Giâm cành chè in vitro

ophylla Sieb), chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. bohea hay (Camellia sinensis var. microphylla), chè Shan (Camellia sinensis var. Shan J. Wan-Fan) chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.assamica (Mast) Choisy) (trích dẫn bởi Võ Thái Dân, 2004). 3 Giá trị của cây chè Chè là loại nước uống thông dụng và phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Hỗn hợp tanin trong chè có tác dụng làm nguôi cơn khát. Cafein và một số hợp chất ankaloide khác (theobromin, theofinlin, adenine) trong chè là những chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho thần kinh minh mẫn, kích thích sự tiêu hóa. Trong chè có chứa nhiều vitamin: A, B1, B2, B6, K, PP,… và đặc biệt chứa nhiều Vitamin C. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 5 Đây là nguồn dinh dưỡng có giá trị và rất cần thiết cho cơ thể. Theo Zaprometo, cathesin chè có tác dụng vững chắc cho mao mạch trong cơ thể con người. Qua kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh chè có tác dụng chống phóng xạ đó là chất stronti 90 (Sr-90) là một đồng vị phóng xạ nguy hiểm. Ngoài ra, chè được dùng làm chất tạo màu thực phẩm vừa có khả năng thay thế các chất tạp màu nhân tạo độc hại, có giá trị dinh dưỡng cao. Các sản phẩm phụ của chè như dầu hạt chè có thể sử dụng trong công nghiệp hay làm dầu ăn như các loại thực phẩm khác. 4 Tình hình sản xuất chè ở thế giới và Việt Nam 4.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới Chè được trồng tập trung nhiều nhất ở Châu Á và Châu Phi. Trên thế giới cây chè được phát triển với tốc độ rất nhanh từ thế kỷ XVIII. Trên thế giới hiện nay có khoảng 52 nước trồng chè, chiếm 2,7 triệu hecta diện tích đất canh tác nông nghiệp trên thế giới, sản lượng hàng năm đạt 2,2 triệu tấn. Mặc dù chỉ chiếm 16,4% tổng diện tích sản xuất chè của thế giới nhưng Ấn Độ là nước xuất khẩu chè lớn nhất thế giới với doanh thu hàng năm đạt 66 triệu đôla Mỹ một năm.Trong những năm qua diện tích chè trên thế giới không ngừng tăng trưởng bình quân 40.000 ha/năm. Theo Mao (1995) diện tích chè thế giới ổn định trong vòng 15 năm qua đạt khoảng 2.430.000 ha. Sản lượng chè thế giới gia tăng do được chú trọng đầu tư, nghiên cứu cải thiện. Số lượng thống kê của FAO về diện tích chè trên thế giới được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2. Bảng 2.1 Diện tích chè kinh doanh (ha) ở một số khu vực trên thế giới 2000 – 2007 Năm Thế giới Châu á Châuphi Châumỹ Châu âu Châu đại dương 2000 2384046 2104580 223544 46982 1540 7400 2001 2415365 2132570 228448 45407 1540 7400 2002 2480092 2183976 242608 44573 1535 7400 2003 2508339 2217087 241190 43526 1536 5000 2004 2601131 2801064 517608 80018 1365 9000 2005 2716075 2980027 532703 80095 1372 9000 2006 2708366 3052297 499438 84452 1265 9000 2007 2805502 3231778 565506 80269 755 9000 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Về lâu dài, các nước sản xuất chè lớn đều tăng sản lượng kể từ thập niên 80 nhưng với tốc độ chậm. Hơn nữa, sản lượng thu hoạch rất khác nhau giữa các năm do phụ thuộc nhiều vào thời tiết và nhiều nhân tố khác. Nhìn chung, sản lượng chè dự kiến sẽ tăng khoảng 1,9%/năm giai đoạn từ 1999- 2010, cao hơn mức bình quân 1,3%/năm của thập kỷ 90. Phần lớn sự tăng trưởng này là nhờ gia tăng sản lượng chè xanh. Theo ước tính của FAO, sản lượng chè đen thế giới sẽ tăng trung bình 1,2 triệu tấn/năm lên 2,4 triệu tấn vào năm 2010, chủ yếu là nhờ tăng năng suất. Trong giai đoạn này, dự đoán phần lớn các nhà sản xuất chè châu Phi sẽ tăng sản lượng do các đồn điền chè đã đến tuổi trưởng thành và kỹ thuật sản xuất cũng được cải thiện. Ví dụ như sản lượng chè của Uganda, Kenya và Tanzania được dự đoán sẽ tăng tương ứng thêm 2,7%, 2,3% và 1,7% CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 6 Bảng 2.2 Một số quốc gia có diện tích sản xuất chè (ha) lớn trên thế giới năm Ấn độ Trung quốc Sri lanka Kenya Indonesia 2000 490000 898012 188970 120390 121200 2001 504000 905662 188970 124290 115416 2002 510000 913100 210620 131450 115803 2003 516000 943400 210620 131450 116200 2004 520000 989262 212720 136700 116200 2005 521000 1058564 212720 141300 142847 2006 523000 1116740 212720 147080 111055 2007 558000 1165732 212720 149190 110524 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Tại châu Á, sản lượng chè Ấn Độ ước tăng bình quân 2,5%/năm cho đến năm 2010. Trong thập kỷ này, tỉ trọng của Ấn Độ trong tổng sản lượng chè thế giới sẽ tăng từ 38% lên 44%. Sản lượng chè của Inđônêxia và Sri Lanka ước tăng lần lượt 1,1% và 1,7%. Tuy nhiên, sản lượng chè đen của Trung Quốc có thể sẽ tiếp tục giảm (khoảng 1,7%/năm) do nước này đang tập trung sản xuất các loại chè khác. Đến 2010, dự đoán ba nước sản xuất chè đen lớn nhất thế giới là Ấn Độ, Kyena và Sri Lanka sẽ chiếm 70% sản lượng chè toàn cầu, tăng so với 63% năm 2000. Chè xanh chủ yếu được sản xuất ở Trung Quốc (chiếm 73% sản lượng thế giới năm 2000), Nhật Bản (13%), Việt Nam (6%) và Inđônêxia (6%). Phần lớn chè xanh được tiêu thụ ngay tại nước sản xuất (như Trung Quốc và Nhật Bản). Khối lượng xuất khẩu rất thấp, chỉ khoảng 27%. Trong năm 2001, nhập khẩu chè xanh thế giới chỉ đạt tổng cộng 187.000 tấn, bằng 17% lượng chè đen nhập khẩu. Theo ước tính của FAO, sản lượng chè xanh thế giới sẽ tăng bình quân 2,6%/năm cho đến năm 2010, cao hơn gấp 3 lần tỉ lệ tăng trưởng của chè đen và đạt 900.000 tấn. Trong đó, sản lượng chè xanh của Trung Quốc tăng nhiều nhất (2,7%/năm), tiếp đến là Việt Nam (2,5%), Inđônêxia (2,3%) và cuối cùng là Nhật Bản (0,1%/năm). Đến năm 2010, Trung Quốc sẽ chiếm tới 75% sản lượng chè thế giới. 4.1 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam Việt Nam được xác định là một trong tám địa điểm cội nguồn của cây chè, có điều kiện địa hình, đất đai, khí hậu phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây chè và đứng thứ năm trên thế giới về sản lượng và xuất khẩu chè. Sản phẩm chè của Việt Nam có mặt trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó “CheViet” đã được đăng ký bảo hộ tại 70 thị trường (Hiệp hội Chè Việt Nam, 2009). Năm 2004, toàn quốc có 108.000 ha chè, đạt năng suất 513,8 nghìn tấn (chè tươi) trong đó có 85% diện tích đang được trồng bằng các giống chè địa phương có năng suất và chất lượng thấp nên chất lượng chè của Việt Nam chỉ đạt mức trung bình yếu của thế giới (Báo cáo ngành chè năm 2004). CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 7 Bảng 2.3 Biến động diện tích, năng suất và sản lượng chè ở Việt Nam từ 2000- 2007 Năm Diện tích(ha) Năng suất (kg chè khô/năm/ha) Sản lượng (tấn/năm) 2000 70300 9943 69900 2001 80000 9462 75700 2202 98000 9612 94200 2003 86100 12113 104300 2004 120800 9892 119500 2005 122500 10818 132525 2006 102100 14789 151000 2007 106500 15399 164000 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Hiện nay, nước ta có năm vùng sản suất chè chính bao gồm: Vùng chè miền núi Tây Bắc: gồm Sơn La, Lai Châu là hai tỉnh trồng chè lớn, giống chè trồng chủ yếu là Shan và Trung Du Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: gồm các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Hòa Bình, Lào Cai, giống chè chủ yếu là Shan, Trung du, Assam Vùng chè Trung du – Bắc Bộ: Bao gồm Thái Nguyên, Bắc Cạn, Phú Thọ, Yên Bái, Hà Tây, giống chủ yếu được trồng chủ yếu là Trung Du, Assam và chè lai. Vùng chè Bắc Trung Bộ: gồm các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống trồng chu yếu là chè Gay địa phương và chè Assam. Vùng chè Miền Nam: chủ yếu trồng ở vùng Tây Nguyên như Lâm Đồng, Gia Lai, Kontum và Đắc Lắc, giống được trồng chủ yếu là chè Shan. Việt Nam trở thành thành viên chính thức của Tổ chức thương mại thế giới (WTO) từ tháng 1/2007. Nền nông nghiệp nói chung, ngành chè nói riêng bước vào quá trình hội nhập đối mặt với thách thức lớn về cải thiện chất lượng sản phẩm, tiếp cận thị trường mới, nhất là bối cảnh buộc phải thực hiện những biện pháp ngặt nghèo hơn các nước khác về kiểm dịch động thực vật, an toàn thực phẩm, sở hữu trí tuệ và các rào cản kỹ thuật trong thương mại. Năm 2006, chè Việt Nam đứng ở vị trí thứ 6 về diện tích, thứ 7 về sản lượng và thứ 5 về lượng xuất khẩu trong số gần 40 nước sản xuất và hơn 30 nước xuất khẩu chính, được xem là kỷ lục về sản lượng và giá trị xuất khẩu mà trước đó chưa từng có. Theo số liệu của của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5 nghìn ha tăng 1.900 ha so với diện tích năm 2007. Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiến đạt 6,5 tấn búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha của năm 2007 (Vinanet, 2009). Song, chè Việt Nam là một trong số ít nước được cảnh báo về dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm. Chính vì vậy, vấn đề sản xuất chè an toàn, chất lượng, bền vững, an toàn cho sức khỏe của con người, bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững đã và đang được nghành chè quyết tâm thực hiện. 5 Giới thiệu giống chè TB14 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 8 Là giống chè Shan Trấn Ninh được người Pháp bình tuyển tại Blao từ tập đoàn so sánh giống của Trung tâm thực nghiệm nông nghiệp Bảo Lộc từ năm 1952. Hiện nay là giống chủ lực của nghành chè Lâm Đồng chiếm 80% diện tích (Trung tâm nghiên cứu và chuyển giao kĩ thuật cây công nghiệp và cây ăn quả Lâm Đồng, 2008). Giống chè TB14 có lá màu xanh nhạt, hình thon dài, lá dài từ 10 – 15 cm, rộng 4 – 4,5 cm, có 12 đôi gân lá. Mép lá có răng cưa đều và kéo dài đến chóp lá. Góc lá lớn, trên tôm có nhiều lông tơ trắng mịn, khả năng phân cành mạnh, năng suất đạt từ 18 – 20 tấn/ha/năm. Chất lượng chè phù hợp với chế biến hương nội tiêu và chè đen. Hiện nay là giống chè cành chủ lực ở Lâm Đồng. 6 Các phương pháp nhân giống chè 6.1 Nhân giống bằng hạt Đây là phương pháp nhân giống chè đầu tiên được áp dụng từ khi ngành chè Việt Nam phát triển. Hiện nay trong phát triển ngành chè khuyến cáo là không nên sử dụng vì chè là cây giao phấn nên vườn chè trồng bằng hạt có sự phân ly rất lớn về hình thái, về đặc tính sinh trưởng, về năng suất, phẩm chất giảm và không ổn, chỉ được áp dụng trong công tác chọn tạo giống mới ở các trung tâm nghiên cứu.  Ưu điểm – Đơn giản, dễ làm giá thành thấp. – Chi phí lao động thấp. – Tuổi thọ của cây chè cao. – Cây có khả năng thích ứng rộng trên nhiều địa hình.  Nhược điểm – Cây chè không giữ được đặc tính của cây mẹ, quần thể cây chè không đồng đều, năng suất chè không cao, chất lượng phẩm chất không ổn định. – Hạt chè dễ mất sức nảy mầm và khó bảo quản được lâu. Thời vụ gieo hạt chủ yếu phụ thuộc vào mùa quả chín thường gieo vào đầu tháng 10 đến hết tháng 11. Số lượng hạt gieo cho một hecta 200 – 250 kg tương đương 400 – 500 kg quả. Do đó hệ số nhân giống thấp. Theo Đỗ Ngọc Quý và ctv. (1978) một hecta chè để giống quả chỉ trồng được bốn hecta. 6.2 Nhân giống bằng phương pháp chiết cành Chiết cành chè được tiến hành trên cây mẹ, hàng năm các cành chiết không thu hái, sau đó tiến hành chiết bằng hai cách: Cách 1: Uốn cành sát đất, lấy đất vùi một phần cành, phần bị lấp đất sẽ mọc ra rễ mới. Cách 2: Đắp đất vào toàn bộ gốc cao đến tận các cành, để cho phần cành bị lấp mọc ra rễ mới. Khi cành chè có bộ rễ phát triển tốt tiến hành chặt đứt phần tiếp giáp với cây mẹ rồi bứng cành đưa đi trồng.  Ưu điểm – Cây con mau cho thu hoạch búp, rút ngắn thời gian kiến thiết cơ bản. – Cành chiết đem trồng có tỷ lệ sống cao.  Nhược điểm – Phương pháp chiết cành có hệ số nhân giống thấp một cây chè mẹ chỉ được 10 – 15 cây con. – Tốn nhiều nhân công nên không được phổ biến rộng rãi trong sản xuất. 6.3 Nhân giống bằng ghép cây con trong giai đoạn vườn ươm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 9 Chè là cây giao phấn vì vậy khi trồng chè bằng hạt làm cây chè dễ bị thoái hóa và lẫn tạp, năng suất không ổn định, nhưng chè trồng bằng hạt có bộ rễ phát triển tốt ăn sâu, chịu hạn tốt. Mặt khác, cây chè trồng bằng cành cho năng suất cao hơn chè trồng bằng hạt từ 33 – 45 % tùy giống (kết quả nghiên cứu của Trường Đại Học Nông Nghiêp I Hà Nội), nhưng bộ rễ của chè cành phát triển nông và chịu hạn kém. Tháng 5 – 1999 Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao kỹ thuật cây Công nghiệp và cây Ăn Quả Lâm Đồng đã tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo cây chè ghép. Cây chè ghép được tạo thành bằng cách kết hợp giữa hai cá thể, chè trồng bằng hạt làm gốc ghép và chè cành làm cành ghép. Cành ghép lấy từ cây chè giống nội địa hoặc nhập nội có năng suất và phẩm chất cao, dễ canh tác và chăm sóc.  Ưu điểm: – Sản lượng và chất lượng chè cao hơn cây chè hạt. – Cây con đồng đều. – Cây chè ghép có khả năng chống chịu tốt và tuổi thọ cao, dễ chăm sóc.  Nhược điểm: – Chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật trong thao tác ghép, thời vụ ghép. 6.4 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành Hiện nay, giâm cành chè là một phương pháp nhân giống phổ biến trên thế giới Giâm cành chè được nghiên cứu ở Trung Quốc từ năm 1900, Ấn Độ 1911, Gruzia năm 1928, Srilanka năm 1938. Ở nước ta, miền Bắc bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng năm 1962, miền Nam năm 1952 (Đỗ Ngọc Quỹ và ctv, 1997).  Ưu điểm: – Có hệ số nhân giống rất cao, có thể cung cấp đồng thời một số lượng giống lớn, tránh được khó khăn thiếu giống khi trồng mới. Một hecta chè để giống đem giâm cành có thể trồng được 30 – 70 hecta (Lê Tất Khương và ctv. 1999). Số liệu từ Viện nghiên cứu chè Phú Hộ cho thấy từ một hecta vườn chè giống bốn tuổi có thể cung cấp được khoảng ba triệu hom, đủ cây cho trồng mới 50 hecta nếu trồng hai cây/hố, hoặc 80 hecta nếu trồng một cây/hố. – Tạo được vườn chè đồng đều với những đặc tính tốt của cây mẹ, rất thuận lợi cho đầu tư và thâm canh, cơ giới hóa, cho năng suất cao, nguyên liệu đồng đều giúp chế biến được chè có chất lượng tốt và ổn định. – Rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản. Thời gian cho thu hái nhanh khoảng hai đến ba năm (Viện nghiên cứu chè, 2000).  Nhược điểm: – Phải qua giai đoạn vườn ươm. – Đòi hỏi phải có kỹ thuật trong các khâu giâm cành, chăm sóc, quản lý vườn ươm tỉ mỉ, tốn nhiều công lao động. – Khối lượng vận chuyển cây con ra trồng ngoài đồng lớn. – Giá thành cây con cao, làm tăng đáng kể chi phí trồng mới, chi phí cao hơn trồng hạt từ sáu đến tám lần (Viện nghiên cứu chè, 2000). – Trong thời gian kiến thiết cơ bản, khả năng chịu hạn của cây con kém. 6.5 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô Hiện nay, nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cây mô là một hướng nghiên cứu rất mới. Theo Willson và Clifford (1992), những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu tế bào và nuôi cấy mô mở ra cơ hội cho không chỉ việc nhân nhanh chóng vật liệu nhân giống, và cả cho việc sử dụng các quy luật di truyền, sinh lý học và sinh hóa học vào việc phát triển các dòng chè đặc trưng. Đối với các nước trồng chè nổi tiếng trên thế giới hiện nay như: Ấn Độ, Trung CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 10 Quốc, Nhật Bản, Kenya, Đài Loan…đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trên chè thu được một số thành tựu bước đầu trong việc chuẩn hóa quy trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy mô chè.  Ưu điểm: – Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. – So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. – Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. – Phục tráng giống.  Nhược điểm: – Đòi hỏi kỹ thuật cao. – Chi phí cao. 6.6 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành in vitro Đây là phương pháp nhân giống dựa trên sự kế thừa của phương pháp giâm cành truyền thống và nuôi cấy mô. Bằng cách sử dụng một hom chè mang một mầm nách qua khử trùng được giâm trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất kích thích sinh trưởng. Hom chè sẽ được kích thích cho tăng trưởng tạo rễ và tạo chồi trực tiếp từ hom chè, không qua giai đoạn tạo cụm chồi và cấy chuyền. Từ một hom chè ban đầu qua giâm cành tạo thành một cây con phát triển hoàn chỉnh rễ thân lá, rồi tiến hành trồng ra đất.  Ưu điểm – Làm cho cây con thuần nhất và sinh trưởng tốt, cây được làm trẻ lại và ít nhiễm bệnh. – Giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có ý nghĩa trong công tác phục tráng giống và nhân giống chè. – Hệ số nhân giống cao. – Có thể tiến hành nhân giống quanh năm, rút ngắn thời gian nhân giống. – Tuổi chung của cây chè tạo ra từ giâm cành in vitro nhỏ hơn tuổi chung của cây chè được tạo ra từ giâm cành truyền thống.  Nhược điểm – Chi phí tốn kém. – Kỹ thuật giâm cành chè in vitro hiện nay đang ở giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. – Chưa tìm ra chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp cho hom chè được lấy trực tiếp từ đồng ruộng. – Trong chè hàm lượng tanin cao, gây khó khăn lớn trong việc khử trùng mẫu, và sự hóa nâu của môi trường do tanin trong mẫu tiết ra làm hóa nâu môi trường làm hom chè dễ bị chết hoại. 2.7 Cơ sở của giâm cành chè 7.1 Cơ sở hình thành callus và rễ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 11 Khi cắt đoạn thân chè giâm vào trong môi trường dinh dưỡng thích hợp sau một thời gian sẽ xuất hiện những mô lồi màu trắng nhạt hay vàng nhạt đó la callus. Nhờ sự biến đổi của tế bào tượng tầng chu luân và các tế bào nhu mô ở cạnh mô sẹo xảy ra hiện tượng phản phân hóa và tại những chỗ riêng biệt của callus dưới tác động của chất kích thích sẽ tạo ra các tế bào mới là nhóm tế bào phân sinh, chúng phát triển thành các mấu lồi là nguồn gốc của rễ non. Chúng chọc thủng vỏ hóa bần của mô sẹo và chui ra ngoài (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990). Callus được coi là nguồn cung cấp dinh dưỡng vì không bào chứa nhiều chất dự trữ cần thiết để tạo rễ. Theo Mitshuhashi (1969), Mai Trần Ngọc Tiếng (1983) và Nguyễn Bá (1987) quá trình hình thành rễ gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn chuẩn bị, khởi sự bằng sự hoạt động của một vài tế bào tầng phát sinh libe gỗ hoặc chu luân để tạo một nhóm tế bào sơ khởi. Giai đoạn 2: là giai đoạn kéo dài của tế bào sơ khởi. Mỗi giai đoạn do một nhóm kích tố điều khiển. Các kích tố của giai đoạn hai phối hợp với nhau tạo sự cân bằng thích hợp thì rễ bất định mới tạo đủ số lượng và chiều dài thích hợp cho cây (trích dẫn bởi Lê Tuyết Hoa, 1990). Chất điều hòa sinh trưởng auxin có tác động kích thích ra rễ. Theo Hartmann và Kester’s (2002), sự hình thành rễ bất định chịu ảnh hưởng của chồi và lá có trên cành giâm. Đối với một số loài, nếu ta cắt bỏ lá hoặc chồi thì cành giâm sẽ không ra rễ hoặc ra rễ rất ít mặc dù có xử lý với chất kích thích ra rễ. Vì lá và chồi là nơi sản sinh ra auxin và vận chuyển xuống gốc để kích thích sự hình thành rễ, lá còn cung cấp carbonhydrat cho sự phát triển của rễ. 7.2 Cơ sở hình thành chồi Chồi là mầm mống của cành cây, nó bắt đầu khởi động rất sớm dưới dạng mấu lồi trong nách phôi thai, lá còn nằm trong chồi, về sau mấu chồi phát triển thành chồi nách. Khi còn ở cành bình thường các chồi không phát triển được nằm trong trạng thái ngủ nghỉ. Khi cành chè được cắt thành từng hom làm mất ảnh hưởng của ưu thế ngọn. Các mầm nách thoát khỏi giai đoạn ngủ nghỉ phát triển thành chồi mới. Các hom chè được cắt đem giâm trong môi trường chứa cytokinin ở nồng độ thích hợp ,các mầm nách sẽ phát triển thành chồi. 8 Chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những chất liệu với liều lượng thấp hiệu lực sinh học cao. Các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Các chất điều hoà sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng với nhau là điều cần thiết. Hiện nay có năm nhóm chất điều hoà sinh trưởng thường sử dụng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trưởng. 8.1 Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Auxin bị phân huỷ bởi ánh sáng, có tính phân cực.  Chức năng của auxin Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thước của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào như cenlulose, pectin. Điều chỉnh tính hướng động của cây: quang hướng động và địa hướng động. Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 12 chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù. Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý, trao đổi chất khác. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Torry và ctv.,1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hoá các enzyme tác động nới lỏng vách tế bào và enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Prat, 1993). Auxin hoạt hoá sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin,…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002). 8.2 Cytokinin Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh. Đây là chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, đồng thời làm tăng quá trình chuyển hoá acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô.  Đặc điểm của cytokinin Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng ngọn và hướng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure. Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA và TDZ  Chức năng của cytokinin Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hoá cơ quan đặc biệt là phân hoá chồi. Kìm hãm quá trình hoá già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân huỷ của diệp lục, protein và acid nucleic. Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn. Ảnh hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô gồm mô sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và ctv., 1985; Taiz và ctv., 1991).  Vai trò của cytokinin trong kích thích sự tạo chồi Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin. Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10,0 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và ctv., 1991; Humphries, 1960; trích bởi Vũ Văn Vụ, 2003). Tùy vào từng loại cây trồng và mục đích sử dụng để kết hợp hợp lý nồng độ axin và cytokinin. 9 Các nghiên cứu về in vitro trên chè 9.1 Chất khử trùng mẫu CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 13  Theo Debergh và Vanderschaeghe (1988), mẫu chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng đã bị nhiễm bẩn bởi nhiều nguồn khác nhau tùy theo từng cơ quan và bộ phận, đó là nguyên nhân chủ yếu gây tổn thất trong nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cấy mô. Thông thường mẫu cấy được lấy từ những cây phát triển được sàng lọc, bảo vệ từ ruộng thí nghiệm. Theo Sandal và ctv. (2001), đã tiến hành rửa sạch hom chè bằng Tween 20 trong 15 phút, sau đó khử trùng bề mặt hom chè bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 5 phút rồi rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng. Mondal và ctv. (1998) tiến hành khử trùng bề mặt hạt chè bằng Natri clorua 4% trong 10 phút, sau đó rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng.  Sharma và ctv. (1999) tiến hành khử trùng mẫu hom chè có mang hai đốt bằng Streptomycin sulphate 0,001% trong 10 – 15 phút, sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua 0,04% trong 7 – 8 phút rồi rửa sạch bằng nước cất từ 3 – 4 lần. Ogutaga và Northcote (1970) đã dùng đoạn thân chè dài 5 -15 mm được trồng trong nhà kính khử trùng bề mặt với cồn 70o sau đó khử trùng mẫu bằng dung dịch natri hypoclorit 7%.  Kato (1985, 1989) dùng những đoạn thân chè có từ 3 – 4 lá từ những cây chè được trồng trong nhà kính (giống Yabukira) khử trùng mẫu bằng Canxi hypoclorit 7% trong 20 phút. Arulpragasam và Latiff (1986) đã tách bỏ những lá có cuống lá nằm sát thân một cách cẩn thận tránh gây hại cho mầm nách. Sau đó khử trùng bề mặt bằng dung dịch clo 10 – 15% trong 15 phút lắc mẫu liên tục sau đó rửa sạch bằng nước cất và cấy vào môi trường. Karanuki và Shibata (1993) làm giảm vi khuẩn nội sinh có trong mẫu bằng cách lấy những mẫu cấy ở mô phân sinh ngọn và những lá mầm non với kích thước 0,5 mm. Theo Nakamura (1989) tỉ lệ nhiễm của mẫu phụ thuộc theo mùa. Để làm giảm nấm ta thu thập, lấy mẫu vào đầu mùa khi nhiệt độ không khí tương đối thấp và chọn những cây trưởng thành khỏe mạnh. Haldeman và ctv. (1987) đã chỉ ra một biện pháp quan trọng để làm giảm vi khuẩn và nấm, nhưng không gây độc cho mẫu bằng benomyl (1, 2, 4 g/l) và rifampicin (10, 25, 50 mg/l). Das và Barman (1988) xử lý mẫu bằng Streptomycin sulfate 1% ngăn chặn sự tái nhiễm của mẫu thí nghiệm. Rajacumar và Ayyappan (1992); Rajashekaran và Mohankumar (1992); Jha và Sen (1992); Agarwal và ctv. (1992) đã dùng dung dịch thủy ngân clorua 0,05 – 1,0% khử trùng bề mặt mẫu đối với mẫu thí nghiệm. 9.2 Môi trường và vật liệu vô trùng mẫu Murashige và Skoog (1962) đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường MS của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây trong đó có áp dụng phổ biến trên chè.  Theo Sandal và ctv. (2001) thực hiện vô trùng mẫu hom chè, Camellia sinensis (L) O. Kuntze, 30 năm tuổi tạo nguồn vật liệu sạch cho thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml có bổ sung 100ml môi trường MS với 0,8% agar bổ sung thêm BA (8,88µM), IBA (0,98µM) và 3% đường. Mondal và ctv. (1998), tiến hành vô trùng mẫu hạt chè Camellia sinensis (L) O. Kuntze bằng cách cho hạt nảy mầm trong môi trường 1/2 MS bổ sung sucrose 30g/l và agar 8g/l (Qualigens, Bombay) tạo cây trong ống nghiệm sau 60 ngày làm vật liệu cho vi nhân giống chè. Sharma và ctv. (1999) vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var. China hybrid trong môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8 g/l (Qualigens, Bombay). Theo Nguyễn Thanh Mai và Nguyễn Sĩ Tuấn (2005), quá trình vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var. Oo-Long được tiến hành trong erlen 100ml có bổ sung 20 ml môi trường MS, agar 8g/l, TDZ 1mg/l, sucrose 30g/l. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 14 9.3 Môi trường tạo chồi  Sandal và ctv. (2001) tiến hành cắt khúc những hom chè được tạo thành từ vật liệu vô trùng mẫu, có chiều dài từ 0,5 – 1,0 cm đem cấy vào trong môi trường MS lỏng lắc, lỏng tĩnh và môi trường đặc với TDZ (2,5 µM, 5,0 µM, 10,0 µM) và BA (4,4 µM, 8,8 µM, 17,7 µM). Thể tích môi trường nuôi cấy chứa trong bình tam giác 250ml là 10ml, 20ml, 50ml. Kết quả thu được như sau: Sự nhân chồi chè tốt nhất trên môi trường MS lỏng tĩnh với nồng độ TDZ 2,5 – 5,0 µM, và thể tích môi trường chứa trong bình tam giác 250ml phù hợp nhất cho tái sinh chồi là 20ml. Thời gian cấy chuyền từ 6 – 8 tuần trong phòng thí nghiệm tiết kiệm giá thành và sản xuất có hiệu quả hơn so với phương pháp tạo protocols bằng vi nhân giống chè trong môi trường đặc với 4 tuần một lần cấy chuyền. Trong thí nghiệm TDZ là một cytokinin làm giảm tỉ lệ chết hoại của mẫu cấy tái sinh chồi chè trong môi trường lỏng tốt hơn BA (Mok và ctv. 1982; Huetteman và Preece, 1993).  Mondal và ctv. (1998), từ những cây mọc trong ống nghiệm trong vô trùng mẫu sau 60 ngày gieo cắt thành những hom có chiều dài 1 cm. Tiến hành nuôi cấy trong hai môi trường WPM và môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l và agar 0,8g/l. Nồng độ TDZ (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với nồng độ NAA (5µM, 10 µM, 15 µM) và BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với IBA(5µM, 10 µM, 15 µM). và BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với NAA 5µM. Kết quả thu được với nồng độ 5µM TDZ và 10µM NAA thu được (98%) mẫu cảm ứng tạo chồi, chồi kéo dài ra. Cảm ứng tạo chồi của 5µM NAA với 10µM BAP là (77,9%) và 5µM IBA với 5µM BAP (84,8%). Mặc dù tỉ lệ cảm ứng tạo mô sẹo của BAP cũng tương đối cao nhưng sau 2- 3 lần cấy chuyền mẫu bị hóa nâu và chết hoại. TDZ tỏ ra phù hợp hơn trong việc nhân nhanh và tái tạo chồi trên chè. Môi trường MS đặc thích hợp hơn môi trường WPM đặc. Sandal và ctv. (2000) đã tiến hành nuôi cấy mô chè bằng cách tạo mô sẹo từ các mắt mầm trong điều kiện có ánh sáng trên môi trường MS lỏng tĩnh có thêm chất điều hoà sinh trưởng TDZ và IBA. Trên giống chè Camellia sinensis var. TV-1, T-78, UPASI-9 và KangraJat.  Sood và ctv. (1993) Nuôi cấy chè tạo ra từ protocols trong nuôi cấy mô bằng phương pháp vi nhân giống chè trong môi trường MS + IBA (0,98 µM) + BA( 8,88 µM) trên giống chè Camellia sinensis var. Kangra Jat trên môi trường lỏng tĩnh, môi trường lỏng. Tahardi (1994), đã nhân giống chè trong ống nghiệm trên môi trường WP có GA3 thu được 30% tỉ lệ tạo chồi. Trần Hoài Khải (2002), tiến hành tạo mô sẹo thu được môi trường MS + 100ml nước dừa + 3mg BA + 50mg adenin sulfate và môi trường MS + 100ml nước dừa + 5mg BA + 5 mg NAA tỏ ra thích hợp trong nuôi cấy mô chè. Nguyễn Thanh Mai và Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ cành chè được hình thành từ quá trình vô trùng mẫu cắt lá thứ ba tính từ đỉnh cây xuống được cắt thành mẫu cấy 5 – 10 mm được dùng làm vật liệu thí nghiệm. Các phản ứng phát sinh hình thái mô được thử nghiệm trên môi trường MS1 có bổ sung 30g/l sucrose và các nồng độ IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg/l) và BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). Các mô sẹo được hình thành sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1 được chuyển sang môi trường MS2 có bổ sung các nồng độ ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và tổ hợp của BA và IBA để tái sinh chồi. Kết quả thu được: Sau 14 ngày nuôi cấy trên tất cả các nồng độ mô sẹo cảm ứng trên lá thứ 3 tính từ ngọn xuống với kích thước 5 – 1 mm. Các phát thể chồi bất định phát triển từ mô giai đọan nuôi cấy kéo dài trong 8 tuần tốt nhất trên môi trường có bổ sung IBA 0,05 mg/l, BA 2,0 mg/l, ABA 1,0 mg/l. Các thể chồi phát triển từ mô sẹo chỉ khi ABA được thêm vào môi trường nhằm gây ức chế sự tăng sinh của khối mô sẹo và kích thích sự phát thể chồi của khối mô sẹo. 9.4 Môi trường tạo rễ Sandal và ctv. (2001) tiến hành cắt những chồi chè có chiều dài 3 cm được hình thành trong quá trình nuôi cấy mô rồi nhúng vào dung dịch IBA 4,92 µM trong 30 phút, sau đó CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 15 chuyển sang khay chứa tỉ lệ cát: đất: 2: 1 dưới điều kiện trồng trong phòng thí nghiệm. Sau 60 ngày chồi mọc rễ và chuyển sang chậu để trong nhà kính. Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ các chồi tái sinh trong quá trình nuôi cấy được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 3mg/l và 1g/l than hoạt tính và môi trường IBA 5mg/l không có agar. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy các rễ bất định được hình thành. 10.5 Hạn chế sự hoại mẫu Hàm lượng phenol trong chè rất cao, tiết ra môi trường từ vết cắt của mẫu cấy trải qua quá trình oxy hóa trở thành chất độc cho mẫu cấy. Những chất độc này được giảm bằng cách hạ thấp pH môi trường nuôi cấy. Sarwar (1985) thử bỏ một số chất hóa học khác nhau vào trong môi trường như acid ascorbic, catechol, l-cystein, phloroglucinol, phenyl-thiourea, polyvilyl-pyrolidone- 10, natri diethyl dithio-carbonat, natri flouride và thioure với những nồng độ khác nhau của môi trường muối khoáng MS. Ông đã tìm ra nồng độ cao để ngăn chặn sự hóa nâu của mẫu của MS là 1/20.  Pandidurai và ctv. (1996) đã báo cáo thành công việc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường mới định kỳ cũng ngăn chặn tốt quá trình hóa nâu của mẫu. Trần Hoài Khải (2002), tiến hành khử tanin trong chè bằng lòng trắng trứng đã thu được những dấu hiệu khả quan về biện pháp khử tanin, thời gian khử tốt là 120 phút và thu được từ 30 - 40% mô sẹo. Từ những cơ sở lý luận trên làm cở sở cho thí nghiệm thử nghiệm quy trình giâm cành chè in vitro. III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu thí nghiệm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 16 1.1. Đối tượng thí nghiệm Hom chè (VD ở nước ta hom chè TB14 được lấy từ Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao kỹ thuật cây công nghiệp và cây ăn quả Lâm Đồng) 1.2 Trang thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 1.2.1 Phòng chuẩn bị và giữ môi trường dinh dưỡng Dùng để chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường giâm và dụng cụ để giâm và bảo quản dung dịch mẹ. Trang thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình. Dụng cụ: Pen, kéo, dao, ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, đèn cồn. 1.2.2 Phòng tiến hành nuôi cấy Phòng này sử dụng để tiến hành các thao tác giâm cành trong điều kiện vô trùng, phòng gồm hai lớp cửa kiếng để hạn chế bụi, kín gió và ngăn cản côn trùng. Thiết bị gồm: tủ cấy, đèn UV, các dụng cụ nuôi cấy đã hấp vô trùng, giá để môi trường. 1.2.3 Phòng bảo quản nuôi mẫu Tạo điều kiện thích hợp nhất giúp cành giâm phát triển. Thiết bị gồm có: kệ, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, ẩm kế, máy điều hoà nhiệt độ. Điều kiện bảo quản: pH môi trường = 5,8, nhiệt độ 23 – 27 0C, chu kì chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ. 1.2.4 Các vật liệu trong nghiên cứu Dung dịch khử trùng mẫu: Sử dụng dung dịch khử trùng mẫu: Cồn 700, nước cất vô trùng, xà phòng, nước javen. Chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính, nước dừa, agar. Môi trường cấy là môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) với các thành phần cơ bản được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Thành phần môi trường cơ bản MS( Murashige vaø Skoog): Tên Thaønh phaàn: Noàng ñoä (mg/l) Khoaùng ña löôïng: Khoaùng vi löôïng: NH4NO3 KNO3 CaCL2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O Na2EDTA FeSO4.7H2O 1650 1900 440 370 170 16.9 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 Vitamin vaø Amino acid: Thiamine HCL Myo-Inositol Pyridoxine HCL Glycine Nicotinic Acide 0.1 100 0.5 2 0.5 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 17 Chất khác Đường Agar 30 g/l 8.5 g/l 2 Phương pháp thí nghiệm Mô tả quy trình thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm mục tiêu tạo cây con ở mắt mầm thứ 2 tính từ búp, vì vậy quy trình thí nghiệm được tiến hành qua các bước sau: Bước 1: Lấy mẫu:Cắt những cành chè có búp sinh trưởng bình thường, không bị sâu bệnh hại, gồm 4 - 6 lá thật, gói trong giấy báo và túi nilông giữ cho mẫu tươi không bị héo mang về phòng thí nghiệm. Nhiều nghiên cứu cho rằng các mầm nách ở lá thật thứ nhất và lá thứ hai chưa được phân hóa hoàn chỉnh nên ít bị tác động bởi tuổi cây. Vì vậy cho nên chọn hom chè ở lá thật thứ hai tính từ lá tôm để làm vật liệu tiến hành giâm cành. Từ đoạn cành chè non gồm một tôm và ba lá thật. Dùng kéo cắt bỏ lá để lại cuống lá, lấy đoạn hom ở vị trí lá thật thứ hai, và để chừa lại một đốt phía trên và một đốt phía dưới, hom có chiều dài từ 4 - 6 cm. Hình 3.1 Hom chè sau bước 1 Bước 2: Xử lý hom chè: Hom chè được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó đem ngâm trong nước xà phòng loãng trong hai phút, rồi dùng bông thấm nước xà phòng và rửa kĩ mẫu, nhẹ nhàng tránh làm dập và gây tổn thương cho mẫu. Dùng ngón tay chèn vòi nước cho dòng chảy thành tia, và xịt vào mẫu để rửa trôi các bào tử và nấm bám trên mẫu. Sau đó để dưới vòi nước chảy tràn nhẹ trong 3 – 5 phút. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 18 Hình 3.2 Hình ảnh hom chè trong khử trùng mẫu A: có lắc B: không lắc Hom chè được đựng trong bình tam giác 350 ml đã được hấp vô trùng, đem vào phòng giâm vô trùng tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch khử trùng Canxi hypoclorit, nước javen với các nồng độ và thời gian thích hợp, vớt mẫu ra rửa sạch từ 3 – 4 lần bằng nước cất vô trùng, tiếp tục bỏ mẫu vào ngâm trong cồn 700 trong vòng 30 giây vớt ra và rửa sạch bằng nước cất vô trùng từ 2-3 lần. Đến đây khâu khử trùng mẫu đã hoàn tất. Bước 3: Tiến hành giâm cành: Dùng giấy thấm đã được hấp vô trùng thấm cho khô những hom mẫu, dùng dao sắc cắt hai đầu hom còn khoảng 1 – 2 cm và cuống còn 0,2 – 0,3 cm tránh làm hư hại đến mầm. Sau đó tiến hành cắm vào môi trường, mỗi chai nước biển cắm 1 hom. Thao tác giâm cành phải nhanh để hạn chế sự tiếp xúc của hom chè với không khí làm đen hom chè, được tiến hành trong điều kiện vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn. Bước 4: Bảo quản mẫu: Mẫu chè giâm xong được chuyển qua phòng bảo quản ở nhiệt 23 – 27 0C, chu kì chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 h. Môi trường giâm cành được chuẩn bị trước trong chai nước biển 100 ml, 200 ml, 500 ml dùng để chứa môi trường IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hình ảnh quá trình nuôi cấy hom chè 1.1.Hom chè sau khử trùng CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 19 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 20 1.2.Hom chè không phát động mầm Hình 4.1: Hom chè sau khử trùng A: Hom chè chết hoại, môi trường hóa nâu B: Hom chè thối mầm nách C: Hom chè nhiễm khuẩn D: Hom chè chết hoại thân có màu xanh E: Hom chè nhiễm nấm F: Hom chè chết hoại G: Hom chè sạch CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 21 Hình 4.2 Hom chè không phát động mầm A: Hom chè sau 15 ngày D: Hom chè sau 60 ngày B: Hom chè sau 30 ngày E: Hom chè sau 75 ngày C: Hom chè sau 45 ngày F: Hom chè sau 90 ngày 1.3.Hom chè tái sinh chồi CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 22 Hình 4.5 Hom chè tái sinh chồi A: Hom chè sau 15 ngày D: Hom chè sau 60 ngày B: Hom chè sau 30 ngày E: Hom chè sau 75 ngày C: Hom chè sau 45 ngày F: Hom chè sau 90 ngày 2. Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng mẫu Khử trùng mẫu trong giâm cành chè in vitro để tạo hom chè sạch nấm và vi khuẩn, không bị dập nát, hư hại đến mầm chè, mầm nách có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh là một việc làm khó. Hom chè dùng trong thí nghiệm được lấy trực tiếp từ đồng ruộng tiếp xúc trực tiếp với các tác nhân gây nhiễm (nấm, vi khuẩn, virus) gây khó khăn rất lớn cho quá trình khử trùng mẫu. Do đó, cần tìm ra loại chất, nồng độ chất khử trùng, thời gian khử trùng mẫu thích hợp là yêu cầu đầu tiên nhất trong giâm cành chè in vitro. Hiện nay, các dung dịch khử trùng thường dùng là Natri hypoclorit , Canxi hypoclorit, thủy ngân clorua. Khử trùng bằng thủy ngân clorua mang lại hiệu quả cao, nhưng rất độc hại ít được sử dụng phổ biến. Hai loại chất khử trùng được dùng phổ biến hiện nay và được chọn làm chất khử trùng trong thí nghiệm là Natri hypoclorit và Canxi hypoclorit. Để làm tăng hiệu quả khử trùng, tiến hành thêm từ 2 -3 giọt Tween 20, có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật, bề mặt tiếp xúc giữa hom chè và chất khử trùng tốt hơn. Việc khử trùng mẫu chè cho tới hiện nay vẫn chưa tìm ra phương thức khử trùng mẫu thích hợp, chất khử trùng và thời gian khử mẫu thích hợp. 3 Kết luận Cho đến nay các Thí nghiệm “Giâm cành chè in vitro” qua quá trình tiến hành tuy vẫn chưa thu được kết quả như mục tiêu đề ra nhưng bước đầu đã thu được cây chè sống bằng phương pháp giâm cành in vitro. Qua đó, cho thấy có thể tiếp tục tiến hành thí nghiệm giâm cành chè in vitro trong các giai đoạn tiếp theo. Bước đầu đã thu được một số kết quả thí nghiệm như sau:  Về phương pháp khử trùng: Chọn Javen làm chất khử trùng, với tỉ lệ 1:3 trong thời gian 6 phút và 1:5 trong thời gian 5 phút.Khử trùng kép và không lắc mẫu.  Về phương pháp khử tanin trong mẫu: Đối với việc khử tanin trong hom chè dùng trong thí nghiệm giâm cành in vitro bằng lòng trắng trứng gà và Vitamin C không phù hợp. Tanin trong mẫu tiết ra môi trường được khắc phục bằng cách cấy chuyển môi trường một tuần một lần trong 3 tuần đầu tiên và bổ sung thêm 1g/l than hoạt tính vào môi trường, thao tác cấy nhanh và hạn chế làm dập mẫu. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 23 4 Đề nghị Không tiến hành khử tannin trong mẫu chè bằng lòng trắng trứng gà và Vitamin C Tiếp tục tiến hành khử trùng mẫu kép bằng javen và các chất khử trùng khác nhau với các nồng độ và thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng phù hợp và thời gian khử trùng tối ưu. Tiến hành kiểm soát cách ly sâu bệnh hại trên khu vực vườn chè lấy mẫu. Thường xuyên theo dõi thí nghiệm và cấy chuyển môi trường khi môi trường bị hóa nâu. V. Nghiên Cứu Chiết Xuất và Xác Định tác dụng kháng oxy hóa của Polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam: 1. Giới Thiệu Chè xanh chứa epigallocatechin gallat (EGCG), hợp chất này được coi là hoạt chất trong chè xanh có tác dụng dự phòng bệnh ung thư. EGCG gây sự chết tế bào theo chương trình và ức chế men cyclooxygenase và do đó ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư. Trong những năm gần đây, nhờ áp dụng các phương pháp nghiên cứu khoa học hiện đại,đã tìm thấy tác dụng sinh học của nước chiết lá chè chủ yếu !à do các polyphenol, trong đó, quan trọng là các dẫn xuất của catechin, có công thức như sau: trong đó, khi R1 =R2 = H ta có epicatechin (EC); khi R1 =OH, R2 = H ta có epigallocatechin (EGC). Khi R2 là gốc gallat: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 24 Và, nếu R1 = H ta có epicatechingallat (ECG), còn khi R1 =OH ta có epigallocatechin gallat (EGCG).Chính các polyphenol trên là tanin trong lá chè. Tác dụng sinh học của các polyphenol chè hay của dịch chiết lá chè xanh được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất antioxidant [5,6]. Cácgốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong quá trình sống, chính là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người. Ngày nay, đã tìm thấy tác dụng của polyphenol chè ở mức độ khác nhau đối với bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh răng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá, tăng tuổi thọ. Polyphenol chè còn được sử dụng có hiệu quả và an toàn trongcông nghiệp thực phẩm để thay thế các chất antioxidant tổng hợp ,như BHA, BHT dễ gây tácdụng phụ có hại . Nhờ những tác dụng quý giá như nói trên của các polyphenol chè, nênchúng có giá trị cao trên thị trường hiện nay. 2. Hợp chất EGCG: Epigallocatechin gallate (EGCG), còn được gọi là epigallocatechin gallate-3, là các ester của epigallocatechin và acid Gallic, và là một loại catechin. Thuộc nhóm flavonoids. EGCG là catechin có nhiều nhất trong trà đáng chú ý nhất trong số các loài thực vật khác, và cũng là một chất chống oxy hóa mạnh có thể có các tính chất điều trị cho nhiều bệnh như ung thư. Nó được tìm thấy trong trà xanh, nhưng không có trong chè đen, như EGCG được chuyển thành thearubigins trong trà đen. Trong môi trường nhiệt độ cao, một sự thay đổi epimerization có nhiều khả năng xảy ra, tuy nhiên khi tiếp xúc với nước sôi trong 30 phút chỉ thẳng dẫn đến việc giảm 12,4% tổng số lượng EGCG. Hầu hết các catechin được oxy hóa trong quá trình sản xuất chè đen để trở thành thearubigins mà mất trung bình 58% của các flavonoid kết quả, và các theaflavins số tiền đó đến 6%. flavonoids trong trà khác, trong nội dung thấp hơn rất nhiều, bao gồm kaempferol, myricetin, quercetin, và số lượng phút apigenin và luteolin. 3.Chiết Xuất EGCG: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 25 Việc chiết xuất polyphenol từ lá chè xanh thường được tiến hành trong dung môi nước ở nhiệt độ sôi , hỗn hợp nước-metanol hay nước- etanol . Sau khi xử lý lá chè bằng dungmôi chiết, thì trong dịch chiết, ngoài polyphenol,còn có mặt cafein, pigment và polysacarit. Để tách cafein và các tạp chất, dịch chiết được xử lý với clorofom. Sau khi tách ra tướng clorofom thìtrong dịch chiết còn lại polyphenol. Đem xử lý dịch chiết bằng dung môi hữu cơ, như etylaxetat,thì polyphenol chuyển vào tướng etylaxetat. Tách lấy dịch chiết etylaxetat, đem cất loại etylaxetat,thu được polyphenol. Hàm lượng chất khô của chè xanh Việt nam: stt Mẫu chè Mẫu tươi (g) Mẫu khô (g) Hàm lượng chất khô(%) 1 2 3 4 Lá chè non Lá chè bánh tẻ Lá chè già Hỗn hợp Trung bình 700 210 100 480 139,9 45,5 24,9 104 18,84 21,66 24,9 21,66 21,76 Kết quả tách chiết cafein bằng clorofom: stt Mẫu lá chè Lượng lá chè khô (g) Lượng clorofom(ml) Cafein (g) 1 2 Lá chè bánh tẻ Lá chè già 50 150 130 450 1,096 3,05 Cafein thu được là chất rắn tinh thể hình kim, mầu trắng, có nhiệt độ nóng chảy 234oC (tài liệu 23oC) và trên phổ tử ngoại đặc trưng bằng vạch 272 nm (hình 1). Kết quả cho thấy hàm lượng cafein có thể thu được từ lá chè Việt Nam dao động trong khoảng 2 - 2,1% so với lượng mẫu khô. Đã tiến hành chiết lá chè xanh khô bằng nước sôi (mẫu A) và bằng kỗn hợp nước - etanol với tỉ lệ thể tích 50/50 (mẫu B). Sau khi tách cafein và các tạp chất khác, đã tiến hành chiết lỏng- lỏng bằng etylaxetat. Sau khi cất loại etylaxetat, đã thu được polyphenol kết tủa mầu nâu sáng. Đã xác định hàm lượng catechin theo phương pháp chuẩn tanin bằng dung dịch pemanganat kali . Kết quả chiết polyphenol từ 100 g lá chè xanh khô stt Mẫu thí nghiệm Dung môi Lượng polyphenol thu được (g) Hàm lượng catachin (%) 1 2 Mẫu A Mẫu B Nước Nước - etanol 7,18 8,68 73 83 Từ kết quả thu được có thể nhận thấy rằng khi dùng dung môi hỗn hợp nước - etanol thì thu được hiệu suất cao hơn và hàm lượng catachin cũng lớn hơn. Tác dụng kháng oxy hóa (antioxidation) của polyphenol thu được từ lá chè xanh Việt nam CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 26 đã được đánh giá theo khả năng bảo quản dầu hạt cải. Trong thời gian bảo quản, dầu tiếp xúc với không khí, bị oxy hoá và tăng trọng lượng. Khi có mặt chất kháng oxy hoá, thì quá trình oxy hoá của dầu bị hạn chế. Tác dụng kháng oxy hoá của chất antioxidant càng mạnh, thì sự oxy hoá dầu càng chậm. Khả năng kháng oxy hoá của polyphenol được đánh giá khi tăng tỉ lệ polyphenoltrong dầu và khi so sánh với các chất có tính chất kháng oxy hoá đã biết như axit ascorbic (vitamin C) và tocopherol (vitamin E). Kết quả cho thấy có thể thu được cafein vào khoảng 2 - 2,1% và polyphenọl vào khoảng 7-8% so với lượng mẫu lá chè khô. Polyphenol chiết xuất từ lá chè xanh thứ phẩm có tác dụng kháng oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn nhiều so với axit ascorbic và tocopherol. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô (86 trang). 2. Võ Thái Dân, 2004. Bài giảng cây chè. Trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3. Trần Hoài Khải, 2002. Thử tìm phương pháp khử tanin trong mẫu cấy và xây dựng môi trường nuôi cấy mô trà. Đánh giá sản lượng trà dựa trên lớp tế bào mô dậu của lá. Luận văn tốt nghiệp khoa học nông nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. 4. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh (199 trang). 5. Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong, 1997. Cây chè Việt Nam. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 6. Nguyễn Đức Thiết, 2005. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Nông Nghiệp. 7. Carl A. Huetteman & John E. Preece, 1993. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 33: pp 105 – 119, 1993. 8. Chin-YiLu, 1993.The use of thidiazuron in tissue culture .In vitro Cell. Dev. Biol 29P: pp 92- 96, 1993. 9. Tapan K. Mondal, Amita Bhattacharya, Malathi Laxmikumaran & Paramvir Singh Ahuja, 2004. Recent advances of tea (Camillia sinensis) biotechnology. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76, pp 195-254. 10. Yoriguki Nakamura, 1991. In vitro propagation Techniques of Tea Plants. JARQ25, pp: 185 – 194, 1991. 11. Indra Sandal, Amita Bhattacharya và Paramvir Singh Ahuja, 2001. An efficientliquidculture system for tea shoot proliferation. Plant cell, tissue and Organ Culture 65: pp 75-80,2001. 12. Phỏng dịch từ bài: 'Node culture'