Enzyme Amylase và các ứng dụng

một mạch xoắn dài không phân nhánh. • Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α- 1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợp gồm nước và tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột. ¾ Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glucogen được Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 8 cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2 - 3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. 2. Phân Loại: Enzymes Amylase có 5 loại: Enzym α - amylase(EC 3.2.1.1) Enzyme Pullulanase (EC 3.2.1.41 ) hay α – 1-4 – glucanohydrolase hay α - dextrin 6 – glucosidase. Enzyme Isoamylase (EC 3.2.1.68) Enzyme β – amylase (EC 3.2.1.2). hay glycogen 6 – glucanohydrolase. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 9 Enzyme γ - amylase (EC 3.2.1.3) hay glucose amylase 3. Đặc Tính: Enzyme thủy phân tinh bột tạo thành dextrin và một ít maltoza. Dextrin có khả năng họat hóa cao đặc trưng cho tính chất của enzyme này. Phân tử có 1 - 6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme .Tính bền nhiệt của enzyme α - amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt: + Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: - Nấm mốc: pH 4,5 - 4,9 - Vi khuẩn: pH 5,9 - 6,1; pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ enzyme của Asp.Niger (pH 2,5 - 2,8). + α - Amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn glucose và maltose. + Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Trong dung dịch đệm pH = 4,7 thì α - amylase của Asp. Oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ thì hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29% và hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 500C trong 2 giờ thì α - amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn. α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng do α-amylase là một protein Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 10 giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme; α- amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.Trọng lượng phân tử của α- amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ). Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-Amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+ thì không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9; leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2; phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7; cystein và cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.Oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme (Akabori et amiloza, 1965). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. α-Amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953). α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 11 dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase Vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau, pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4 - 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 - 5,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.Oryzae trong vùng 5,6- 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của Asp.Oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.Subtilis. Ở pH= 3,6 và 00C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5 - 2,8. Ở 00C và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C(Kozmina, 1991). Trong dung dịch đệm pH= 4,7 thì α-amylase của Asp.Oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự). Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 12 α-amylase 4. Cơ Chế Tác Dụng: Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase • Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp • Giai đoạn đường hóa: Dextrin Æ tetra và trimaltose Æ disaccharide&monosaccharide. Amylase Æ oligosacharide Æ poliglucose. Maltose Æ maltotriose Æ maltotetrose. α-Amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau, có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod. Các chất này Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 13 bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose(vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6- glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. III. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE: Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đa và đang phát triễn mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đa được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 14 ligase, amylase,… và một số enzym đặc biệt khác. Sau đây là một số ứng dụng của enzyme Amylase được sử dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. 1. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Chế Biến Thực Phẩm Gia Súc: Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào. Enzyme amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. 2. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Dược Phẩm. Nguồn cung cấp enzyme amylase là vi khuẩn Bacillus subtilis với ưu điểm là bền hơn trong môi trường acid của dạ dày so với diastase (amylase) lấy từ động vật và vi nấm. Amylase được sử dụng để phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh. Mặt khác amylase phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme đường tiêu hóa. Trong cơ thể, amylase là hormon tuyến tuỵ ngoại tiết, có tác dụng chống phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ. Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuẩn đường hô hấp trên hoặc dưới. Các sản phẩm chứa enzyme alpha- amylase dùng Alpha-amylase là một loại enzyme mà sẽ kiểm soát lượng calo của cơ thể. Alpha-amylase là một men nội sinh có thể thủy phân tinh bột và các polysaccharide (hoạt tính amylotic) bằng cách tấn công vào mối nối a-1,4 glucosidic cho ra các dextrine, oligosaccharide và monosaccharide. Alpha-amylase dùng trong Neopeptine viên nang được lấy từ nguồn vi khuẩn Bacillus subtilis. Amylase của vi khuẩn cho đến nay có ưu điểm là bền hơn trong môi trường acid của dạ dày so với diastase (amylase) lấy từ động vật và vi nấm. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 15 Sản phẩm chữa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống suy dinh dưỡng và các sản phẩm cùng loại: 3. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Công Nghiệp Dệt Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm enzym amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm amylase khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 900C. Tuy nhiên ngoài chế phẩm enzym amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng amylase từ nấm sợi. Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng enzym trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Các nước sử dụng lượng enzym amylase nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Đan Mạch. Ngoài ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm…ở quy mô công nghiệp. MINIGADINE TRYMO CALCINOL-RB CALCINOL 1000 NEOGADINE elixir 150ml NEOPEPTIN Liquid Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 16 4. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Việc Tẩy Màu Giấy. Việc sử dụng enzyme để khử mực giấy loại trên thế giới đã có thăm dò theo nhiều hướng và một số chủng vi sinh, theo các công bố gần đây nhất cho thấy, enzyme α-amylase đang có khả năng thúc đẩy quy trình khử mực tốt. Nguyên lý hoạt động của enzyme là: chúng bẻ gãy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéo theo sự làm long các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho quá trình tuyển nổi khử mực. Giai đoạn từ năm 2000, Viện Công nghiệp giấy và xenluylô đã đầu tư nghiên cứu một cách tích cực về sử dụng enzyme trong công nghệ khử mực giấy loại, trong đó đặc biệt chú trọng đối với chủng enzyme α-amylase. Kết quả đã nghiên cứu thành công và thiết lập quy trình công nghệ sử dụng enzyme α-amylase để khử mực giấy loại có gia keo tinh bột. Nguyên liệu: giấy photocopy, giấy văn phòng loại, giấy in bằng mực laser một mặt có gia keo tinh bột. Quy trình xử lý: bao gồm các bước ngâm và xử lý giấy loại bằng enzyme α- amylase tại nhiệt độ thường, xử lý cơ hóa nhiệt: đánh tơi có pha trộn hóa chất và gia nhiệt, ủ tại điều kiện nhiệt độ, pha loãng và tuyển nổi, rửa và cô đặc, thành phẩm. Hóa chất sử dụng: enzyme α-amylase, NaOH công nghiệp, Na2SiO3, H2O2, chất hoạt tính bề măt, chất tạo bọt, dầu béo. Mẫu đối chứng không sử dụng enzyme α-amylase, các điều kiện công nghệ khác không đổi. Hiệu quả: Thời gian ủ giảm 30%, mức dùng các loại hóa chất giảm 10 - 35% tùy theo từng loại, giảm nhiều nhất là mức dùng NaOH (giảm 35%), độ trắng của bột sau khử mực tăng 2,7 - 3,0% ISO, độ dài đứt tăng 1,5%, độ chịu gấp (đôi lần) tăng 14% và độ chịu xé tăng 28%. Độ trắng cuối cùng đạt tối đa 87,0% ISO. Dịch vụ cung cấp: Hiện nay Viện Công nghiệp giấy và xenluylô có thể cung cấp cho các đối tác có nhu cầu các dịch vụ kỹ thuật sau: thiết kế chế tạo và cung cấp thiết bị toàn bộ dây chuyền xử lý giấy loại bằng enzyme α-amylase và tuyển nổi khử Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 17 mực công suất đến 30 tấn/ngày, hướng dẫn lắp đặt, chuyển giao công nghệ, đào tạo và hướng dẫn vận hành. Năm 2008, Viện công nghiệp giấy và xenluylô tiếp tục mở rộng nghiên cứu các chủng loại enzym khác nhau để khử mực giấy loại theo Hợp đồng nghiên cứu giữa Viện với Bộ Công thương. Vừa qua Hợp đồng nghiên cứu đã được nghiệm thu, trên cơ sở các kết quả nghiên cứu có thể triên khai ứng dụng ở một số xí nghiệp sản xuất bột giấy DIP. - Chủng loại Enzym sử dụng: BIO-DE 30 với thành phần gồm: xylanase, cenllulase và β-glucanase, mananase, α-amylase với nguyên liệu là giấy loại văn phòng. - Nguyên liệu sử dụng: Giấy loại văn phòng - Quy trình chọn lựa: + Bước 1: xử lý giấy loại bằng enzym với mức dùng, độ pH, nhiệt độ và thời gian phù hợp. + Bước 2: Xử lý bằng hóa chất: NaOH công nghiệp, Na2SiO3, H2O2, DTPA, chất hoạt tính bề măt. - Hiệu quả thu được: + Tăng độ trắng của bột giấy lên 1,5÷3,0 %ISO. + Tăng hiệu quả loại mực. + Tiết kiệm 10÷30% hóa chất tùy theo từng loại. + Giảm nhiệt độ trong giai đoạn đánh tơi và ủ 10÷15oC. + Không làm thay đổi chế độ công nghệ như sử dụng phương pháp khử mực thông thường. + Giảm ảnh hưởng xấu tới môi trường do giảm được mức dùng hóa chất + Các kết quả ban đầu cho thấy là hoàn toàn khả quan khi tiến hành áp dụng vào thực tế sản xuất. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 18 Cùng với việc nghiên cứu sử dụng chủng loại enzym BIO-DE 30, Viện công giấy và xenluylô đang tiếp tục nghiên cứu ứng dụng một số loại chủng loại enzym thế hệ mới, sử dụng cho quá trình khử mực giấy báo và tạp chí. - Dịch vụ cung cấp: Thiết kế chế tạo hệ thống thiết bị tuyển nổi, hướng dẫn lắp đặt, chạy thử và giao công nghệ khử mực giấy loại văn phòng sử dụng enzym BIO-DE 30 kết hợp với sử dụng hóa chất. 5. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Sản Xuất Bia: Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzym amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzym của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzym amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm. Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không sử dụng hoàn tòan 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trịnh lên men. Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzym amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột .Enzym này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 19 Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzym cellulose có tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thóat ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzym khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzym này được sử dụng để loại trừ O2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều. 6. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Sản Xuất Cồn: Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau.Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Quá trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa. Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid). Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzym này thay amylase của malt để sản xuất cồn. Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt ( mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu. Giai đọan rượu hóa, nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem đây là một quá trình áp dụng enzym. Qúa trình rượu hóa là quá trình hết sức phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều enzym khác nhau. Điểm khác với enzym amylase là ở chổ các enzym tham gia quá trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 20 bởi enzym trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường. 7. Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Sản Xuất HFCS: HFCS (High Fructose Corn Syrup) là một nhóm bất kì của siro bắp mà trải qua quá trình enzyme để làm tăng hàm lượng fructose và sau đó được pha trộn với siro bắp sạch (100% glucose) để tạo thành dạng sản phẩm cần thiết. Nguyên nhân chính là: + Nguyên liệu rẻ ở Mỹ, nó phụ thuộc vào giá cả của bắp và đường. + Sản phẩn dễ dùng để pha trộn và di chuyển bởi vì nó ở dạng lỏng. Các dạng phổ biến của HFCS: + HFCS 90 + HFCS 55 + HFCS 42 Quá trình enzyme làm thay đổi 100% glucose siro bắp thành HFCS 90 theo các bước sau: + Tinh bột bắp được xử lý bằng α-amylase để sản xuất chuỗi đường ngắn hơn gọi là oligosaccharides. + Glucoseamylase phá vỡ những chuỗi đường để sản xuất đường đơn glucose. + Xylose isomerase biến đổi glucose để tạo ra hỗn hợp có khoảng 42% fructose và 50- 52% glucose với một vài loại đường được hòa trộn. + Hỗn hợp 42 - 43% fructose glucose phải chịu qua một bước sắc kí lỏng nơi mà fructose sẽ được làm giàu đến xấp xỉ 90%. IV. CÔNG NGHỆ LÊN MEN TẠO ENZYMSE α- AMYLASE: 1. Giới Thiệu Về Phương Pháp Lên Men Bề Mặt: Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy Vi sinh vật thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 21 thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống. a. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt: Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: - Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. - Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối Vi sinh vật, enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các Vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. i. Môi trường lỏng: Trong môi trường lỏng, Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí). Ở đây, Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối Vi sinh vật. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 22 Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay: Nuôi cấy Vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, Vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý. ii. Môi trường đặc: Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy Vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối Vi sinh vật. Vi sinh vật không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho Vi sinh vật phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu Vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 23 b. Qui trình sản xuất nấm mốc giống: i. Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống: Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1,B2,B6,PP và E. Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%. Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%. Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%. ii. Chuẩn bị mốc giống: Nuôi cấy giống bao gồm: - Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm. - Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ). - Trên sàng, khay (nhân giống lớn). Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng: Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài Vi sinh vật nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. Nuôi cấy giống trong bình tam giác: Cách làm môi trường trong bình tam giác: Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 24 thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút. Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục. Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh. Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng. Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay. Nuôi cấy mốc trên khay: Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa. Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh. Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 25 Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C. ượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc. Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất. Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn. 2. Qui Trình Lên Men Công Nghiệp Tạo Enzym Αlpha-Amylase: a. Nguyên liệu: Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú. Ví dụ tinh bột từ gạo (gạo tẻ, gạo nếp, tấm), ngô, sắn,… Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dễ kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà. Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: - Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo: Thành phần dinh dưỡng /100g gạo: Protein 6g, Tinh bột 82g, Lipid 0.8g,Cellulse 0.6g, Nước 10.2g, Năng lượng 361 kcal (Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan, 1999). Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản. Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 26 chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P, K, Mg,… Ngoài ra còn có một số Vitamin: B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid. - Thành phần dinh dưỡng của ngô: Thành phần dinh dưỡng /100g bắp ngọt: Protein 9.1-12.9, Tinh bột 69.3-72.8, Lipid 2.2- 3.9, Cellulose 1.8-2.9, Nước 9.5-11.2, Khoáng 1.5-2.5 (Cortez và Wild-Altamirano,1972). - Thành phần dinh dưỡng của sắn (khoai mì): Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae. Củ sắn gồm ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi. Ngoài ra còn có cuống và rễ củ. + Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường chiếm khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng trong vỏ cùi còn có mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol của củ sắn. + Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở đây có khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi chế biến, đặt biệt là để sắn chảy mủ sẽ làm cho bột sắn biến màu, thay đổi mùi vị khó ăn trực tiếp khi luộc, khó thoát nước khi sấy hay phơi khô sắn lát hay săn bột. + Thành phần hoá học tươi của sắn: Tinh bột 20-34%; protein 0,8- 1,2%; chất béo 0,3-0,4%; cellulose 1-3,1%; chất tro 0.54%; polyphenol 0,1-0,3%; nước 60-74,2% . Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho Vi sinh vật phát triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ Vi sinh vật. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 27 nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt. b. Qui trình công nghệ: Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử Vi sinh vật khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa Vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1- 1,5 atm trong thời gian 45-60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường. Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của môi trường. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 28 Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: - Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: + Nhiệt độ tăng rất chậm. + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. + Khối môi trường còn rời rạc. + Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. - Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. + Môi trường được kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trường giảm dần. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 29 + Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. + Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. + Enzyme amylase được tổng hợp mạnh. + Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 300C là tốt nhất. - Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: + Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. + Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. c. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae: i. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm: Khi nuôi Vi sinh vật tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối Vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số Vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau. Tuy nhiên sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào Vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của Vi sinh vật hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 30 ii. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym: Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng: Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α- amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….). Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng các nguồn Nitơ từ những muối khác nhau. Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ trong môi trường phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm Asp.oryzae và sự tạo thành amylase. Ảnh hưởng của Amino acid: Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổng hợp enzym amylase do những nguyên nhân sau: - Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon , nguồn Nitơ vừa là nguồn năng lượng. - Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong qúa trình chuyển amine hóa. Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al,1968). - Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số Vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi ( Kurland, Marloe, 1962 ). Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 31 - Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzym, α-amylsae ở nấm mốc Asp.oryzae. - Ion Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bên nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α- amylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-amylase là 0,05%. - Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzym. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4. - Canxi (Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzym này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiu et amiloza, 1964). Muốn tích lũy nhiều α-amylase cấn có lượng Ca trong môi trường là 0,01-0,05%. - Lưu huỳnh (S) kích thích sự tạo amylase ( S có trong thành phần của các amino acid quan trọng : methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Asp.oryzae tạo amylase. Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng. Chẳnng hạn như: Coban, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, … iii. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: Độ ẩm(w) môi trường: Tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 32 triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt: Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi. - Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà tức là 100% W đều thích hợp cho nấm mốc phát triển. Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hoà để tránh cho môi trường khỏi bị khô. - Ảnh hưởng của không khí: Asp.oryzae là Vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp, rải thành lớp dày không quá 2,5-3cm, phòng nuôi phải thoáng. Theo thực nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc Asp.oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển cứ cách 1giờ, môi trường cần khoảng 1,7m3 không khí. Asp. oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%. - Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzym amylase. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzym là 28-320C. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn. Do vậy cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 270C và không cao hơn 360C. Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc cám có thể chia làm hai thời kỳ: + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu. Trong thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt cho phòng nuôi không hơn 23-300C . Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%. + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4-18 giờ). - Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc Asp. oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42. Một số chủng cho hai cực đại của enzym, ví dụ: cực đại của enzym amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60. Do đó, thời gian nuôi mốc có thể kéo dài từ 60-72 giờ. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt Báo Cáo Enzyme Amylase & Các Ứng Dụng GVHD: TS.Nguyễn Công Hà Trang 33 lực của enzym. Đối với Asp. Oryzae, sự tạo hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử. - Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6.5. Các môi trường tự nhiên từ cám, nhô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ. TÀI LIỆU THAM KHẢO www.en.wikipedia.org www.mrc-lmb.cam.ac.uk www.schmohz.com www.baigiang.bachkim.vn www.elearning.hueuni.edu.vn www.thuocbietduoc.com.vn