Góp phần phân lập scopolamine từ cà độc dược (datura metel l.), họ cà (solanaceae)

.............................. 4 Hình 2.4 Công thức scopolamine ........................................................................ 8 Hình 2.5 Cách tính giá trị Rf ................................................................................ 13 Hình 2.6 Cấu trúc mạng silica gel ....................................................................... 14 Hình 3.1 Lá Cà độc dƣợc khô .............................................................................. 21 Hình 3.2 Qui trình điều chế các loại cao ............................................................. 22 Hình 4.1 Cao ethanol từ lá Cà độc dƣợc .............................................................. 23 Hình 4.2 Sơ đồ điều chế cao ethanol và cao C từ lá Cà độc dƣợc....................... 25 Hình 4.3 SKLM scopolamine chuẩn so với cao C .............................................. 26 Hình 4.4 SKLM cao C ......................................................................................... 26 Hình 4.5 SKC cao C ............................................................................................ 27 Hình 4.6 SKLM phân đoạn SC1 .......................................................................... 27 Hình 4.7 SCK phân đoạn SC1 ............................................................................. 28 Hình 4.8 SKLM phân đoạn SC2 .......................................................................... 28 Hình 4.9 SKLM scopolamine chuẩn và phân đoạn SC3 ..................................... 28 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số khung cơ bản của alkaloid ........................................................ 7 Bảng 2.2 Màu vết của các hợp chất hữu cơ trong các thuốc thử .......................... 16 Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng ................................................................................... 20 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) PE Ether dầu hỏa 60-90C C Chloroform EA Ethyl acetate Me Methanol Rf Retention factor Dd Dung dịch TÓM TẮT Cà độc dƣợc (có tên khoa học là Datura metel L.) thuộc họ Cà (Solanaceae), là loại cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi ở nƣớc ta. Thành phần hóa học của Cà độc dƣợc chủ yếu là alkaloid, alkaloid chính là scopolamine. Scopolamine là chất chống tiết cholin (anticholinergic) và tác động lên hệ thẩn kinh trung ƣơng. Trong y học, nó đƣợc sử dụng ở liều tƣơng đối, sử dụng chính trong điều trị say tàu xe và buồn nôn và nôn sau phẫu thuật. Với mong muốn tìm ra phƣơng pháp phân lập hợp chất scopolamine, đề tài đƣợc chọn để thực hiện là “Góp phần phân lập scopolamine từ Cà đôc dƣợc (Datura metel L.), họ Cà (Solanaceae)”. Phƣơng pháp chiết lỏng lỏng đƣợc thực hiện để điều chế cao chloroform ở pH 9-10 từ cao ethanol. Việc tách scopolamine đƣợc thực hiện bằng sắc ký cột. Hàm lƣợng scopolamine trong Cà độc dƣợc, cao ethanol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC. Hàm lƣợng scopolamine trong nguyên liệu (lá Cà độc dƣợc khô) là 1,24%. Khối lƣợng scopolamine thu đƣợc từ quá trình sắc ký cột là 660 mg. Hiệu suất chiết scopolamine của cả quá trình là 53,2%. ABSTRACT Datura metel L. belongs to the Solanaceae family. A wild perennial herbaceous plant is cultivated everywhere in our country. The chemical composition of Datura metel L. is mainly alkaloid, scopolamine is the main alkaloid. Scopolamine is an anticholinergic agent which effects on the central nervous system. Its use in medicine is relatively limited, with its chief uses being in the treatment of motion sickness and postoperative nausea and vomiting. In order to find a method to isolate this compound, the "Contributing isolation of scopolamine from Datura metel L., family Solanaceae” was chosen. Liquid-liquid extraction method was carried out to prepare chloroform extract at pH 9-10 from ethanol extract. The separation of scopolamine from chloroform extract was performed by open-column chromatography method. The amount of scopolamine in Datura metel L. and ethanol extract were determined by HPLC method. The scopolamine content in Datura metel L. is 1.24% for the dry leaves. The yield of scopolamine form the column chromatography process is 660 mg. The yield of the entire scopolamine extraction process is 53.2%. CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU Thiên nhiên Việt Nam rất phong phú và đa dạng về thực vật, nhiều loại cây đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh từ xƣa đến nay. Cà độc dƣợc (Datura metel L.), là loại cây từ lâu đã đƣợc biết đến và sử dụng trong y học ở một số nƣớc trên thế giới và Việt Nam. Theo Đông y, cà độc dƣợc có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức, là vị thuốc ngừa cơn hen, chống co bóp trong bệnh loét dạ dày, chống say tàu xe. Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng, Thành phần hóa học của Cà độc dƣợc chủ yếu là alkaloid, alkaloid chính là scopolamine, ngoài ra còn có atropine, hyoscyamine. Đƣợc biết scopolamine ở liều thấp là chất chống tiết cholin và tác động lên hệ thẩn kinh trung ƣơng để làm cho các cơ dạ dày và ruột đƣợc êm dịu, làm khô nƣớc bọt, dịch vị, mồ hôi.[1] Khi khoa học kỹ thuật phát triển, ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu tìm hiểu về những thảo dƣợc nói chung và cây Cà độc dƣợc nói riêng. Việc nghiên cứu và phân lập các hợp chất có hoạt tính chữa bệnh trong Cà độc dƣợc đã đƣợc thực hiện nhiều trên thế giới. Hợp chất scopolamine trong Cà độc dƣợc đƣợc phân lập thành công và đƣợc ứng dụng trong y học với nhiều dạng thuốc nhƣ: dạng miếng dáng chống say tàu xe, dạng dẫn xuất scopolamine hydrobromine viên nén và dung dịch tiêm với tác dụng an thần, giảm đau cho những bệnh nhân sau phẩu thuật,... Cà độc đƣợc mọc hoang và đƣợc trồng khá phổ biến ở nƣớc ta, với nguồn nguyên liệu dồi dào rất thuận lợi để có thể nghiên cứu ứng dụng vào y học trong tƣơng lai. Tuy nhiên, ở nƣớc ta chƣa có nhiều nghiên cứu về cây Cà độc dƣợc cũng nhƣ nghiên cứu phân lập hợp chất có giá trị về y học này. Với mong muốn bƣớc đầu phân lập hợp chất scopolamine, đề tài đƣợc chọn để thực hiện là “Góp phần phân lập scopolamine từ Cà đôc dƣợc (Datura metel L.), họ Cà (Solanaceae)”. CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thực vật học 2.1.1 Khái quát về họ Cà (Solanaceae) Họ Cà hay còn đƣợc gọi là họ Khoai tây là một họ thực vật có hoa. Tên gọi khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum nghĩa là “cây cà dƣợc”. Họ này bao gồm Cà độc dƣợc (chi Datura), cà tím, khoai ma, cà dƣợc (benlađôn), ớt, khoai tây, thuốc lá, cà chua và cỏ dã yên. Hoa hình nón hay phễu với 5 cánh hoa. Lá mọc so le, thƣờng có lông hoặc bề mặt hơi dính. Quả mọng (cà chua) hay quả nang dễ nứt nhƣ trong trƣờng hợp của chi Datura. Hạt tròn và bẹt. Các nhị hoa là bội số của 4. Các loài họ Cà thƣờng chứa nhiều glucoside dạng alkaloid có cả dƣợc tính và độc tính. Theo hệ thống APG II năm 2003 thì họ này chứa 102 chi với 2.460 loài.[2] 2.1.2 Giới thiệu về cây Cà độc dƣợc (Datura metel L.) Hình 2.1 Cây Cà độc dƣợc (Datura metel L.) Cây Cà độc dƣợc, tên khoa học là Datura metel L., thuộc họ Cà (Solanaceae). Tên gọi khác: Cây cà dƣợc, cà diên, cà lục dƣợc (Tày), mạn đà la, sùa tùa (H’mông), hìa kìa piếu (Dao). 2.1.3 Thực vật học Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật: Hình 2.2 Vị trí của Cà độc dƣợc trong bản hệ thống phân loại thực vật Loài: D. metel Giới: Thực vật bật cao (Không phân hạng) Angiospermae (Không phân hạng) Eudicots (Không phân hạng) Asterids Bộ: Solanales Họ: Cà (Solanaceae) Chi: Datura 2.1.4 Hình thái thực vật Căn cứ vào màu sắc của hoa và thân ngƣời ta chia ra nhiều dạng Cà độc dƣợc. Ở nƣớc ta có 3 loại Cà độc dƣợc: Cà độc dƣợc với hoa trắng, thân xanh, cành xanh (Datura metel L. forma alba), Cà độc dƣợc với hoa đốm tím, cành và thân tím (Datura metel L. forma violacea) và dạng lai của hai dạng trên. Hình 2.3 Cây và quả Cà độc dƣợc Các dạng Cà độc dƣợc đều là những loại cây cỏ nhỏ, mọc hàng năm, cao từ 1-1,5 m. Thân nhẵn, phần non có nhiều lông tơ ngắn. Thân cây có màu xanh, hoặc màu tím, tùy theo dạng. Lá đơn, mọc cách, nhƣng ở gần ngọn nhƣ mọc đối hay mọc vòng. Phiến lá hình trứng dài, gốc lá lệch, ngọn lá nhọn, mép lá ít khi nguyên, thƣờng lƣợn sóng hay xẻ răng cƣa. Mặt lá màu xanh xám, mặt dƣới màu xanh nhạt, gân chính và gân phụ màu xanh, hoặc tím tùy theo dạng. Mặt lá còn non có nhiều lông, sau rụng dần. Hoa đơn mọc ở kẽ lá, cuống lá, khi hoa héo, một phần còn lại trƣởng thành với quả hình mâm, tràng to, hình phiểu có màu trắng hoặc tím. Quả hình cầu, có gai, đƣờng kính chừng 3 cm, quả non có màu xanh, khi già có màu nâu chứa nhiều hạt hình trứng dẹt, màu vàng đen.[1] 2.1.5 Sinh thái phân bố và trồng hái Cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi ở Việt Nam, Campuchia, Lào, Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc, để làm cảnh và làm thuốc. Cây thƣờng mọc ở những nơi đất hoang, đất mùn, hơi ẩm. Ở nƣớc ta có nhiều ở Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Thu hái lá vào lúc cây sắp và đang ra hoa (tháng 5-6 đến hết tháng 9-10). Hoa hái vào các tháng 8, 9, 10. Hạt lấy ở những quả chín ngả màu nâu.[1] 2.1.6 Thành phần hóa học Trong lá, hoa, hạt và rễ Cà độc dƣợc có chứa alkaloid, trong đó alkaloid chính là L-scopolamine (hay hyoscine) C17H21NO4. Ngoài ra còn có hyoscyamine, atropine (DL-hyoscyamine) C17H21NO3, norhyoscyamine. Tỷ lệ các alkaloid trên thay đổi tùy theo bộ phận và tùy theo thời kỳ thu hái. Thƣờng trong lá là 0,10-0,5%, có khi tới 0,6-0,7%, trong rễ 0,1-0,2%, trong hạt 0,1-0,5%, trong quả 0,12%, hoa 0,25-0,6%.[1] Ngoài alkaloid, trong lá, rễ còn có flavonoid, saponin, coumarin, tannin, trong hạt còn có chất béo.[3] 2.1.7 Tác dụng dƣợc lý Cà độc dƣợc vị cay, tính ôn hòa có độc, vào kinh quản. Có tác dụng khử phong thấp, chữa hen xuyễn. Nƣớc sắc dùng rửa những nơi da tê dại, hàn thấp, cƣớc khí, uống trong dùng chữa kinh sợ, cuộn thành thuốc lá hút chữa ho do hàn. Những ngƣời thể lực yếu không dùng đƣợc. Cà độc dƣợc đƣợc dùng để chữa ho, hen, chống co bóp trong bệnh loét dạ dày, say sóng hoặc nôn mửa khi đi máy bay. Dùng ngoài đắp mụn nhọt cho khỏi đau nhức. Dùng dƣới hình thức bột lá hay bột hoa, hoặc dùng lá hay dùng hoa phơi khô, thái nhỏ để hút nhƣ thuốc lá, liều hút: ngày 1-1,5 g. Nếu thấy triệu chứng ngộ độc phải thôi ngay. Còn dùng dƣới hình thức rƣợu 1/10 (ngày dùng 0,5-0,3 g rƣợu cho ngƣời lớn, 0,10 g/5 giọt cho trẻ em). Đơn thuốc lá chữa hen: Hoa cà độc dƣợc phơi khô thái nhỏ, lá 1 phần và kali nitrat 1 phần, cho vào giấy cuộn thành điếu thuốc lá. Ngày hút 1-1,5 g vào lúc có cơn hen. Tác dụng của Cà độc dƣợc là tác dụng của scopolamine và của atropine. Atropine làm cơ vòng của mắt dãn ra, nên đồng tử dãn. Nhãn cầu dẹt lại, áp lực mắt tăng lên. Sự tiết nƣớc bọt, mồ hôi, dịch vị, dịch ruột ngừng lại. Làm nở khí đạo khi khí đạo bị co thắt và phó giao cảm bị kích thích. Lúc bình thƣờng, atropine không tác dụng. Ít tác động trên nhu động ruột và co thắt ruột. Liều độc atropine tác động lên não làm say có khi phát điên, hô hấp tăng, sốt, cuối cùng thần kinh trung ƣơng bị ức chế và tê liệt. Tác dụng của scopolamine gần giống atropine, nhƣng làm giản đồng tử trong thời gian ngắn hơn. Khác với atropine, là khi ngộ độc thì scopolamine ức chế thần kinh nhiều hơn là kích thích. Vì vậy scopolamine đƣợc dùng ở khoa thần kinh để chữa cơn co giật của bệnh Parkinson, phối hợp với atropine để chống say phi cơ hoặc tàu thủy, làm thuốc dịu thần kinh.[1] 2.2 Sơ lƣợc về alkaloid Một số tính chất hóa lý và phƣơng pháp chiết tách alkaloid nhƣ sau:[4,5] 2.2.1 Các đặc tính hóa lý của alkaloid Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên chứa ít nhất một nguyên tử nitơ trong vòng heterocylic, chứa cả phân tử nitơ và carbon. Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, tính base của các alkaloid cũng khác tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alkaloid tính base yếu thì phải cần môi trƣờng acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nƣớc. Phần đông alkaloid có vị đắng và có tính triền quang. Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy. Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotine, coniine) và một vài alkaloid có màu (berberine màu vàng, betanidine màu đỏ). Các alkaloid dạng base tự do hầu nhƣ không tan trong nƣớc, nhƣng thƣờng tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣ chloroform, diethyl ether, alcol bậc thấp. Các muối của alkaloid thì tan trong nƣớc, alcol và hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cơ nhƣ chloroform, diethyl ether, benzene. Ngoài tính base, các alkaloid có phản ứng tƣơng tự nhau đối với một số thuốc thử, gọi tên chung là thuốc thử alkaloid. Phần đông alkaloid là những chất ngoài dƣợc tính có cả độc tính, do đó trong y dƣợc chúng thƣờng đƣợc dùng với liều lƣợng yếu và nghiêm ngặt. Tính hòa tan của alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc chiết tách alkaloid ra khỏi cây cũng nhƣ trong kỹ nghệ dƣợc phẩm điều chế dạng thuốc để uống. Nói chung alkaloid là hợp chất tƣơng đối bền, tuy vậy một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng hoặc các tác nhân oxi hóa. 2.2.2 Một vài nhóm cấu trúc alkaloid Một số cấu trúc alkaloid đƣợc chia theo các nhân cơ bản nhƣ sau: Bảng 2.1 Một số khung cơ bản của alkaloid Nhóm alkaloid Khung cơ bản Hợp chất điển hình Protobecberine N+ Berberine Tropane N CH3 Cocaine, Atropine, Scopolamine Purine N N N N Cafeine, Theophuline Morphinane NH H Morphine, Codeine Quinoline N Dictamine 2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách alkaloid ra khỏi cây Alkaloid có thể chiết từ bột dƣợc liệu khô xay nhuyễn thành bột. Tùy theo lý tính alkaloid dễ bay hơi hay alkaloid ổn định, chiết alkaloid bằng một trong hai cách cơ bản sau:  Trƣờng hợp alkaloid dễ bay hơi Alkaloid dễ bay hơi hiện diện trong cây dƣới dạng muối. Cây đƣợc phơi khô và nghiền nát thành bột, cho chất kiềm vô cơ vào để phóng thích alkaloid. Các chất kiềm thƣờng dùng là vôi, dd NH3, NaOH. Sau đó chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc để thu alkaloid. Sau đó chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc để thu alkaloid. Đây là trƣờng hợp chiết conin (alkaloid của ague), nicotine (alkaloid của thuốc lá), sparlein (alkaloid của Genet).  Trƣờng hợp alkaloid là base ổn định, dùng hai phƣơng pháp khác nhau  Nấu cây với nƣớc acid, hoặc với alcol acid hóa bằng acid mạnh. Trong điều kiện này alkaloid đƣợc chuyển sang dạng muối hòa tan trong nƣớc hoặc alcol loãng. Sau khi thu hồi dung môi bằng sự cô quay dƣới áp suất kém hoặc để bay hơi tự nhiên dung môi, thì thu đƣợc hỗn hợp alkaloid dƣới dạng cao sệt hoặc khô. Sự tách dung môi ở nhiệt độ càng thấp càng tốt. Cao đƣợc chế hóa bởi base nhƣ NaOH, dd NH3, vôi để chuyển alkaloid ra khỏi hỗn hợp muối, tiếp tục chiết bằng dung môi hữu cơ. Việc chọn dung môi phải phù hợp với tính phân cực của alkaloid là trung bình hay yếu để alkaloid tan tốt trong pha đó. Cuối cùng chƣng cất dung dịch alkaloid và thực hiện sự phân ly, tinh chế đối với hỗn hợp sản phẩm.  Chế hóa bột cây khô với base mạnh để phóng thích alkaloid. Dùng NaOH, dd NH3, vôi, MgO, đôi khi dd Na2CO3 để tránh xà phòng hóa chức ester. Làm khô dịch chiết ở áp suất thấp, tận chiết bằng dung môi thích hợp để hòa tan alkaloid tự do. Cũng nhƣ trong phƣơng pháp thứ nhất, dung dịch trên chứa tất cả alkaloid trong cây cộng với nhiều tạp khác. 2.3 Giới thiệu về hợp chất scopolamine Danh pháp và đặc tính hóa lý đƣợc khái quát nhƣ sau:[6] Hình 2.4 Công thức scopolamine  Công thức phân tử: C17H21NO4  Tên IUPAC: (–)-(S)-3-hydroxy-2-phenylpropionic acid(1R,2R,4S,7S,9S)- 9-methyl-3-oxa-9-azatricyclo[3.3.1.0 2,4 ]non-7-yl ester O O OH O NH3C  Tên gọi khác: 6β,7β-Epoxy-1αH,5αH-tropan-3α-ol (-)-tropane 6β,7β-epoxy-3α-tropanyl S-(-)-tropate 6,7-Epoxytropine tropate Tropic acid ester with scopine Scopine tropate Hyoscine L-Scopolamine  Scopolamine là chất lỏng sệt, không màu, không mùi, hiện diện trong cây chủ yếu dƣới dạng L-Scopolamine  Tỷ trọng: 1,313 g/cm3  Dạng base của scopolamine tan tốt trong dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, methanol, acetone, chloroform, ether, henxane; không tan trong benzene, PE  Dạng muối của scopolamine tan trong ethanol, nƣớc  Scopolamine dễ bị thủy phân bởi acid mạnh hoặc kiềm mạnh  Nhiệt độ sôi là 460,313C ở áp suất thƣờng  Tinh thể scopolamine ở dạng ngậm một phân tử nƣớc, nhiệt độ nóng chảy 59C 2.4 Một vài nghiên cứu khoa học về cà độc dƣợc (Datura metel L.)  Nghiên cứu tại Đại học GITAM, Visakhapatnam (Ấn Độ) ghi nhận dịch chiết Datura metel L. với chloroform và methanol có khả năng kháng nhiều loại vi sinh vật (bao gồm vi khuẩn và nấm), ức chế sinh trƣởng đáng kể trên Erwinia carotovora và Pseudomonas syringae. Vùng ức chế (bán kính vòng vô khuẩn) của dịch chiết chloroform từ 9 đến 18 mm trong khi với dịch chiết methanol từ 11 đến 30 mm ở nồng độ 100 mg/mL DMSO. Ở nồng độ 250 mg/mL thì vùng ức chế của dịch chiết chloroform là 11 đến 19 mm và dịch chiết methanol là 12 đến 35 mm. Datura metel L. có thể đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Trong tƣơng lai sẽ tiến hành nghiên cứu phân lập các thành phần hiện diện trong các dịch chiết từ Datura metel L. bằng phƣơng pháp sắc ký cột.[7]  Bing-You Yang, Yong-Gang Xia, Qiu-Hong Wang, De-Qiang Dou, Hai-Xue Kuang (2010) đã phân lập đƣợc hai alkaloid mới từ Datura metel L. là (E)-methyl 4-(3-(4-hydroxyphenyl)-N-methylacrylamido) butanoate và 6,7-dimethyl-1-D-ribityl-quinoxaline-2,3(1H,4H)-dione-5′- O-β-D-glucopyranoside.[8]  Avaratnarajah Kuganathan và Sashikesh Ganeshalingam (2010) đã tiến hành phân tích thành phần vô cơ và hữu cơ trong lá Datura metel L. và nghiên cứu độc tính ở nhiều nồng độ trên châu chấu và kiến đỏ. Đã xác định đƣợc các chất vô cơ ở dạng ion với nồng độ (ppm) nhƣ sau: Ca2+ (4,28 ± 0,05)×10 4 , Mg 2+ (3,86 ± 0,009)×10 4 , Fe 3+ (2,33 ± 0,007)×10 4 và PO4 3- (4,65 ± 0,06)×10 4 . Qua thử nghiệm sàn lọc trên dịch chiết Datura metel L. với chloroform đã xác định đƣợc sự hiện diện của alkaloid và steroid, không có saponin và flavonoid. Qua thử nghiệm, kết quả giá trị EC50 (nồng độ giết chết 50% số cá thể) trên châu chấu là 12000 ppm và kiến đỏ là 11600 ppm. Phần trăm tử vong tăng từ 20-60% khi tăng nồng độ từ 2500-15000 ppm. Nhƣ vậy, dịch chiết từ lá Datura metel L. ở nồng độ cao sẽ có độc tính cao và đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu diệt châu chấu và kiến đỏ.[9] 2.5 Cơ sở lý thuyết và một số phƣơng pháp thực nghiệm Cơ sở lý thuyết, phƣơng pháp và kỹ thuật chiết tách hợp chất thiên nhiên đƣợc khái quát nhƣ sau:[5] 2.5.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm Kỹ thuật chiết ngâm dầm không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lƣợng lớn mẫu cây. Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng, có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Phƣơng pháp thực hiện: bột cây đƣợc đặt vào bình, rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 tiếng để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua một tờ giấy lọc hoặc lọc bằng thiết bị lọc chân không, cô quay thu hồi dung môi sẽ có đƣợc cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi thu hồi vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lƣợng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm đƣợc nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mất thời gian. Dung môi sau khi thu hồi đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau. 2.5.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng thƣờng đƣợc áp dụng để:  Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu.  Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc của sự chiết lỏng-lỏng là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo,), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometane,) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether –O–, aldehyde –CHO, ketone –CO–, ester –COO–,) và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức – OH, –COOH,). Việc chiết lỏng-lỏng đƣợc thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu đƣợc hoà tan vào pha nƣớc. Sử dụng lần lƣợt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nƣớc hoặc loại có thể hỗn hợp đƣợc với nƣớc để chiết ra khỏi pha nƣớc các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nƣớc mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dƣới so với pha nƣớc. Việc chiết đƣợc thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ nhƣ: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol, Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4, CaSO4, và cô quay đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết. Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã đƣợc chiết vào pha hữu cơ cũng nhƣ các hợp chất nào còn lại ở trong pha nƣớc và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nƣớc và của pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó đƣợc coi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nƣớc cũng nhƣ trong pha hữu cơ. Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng. Cần lƣu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi. 2.5.3 Phƣơng pháp sắc ký Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là:[9]  Tính chất hấp phụ của chất rắn  Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion  Sự rây phân tử theo kích thƣớc của chúng  Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử  Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau, Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột đƣợc khái quát nhƣ sau:[5,10] 2.5.3.1 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng a. Giới thiệu chung về phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) còn gọi là sắc ký bản mỏng chủ yếu dựa vào hiện tƣợng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ nhƣ: silica gel hoặc alumina, chất hấp phụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này đƣợc gọi là sắc ký lớp mỏng.  Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ, bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy.  Pha tĩnh: Một lớp mỏng, thƣờng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ nhƣ silica gel, alumina, đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ.  Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thƣờng là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.  Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào lực mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tƣơng tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tƣợng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm hoặc không di chuyển. Chất cần phân tích sẽ đƣợc phân bố trên pha tĩnh, sau đó cho pha động di chuyển ngang qua. Tùy vào ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động mà các cấu tử trong hỗn hợp chất sẽ đƣợc tách ra và di chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản mỏng. Vị trí của mỗi cấu tử trên bản mỏng đƣợc tính bằng giá trị Rf: Rf đƣợc xác định nhƣ sau: Sắc ký chƣa triển khai Sắc ký đã triển khai hoàn tất Hình 2.5 Cách tính giá trị Rf Cách tính giá trị Rf:  b a R f Các chất trên bản mỏng có thể có màu dễ quan sát, cũng có thể không có màu. Để biết chính xác vị trí của các chất đó trên bản mỏng ta có thể dùng các thuốc thử đặc trƣng để phát hiện, gọi là quá trình hiện vết. Các thuốc thử này đƣợc phun xịt lên bản mỏng hoặc nhúng nhanh bản mỏng vào dung dịch thuốc thử. Các chất khác nhau thƣờng sẽ có giá trị Rf khác nhau trong cùng điều kiện thử. Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định. Khoảng cách dịch chuyển chất tan Khoảng cách dịch chuyển pha động b. Chất hấp phụ silica gel Silica gel là chất hấp phụ đƣợc sử dụng thông dụng nhất. Silica gel đƣợc sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký đƣợc chế tạo bằng cách thủy giải natri silicate (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngƣng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết nhƣ có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, nhƣ yêu cầu. Ngoài ra ngƣời ta còn bổ sung thêm các hợp chất khác vào silica gel để tăng khả năng tách theo mong muốn. Hình 2.6 Cấu trúc mạng silica gel Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm –Si–OH, đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất đƣợc sắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức –OH, –NH2, –COOH,...) có khả năng tạo mối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực nhƣ alkane, terpene (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm. c. Dung môi giải ly Nguyên tắc chọn dung môi: Nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lƣợng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không đƣợc quá dễ bay hơi, ví dụ nhƣ diethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35C, gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam). Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng SKLM tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, ngƣời thay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly; thông thƣờng ta sử dụng hệ hai dung môi. Nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp nhƣ thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ. Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân, nhƣng những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho ngƣời nghiên cứu. d. Giải ly bản mỏng  Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng Chuẩn bị bình có kích thƣớc lớn hơn một chút so với kích thƣớc của bản mỏng. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì nhƣ thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình, với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích khoảng 10 mL dung môi. Chiều cao của lớp dung môi trong bình không đƣợc cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng (vết chấm trên bản mỏng không đƣợc ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản vào bình). Bình triển khai bản mỏng yêu cầu phải:  Kín  Đáy bằng và không rộng lắm  Có giấy lọc dùng bão hòa dung môi trong bình  Cho dung môi bão hòa bình một thời gian trƣớc khi đặt bản mỏng vào  Trong quá trình giải ly không di chuyển bình, đặt bình vào nơi kín gió  Đong dung môi đúng tỉ lệ đã định và trộn thật đều trƣớc khi rót vào bình  Kỹ thuật giải ly bản mỏng Dung môi giải ly di chuyển lên. Sau khi bình đã bão hòa dung môi, đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dƣới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1 cm. Hiện hình các vết sau khi giải ly bản mỏng Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ đƣợc nhìn bằng mắt thƣờng, nhƣng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý.  Phương pháp vật lý Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu, nếu quan tâm thì dùng viết chì khoanh lại.  Phương pháp hóa học Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trƣng: Bảng 2.2 Màu vết của các hợp chất hữu cơ trong các thuốc thử[5] Thuốc thử Màu của vết Hợp chất Hơi I2 H2SO4đđ H2SO4đđ H2SO4đđ FeCl3 Mayer Dragendorff Vàng hoặc nâu Vàng đậm đến da cam Màu đỏ hoặc xanh dƣơng-đỏ Màu cam đến đỏ Xanh lục đến xanh đen Màu vàng nhạt Màu đỏ cam Hợp chất hữu cơ nói chung Flavone, Flavonol Chalcone, aurone Flavonoid Sesquiterpen Alkaloid Alkaloid Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô. Nếu hiện hình bằng hơi I2 thì đặt bản mỏng trong bình chứa I2. Nếu hiện hình bằng dung dịch FeCl3, H2SO4 hay Dragendorff thì nhúng tấm bản mỏng vào lọ chứa dung dịch đó, lấy ra và lắc nhẹ cho thuốc thử chảy xuống hết. Tiến hành nƣớng bản mỏng bằng máy sấy hay bếp điện, các vết màu sẽ hiện lên, dùng băng keo dán tấm bản mỏng lại để tấm bản mỏng không bị vỡ để tiện cho quan sát lần sau. Trên tấm bản mỏng phải ghi rõ dung môi hoặc hệ dung môi giải ly. e. Các công dụng của SKLM Kỹ thuật SKLM hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên. Một số công dụng của sắc ký lớp mỏng:  Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập đƣợc  Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không  Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát  Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột  Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ  Để kiểm tra một hợp chất có kém bền  Để cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế) 2.5.3.2 Phƣơng pháp sắc ký cột a. Giới thiệu về phƣơng pháp sắc ký cột Sắc ký cột (SKC) là một phƣơng pháp cổ điển để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, ngƣời ta có thể tách hầu hết các chất của bất kỳ một hỗn hợp nào. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm:  Sự lựa chọn chất hấp phụ  Sự lựa chọn dung môi giải ly  Kích thƣớc cột sắc ký, số lƣợng chất hấp phụ, lƣợng mẫu chất đƣợc dung  Vận tốc giải ly Sắc ký cột hở đƣợc tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thƣờng là những hạt silica gel có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 μm) đƣợc nạp trong một cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách đƣợc đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột, đƣợc hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Hệ thống nhƣ thế thƣờng làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với HPLC. Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ƣu điểm nhƣ pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một lƣợng lớn mẫu chất. b. Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly Các hệ dung môi dùng cho SKLM đều có thể ứng dụng vào SKC. Tuy vậy, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp hoặc có mùi khó chịu hoặc độc thì không nên dùng làm dung môi giải ly cột. Trƣớc khi triển khai SKC, nhất thiết phải sử dụng SKLM để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Sau khi đã chọn đƣợc thì có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột. Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn. Thông thƣờng nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tƣơng đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải ly sẽ đƣợc tăng dần độ phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn. Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lƣợng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải ly. Nếu cho thêm vào đột ngột thì sẽ làm gãy cột do silica gel đƣợc trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt, gãy cột, cột gãy sẽ làm khả năng tách của cột kém đi. Thông thƣờng, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh và đƣợc giải ly ra khỏi cột trƣớc còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn (khối lƣợng phân tử cũng liên quan đến thứ tự giải ly, một hợp chất không phân cực và có khối lƣợng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn). c. Kích thƣớc cột sắc ký và lƣợng chất hấp phụ  Tỷ lệ giữa lƣợng mẫu cần tách và lƣợng chất hấp phụ sử dụng Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lƣợng chất hấp phụ phải lớn hơn 25-50 lần trọng lƣợng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lƣợng). Tuy nhiên, với hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lƣợng lớn chất hấp phụ nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng chất hấp phụ ít hơn.  Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đƣờng kính trong của cột sắc ký Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp phụ nạp trong cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất hấp phụ: đƣờng kính của cột vào khoảng (10:1). Muốn biết lƣợng chất hấp phụ có phù hợp với cột thì cho chất hấp phụ khô vào cột để quan sát. d. Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạng dung dịch và nạp mẫu chất dạng bột khô.  Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch Để nạp mẫu vào cột, phải theo tiến trình sau đây: mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống bằng sát với mực chất hấp phụ đang có trong cột, khóa cột lại, dùng một ống nhỏ giọt để hút dung dịch mẫu cho vào đầu cột thật chậm. Từ từ mở khóa cột để cho dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp phụ trên đầu cột, lúc thấy mức dung dịch đã xuống sát mực chất hấp phụ thì khóa cột lại, dung dịch không chạy ra nữa; tiếp tục nạp cho hết lƣợng mẫu chất vào đầu cột. Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ, khóa lại, dùng ống nhỏ giọt cho một lƣợng nhỏ 5-10 mL dung môi bắt đầu rửa giải vào đầu cột lại mở khóa để dung dịch chảy ra.  Nạp mẫu ở dạng bột khô Nếu chất mẫu không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hƣởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”. Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (x g) đƣợc hòa tan trong dung môi nhƣ ethyl acetate hoặc methanol (50x g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10x g). Hỗn hợp này đƣợc cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã đƣợc tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel. Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ƣớt một phần bột silica gel. Cho một lớp cát dày khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly. e. Theo dõi quá trình giải ly cột Đối với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, ta có thể theo dõi quá trình giải ly bằng mắt thƣờng, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi đƣợc giải ly ra khỏi cột. Nhƣng đa số các hợp chất hữu cơ thƣờng không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu; do đó ta phải theo dõi bằng những cách khác nhau. Phƣơng pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích nhƣ nhau. Nên pha một lƣợng lớn dung môi giải ly để hạn chế sai lệch nồng độ trong mỗi lọ. Dung dịch trong những lọ hứng sẽ đƣợc SKLM trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có kết quả SKLM giống nhau (giống nhau nhƣng có thể chứa nhiều hợp chất, vì hỗn hợp) sẽ đƣợc gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó. f. Thay đổi hệ dung môi giải ly cột SKC đƣợc khởi đầu bằng loại dung môi nào là do kết quả sắc ký trên cao ban đầu. Thí dụ khởi đầu SKC bằng ether dầu hỏa, cứ tiếp tục giải ly cho đến khi lọ cuối cùng, hứng dung dịch giải ly ra, đuổi hết dung môi ra khỏi lọ này, cân lại không thấy có cặn hoặc còn cặn không đáng kể, hoặc đuổi bớt dung môi rồi chấm sắc ký lớp mỏng mà không còn hiện vết nữa. Điều này có nghĩa là dung môi ete dầu hỏa đã lôi hết ra khỏi cột những hợp chất không phân cực trong cao đã nạp ở đầu cột. Tiếp theo, cần tăng thêm độ phân cực cho dung môi giải ly để tiếp tục quá trình SKC. Lần lƣợt giải ly từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực. CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Các phƣơng tiện 3.1.1 Dung môi, hóa chất Dung môi và hóa chất sử dụng thực hiện đề tài đƣợc liệt kê trong bảng sau: Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng Tên hóa chất Nƣớc sản xuất Ethanol 96 Ether dầu hỏa (PE) Chloroform Ethyl acetate (EA) Methanol (Me) Na2SO4 khan H2SO4 Dd NH3 30% Nƣớc cất Silica gel 60 F254 Bản SKLM Việt Nam Việt Nam, Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung quốc Trung quốc Trung quốc Việt Nam Merck Merck 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị Dụng cụ, thiết bị:  Tủ sấy  Máy cô quay Buchi  Bếp từ  Phễu chiết  Bình lóng  Cột sắc ký  Ống mao quản, giấy lọc  Cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, pipet, lọ thủy tinh, đũa thủy tinh, 3.1.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc và hàm lƣợng  Chạy SKLM với chất chuẩn, dùng thuốc thử đặc trƣng, so sánh các vết trên bản mỏng để định tính sự có hiện diện của chất.  Xác định hàm lƣợng và kiểm tinh khiết bằng phƣơng pháp HPLC. 3.1.4 Nguồn gốc nguyên liệu Lá Cà độc dƣợc đƣợc thu mua ở tỉnh Tiền Giang vào tháng 7 năm 2013. Lá ở dạng khô, cắt nhỏ khoảng 1-1,5 cm. Hình 3.1 Lá Cà độc dƣợc khô 3.1.5 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài  Thời gian: tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.  Địa điểm: Phòng RD (Research Development), nhà máy Dƣợc Liệu, Công ty Cổ phần Xuất nhập khẩu Y tế Domesco, tỉnh Đồng Tháp. 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp tách chiết Nguyên liệu đƣợc chiết trong ethanol bằng phƣơng pháp ngâm dầm, mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ thu đƣợc dịch chiết. Dịch chiết của các lần ngâm đƣợc gom lại cô quay đuổi dung môi thu đƣợc cao ethanol tổng. Điều chế các cao chloroform bằng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, sơ đồ điều chế các loại cao: Hình 3.2 Qui trình điều chế các loại cao 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập Sử dụng phƣơng pháp SKC để tách các chất, dò tìm hệ dung môi giải ly cột và kiểm tra quá trình SKC cũng nhƣ mức độ tinh sạch của hợp chất bằng SKLM so với chất chuẩn. Dịch chiết PE, chloroform Dịch nƣớc acid Nguyên liệu khô Ngâm dầm với ethanol 96 Dịch chiết cô quay đuổi dung môi Cao ethanol tổng Acid hóa cao ethanol tổng Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform Kiềm hóa Chiết lỏng-lỏng với chloroform Cao chloroform CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình điều chế các loại cao 4.1.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol Mẫu nguyên liệu lá Cà độc dƣợc khô đƣợc ngâm trong ethanol 96 với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:4. Sau thời gian khoảng 24 giờ/mỗi lần ngâm thu lấy dịch chiết, lọc dịch chiết bằng máy lọc áp suất thấp và đem cô quay thu hồi dung môi. Cứ thế lặp lại quá trình này thêm 2 lần nữa. Sau đó, gom tất cả các lần thu cao trên lại sẽ đƣợc cao ethanol có màu xanh đen. (Hình 4.1) Cao ethanol tổng đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm xác định hàm lƣợng sopolamine bằng phƣơng pháp HPLC. Hình 4.1 Cao ethanol từ lá Cà độc dƣợc 4.1.2 Quá trình điều chế cao chloroform (cao C) Cao ethanol đã thu đƣợc ở trên sử dụng cho quá trình điều chế cao C bằng các bƣớc sau:  Acid hóa cao ethanol (chuyển alkaloid sang dạng muối) Cho hết lƣợng cao ethanol vào cốc 1000 mL, thêm từ từ dung dịch acid H2SO4 1N vào cốc đựng cao, khuấy đều và thử giấy đo pH vạn năng đến khi pH của hỗn hợp khoảng 2-3 thì ngừng cho acid, đun ấm và thêm nƣớc cất để hòa tan hết cao. Hỗn hợp đƣợc lọc bằng máy lọc áp suất thấp và tận chiết lần lƣợt với các dung môi PE, chloroform để loại bớt tạp. Chuẩn bị bình lóng 1000 mL đặt trên một giá đỡ, mở nắp và khóa van lại. Cho mỗi lần 400 mL hỗn hợp cao đƣợc acid hóa cho vào bình lóng, tiếp tục cho thêm dung môi PE vào bình khoảng 300-400 mL/lần chiết. Đóng nắp bình lại, lắc đều rồi để bình lóng yên trên giá đỡ khoảng 15-20 phút để hỗn hợp trong bình lóng tách thành hai lớp: lớp dƣới màu nâu sậm và lớp trên màu xanh đen. Mở van, phần dung dịch màu nâu chảy sệt và dung dịch chất lỏng màu xanh đen lần lƣợt chảy ra và đƣợc hứng riêng từng cốc. Lấy lớp dƣới tiếp tục chiết với PE cho đến khi màu của lớp PE nhạt dần và kiểm tra bằng SKLM. Nếu thấy không còn vết chứng tỏ chất đã đƣợc trích hoàn toàn vào dung môi PE, sau đó gom lớp PE của các lần chiết lại cô quay thu hồi dung môi. Tƣơng tự, phần dịch nƣớc màu nâu sậm đƣợc chiết loại tạp tiếp với dung môi chloroform (300-400 mL/lần chiết). Lắc đều và để yên khoảng 15-20 phút, hỗn hợp trong bình lóng lúc này tách thành hai pha, do sự khác biệt về khối lƣợng riêng nên pha nƣớc nằm phía trên, pha hữu cơ nằm phía dƣới. Tách lấy pha hữu cơ cô quay thu hồi dung môi chloroform, pha nƣớc đƣợc hứng ra cốc riêng để tiến hành kiềm hóa.  Kiềm hóa pha nƣớc (chuyển alkaloid về dạng base) Cho từ từ dd NH3 30% vào cốc đựng pha nƣớc, khuấy đều và thử giấy đo pH vạn năng đến khi pH của hỗn hợp khoảng 9-10 thì ngừng. Sau đó, hỗn hợp đƣợc chiết với dung môi chloroform, cho đến kiểm tra bằng SKLM trên pha hữu cơ và phun thuốc thử đặc trƣng Dragendroff không thấy vết của scopolamine nữa thì dừng lại. Dịch chiết từ dung môi chloroform sẽ đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan, cô quay thu đƣợc cao C (gồm họ alkaloid ở dạng base và các chất tan trong chloroform) và dung môi chloroform thu hồi. Cao C đƣợc gửi Phòng kiểm nghiệm để xác định hàm lƣợng scopolamine bằng phƣơng pháp HPLC. SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Hình 4.2 Sơ đồ điều chế cao ethanol và cao C từ lá Cà độc dƣợc 4.2 Phân lập scopolamine từ cao C 4.2.1 Khảo sát SKLM từ cao C SKLM cao C và scopolamine chuẩn với hệ dung môi EA:Me:NH3 (9:1:0,5), thuốc thử Dragendorff, để có thể quan sát hết toàn bộ các alkaloid trong cao C và vị trí vết của scopolamine so với các alkaloid còn lại. Dịch chiết PE, choloroform Dịch nƣớc acid Lá Cà độc dƣợc khô (1 kg) Ngâm dầm với ethanol 96 Dịch chiết đƣợc cô quay đuổi dung môi Cao ethanol tổng (250 g) Thêm H2SO4 1N đến pH=2-3, đun ấm Thêm nƣớc cất hòa tan hết cao, lọc Chiết lỏng-lỏng với PE, chloroform Thêm dd NH3 30% đến pH=9-10 Chiết lỏng-lỏng với chloroform Làm khan, cô quay thu hồi dung môi Cao C (3,8 g) Dịch nƣớc còn lại Hình 4.3 SKLM scopolamine chuẩn so với cao C Tuy nhiên, khi hiện hình bằng thuốc thử đặc trƣng Dragendorff thì không thấy đƣợc các chất tạp không phải là alkaloid. Để quan sát đầy đủ các chất trong cao phải hiện hình vết trên bản mỏng bằng thuốc thử H2SO4 (H2SO4 đậm đặc 20% trong methanol). Với thuốc thử này, các vết họ alkaloid đều hiện màu vàng nâu. Hình 4.4 SKLM cao C SKLM cao C với nhiều hệ dung môi khác nhau, nhận thấy rằng hệ dung môi PE-EA (80:20) đẩy vết tạp kém phân cực nhất lên vị trí Rf ≤ 0,3 trên bản mỏng. Tiến hành SKC cao C có khối lƣợng là 3,8 g với cột có đƣờng kính 3 cm, sử dụng loại silica gel 60 GF254 khối lƣợng là 80 g, dung môi giải ly đầu tiên là PE, sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi với hệ PE:EA. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 50 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi. Đặt tên phân đoạn có scopolamine là SC1, có khối lƣợng 2,01 g. Phân đoạn SC1 đƣợc SKLM và hiện hình bằng thuốc thử H2SO4, cho một vết chính là scopolamine màu vàng nâu kèm theo nhiều tạp màu xám đen. Hình 4.5 SKC cao C Hình 4.6 SKLM phân đoạn SC1 4.2.2 Xử lý phân đoạn SC1 Tiến hành SKC phân đoạn SC1 có khối lƣợng 2,01 g với cột có đƣờng kính 2,5 cm và 40 g silica gel. Giải ly cột với dung môi C và tăng dần độ phân cực của dung môi với hệ C:EA. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 20 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi thu đƣợc phân đoạn SC2 với khối lƣợng 0,92 g. Tiến hành SKLM phân đoạn SC2 cho vết chính scopolamine màu vàng nâu, tuy nhiên vẫn còn tạp kéo đuôi. Do đó, tiếp tục SKC phân đoạn này, hy vọng có thể phân lập đƣợc scopolamine tinh sạch hơn. Hình 4.7 SKC phân đoạn SC1 Hình 4.8 SKLM phân đoạn SC2 4.2.3 Xử lý phân đoạn SC2 Tiến hành SKC phân đoạn SC2 có khối lƣợng 0,92 g, sử dụng buret 25 mL có đƣờng kính 1 cm (thay thế cho cột sắc ký đƣờng kính 1 cm) và 15 g silica gel. Giải ly cột với hệ dung môi C:EA (30:70) và tăng dần độ phân cực. Hứng dung dịch giải ly ra khỏi cột với thể tích mỗi lần là 10 mL. Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM, gom các lọ bi có SKLM hiện vết của scopolamine cô quay đuổi dung môi đƣợc phân đoạn SC3 có khối lƣợng 660 mg. Kiểm tra lại phân đoạn SC3 bằng SKLM so với scopolamine chuẩn, cho thấy 2 vết giống nhau về Rf và màu sắc. Hình 4.9 SKLM scopolamine chuẩn và phân đoạn SC3 Phân đoạn SC3 này là chất lỏng sệt, màu trắng, tan trong chloroform, ethanol, không tan trong PE và nƣớc. CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Bƣớc đầu phân lập đƣợc scopolamine từ lá cà độc dƣợc (Datura metel L.), thu đƣợc kết quả sau:  Hàm lƣợng scopolamine trong nguyên liệu khô (đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp HPLC) là 0,124%.  Một kg nguyên liệu khô điều chế đƣợc 250 g cao ethanol tổng bằng phƣơng pháp ngâm dầm, hàm lƣợng scopolamine trong cao tổng là 0,374%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao ethanol là 75,4%.  Điều chế cao chloroform từ cao ethanol với khối lƣợng 3,8 g, hàm lƣợng sopolamine trong cao choloroform là 21%, hiệu suất chiết scopolamine giai đoạn nguyên liệu-cao chloroform là 64,4%.  Đã tiến hành SKC trên 3,8 g cao C, thu đƣợc phân đoạn có scopolamine (SC3) có khối lƣợng 660 mg. Hiệu suất cả quá trình chiết scopolamine từ Cà độc dƣợc là 53,2%. 5.2 Kiến nghị  Nghiên cứu tách chiết scopolamine bằng hệ thống CO2 siêu tới hạn  Kiểm tra phân đoạn SC3 bằng HPLC hoặc IR để có đƣợc đánh giá chính xác hơn  Bán tổng hợp scopolamine tạo một số dẫn xuất:  Scopolamine hydrobromide (C17H21NO4.HBr.3H2O);  Scopolamine hydrochloride (C17H21NO4.HCl);  Scopolamine methylnitrate (C17H21NO4.CH3NO3). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. [2] ọ-Cà, truy cập ngày 24-10-2013. [3] truy cập ngày 18-10-2013. [4] Tôn Nữ Liên Hƣơng, 2008. Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Giáo trình đại học, khoa Khoa học Tự Nhiên, trƣờng Đại học Cần Thơ. [5] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [6] truy cập ngày 12-08-2013. [7] Varahalarao Vadlapudi và D.S.V.G.K.Kaladhar, 2012. Antimicrobial study of plant extracts of Datura metelL. against some important disease causing pathogens, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, S94-S97. [8] Bing-You Yang, Yong-Gang Xia, Qiu-Hong Wang, De-Qiang Dou, Hai-Xue Kuang, 2010. Two new amide alkaloids from theflower of Datura metelL., Fitoterapia, 81: 1003-1005. [9] Avaratnarajah Kuganathan và Sashikesh Ganeshalingam, 2010. Chemical Analysis of Datura Metel Leaves and Investigation of the Acute Toxicity on Grasshoppers and Red Ants, E-Journal of Chemistry, 8(1): 107-112. [10] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Bài giảng các phương pháp phân tích hiện đại, Đại học Cần Thơ.