Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (tis) trong vi nhân giống

Trang 1 1 Công nghệ tế bào HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS) TRONG VI NHÂN GIỐNG Mục lục 1. Nguyên nhân & lịch sử ra đời 2. Các hệ thống nuôi cấy chính 3. Ưu điểm và hạn chế 4. Giới thiệu nghiên cứu ứng dụng TIS ở Việt Nam 5. Tài liệu tham khảo Trang 2 2 Công nghệ tế bào 1. Nguyên nhân & Lịch sử ra đời: a. Nguyên nhân: Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ nhân giống cây in vitro với nhiều đối tượng cây trồng đã giúp thu được một lượng lớn cây giống với độ ổn định cao, chất lượng cây giống tốt, đồng điều. Có rất nhiều nghiên cứu về việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống trên nhiều đối tượng cây trồng đã được tiến hành và thu được các kết quả rất khả quan. Ngay từ khi công nghệ nhân giống cây in vitro ra đời người ta tiến hành nuôi cấy mẫu trên môi trường thạch. Nhưng khi ứng dụng của hệ thống vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp thì gặp phải những khó khăn lớn về tỉ lệ nhiễm bệnh, tồn nhiều chi phí nhân công, hiệu quả sử dụng môi trường không cao, hệ số nhân giống còn thấp dẫn đến giá thành còn cao. Để khắc phục các nhược điểm trên người ta đã tiến hành vi nhân giống cây trên môi trường lỏng trong các thiết bị bioreactor. Phương pháp nhân giống trên môi trường lỏng tuy khắc phục được các nhược điểm khi nhân giống trên môi trường thạch, cho hê số nhân giống cao và có thể tiến hành nhân giống với một số lượng lớn nhưng các mẫu cấy khi nuôi trong môi trường lỏng ngập chìm trong nước quá lâu dẫn đến bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể, mẫu còn bị những tổn thương do quá trình lắc, và trong quá trình nuôi phải sụt khí vào môi trường lỏng để tránh hiện tượng mẫu bị thiếu oxi do ngập liên tục trong môi trường lỏng. Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên người ta đã cho ra đời hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời - Temporary Immersion System (TIS). Giống như tên của hệ thống, hệ thống này là bước cải tiến từ việc nuôi cấy mẫu trên môi trường lỏng nhưng ở hệ thống này mẫu chỉ được ngập trong môi trường lỏng một thời gian nhất định rồi cứ theo một chu kỳ chúng lại tiếp tục được cho ngập một khoảng thời gian. b. Lịch sử: Năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker. Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền. Trang 3 3 Công nghệ tế bào Hiện nay có các hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động. Đáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® của hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba; Hệ thống Plantima, của Đài Loan đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Trên thế các nghiên cứu về hệ thống này từ năm 1983 đến nay rất nhiều nhưng ở nước ta các nghiên cứu về hệ thống này còn rất khiêm tốn. 2. Các hệ thống nuôi cấy chính: Nguyên tắc vận hành hệ thống: Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999. Gồm 6 nguyên tắc cơ bản:  Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy;  Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ;  Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ;  Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động;  Hạn chế sự nhiễm;  Gía thành hạ. Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường. a. Hệ thống RITA: Năm 1995, Teisson và Alvard cùng nhau cho ra đời hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA. Hệ thống này gồm:  Một bình chứa khoảng 1 lít gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường. Trang 4 4 Công nghệ tế bào  Một máy bơm tạo áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy.  Các van, ống dẫn khí và các màng lọc khí vô trùng.  Một timer điều khiển hoạt động của hệ thống bằng khoảng thời gian ngập chìm và chu kỳ giữa các lần ngập chìm. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống. Hình 1: Sơ đồ hoạt động hệ thống RITA Qui trình hoạt động của hệ thống: 1) Hệ thống ở trạng thái không ngập chìm mẫu cấy; 2) Đến thời gian cho mẫu ngập chìm, timer kích hoạt bơm hoạt động thổi không khí vào hệ thống qua đường ống dẫn khí tạo áp Trang 5 5 Công nghệ tế bào suất vượt mức ở ngăn dưới đẩy chất lỏng dâng lên ngâp chứa mẫu phía trên theo khe thông với hai phần chủa bình; 3) Bơm tiếp tục hoạt động, khi chất lỏng bên dưới đã được đưa lên trên hết thì không khí phần dưới được sụt vào môi trương lỏng lên trên làm cho mẫu cấy xoay chuyển; 4) Hết thời gian ngập chìm, timer điều khiển tắt hoạt động của bơm. Áp lực bên phần bên dưới giảm dần đến cân bằng với môi trường bên ngoài và đồng thời môi trường lỏng bên trên bị trọng lực nên di chuyển xuống phần dưới. Trong quá trình hoạt động của hệ thống van thông khí ở phần ngăn trên luôn được mở. Hình 2: Hệ thống RITA ngoài thực tế b. Hệ thống bình đôi BIT: Được thiết kế bởi Escalona và cộng sự vào năm 1998. Được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma. Trang 6 6 Công nghệ tế bào Hệ thống này gồm:  Hai bình chứa thể tích nằm trong khoảng 250ml-10l được nối với thông nhau qua một ống dẫn.  Máy tạo áp suất, ống dẫn, van và các màng lọc như trong hệ thống RITA. Hình 3: Sơ đồ hoạt động của hệ thống BIT Qui trình hoạt động của hệ thống: 1) Hệ thống khi chưa cho mẫu cấy ngập chìm; 2) Đến thời điểm cho mẫu ngập chìm timer kích hoạt bơm thổi không khí qua bộ lọc khí vào trong bình chứa môi trường dinh dưỡng dạng lỏng. Áp suất bên bình chứa môi trường tăng cao hơn áp suất bên bình chứa mẫu cấy làm môi trường di chuyển qua bên bình chứa mẫu và ngập chìm mẫu; 3) Khi hết thời gian ngập chìm, timer điều khiển tắt bơm bên bình chứa môi trường và mở bơm bên bình chứa mẫu cấy. Không khí được thổi vào bình chứa mẫu cấy làm áp suất tăng cao hơn áp suất trong bình chứa môi trường dinh dưỡng và chất lỏng di chuyển về bình chứa môi trường. Sau đó đến một thời điểm chất lỏng đã di chuyên gần như hoàn toàn thì bơm sẽ tự động tắt. Đối với hệ thống BIT ta thấy do môi trường dinh dưỡng được chứa ở một ngăn riêng nên tao có thể đễ dàng thay thôi môi trường nuôi cấy so với hệ thống một bình hai ngăn. Trang 7 7 Công nghệ tế bào Hình 4: Hệ thống BIT ngoài thực tế c. Hệ thống Plantima: Hệ thống này do Đài Loan sản xuất. Về tổng thể thiết kế giống tương tự hệ thống RITA. Nhưng có một số thay đổi, cải tiến các chi tiết ở hệ thống bơm và vị trí đặt bơm. Hình 5: Cấu tạo của hệ thống Plantima Trang 8 8 Công nghệ tế bào Hình 6: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập Hình 7: Hệ thống Plantima ngoài thực tế Trang 9 9 Công nghệ tế bào 3. Ưu điểm và hạn chế: a. Ưu điểm:  Tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau.  Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi luôn cao hơn so môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường.  Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn  khi đem cây ra vườm ươm có tỉ lệ sống cao, khỏe mạnh.  Có thể tạo thành một hệ thống nuôi cấy qui mô lớn được điều khiển tự động. b. Hạn chế:  Do mới xuất hiện nên các nghiên cứu về hệ thống này chưa nhiều đặc biệt là ở nước ta.  Cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn để tìm kiếm các thông số tối ưu cho hệ thống: - Mật độ tế bào sử dụng trong bình nuôi - Các thông số vật lý: nhiệt độ, ánh sáng,… - Thời gian ngập, thời gian giữa 2 lần ngập - Thành phần môi trường,…  Ở Việt Nam, do phải nhập công nghệ và thiết bị từ nước ngoài nên chi phí còn tương đối cao  cần nghiên cứu thiết kế trong nước.  Cần phải cung cấp điện liên tục để đảm bảo hệ thống hoạt động ổn định. 4. Giới thiệu nghiên cứu ứng dụng TIS ở Việt Nam: a. Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ Điệp lai – Plalaenopsis hybrid: Của các giả: Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô. Trung tâm công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Tóm tắt nội dung của báo cáo: “Trong báo cáo này hệ thống nuôi cấy tạm thowid được thiết lập. kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy với đối tượng nghiên cứu là giống Hồ Điệp lai Dtps. Taida Salu, nuôi cấy trên hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên môi trường thạch và gấp 1,3 lần trên môi trường lỏng. Đối với giai đoạn tái sinh chồi và nhân chồi, hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân chồi gấp 3,6 lần so với nuôi cấy trên thạch. Từ đó giúp gia tăng tỉ lệ tạo cây con lên 10,8 lần so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Hệ thống này mở ra một hướng mới trong nhân nhanh các loại cây trồng Việt Nam”. Trang 10 10 Công nghệ tế bào Ở nghiên cứu này người ta sử dụng hệ thống bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất. Nội dung của nghiên cứu này: 1) khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau; 2) khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS; 3) khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS. Điều kiện tiến hành thí nghiệm: các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM)  Nhiệt độ 25±20C  Độ ẩm 80-85%  Thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày  Cường độ chiếu sáng 2500lux Kết quả nghiên cứu: 1. Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau: Môi trường nuôi cấy trong phần nghiên cứu này: môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose, glucose, nước dừa. Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar. Bảng 1: Kết quả khảo sát mật độ PLBs thích hợp cho việc nhân nhanh trên hệ thống TIS sau 6 tuần nuôi: Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLBs/1g PLBs ban đầu Số chồi Nhận xét 2g 11,25 ±1,87 973,27 ±30,68 19,58 ±4,79 PLBs xanh tốt, tròn, từng cụm một Một số PLBs phát triển thành chồi Không gian TIS còn trống 4g 23,05 ±4,65 1020,11 ±110,36 36,31 ±6,91 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Không gian TIS còn trống 6g 40,15 ±5,08 984,60 ±116,54 73,21 ±6,99 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Vừa đủ không gian TIS 8g 53,30 ±6,80 753,26 ±151,81 113,25 ±8.91 PLBs không được tròn, hơi vàng, chồi nhiều, lá chồi bị vàng Chật kín không gian TIS Trang 11 11 Công nghệ tế bào Bảng 2: Khảo sát ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm của hệ thống lên việc nhân PLBs: Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLBs hình thành Số chồi Nhận xét 2 giờ/ 10 phút 50,85 ±5,31 6276,98 ±413,26 125,28 ±11,65 PLBs rất to, xanh tốt 2 giờ/ 5 phút 42,27 ±6,27 6112,30 ±326,41 82,96 ±6,57 PLBs xanh tốt 1 giờ/ 10 phút 68,18 ±6,96 8545,68 ±612,45 187,89 ±9,60 PLBs rất to, một số có dạng trong, mọng nước Bảng 3: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs sau hai tháng: Hệ thống nuôi cấy Số PLBs tạo ra/1PLB ban đầu Lỏng lắc 8,3±0,58 TIS 10,2±1,55 Thạch 3,6±0,31  Tóm lại: - Việc nhân PLBs trên hệ thống TIS cho kết quả tối ưu khi thời gian ngập từ 5-10 phút sau mỗi 2 giờ, thể tích bình nuôi cấy 200ml và mật độ là 6g PLBs. - Sau 6 tuần nuôi cấy mỗi bình cho khoảng 6100 PLBs từ 600 PLBs ban đầu. - Nếu so sánh nuôi cấy trên môi trường thạch, cùng thể tích và mật độ, sau 6 tuần thu được 2200 PLBs và với môi trường lỏng lắc trong bình tam giác 250ml, thể tích môi trường 40ml từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 7-8 PLBs mới. Vậy, nuôi cấy trên hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên môi trường thạch và gấp 1,3 lần trên môi trường lỏng. 2. Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS: Môi trường nuôi cấy trong phần nghiên cứu này là môi trương MS ½ có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose. Đối chứng là những mẫu cấy được nuôi trên môi trường đặc. Trang 12 12 Công nghệ tế bào Bảng 4: Ảnh hưởng của mật độ PLBs lên sự tái sinh chồi và nhân chồi trong hệ thống TIS: Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Tỷ lệ PLBs tái sinh chồi Số chồi/PLB ban đầu Nhận xét 20PLBs 11,54 ±2,19 100% 4,35 ±0,38 Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt có rễ 30PLBs 18,41 ±2,67 100% 4,66 ±0,71 Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt có rễ 50PLBs 31,25 ±5,10 100% 6,3 ±0,64 Cụm chồi xanh tốt nhưng lá nhỏ hơn nghiệm thức 20, 30 PLBs Đối chứng trên thạch (30PLBs) 7,24 ±1,04 100% 1,73 ±0,26 Lá hơi bị dún lại, thân chồi kéo dài Bảng 5: Ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm lên sự tái sinh chồi từ PLBs: Hệ thống nuôi cấy Số chồi/ mẫu cấy Chiều cao thân (mm) Chiều dài lá (mm) Chiều rộng lá (mm) Bình tam giác (môi trường thạch) 1,73 7±0,36 6±0,14 3±0,5 TIS (môi trường lỏng) 6,30 9±0,23 7±0,24 5±0,22  Tóm lại: - Trong bình mật độ 50 PLBs trung bình từ 1 PLB ban đầu tạo 6,3 PLBs so với 1,73 PLBs trên môi trường thạch (gấp 3,6 lần) và các trong hệ thống TIS đều sinh trưởng và phát triển tốt hơn. - Tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho kết quả số chồi tạo thành trên một PLB là cao nhất. Ở nghiệm thức 4 giờ/ 3 phút được cung cấp chất dinh dưỡng thường xuyên hơn nên từ gốc lại tiếp tục tạo PLBs. Nghiệm thức 8 giờ/ 3 phút do sự cung cấp chậm chất dinh dưỡng và sự thoáng khí nên mẫu tạo ít chồi hơn. - Do ít bị ảnh hưởng bởi chất thải và có độ thông khí nhiều hơn nên mẫu trong hệ thống TIS phát triển tốt hơn so với bình tam giác. Trang 13 13 Công nghệ tế bào 3. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS: Môi trường nuôi cấy là môi trường MS ½ có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA. Đối chứng là các mẫu cấy được nuôi trên môi trường đặc. Bảng 6: Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự ra rễ và phát triển của chồi Hồ Điệp: Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số chồi/ chồi ban đầu Chiều rộng lá (cm) Chiều dài rễ (cm) Tình trạng cây 4 giờ/ 3 phút 47,39±6,27 3,79±6,27 0,68±0,06 0,92±0,16 Xanh mướt 6 giờ/ 3 phút 60,19±7,78 3,99±0,59 0,97±0,09 2,62±0,29 Xanh mướt 8 giờ/ 3 phút 43,23±5,39 2,59±0,26 0,77±0,05 1,67±0,14 Xanh mướt Bảng 7: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp sau hai tháng nuôi cấy: Hệ thống nuôi cấy Chiều cao thân (mm) Chiều rộng lá (cm) Chiều dài lá (cm) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Bình tam giác 500ml 15±0,4 6±0,2 11±0,3 3 10±0,1 TIS 20±0,6 9,8±0,4 15±0,7 6 26±0,2  Tóm lại: - Nghiệm thức 3 phút ngập trong chu kỳ 6 giờ cho sự tảo rễ tốt nhất. - Hệ thống ngập chìm tạm thời tạo độ thoáng khí giúp cây không bị thủy tinh thể, cây tăng cường khả năng quang hợp nên cây phát triển khá đều đặn, thích hợp cho quá trình tạo bộ rễ khỏe mạnh trước khi ra vườn ươm. b. Bước đầu ứng dụng thành công hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation: Theo bài báo của tác giả Nguyễn Văn Hiếu đăng trên trang web của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM. ( Trang 14 14 Công nghệ tế bào Mục tiêu thực hiện: Dựa vào các tính năng, các ưu điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời từ đó tiến hành khảo sát khả năng phát triển của đối tượng nghiên cứu trên hệ thống như khả năng nhân chồi và ra rễ. Từ đó có thể rút ra được kết luận sự phù hợp của đối tượng nuôi cấy trên hệ thống, chi phí nuôi cấy và định hướng ứng dụng hệ thống vào công tác sản xuất vi nhân giống. Từ kết quả thu được trên hệ thống nuôi cấy thông thường như môi trường nuôi cấy thích hợp trong các giai đoạn, tiến hành so sánh sự tăng sinh của mẫu nuôi cấy giữa hai hệ thống nuôi cấy trong cùng điều kiện. Qua các giai đoạn khảo sát rút ra kết luận sự phù hợp, hiệu quả cuả đối tượng nuôi cấy trong từng giai đoạn nuôi cấy trên hệ thống. Kết quả: Trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS), các thí nghiệm được tiến hành trong việc khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích và tần suất ngập chìm.Giống kiểng lá Spathiphyllum sensation được nuôi với mật độ 8g, thể tích nuôi cấy 250 ml và tần suất ngập chìm được thiết lập là ngập 3 phút sau mỗi 6 giờ. Bên cạnh đó, để đánh giá khả năng sinh trưởng của đối tượng nuôi cấy trên hệ thống TIS thì mẫu đối chứng được nuôi cấy trên môi trường thạch trong bình tam giác trong cùng điều kiện. Sau thời gian nuôi cấy 2 tháng cho kết quả như sau: Bảng 8: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy lên sự tạo chồi sau 2 tháng nuôi cấy: Hệ thống Trọng lượng (g) Số chồi thu được Chiều cao chồi (cm) Rộng lá (cm) TIS 25.06 56.67 3.93 1.23 Thạch 8.72 13.33 4.10 1.03 Trang 15 15 Công nghệ tế bào Hình 8: So sánh kết quả trên hai hệ thống nuôi cấy Đây là kết quả bước đầu ứng dụng hệ thống TIS trong việc nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation cho kết quả rất khả quan sau 2 tháng nuôi cấy. Các mẫu cấy sống 100% và có khả năng tái sinh chồi, chồi thu được có từ 3-4 lá, xanh mướt. Xét về số lượng chồi thu được cho tỷ lệ khác biệt giữa hai hệ thống nuôi cấy. Trên hệ thống TIS cho hệ số nhân chồi gấp 4 lần trên môi trường thạch, các chồi phát triển đều về mọi phía của khối mô điều này có thể do mẫu cấy được ngập trong dịch nuôi cấy, khối mô có điều kiện tiếp xúc toàn bộ với môi trường nuôi cấy. Hệ thống TIS có nhiều ưu điểm trong công tác vi nhân giống, tuy nhiên tối ưu hóa các thông số kỹ thuật (mật độ nuôi cấy, thể tích, số lần ngập chìm) là rất quan trọng. Để có kết quả chính xác hơn, nhóm thực hiện sẽ tiến hành tối ưu hóa các thông số kỹ thuật trong các thí nghiệm tiếp theo. 5. Tài liệu tham khảo 1. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (05-01-2007), Nguyễn Quốc Thiện, =31 Trang 16 16 Công nghệ tế bào 2. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô. Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong giống lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hybrid. Trung tâm công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh, 2007. 3. Bước đầu ứng dụng thành công hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation (31-03- 2009), Nguyễn Văn Hiếu, 6 4. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2006.