Động học enzyne dị lập thể

Nguyễn Xuân Hưng 2005 1 MỤC LỤC Mục lục 1 Mở đầu 2 Giới thiệu chung 3 1.1 Lịch sử phát triển 3 1.2 Enzyme dị không gian 4 Động học enzyme dị thể 6 2.1 Mô hình thứ tự 6 2.1.1 Enzyme dimer 7 2.1.2 Enzyme tetramer 8 2.1.3 Trường hợp tổng quát 11 2.2 Mô hình đối xứng hay phối hợp 13 2.2.1 Khi không có chất hiệu ứng 18 2.2.2 Các chất hiệu ứng gắn riêng 19 2.2.3 Cơ chất và chất hiệu ứng gắn chung (nonexclusive) 23 Tài liệu tham khảo 27 Nguyễn Xuân Hưng 2005 3 1. Giới thiệu chung 1.1 Lịch sử phát triển Năm 1913, Leonon Michaelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình để giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzyme. Phương trình Michaelis - Menten đúng trong nhiều trường hợp đơn giản cũng như phức tạp. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, vận tốc xúc tác cực đại khi enzyme bão hoà cơ chất, ký hiệu là Kcat, còn phụ thuộc vào một số hằng số vận tốc khác [Lê Ngọc Tú et al., 2002]. Vào giữa những năm 1950, một số nhà nghiên cứu đã mô tả các enzyme có tính chất xúc tác không chỉ phụ thuộc cơ chất mà còn phụ thuộc vào các phân tử hiệu ứng. Các nghiên cứu con đường điều hoà sinh tổng hợp ở vi khuẩn cho thấy rằng tính chất xúc tác của enzyme đầu tiên thường được điều biến bởi sản phẩm cuối cùng của con đường. Sản phẩm cuối cùng này có cấu trúc khác với cơ chất. Các cơ chế điều hoà theo kiểu này đóng vai trò sống còn trong trao đổi chất. A B C D E F [Theo Talaro, 2002] Trong sơ đồ trên, F là sản phẩm cuối cùng thiết yếu (axit amin hoặc nucleotide) kìm hãm enzyme 1 (enz1), bước đầu tiên trong con đường. Do đó, khi F được tạo ra đủ, nó tự khoá sự tổng hợp của chính mình. Hiện tượng này gọi là kìm hãm hồi biến hay điều hoà ngược [Garrett & Grisham, 2003]. Một trong các ví dụ đầu tiên của hiện tượng này xuất phát từ nghiên cứu threonine deaminase của vi khuẩn E. coli. Abelson (1954) thấy rằng nếu thêm isoleucine vào canh trường vi khuẩn sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp tiếp theo của chính nó. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy hiệu ứng này do threonine deaminase, enzyme đầu tiên trong lộ trình sinh tổng hợp của isoleucine bị kìm hãm đặc biệt bởi isoleucine [Umbarger, 1956]. Các enz1 enz2 enz3 enz4 enz5 Nguyễn Xuân Hưng 2005 4 nghiên cứu sâu hơn với threonine deaminase tinh khiết cho thấy cơ chất threonine và chất kìm hãm isoleucine gắn với enzyme tại các vị trí khác nhau [Copeland, 2000]. Một ví dụ nữa là sự kìm hãm CTP của aspartate carbamoyltransferase [Yates & Pardee, 1956]. Enzyme này xúc tác tạo thành carbamoylaspartate từ aspartate và carbamoylphosphate, bước đầu tiên trong sinh tổng hợp de novo pyrimidine. Đồ thị tốc độ phản ứng - cơ chất aspartate có hình sigmoid, chứng minh tính hợp tác giữa các trung tâm hoạt động của enzyme oligomer này [Copeland, 2000]. Ví dụ đầu tiên được xác định rõ ràng là nghiên cứu của Cori và đồng sự cho thấy 5’- AMP cần cho hoạt tính xúc tác in vitro của glycogen phosphorylase b của cơ xương trong trạng thái nghỉ (resting skeletal muscle) [Fischer et al., 1971]. Để hiểu đầy đủ cơ chế điều hoà sinh học quan trọng này cần một khuôn khổ lý thuyết để mô tả làm thế nào mà các vị trí khác nhau trong enzyme có thể tương tác để tác động đến ái lực của các vị trí khác bởi các phối tử giống hoặc khác cơ chất [Copeland, 2000]. 1.2 Enzyme dị không gian Định nghĩa dị không gian (Allosteric, theo tiếng Lain allos có nghĩa là khác, stereos có nghĩa là cấu trúc) được Monod và cộng sự đưa ra vào đầu những năm 1960 để nhấn mạnh tương tác hợp tác của những vị trí khác nhau dẫn tới biến đổi cấu trúc của protein. Các khác nhau trong cấu trúc cơ chất và chất hiệu ứng được chú ý đầu tiên bởi Monod và Jacob. Họ đã đưa ra trong buổi thuyết trình năm 1961 rằng chất hiệu ứng gắn với các vị trí khác nhau và tách biệt [Monod & Jacob, 1961]. Chúng được gọi là vị trí dị không gian để phân biệt với trung tâm hoạt động. Hai ông cũng kết luận rằng các chất hiệu ứng gián tiếp gây ra biến đổi hình dạng của enzyme do đó thay đổi vị trí xúc tác và các tính chất động học của nó [Marangoni, 2003]. Các enzyme nêu trên là đối tượng của điều hoà ngược, đại diện cho nhóm enzyme có tên enzyme điều hoà (regulatory enzyme). Năm 1963, Monod và đồng sự biên soạn dữ liệu về các enzyme điều hoà [Monod et al., 1963] và nhận thấy chúng có các tính chất đặc biệt [Garrett & Grisham, 2003]: 1. Động học của các enzyme điều hoà không tuân theo phương trình Michaelis-Menten. Đồ thị v - [S] của chúng là đường cong dạng sigmoid hay S (hình 1). Các đường cong này chỉ ra tương quan bậc hai (hoặc cao hơn) giữa v và [S]; trong đó v tỷ lệ với [S]n (n > 1). 2. Sự kìm hãm của enzyme điều hoà bởi chất kìm hãm ngược (F) không giống với bất kỳ mô hình kìm hãm thông thường nào. F có cấu trúc ít tương đồng với cơ chất của enzyme điều hoà (S). F rõ ràng gắn với vị trí không phải trung tâm hoạt động của enzyme. 3. Các enzyme điều hoà hay enzyme dị không gian như enzyme 1 trong một vài trường hợp được điều hoà tăng bởi chất hoạt hoá. 4. Các enzyme dị không gian có tổ chức oligomer. Chúng gồm nhiều hơn một chuỗi polypeptide (phần dưới đơn vị) và có nhiều hơn một vị trí gắn S. 5. Lý thuyết được chấp nhận là, bằng cách nào đó tương tác của một enzyme điều hoà với chất hiệu ứng hoặc chính cơ chất làm thay đổi hình dạng hoặc trật tự tương tác Nguyễn Xuân Hưng 2005 5 vốn có của các phần dưới đơn vị enzyme. Ngoài enzyme, các protein không có hoạt tính xúc tác cũng thể hiện một số tính chất này, tiêu biểu là hemoglobin. Có hai loại hiệu ứng trong trường hợp của một enzyme điều hoà là hiệu ứng hợp tác và hiệu ứng dị không gian. Tính hợp tác (Cooperativity) Tính hợp tác được quan sát khi phản ứng của một phân tử cơ chất với protein tác động đến hiệu quả phản ứng của cơ chất thứ hai với trung tâm hoạt động khác [Gilbert, 2000]. Nguyên nhân là do khi cơ chất gắn vào enzyme gây ra các biến đổi điện tích và/hoặc cấu trúc dẫn đến thay đổi ái lực gắn cơ chất của các trung tâm hoạt động còn lại [Marangoni, 2003]. Cơ chế dị không gian Đó là khi sự gắn của một phân tử hiệu ứng tại vị trí không phải trung tâm hoạt động của enzyme tác động đến Km hoặc Vmax của enzyme đó [Gilbert, 2000]. Phối tử gắn tại một vị trí phải làm thay đổi cấu trúc xung quanh protein truyền theo chuỗi polypeptide tới trung tâm hoạt động ở xa [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Một chú ý quan trọng và cần luôn nhớ rằng tất cả các phương trình gắn và tốc độ của các enzyme hợp tác và dị không gian thu được dưới các giả định cân bằng nhanh (rapid equilibrium) [Leskovac, 2003]. Hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác thường đi đôi với nhau vì các biến đổi cấu trúc thông thường cần cả hai. Bản chất của cả hai hiệu ứng là các yếu tố gắn (và xúc tác) tại một trung tâm hoạt động có thể ảnh hưởng đến các yếu tố gắn (và xúc tác) tại trung tâm hoạt động khác của protein đa thành phần. Thông thường, vùng điều hoà và trung tâm hoạt động của enzyme dị không gian được tìm thấy tại bề tiếp giáp giữa các phần dưới đơn vị [Gilbert, 2000]. Việc phân biệt giữa hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác nằm trong phân tử gây ra tác động [Gilbert, 2000]. Các đáp ứng đẳng hướng chỉ điều biến dị không gian hoạt tính enzyme gây ra bởi cơ chất, các đáp ứng dị hướng chỉ điều biến dị không gian hoạt tính enzyme bởi các phân tử phi cơ chất hoặc kết hợp của các phân tử cơ chất và phi cơ chất. Điều biến dị không gian có thể là dương (hoạt hoá) hay âm (kìm hãm). Một số enzyme dị không gian cũng thể hiện tính điều hoà làm việc phân biệt rõ ràng giữa hiệu ứng dị không gian và hiệu ứng hợp tác đôi khi rất khó [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Tuy nhiên, gần đây người ta khám phá ra một số protein có tính chất dị không gian nhưng lại có cấu trúc monomer. Gunasekaran và cộng sự (2004) đã đưa ra kết luận rằng dường như dị không gian là tính chất nội tại của tất cả các protein [Gunasekaran et al., 2004]. Nguyễn Xuân Hưng 2005 6 2. Động học enzyme dị thể Trong trường hợp enzyme oligomer, thông thường các phần dưới đơn vị giống nhau hoàn toàn. Mỗi phần dưới đơn vị có một trung tâm hoạt động để gắn phối tử. Nếu các vị trí này đồng nhất và độc lập với nhau (có cùng Km và kcat với cơ chất), sự có mặt của cơ chất tại một vị trí sẽ không ảnh hưởng đến tính chất xúc tác và khả năng gắn cơ chất của vị trí khác [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Động học của n enzyme một vị trí gắn phối tử giống với động học của một enzyme có n trung tâm hoạt động trong trường hợp này [Segel, 1975]. Do đó, phương trình tốc độ của enzyme oligomer với n trung tâm hoạt động độc lập không tương tác là: ]S[ ]S[ Smax + = kV v Với Vmax = kcat[ET]; ks là hằng số phân ly vi mô (disasosiation microscopic constant) của phức hệ ESn [Marangoni, 2003]. ◄Hình 1: Đường cong vận tốc đầu - nồng độ cơ chất của enzyme điều hoà. Đường cong này có hình sigmoid khác với trường hợp theo mô hình Michaelis-Menten [Theo Marangoni, 2003]. Hoạt tính enzyme cũng bị ảnh hưởng bởi sự gắn của cơ chất và các phối tử không phải cơ chất (chất kìm hãm hoặc hoạt hoá) tại vị trí khác trung tâm hoạt động. Đây là trường hợp của các enzyme dị không gian. Trong trường hợp này, đường cong v - [S] có hình sigmoid gần giống chữ S (hình 1). Hai mô hình lý thuyết được đưa ra để giải thích tính dị không gian của các enzyme oligomer tương tác hợp tác là mô hình tương tác thứ tự và mô hình đối xứng hay mô hình chuyển tiếp phối hợp (concerted transition). 2.1 Mô hình thứ tự Năm 1966, Koshland, Nemethy và Filmer đã trình bày một số mô hình cho các protein hoặc các enzyme oligomer [Koshland et al., 1966]. Giả thiết cơ bản của mô hình tương tác thứ tự (SI) là hình dạng enzyme bị biến đổi đáng kể khi cơ chất gắn vào, làm thay đổi ái lực gắn cơ chất của các trung tâm hoạt động còn lại (hình 2). Trong trường hợp điều hoà dương, mỗi phân tử cơ chất gắn vào làm phân tử cơ chất tiếp theo dễ gắn với trung tâm hoạt động còn lại hơn. Do đó đường cong v - [S] có độ dốc tăng rõ rệt khi nồng độ cơ chất tăng. Khi trung tâm hoạt động đã bão hoà, độ dốc của đường cong giảm dần [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. (1) Nguyễn Xuân Hưng 2005 7 2.1.1 Enzyme dimer Trường hợp đơn giản nhất là enzyme dimer dị không gian có tính hợp tác dương. Các cân bằng gắn cơ chất và hằng số cân bằng của chúng được minh hoạ trong hình 2 [Segel, 1975]. Koshland cho rằng protein là các phân tử linh động, hình dạng của chúng thay đổi khi gắn với phối tử. Do vậy, khi enzyme oligomer gắn với một phối tử sẽ gây ra chuyển tiếp hình dạng của chính nó để dễ hoặc khó gắn hơn với các phối tử khác (cùng hoặc khác loại). Hình 3 thể hiện các đặc trưng quan trọng của mô hình này với enzyme dimer. Chú ý rằng trong trường hợp này không cần duy trì tính đối xứng, hai phần đưới đơn vị có thể có hình dạng khác nhau. Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, sau khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác có ái lực thấp hoặc cao hơn với S (hoặc một số phối tử khác). Cơ chế được đưa ra là biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử của một phần dưới đơn vị có thể chuyển tiếp hiệu ứng của nó tới các phần dưới đơn vị bên cạnh bằng những tương tác thay thế và các sắp xếp của các gốc axit amin tại nơi tiếp giáp của các dưới đơn vị. Phụ thuộc vào ái lực tương đối của hình dạng thích ứng với dưới đơn vị bên cạnh, hiệu quả tổng thể của phối tử gắn tiếp theo có thể là âm, dương hoặc trung tính (hình 3) [Garrett & Grisham, 2003]. ►Hình 3: Mô hình SI với enzyme dị không gian. (a) Cơ chất S gắn vào làm biến đổi hình dạng của dưới đơn vị mà nó gắn. (b) Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác biến đổi hình dạng để có ái lực lớn hơn (đẳng hướng dương) hoặc nhỏ hơn (đẳng hướng âm) với S. Nói cách khác, biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử trong một dưới đơn vị có thể ảnh hưởng đến dưới đơn vị kề bên. Các hiệu ứng này có thể được chuyển tiếp giữa các miền peptide cạnh nhau bằng cách thay đổi sự sắp xếp của các gốc axit amin không liên kết [Theo Garrett & Grisham, 2003]. ◄Hình 2: Sơ đồ cân bằng khi enzyme holodimer gắn với cơ chất, ở đó cơ chất gắn được trợ giúp bởi sự chuyển vị hình dạng của phần dưới đơn vị nơi nó gắn, theo mô hình Koshland và cộng sự (1966) [Theo Copeland, 2000]. S S S S KS KS aKS aKS +S +S +S +S Nguyễn Xuân Hưng 2005 8 Hằng số kết hợp của cơ chất đầu tiên là KS. Tuy nhiên, khi một trong các vị trí gắn cơ chất bị chiếm giữ, hằng số phân ly của vị trí thứ hai bị biến đổi a lần (với tính hợp tác dương, a < 1). Phương trình vận tốc tổng thể của enzyme này là [Copeland, 2000]: 2 S 2 S 2 S 2 S max ]S[]S[21 ]S[]S[ aKK aKK V v ++ ÷÷ ø ö çç è æ + = 2.1.2 Enzyme tetramer Mở rộng mô hình với enzyme tetramer (hình 4). Trong trường hợp này phân tử cơ chất đầu tiên gắn vào làm biến đổi hằng số phân ly của toàn bộ ba vị trí gắn khác a lần. Nếu phân tử cơ chất thứ hai tiếp tục gắn vào, hai vị trí gắn còn trống sẽ có hằng số phân ly biến đổi tiếp b lần trở thành abKS. Tương tự, khi trung tâm hoạt động thứ ba bị cơ chất chiếm giữ, vị trí còn lại sẽ bị biến đổi tiếp c lần và hằng số phân ly sẽ là abcKS [Copeland, 2000]. ▲Hình 4: Sơ đồ tương tác thứ tự của cơ chất với enzyme điều hoà bốn phần dưới đơn vị. Một phân tử cơ chất gắn với trung tâm hoạt động sẽ làm thay đổi ái lực của các vị trí khác. ki là hằng số phân ly vi mô của các vị trí thứ i tương ứng [Theo Marangoni, 2003]. Đường cong v - [S] có hình sigmoid (hình 1). Theo lý thuyết, enzyme điều hoà tetramer có bốn trung tâm hoạt động, phương trình tốc độ phản ứng và cân bằng khối của enzyme là [Marangoni, 2003]: ]ES[4]ES[3]ES[2]ES[ 4cat3cat2cat1cat kkkkv +++= ]ES[]ES[]ES[]ES[E][]E[ 4321 ++++=T Thừa số yếu tố tương tác Để thuận tiên, khi nghiên cứu enzyme điều hoà người ta cố gắng quy tất cả các hằng số phân ly khi có cơ chất gắn vào (k1, k2, k3, k4) về hằng số phân ly vi mô nội tại k. Hằng số phân ly nội tại của phức ES là k1, trong trường hợp này k1 = k. Khi cơ chất gắn với trung tâm hoạt động đầu tiên, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ hai (ES2) sẽ biến đổi a lần: k2 = ak Khi cơ chất thứ hai gắn, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ ba sẽ biến đổi b lần: k3 = abk (2) (3) (4) (5) (6) S S S S S S S S S S k1 k3 k4 k4 Nguyễn Xuân Hưng 2005 9 Khi phân tử cơ chất thứ ba gắn vào, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ tư sẽ biến đổi c lần: k4 = abck a, b, c được gọi là các thừa số yếu tố tương tác. Do đó, với enzyme điều hoà tetramer, hằng số phân ly nội tại enzyme - cơ chất tổng thể (k’): k’ = k1k2k3k4 = a3b2ck4 Các thừa số tương tác sẽ có giá trị 1 với điều hoà âm. Rất khó thu được các thừa số tương tác riêng biệt, hoặc các hằng số phân ly nội tại chính xác bằng cách phân tích động học enzyme trong trạng thái hoạt tính ổn định [Marangoni, 2003]. Hằng số phân ly vi mô - vĩ mô Việc phân biệt các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô là điều quan trọng. Số cách các phân tử cơ chất chiếm giữ n trung tâm hoạt động trong enzyme, không quan tâm đến sự thay thế và thứ tự chiếm giữ (tổ hợp C) là [Marangoni, 2003]: !)!( ! ssn nC - = Với s là số phân tử cơ chất gắn với enzyme. Trong trường hợp enzyme tetramer có 4 trung tâm hoạt động (n = 4). Số cách tạo phức hệ enzyme-cơ chất vi mô ES2 là 6 (hình 5). Nồng độ của mỗi loại ES2 vi mô sẽ là [ES2]/6. Mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô đạt được bằng cách thay các điều kiện nồng độ ESn vĩ mô bằng điều kiện nồng độ ESn vi mô, giả định cân bằng có thể xảy ra cho mỗi loại vi mô. Ví dụ, hằng số phân ly vĩ mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 S =K Như được đề cập ở trên, có 6 cách enzyme và cơ chất tạo thành các loại ES2 vi mô. Với phức ES và ES3, có thể tạo thành bốn loại vi mô khác nhau trong khi chỉ có một loại vi mô cho phức hệ ES4 (hình 5). Do đó nồng độ ES2 vi mô là [ES2]/6. Nồng độ của phức hệ ES, ES3, và ES4 vi mô tương ứng là [ES]/4, [ES3]/4, và ES4 [Marangoni, 2003]. Từ những điều trên, hằng số phân ly vi mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 4/]ES[ S])[6/]ES([ 3 2 3 2 ==Sk Do đó, mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vĩ mô (Ks ) và vi mô (ks ) của phản ứng này là: SS kK 2 3 = (7) (8) (9) (10) (11) (12) Nguyễn Xuân Hưng 2005 10 ▲Hình 5. Các trường hợp trong đó, tương ứng, một, hai, ba và bốn phân tử cơ chất có thể chiếm giữ ngẫu nhiên các vị trí gắn trên một enzyme có bốn vị trí điều hoà [Theo Marangoni, 2003]. Như vậy, hằng số phân ly vĩ mô hay toàn bộ (Kn) và vi mô hay nội tại (kn) với các phức hệ ESn khác nhau là [Marangoni, 2003]: ][ES E][S][ 4 1 1 11 == kK 11 1 E][S][4E][S][]ES[ kK == ][ES ][S]ES[ 3 2 2 1 22 == kK 21 2 21 2 2 E][S][6E][S][]ES[ kkKK == ][ES ][S]ES[ 2 3 3 2 33 == kK 321 3 321 3 3 E][S][4E][S][]ES[ kkkKKK == ][ES ][S]ES[4 4 3 44 == kK 4321 4 4321 4 4 E][S][E][S][]ES[ kkkkKKKK == Khi cơ chất gắn vào, hằng số phân ly có thể giảm trong trường hợp điều hoà dương (tăng ái lực của enzyme với cơ chất) hoặc tăng trong trường hợp điều hoà âm (giảm ái lực của enzyme với cơ chất) [Marangoni, 2003]. S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 1 4 6 4 (13) (14) (15) (16) Nguyễn Xuân Hưng 2005 11 Chuẩn hoá phương trình tốc độ ta có [Marangoni, 2003]: 4321 4 321 3 21 2 1 4321 4 321 3 21 2 1 max /]S[/]S[4/]S[6/]4[S1 /]S[/]S[3/]S[3/]S[ kkkkkkkkkk kkkkkkkkkk V v ++++ +++ = Với Vmax = 4kcat[ET ]. Trong trường hợp đặc biệt, khi enzyme có tính điều hoà dương rõ rệt, [ES], [ES2], và [ES3] << [ES4]. Ta có dạng thu gọn [Marangoni, 2003]: 4 4 4321 4 4321 4 max ]S[' ]S[ /]S[1 /]S[ + = + » kkkkk kkkk V v ; Với k’ = k1k2k3k4= a3b2ck4 2.1.3 Trường hợp tổng quát Tổng quát hoá phương trình 18 với enzyme điều hoà cao có n trung tâm hoạt động: n n kV v ]S[' ]S[ max + = Phương trình 19 gọi là phương trình Hill. Hằng số Hill k’, hệ số Hill n, và Vmax là các tham số được dùng để xác định tính chất xúc tác của các enzyme điều hoà. Hằng số Hill liên quan đến các hằng số phân ly enzyme - cơ chất (k’ = Pkn) cho phép đánh giá ái lực của enzyme với một cơ chất riêng. Tương quan giữa hằng số Hill và nồng độ cơ chất tại ]S[ 2 1 0,5maxV là: nk ]S[' 0,5= Hằng số Hill là một chỉ số của ái lực enzyme với cơ chất, nhưng không phải là hằng số phân ly enzyme - cơ chất. Đơn vị của nó là (nồng độ)n. Do vậy khó mà so sánh các phản ứng có giá trị n khác nhau [Marangoni, 2003]. Hệ số Hill là một chỉ số của tính điều hoà trong quá trình gắn cơ chất. Giá trị n càng lớn, tính điều hoà càng cao. Trong trường hợp n = 1 (không hợp tác), phương trình Hill trở thành phương trình Michaelis - Menten. Khi mức độ hợp tác của các vị trí thấp, n sẽ không còn là số vị trí gắn cơ chất và có thể không phải là số nguyên [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Tuy nhiên, phương trình Hill vẫn có thể được sử dụng để xác định động học của enzyme điều hoà. Trong trường hợp này, hệ số xác định được từ thí nghiệm gọi là giá trị n biểu kiến (nH). Giá trị làm tròn lên của nH gọi là số vị trí gắn cơ chất nhỏ nhất trên enzyme oligomer. Ví dụ, từ thí nghiệm xác định được nH = 1,65. Mặc dù có thể nói rằng số vị trí gắn nhỏ nhất trên enzyme là 2 và các vị trí thể hiện mức độ hợp tác vừa phải. Tuy nhiên, không có bằng chứng thí nghiệm cho thấy enzyme này chỉ có hai vị trí gắn cơ chất. Nó có thể có 3, 4 hoặc nhiều vị trí gắn hơn với tính hợp tác yếu hơn. Điều này giải thích tại sao giá trị 2 trong ví dụ này gọi là số vị trí gắn có thể nhỏ nhất [Copeland, 2000]. Bằng cách kết hợp phương trình Hill với dữ liệu v - [S] thực nghiệm, có thể dễ dàng xác định k’, n, và Vmax. Hình 8.4 vẽ các đường cong v - [S] theo phương trình 19. Theo hình 6(a), khi số mũ Hill (n) lớn hơn độ sigmoid của đường cong rõ ràng hơn. Khi n = 1, (17) (18) (19) (20) Nguyễn Xuân Hưng 2005 12 đồ thị có dạng Michaelis–Menten. Tăng giá trị hằng số Hill (k’) làm độ dốc của đường cong v - [S] giảm dần (hình 6b). Do đó, từ phối cảnh topo học, hình dạng (mức độ sigmoid và độ dốc) của đường cong có thể xác định hai tham số này [Marangoni, 2003]. ▲Hình 6: (a) Mô phỏng hiệu quả khác nhau của số mũ Hill (n) đối với hình dạng của đường cong vận tốc - nồng độ cơ chất của enzyme điều hoà. (b) Mô phỏng hiệu quả của các hằng số Hill (k’) với hình dạng của đường cong vận tốc đầu - nồng độ cơ chất với enzyme điều hoà [Theo Marangoni, 2003]. Phương trình Hill có thể chyển về dạng tuyến tính bằng cách lấy loga hai vế: )'log(]Slog[log max kn vV v -=÷÷ ø ö çç è æ - Do đó, đồ thị log(v/(Vmax-v)) là hàm của log[S] có dạng đường thẳng với độ dốc bằng n và cắt trục tung tại -log(k’), như được minh hoạ trong hình 7. Tuy nhiên, đồ thị này không được sử dụng phổ biến vì cần biết trước Vmax và mối tương quan tuyến tính theo phương trình 21 chỉ đúng trong dải nồng độ cơ chất giới hạn (trong vùng [S] = k’). Do đó, bất cứ khi nào có thể, xác định Vmax, n, và Km của enzyme điều hoà từ đường cong không tuyến tính theo phương trình 19 là tốt nhất [Copeland, 2000]. ▲Hình 7: Đồ thị Hill log[v/(Vmax-v)] là hàm của log[S]. Đường thẳng cắt trục tung tại -log(k’) và độ dốc của nó cho phép đánh giá của hệ số Hill n [Theo Copeland, 2000]. (21) Nguyễn Xuân Hưng 2005 13 Phương trình Hill là hàm của ba tham số (k’, n, Vmax) là phương trình động học đơn giản nhất của các enzyme điều hoà. Từ khía cạnh thực nghiệm, mô hình hữu dụng nhất tiếp đó là mô hình đối xứng. Mặc dù nó chỉ thích hợp với điều hoà dương và đôi khi dựa trên các giả định không chắc chắn xảy ra, mô hình này có thể thích hợp với các hiệu ứng dị không gian [Marangoni, 2003]. 2.2 Mô hình đối xứng hay phối hợp Năm1965, J. Monod, J. Wyman, và J. P. Changeux đưa ra lý thuyết mô hình chuyển tiếp dị không gian (allosteric transitions). Mô hình này thích hợp với dị không gian nhưng không giải thích tính kháng hợp tác (anticooperativity). Họ đã đưa ra mô hình cấu trúc của các enzyme dị không gian với các tiên đề sau [Marangoni, 2003]: 1. Các enzyme dị không gian gồm các phần dưới đơn vị đồng nhất chiếm giữ các vị trí như nhau trong enzyme. Hay nói cách khác, có ít nhất một trục đối xứng trong phân tử. Mỗi phần dưới đơn vị là một đơn vị cấu trúc chứa duy nhất một vị trí gắn với mỗi phối tử đặt hiệu (cơ chất hay chất hoạt hoá). Một phần dưới đơn vị có thể không phải chỉ luôn là một chuỗi polypeptide [Leskovac, 2003; Marangoni, 2003]. 2. Mỗi phần dưới đơn vị chỉ tồn tại ở một trong hai trạng thái, R (lỏng hay ái lực gắn cơ chất lớn) hoặc T (chặt hay ái lực gắn cơ chất thấp). Hằng số phân ly của phức hệ cơ chất - dưới đơn vị trạng thái R (KR) thấp hơn của phức hệ cơ chất - dưới đơn vị trạng thái T (KT) [Marangoni, 2003]. 3. Tất cả các dưới đơn vị trong enzyme phải có dạng R hoặc T, không cho phép dạng hỗn hợp mà chỉ có cân bằng giữa chúng [Marangoni, 2003]. 4. Ái lực gắn của phối tử đặc hiệu phụ thuộc hình dạng của enzyme (R hoặc T) mà không phụ thuộc vào sự chiếm giữ bởi cơ chất ở vị trí gần kề [Marangoni, 2003]. 5. Khi protein chuyển từ trạng thái này đến trạng thái khác, tính đối xứng phân tử của nó được bảo tồn [Leskovac, 2003]. Trong khi mô hình SI sử dụng một chuỗi biến đổi cấu trúc bậc ba, mô hình MWC sử dụng biến đổi cấu trúc bậc bốn [Koshland, 1968]. Khi không có phối tử, cân bằng giữa hai trạng thái dị không gian của protein: R0 T0 R0 và T0 là hai trạng thái hình dạng của enzyme không gắn với phối tử. Hằng số cân bằng (L) của hai trạng thái “trống” này gọi là hằng số dị không gian [Copeland, 2000]: ]R[ ]T[ 0 0=L L được giả định là lớn tức protein trong trạng thái hình dạng T nhiều hơn trong hình dạng R. Họ đưa ra L = 104 [Garrett & Grisham, 2003]. (21) Nguyễn Xuân Hưng 2005 14 Trường hợp tổng quát Xét trường hợp enzyme gồm bốn phần dưới đơn vị, quan tâm đến các cách sắp xếp cơ chất (S) khác nhau ta có các cân bằng sau R + S RS1 T + S TS1 R + RS1 RS2 T + TS1 TS2 R + RS2 RS3 T + TS2 TS3 R + RS3 RS4 T + TS3 TS4 Tất cả các phương trình cân bằng trên có hằng số phân ly nội tại KR ứng với trạng thái R và hằng số phân ly nội tại KT ứng với trạng thái T [Leskovac, 2003]. ◄Hình 8: Mô hình chuyển tiếp dị không gian Monod - Wyman - Changeux (MWC). Protein dimer có hai trạng thái hình dạng R hoặc T. Mỗi dưới đơn vị trong dimer có một vị trí gắn cơ chất S và một vị trí hiệu ứng dị không gian F. Các phần dưới đơn vị đồng nhất, đối xứng và tính đối xứng này được duy trì trong cả hai trạng thái hình dạng. Trạng thái của protein khi gắn hoặc không gắn với phối tử liên hệ với nhau thông qua cân bằng khác nhau. Do đó, tương quan mật độ của các phân tử trong trạng thái R và T là hàm của các cân bằng này và nồng độ của cơ chất và các chất hiệu ứng khác nhau (cái gắn với FSR hoặc FST). Khi [S] tăng, cân bằng T/R chuyển theo hướng tăng nồng độ R [Theo Garrett & Grisham, 2003]. Nguyễn Xuân Hưng 2005 15 ◄Hình 9: Biểu đồ thể hiện các cân bằng gắn cơ chất của enzyme tetramer theo mô hình SI (1965) [Theo Copeland, 2000]. Quan tâm đến các khả năng phân ly có thể của các phức hệ R1, R2, R3, R4 và T1, T2, T3, T4, ta có các phương trình biểu diễn nồng độ của 10 dạng enzyme trong hình 9 qua nồng độ trạng thái trống [Leskovac, 2003]: ]R[4]R[]S[4]R[ 001 a== RK ]R[4]R[]S[4]T[ 001 cLLK c R a== ]R[6]R[]S[4]R[ 0 2 02 2 2 a== RK ]R[6]R[]S[6]T[ 02202 22 2 LcLK c R a== ]R[4]R[]S[4]R[ 0 3 03 3 3 a== RK ]R[4]R[]S[4]T[ 03303 33 3 LcLK c R a== ]R[]R[]S[]R[ 0 4 04 4 4 a== RK ]R[]R[]S[]T[ 04404 44 4 LcLK c R a== [T0] = L[R0] Trong đó hệ số gắn chung (nonexclusive binding coefficient), c, là tỷ lệ hằng số phân ly nội tại enzyme - cơ chất của enzyme trong các trạng thái R và T: T R K Kc = (22) (24) (26) (28) (23) (25) (27) (29) (30) (31) R2 R4 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R3 R1 T2 T1 T4 T0 R0 T3 +S +S +S +S +S +S +S +S KS KS KS KS KS KS KS KS L Nguyễn Xuân Hưng 2005 16 a là nồng độ chuẩn hoá của cơ chất: RK S][ =a Trường hợp enzyme oligomer có n vị trí gắn cơ chất Tỷ lệ protein trong trạng thái R (hàm trạng thái R): ])T[...]T[]T[]T[]T([])R[...]R[]R[]R[]R([ ]R[...]R[]R[]R[]R[ n3210n3210 n3210 +++++++++++ +++++ =R Tỷ lệ các vị trí thực tế đã gắn phối tử (YF = hàm bão hoà): ])T[...]T[]T[]T[]T([])R[...]R[]R[]R[]R([ ])T[...]T[3]T[2]T([])R[...]R[3]R[2]R([ n3210n3210 n321n321 F +++++++++++ +++++++++ = nn nnY Sử dụng các phương trình cân bằng và phương trình 31 và 32 và các phương trình biểu diễn nồng độ theo trạng thái trống ta thu được hai hàm mới. Hàm trạng thái R: nn n cL R )1()1( )1( aa a +++ + = Tương tự, hàm trạng thái T: nn n cL cLT )1()1( )1( aa a +++ + = Tỷ lệ tương đối của protein trong trạng thái R so với protein trong trạng thái T (quotient function): n n cLR R T RQ )1( )1( 1 a a + + = - == Với một enzyme trong các điều kiện cân bằng nhanh, tỷ lệ các vị trí bị phối tử F chiếm giữ bằng v0/Vmax [Leskovac, 2003]. Do đó: nn nn cL cLc V vY )1()1( )1()1( 11 max 0 F aa aaaa +++ +++ == -- Rút gọn phương trình này: RR c c V vY ÷ ø ö ç è æ + +- + == a a a a 1 )1( )1(max 0 F Vai trò của L và c với tính hợp tác Hình 10 minh họa hiệu ứng của L và c đối với hình dạng và độ sigmoid của các đường cong bão hoà. Hình này vẽ các đường cong lý thuyết của hàm YF tương ứng với (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) Nguyễn Xuân Hưng 2005 17 các giá trị L và c khác nhau. Trong đó, hiệu ứng hợp tác dị hướng của phối tử được tiên đoán bởi các tính chất đối xứng của mô hình, được biểu hiện bởi độ cong phần thấp hơn của đường cong. Đồ thị cho thấy tính hợp tác của phối tử phụ thuộc vào các giá trị L và c. Tính hợp tác rõ ràng hơn khi hằng số dị không gian lớn tức khi cân bằng R0 T0 nghiêng về về phía T0. Tính hợp tác cũng rõ ràng khi tỷ lệ của các hằng số phân ly vi mô (c) nhỏ [Leskovac, 2003]. Do đó, có thể kết luận là tính hợp tác gắn phối tử phụ thuộc lớn vào độ lớn của L và c. Đường cong bão hoà trở nên sigmoid hơn khi L tăng tức trạng thái T chiếm đa số. Cũng vậy, đường cong bão hoà sigmoid hơn khi c giảm tức là ái lực của trạng thái T với S giảm tương đối so với ái lực của R với S [Leskovac, 2003]. ▲Hình 10: Các đường cong lý thuyết của hàm bão hoà YF với L, c biến thiên và n = 4 [Theo Leskovac, 2003]. Với bất kỳ hệ thống enzyme nào, các hiệu ứng hoạt hoá hay kìm hãm được đánh giá trong giới hạn biến thiên của Km và Vmax. Có hai loại hiệu ứng trong các enzyme dị không gian [Leskovac, 2003]: - Hệ thống K: F và S có ái lực khác nhau với trạng thái R và T. Do đó, rõ ràng sự có mặt của F sẽ thay đổi ái lực của enzyme với S và ngược lại. - Hệ thống V. Trường hợp này R và T có cùng ái lực với cơ chất S nhưng khác nhau trong khả năng xúc tác và ái lực của chúng với F. F có thể là chất hoạt hoá, A (hệ thống V dương), hoặc chất kìm hãm, I (hệ thống V âm). 2.2.1 Khi không có chất hiệu ứng Trường hợp gắn riêng (cơ chất chỉ có ái lực với trạng thái R) Mô hình này giả định rằng trạng thái T hầu như không có ái lực với cơ chất S (do đó KT >> KR,, c = 0). Dưới điều kiện này: n n L R )1( )1( a a ++ + = phương trình vận tốc rút gọn thành: (40) Nguyễn Xuân Hưng 2005 18 n n L R V v Y )1( )1( 1 1 max 0 F a aa a a ++ + =÷ ø ö ç è æ + == - Khi enzyme có bốn vị trí gắn cơ chất: 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S max 0 ]S[]S[4]S[6]S[41 ]S[]S[3]S[3]S[ KKKK L KKKK V v +++++ +++ = Với KS = KR. Hệ thống V Trong hệ thống V, các trạng thái R và T có cùng ái lực với S, nhưng hoạt tính xúc tác nội tại khác nhau hay Rcatk > Tcatk . Phương trình tốc độ của hệ thống V với giả định cân bằng nhanh [Leskovac, 2003]: )1)(1( )1( max 0 F L gL V vY ++ + == a a Với Vmax = nkcatE0 và g là tỷ lệ hoạt tính xúc tác trong trạng thái T và R. Trong phương trình trên g Tcatk ). Đồ thị Mechaelis trong hệ thống V này là hypebol chỉ khi hỗn hợp 2 enzyme cùng Km nhưng Vmax khác nhau [Schuller et al., 1995; Grant et al., 1996]. Hệ thống K và V hỗn hợp Trong trường hợp này, các trạng thái R và T có ái lực khác nhau (c ¹ 1), cũng như hoạt tính xúc tác khác nhau ( Rcatk ¹ Tcatk hay g ¹ 1) với S. Phương trình tốc độ trở thành: nn nn cL cgLc V v Y )1()1( )1()1( 11 max 0 F aa aaa +++ +++ == -- Với Vmax = nkcatE0. Nếu g < 1 và c < 1, trạng thái R có ái lực và hoạt tính với S cao hơn. Cũng có trường hợp trong đó trạng thái ái lực cao hơn, hoạt tính xúc tác thấp hơn (g > 1 và c < 1) dẫn đến sự kìm hãm cơ chất [Leskovac, 2003]. 2.2.2 Các chất hiệu ứng gắn riêng Kìm hãm trong hệ thống K gắn riêng (cơ chất chỉ gắn với trạng thái R và chất kìm hãm chỉ gắn với trạng thái T) Giả sử trong hệ thống K, chất kìm hãm dị không gian có ái lực cao hơn với trạng thái T. Do đó cân bằng T0 R0 sẽ chuyển dịch về phía T0. Nếu cơ chất S chỉ gắn với trạng thái R (c = 0) và chất kìm hãm I chỉ gắn với trạng thái T ( RiK / TiK >>1), phương trình tốc độ trở thành: (41) (42) (43) (44) Nguyễn Xuân Hưng 2005 19 nn n L R V vY )1()1( )1( )1( 1 max 0 F ab aa a a +++ + = + == - Với nn n L R )1()1( )1( ab a +++ + = RKK SS ]S[]S[ ==a , TKK ii ]I[]I[ ==b Áp dụng với enzyme tetramer: ÷÷ ø ö çç è æ +++++÷÷ ø ö çç è æ ++++ +++ == 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S 4 i 4 3 i 3 2 i 2 i 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S max 0 F ]S[]S[4]S[6]S[41]I[]I[4]I[6]I[41 ]S[]S[3]S[3]S[ KKKKKKKK L KKKK V vY Phương trình 48 chứa cả [I] và [S], vì mỗi phối tử chỉ gắn với một trong hai trạng thái. Phương trình 45 cho thấy khi nồng độ S tăng, đồ thị của v0/Vmax - [I] trở nên sigmoid hơn (hình 11) [Leskovac, 2003]. Có thể dùng đồ thị để xác định Ki và L trong hệ thống này bằng cách biến đổi phương trình 45: nLvV v )1( 1 0max 0 ba a + = - Với ÷ ø ö ç è æ + = a aa 1maxmax VV và n)(1 L aa + =L Chuyển phương trình 49 về dạng tuyến tính: n i n n L K L v vV a a a +÷ ÷ ø ö ç ç è æ = - ]I[ 0 0max Do đó, nếu nồng độ cơ chất không đổi (a = [S]/KA), đồ thị n vvV 00max /)( -a - [I] có dạng đường thẳng cắt trục hoành và trục tung các giá trị Ki và n La tương ứng. (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) Nguyễn Xuân Hưng 2005 20 ▲Hình 11: Sự kìm hãm của enzyme tetramer trong hệ thống K. Các đường cong vẽ theo phương trình 45. Khi nồng độ cơ chất S tăng (a= [S]/Ks), các đường cong sigmoid hơn [Theo Leskovac, 2003]. Hoạt hoá trong hệ thống K gắn riêng (S gắn với cả hai trạng thái nhưng A chỉ gắn với trạng thái R) Giả sử trong hệ thống K, chất hoạt hoá dị không gian A gắn ưu tiên với trạng thái R không tại trung tâm hoạt động. Trong trường hợp đặc biệt này, RKA / TKA <<1. Chất hoạt hoá bắt chước (mimic) cơ chất bằng cách chuyển dịch cân bằng T0 R0 về phía R0. Phương trình tốc độ trong trường hợp này: n n n LV v Y )1( )1( )1( 1 max 0 F a g aa ++ + + == - Với RKK SS ]S[]S[ ==a và RKK AA ]A[]A[ ==g Cả S và A có thể gắn độc lập với phần dưới đơn vị R tạo thành rất nhiều khả năng hình thành phức giữa trạng thái R và phối tử. Phương trình tốc độ trong trường hợp này sẽ phức tạp hơn nhiều. Với enzyme dimer, phương trình tốc độ 52 có dạng: 2 A 2 S 22 2 AS 2 A 2 S 2 AS 2 A 2 A 2 S 2 S 2 A 2 S 22 2 AS 2 A 2 S 2 AS 2 S 2 S max 0 F ]A[]S[]A][S[2]A[]S[2]A][S[4]A[]A[2]S[]S[21 ]A[]S[]A][S[]A[]S[2]A][S[2]S[]S[ KKKKKKKKKKKK L KKKKKKKKKK V v Y +++++++++ +++++ == Với Vmax=2kcatE0 (52) (53) (54) Nguyễn Xuân Hưng 2005 21 Rút gọn phương trình 54 thành: 2 A 2 S 2 ASS max 0 F ]A[1]S[1 ]A[1]S[1]S[ ÷÷ ø ö çç è æ +÷÷ ø ö çç è æ ++ ÷÷ ø ö çç è æ +÷÷ ø ö çç è æ + == KK L KKK V vY Biến đổi tiếp ta được: 22 2 max 0 F )1()1( )1)(1( ga gaa +++ ++ == LV v Y Với a và g xác định giống như phương trình 53. Hình 12 vẽ hệ thống K trong trường hợp hoạt hoá. ▲Hình 12: Sự hoạt hoá của enzyme tetramer trong hệ thống K. Các đường cong vẽ theo phương trình 52. Nồng độ của chất hoạt hoá g tăng dần trong sự có mặt của các nồng độ cơ chất khác nhau, a, và ngược lại [Theo Leskovac, 2003]. L và KA trong hệ thống này tương tự với hệ thống trước đây. Với mục đích này, phương trình tốc độ thông thường của chất hoạt hoá 52 có thể chuyển thành dạng tuyến tính: nn n LLKvV v aa a 1]A[1 A0max 0 +÷ ÷ ø ö ç ç è æ = - Với amaxV và La có ý nghĩa theo phương trình 50. (55) (56) (57) Nguyễn Xuân Hưng 2005 22 Tương tác dị hướng với các phối tử dị không gian Bây giờ phân tích mô hình với khía cạnh các tương tác dị hướng giữa các phối tử dị không gian khác nhau, mỗi phối tử gắn tại một vị trí riêng biệt. Giả định rằng một trong các phối tử này là cơ chất S chỉ có ái lực mạnh với các vị trí trong trạng thái R. Tương tự, hai phối tử khác là chất kìm hãm I có ái lực riêng với trạng thái T và chất hoạt hoá A chỉ có ái lực với trạng thái R (hình 13) [Leskovac, 2003]. ▲Hình 13: Hiệu ứng dị không gian dị hướng: A và I gắn tương ứng với R và T trong trường hợp đơn giản nhất (enzyme dimer). Các tham số của hệ thống này: (1) S và A (hoặc I) có ái lực khác nhau với R và T và (2) A (hoặc I) biến đổi rõ ràng K0.5 bởi sự dịch chuyển tương đối tử lệ R/T [Theo Garrett & Grisham, 2003]. Theo mô hình này, các hiệu ứng dị hướng làm chuyển dịch cân bằng giữa các trạng thái R và T của protein. Do đó, hàm bão hoà với cơ chất khi có chất hoạt hoá và kìm hãm là: n n LV v Y )1(' )1( 1 max 0 F a aa ++ + == - Ở đó L’ là hằng số dị không gian rõ rệt (apparent allosteric constant) được định nghĩa là: å å= n n R T L 0 A 0 I' Với ånT0 I và å n R 0 A là tổng các phức hệ của trạng thái T với I và R với A tương ứng. (58) (59) Nguyễn Xuân Hưng 2005 23 Như vậy: n n LL )1( )1(' g b + + = Với b = [I]/KI và g = [S]/KS, ở đó KI và KA đại diện cho các hằng số phân ly vi mô của chất kìm hãm và chất hoạt hoá tương ứng với trạng thái R và T. Thay giá trị L’ trong phương trình 58 chúng ta có: n n n n LV v Y )1( )1( )1( )1( 1 max 0 F a g b aa ++ + + + == - ▲Hình 14: Các đường cong lý thuyết thể hiện các hiệu ứng dị hướng của chất hoạt hoá dị không gian (g) hoặc chất kìm hãm (b) với hình dạng của hàm bão hoà. Vẽ theo phương trình 61 [ Theo Leskovac, 2003]. Khi cơ chất tự nó là phối tử dị không gian, sự có mặt của chất hiệu ứng có thể làm biến đổi hình dạng của đường cong bão hoà như hình 14. 2.2.3 Cơ chất và chất hiệu ứng gắn chung (nonexclusive) Mô hình MWC cũng có thể thích hợp đáng kể với các trường hợp phức tạp hơn. Ví dụ, phương trình 61 phức tạp hơn mặc dù thực tế hơn, nếu các phối tử được giả định có ái lực đáng kể với cả hai trạng thái [Monod et al., 1963]. Một loại cơ chất và một loại chất hiệu ứng gắn với cả hai trạng thái Ví dụ, nếu cơ chất, S, và chất hiệu ứng, F gắn với cả trạng thái R và T và cả hai trạng thái có hoạt tính ngang nhau, phương trình vận tốc hoàn chỉnh là: (60) (61) Nguyễn Xuân Hưng 2005 24 nnnn nnnn ecL ecLc V vY )1()1()1()1( )1()1()1()1( 11 max 0 F gaga gaagaa +++++ +++++ == -- Với F ]F[ K =g , nồng độ chất hiệu ứng đặc hiệu T F R F K Ke = , tỷ lệ của các hằng số phân ly chất hiệu ứng Tử số của phương trình 62 bây giờ cho thấy tất cả các phức hệ R và T chứa cơ chất. Nếu c 1, chất hiệu ứng trở thành chất kìm hãm [Leskovac, 2003]. Một loại cơ chất và hai loại chất hiệu ứng gắn với cả hai trạng thái Sự gắn cơ chất và chất hiệu ứng chung (nonexclusive) có thể thậm chí phức tạp hơn; do đó, S có thể gắn với enzyme khi có chất kìm hãm I và chất hoạt hoá A. Trong trường hợp này, phương trình tốc độ phức tạp hơn: nn nn cL ccL V v Y )1()1(' )1()1(' 11 max 0 F aa aaaa +++ +++ == -- Hằng số phân ly rõ ràng L’: nn nn feLL )1()1( )1()1(' bg bg ++ ++ = Với T A R A K Ke = và T i R i K Kf = Xác định c trong các hệ thống chung Trong quá trình nghiên cứu enzyme dị không gian phosphofructokinase, Blangy và cộng sự (1968) đã phát triển phương pháp đánh giá hằng số gắn RSK , TSK và c trong hệ thống K chung [Leskovac, 2003]. Để minh hoạ phương pháp này, quan tâm đến hệ thống trong đó cơ chất có ái lực đáng kể với trạng thái T, mặc dù c vẫn nhỏ hơn 1 nhiều (c = 0,001). Giả sử một chất kìm hãm I được cho vào và gắn hầu như riêng với trạng thái T, nếu nồng độ của chất kìm hãm trở nên cao và bão hoà, hình dạng của enzyme sẽ được điều khiển hầu như riêng cho trạng thái T suốt toàn bộ dải nồng độ cơ chất sử dụng và đường cong vận tốc sẽ có dạng hypebol với [S] = TSK tại một nửa tốc độ tối đa của phản ứng [Leskovac, 2003]. (62) (63) (64) (65) (66) (67) Nguyễn Xuân Hưng 2005 25 Một các khác, khi nồng độ chất hoạt hoá A (gắn riêng với trạng thái R) bão hoà, enzyme sẽ bị điều khiển hoàn toàn bởi trạng thái R. Lần này [S] = RSK tại nửa vận tốc cực đại của phản ứng. Từ hai đánh giá này, hằng số gắn chung, c: T S R S K K c = Để vẽ các đồ thị thích hợp nhằm đánh giá RSK và TSK bằng đồ thị, phương trình tốc độ 65 thường được chuyển thành ba phần riêng [Leskovac, 2003]: - Khi không có chất hiệu ứng: nn nn cL cLc V v Y )1()1( )1()1( 11 max 0 F aa aaaa +++ +++ == -- - Khi có cơ chất và chất hoạt hoá A: nnnn nnnn ecL ecLc V v Y )1()1()1()1( )1()1()1()1( 11 max 0 F gaga gaagaa +++++ +++++ == -- - Khi có cơ chất và chất kìm hãm I: nnnn nnnn fcL fcLc V v Y )1()1()1()1( )1()1()1()1( 11 max 0 F baba baabaa +++++ +++++ == -- Hình 15 vẽ các đường cong dựa vào các phương trình 69-71. Từ hình này, có thể xác định các giá trị RSK và TSK trực tiếp từ hình vẽ, và tính toán tỷ lệ của chúng (c = RSK / TSK = 1/100 = 0,01) [Leskovac, 2003]. (68) (69) (70) (71) Nguyễn Xuân Hưng 2005 26 Bảng 3: Ví dụ về các enzyme dị không gian tuân theo mô hình MWC [Monod et al., 1965; Neet, 1995]. Enzyme Cơ chất + Chất kìm hãm + Chất hoạt hoá Chất kìm hãm + chất hoạt hoá Tham khảo Pyruvate kinase (Nấm men) (EC 2.7.1.40) Phosphoenolpy ruvate ADP - Fructose-1,6- bisphosphate (hình 1) - Haekel et al., 1968 ; Colman 1990 Isochitrate dehydrogenase (Neurospora crassa) (EC 1.1.1.41) D-Isocitrate NAD+ - AMP (Phương trình 52, hình 12) - Hathaway & Atkinson, 1963 ; Colman 1990. Deoxythimidime kinase (Escherichia coli) (EC 2.7.1.21) Deoxythymidi me ATP - dCDP (Phương trình 52, hình 12) - Okazaki & Kornberg, 1964 Threonine deaminase (Escherichia coli) (EC 4.2.1.16) L-Threonine (phương trình 38, hình 10) L-Isoleucine (phương trình 45, hình 11) L-Norleucine (phương trình 52, hình 12) L-Isoleucine + L-Norleucine (Phương trình 61, hình 13) Changeux, 1962, 1964 dCMP deaminase (Lá lách lừa) (EC 3.5.4.23) dCMP dTTP dCMP dTTP + dCTP (Phương trình 61, hình 13) Scarano et al., 1963, 1964 Phosphofructokina se (Bacillus stearothermophilu s) (EC 2.7.1.11) Fructose-6- phosphate ATP Phosphoenolpyr uvate ATP Phosphoenol- pyruvate + ATP (Phương trình 13.64, hình 14) Blangy et al., 1968 Mô hình MWC rất linh hoạt, tương thích với động học của phần lớn enzyme dị không gian [Neet, 1995]. Bảng 3 liệt kê một số enzyme dị không gian tương thích với hầu hết các mô hình động học được mô tả trong phần này [Leskovac, 2003]. Nguyễn Xuân Hưng 2005 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abelson, P. H. 1954. J. Biol. Chem. 206, 335. In Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc. New York, NY. Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc. New York, NY. Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Ehle, W. 2004. Enzymes in industry. Wiley-VHC Verlag GmbH & Co. KagaA. Weinheim. Fischer, E. H., A. Pocker, and J. C. Saari. 1971. Essays Biochem. 6, 23–68. In Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Gilbert, H. F. 2000. Basic concept in biochemistry. McGraw-Hill. J. Monod, J.-P. Changeaux, and F. Jacob. 1963. J. Mol. Biol. 6, 306–329. In Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Klotz, M. 1997. Ligand - receptor energetics. Wiley, New York. Koshland, D. E., Nemethy, G., and Filmer, D. 1966. Biochemistry, 5, 365. In Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley- VCH, Inc. New York, NY. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên. 2002. Hoá sinh công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật, HN. Leskovac, V. 2003. Comprehensive enzyme kinetics. Kluwer academic/Plenum publishers. NY. Marangoni, A. G. 2003. Enzyme Kinetics: A Modern Approach. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. Monod, J., and F. Jacob. 1961. CSHSQB 26, 389–401. In Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Monod, J., Wyman, J., and Changeux, J. P. 1965. J. Mol. Biol. 12, 88. In Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc. New York, NY. Neet, K. E. 1995. Methods Enzymol. 249, 519-567. Perutz, M. 1990. Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins, Cambridge University Press, New York. In Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc. New York, NY. Segel, I. H. 1975. Enzyme Kinetics, Wiley, New York. In Copeland, R. A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc. New York, NY. Umbarger, H. E. 1956. Science 123, 848. In Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Yates, R. A., and A. B. Pardee. 1956. J. Biol. Chem. 221, 757–780. In Creighton, T. E. 1999. Encyclopedia Of Molecular Biology Vol 1-4. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Talaro, K. P. 2002. Foundations in Microbiology, Fourth edition McGraw−Hill Companies. Nguyễn Xuân Hưng 2005 29 Schuller, D.J., Grant, G.A., & Banaszak, L.J. 1995. The allosteric ligand site in the Vmax-type cooperative enzyme phosphoglycerate dehydrogenase. Nature Struct. Biol. 2, 69–76. Grant, G.A., Schuller, D.J., & Banaszak, L.J. 1996. A model for the regulation of D-3- phosphoglycerate dehydrogenase, a Vmax-type allosteric enzyme. Protein Sci. 5, 34–41. Blangy, D., Buc, H., & Monod, J. 1968. Kinetics of the allosteric transition of phosphofructokinase from E. coli. J. Mol. Biol. 31, 13–35. Gunasekaran, K., B. Ma, and R. Nussinov. 2004. Is Allostery an Intrinsic Property of All Dynamic Proteins?. PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 57:433–443.