm thức Tỉ lệ phần trăm mẫu cấy phát sinh chồi Số chồi/mẫu cấy Chiều cây trung bình của chồi (cm) S 60,00 37,60±0,81 0,82±0,08 SCW 68,10 43,00±5,42 1,18±0,13 G 62,25 41,25±4,11 0,93±0,10 GCW 65,00 112,50±9,57 < 0,5 Kết quả thí nghiệm cho thấy (Bảng 4), nếu đường sucrose được thay bằng glucose và bổ sung 10% nước dừa thì số chồi/mẫu sẽ tăng gấp 3 lần. Glucose cho kết quả tốt hơn sucrose là vì glucose tham gia trực tiếp vào con đường biến dưỡng sinh ATP, dinh dưỡng thiết yếu cho tăng trưởng và phát triển của cây. Còn sucrose thì phải trải qua một phản ứng thủy giải tạo glucose và fructose thông qua enzyme sucrase. Sự kết hợp thêm nước dừa cho hiệu quả tốt hơn vì nước dừa có chứa nhiều amino acid, các chất kích thích tố thực vật, đặc biệt là cytokinin, zeatin, myo-inosytol, scycle-inosytol. Sau 8–10 tuần nuôi cấy, chồi con ngừng tăng trưởng chiều cao (chỉ đạt 0,5–1cm). Nguyên nhân có thể là do sự cạn kiệt dinh dưỡng và sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các chồi. Ngoài ra, trên môi trường 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần có sự xuất hiện của nhiều búp chồi ngủ, loại vật liệu cho hệ số nhân chồi cao, chính khả năng tạo được vật liệu khởi đầu trong diều kiện in vitro sẽ là một yếu tố giúp quy trình nhân giống in vitro cây thông Caribê thêm hoàn chỉnh. Khảo sát sự tăng trưởng chồi Thông qua bảng kết quả (Bảng 5), chúng tôi nhận thấy sự chênh lệch rõ rệch về chiều cao của chồi thông trong hai dạng môi trường là bán rắn và lỏng. Chồi được nuôi cấy trên môi trường lỏng tăng trưởng tốt hơn và nhanh hơn (SH1: 4,74 0,05cm) so với môi trường bán rắn (SH1: 2,65 0,14cm). Môi trường thích hợp hơn hết cho sự tăng trưởng chồi là môi trường SH1 dạng lỏng, bổ sung 0,1 mg/l BA, chiều cao chồi đạt 4,74 0,05cm. Qua những thí nghiệm trước, chúng tôi nhận thấy sự cạn kiệt dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật cao có thể là nguyên nhân chính gây ức chế tăng trưởng chồi. Do đó, sự đầy đủ về dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp sẽ kích thích chồi tăng trưởng. Môi trường SH3 có nồng độ cytokinin cao (BA: 0,5mg/l) ức chế sự kéo dài thân, nên chồi có chiều cao thấp hơn so với chồi trên môi trường khác. Đạt được hai yêu cầu thiết yếu về dinh dưỡng và chất điều hòa tăng trưởng, môi trường SH1 chứng tỏ phù hợp nhất để tăng trưởng chồi. Trong môi trường SH0, tuy không có chất chất điều hòa tăng trưởng nhưng chồi vẫn tăng trưởng, nhưng chậm hơn so với môi trường SH1 và SH2, vì môi trường này chỉ đảm bảo về nhu cầu dinh dưỡng, thiếu hụt hẳn lượng hoormone ngoại sinh. Bảng 5. Sự tăng trưởng của trên môi trường SH bổ sung các nồng độ BA khác nhau, ở hai dạng bán rắn và lỏng sau 4 tuần nuôi cấy Chiều cao trung bình (cm) Nghiệm thức BA (mg/l) Môi trường bán rắn Môi trường lỏng SH0 0 2,55±0,10 3,13±0,08 SH1 0,1 2,65±0,14 4,74±0,05 SH2 0,2 2,62±0,12 4,43±0,08 SH3 0,5 2,14±0,10 2,41±0,14 Tạo rễ chồi thông Caribê in vitro và chuyển cây ra vườn ươm Với phương pháp tạo rễ thông qua hai giai đoạn: (1) Cảm ứng tạo rễ sơ khởi trên môi trường bán rắn, có nồng độ auxin cao (0–5mg/l IBA), ủ tối trong 2 tuần và (2) kích thích kéo dài rễ trên môi trường auxin có nồng độ thấp (0,1mg/l IBA) trong 6 tuần tiếp theo, chúng tôi đã thu được kết quả khả quan như sau: Bảng 6. Sự tạo rễ của chồi trên môi trường SH1/2, sau 8 tuần nuôi cấy Nghiệm thức IBA (mg/l) Tỉ lệ mẫu cấy ra rễ (%) Thời gian xuất hiện rễ (tuần) Số rễ/cây Chiều dài rễ (cm) Ghi chú R0 0,0 0 0 0 0 R1 0,2 0 0 0 0 R2 0,5 40 6 5,43±0,53 0,94±0,15 Có 10-12 rễ nhánh R3 1,0 80 4 1,57±0,53 2,69±0,24 Có 3-4 rễ nhánh R4 1,5 70 4 5,57±0,53 2,03±0,37 Không rễ nhánh R5 3,0 30 4 1,93±0,45 1,96±0,21 Không rễ nhánh R6 5,0 0 0 0 Mẫu chết Kết quả cho thấy môi trường R3 và R4 có thể sử dụng cho mục đích ra rễ (Bảng 6). Trong đó R3 là môi trường thích hợp hơn vì sau 8 tuần nuôi cấy đạt 80% chồi thông ra rễ; mỗi cây có 1,57 0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. Ở các môi trường R0, R1 có nồng độ auxin chưa đủ cao để kích thích sự hình thành rễ sơ khởi từ chồi in vitro. Đối với môi trường R2, nồng độ IBA là 0,5mg/l có thể kích thích sự hình thành rễ từ chồi nhưng tỷ lệ vẫn còn thấp. Nghiệm thức R5, môi trường có lượng auxin cao (3mg/l IBA) ức chế sự tạo rễ nên tỷ lệ giảm so với R3 và R4. Môi trường R6, nồng độ auxin quá cao (5mg/l IBA) làm mẫu chết sau hai tuần ủ tối. Chúng tôi nhận thấy quy trình này có hiệu suất tạo rễ và số rễ mỗi cây cao hơn so với quy trình sử dụng IAA và IBA của Trần Văn Minh (2003) (chỉ tạo được một rễ) và quy ảtình chưa tạo được rễ của tác giả Phạm Thị Kim Thanh (2007) Cây con ra rễ sẽ có tỷ lệ sống ngoài vườn ươm lần lượt là 90% cho cây 8 tuần tuổi và 100% cho cây 14 tuần tuổi. Tuần đầu tiên, thực hiện phun sương theo chu kỳ 60 phút, thời gian phun là 2 phút. Tuần thứ hai trở đi chỉ tưới mỗi ngày 3 lần, sau 30 ngày bón phân N–P–K (16–16–8), liều lượng 3g trong 1 lít nước. Việc bổ sung thêm đất rừng thông vào giá thể còn là điều kiện cho nấm rễ tương tác với thông con, giúp cây phát triển và thích ứng tốt. KẾT LUẬN Vật liệu khử mẫu thích hợp: đoạn chồi non 3 tuần tuổi mang búp chồi. Phương thức khử mẫu tốt nhất: Tiền xử lý, ngâm trong citric acid 0,5% (30 phút) và benzoic acid 0,25% trong 60 phút. Tỷ lệ javel thích hợp cho bước khử mẫu tiếp theo là (1 javel: 3 nước). Môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA + 0,2mg/l IBA thích hợp tạo cụm chồi và tái sinh chồi từ mô sẹo. Tạo búp chồi con trên môi trường SH có 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần. Môi trường SH lỏng bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 0,1mg/l BA thích hợp cho tăng trưởng chồi. Môi trường bán rắn SH1/2 bổ sung 1mg/l IBA giai đoạn 1 thích hợp cho việc tạo rễ sơ khởi rễ. Kết hợp với giai đoạn 2 sử dụng môi trường SH1/2 bổ sung 0,1mg/l IBA để kích thích kéo dài rễ. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, mỗi cây có 1,57 0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. Cây con 8 tuần tuổi chuyển ra vườn ươm sống 90%. Cây 14 tuần tuổi sống 100%. Hệ số nhân chồi trong môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA + 0,2mg/l IBA là 112 chồi/ mẫu sau 10 tuần. Vậy hệ số nhân chồi lý thuyết là 1125 chồi/ năm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thương, Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, 2003. Bước đầu nhân nhanh giống thông Caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 880 – 883. Trần Văn Minh, Hà Thị Loan, 2003. ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phát triển cây nguyên liệu giấy thông Caribê (Pinus caribaea). Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần 2. Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 372 – 376. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II. Tủ sách trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Trang 78 – 110. Phạm Thị Kim Thanh, Huỳnh Đức Nhân, 2007. Nhân giống thông Caribê (Pinus Caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Số 12+13. Trang 91-94. ISSN 0866-7020 IN VITRO PROPAGATION OF CARIBEAN PINE (PINUS CARIBAEA) Kieu Phuong Nam, Cao Quoc Liem, Tran Trung Hieu, Bui Van Le Department of Biology, University of Science, Ho Chi Minh city Kieu Thanh Tinh Centre of South Eastern Forest Science and Production, Forest Science Institute of Vietnam SUMMARY Our aim in this study is to reveal the role of three factors that dramatically affect the efficacy of in vitro propagation process of Pinus caribaea. These are: 1. the effect of increasing effectiveness of sterilization of benzoic acid treatment (93.33%); 2. for the initial step of the process, young shoots carrying bud dormancy are the most suitable material, which can be obtained on SH medium with 30g/L glucose: 10% coconut water, 2mg/L BA, 0.5mg/L IBA; and finally; 3. an increase in root development can be achieved through hormone shock (80%). Keywords: Vitro propagation, Pinus caribaea Hình 1: Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea