Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÙI THỊ THANH TỊNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN BÙI THỊ THANH TỊNH NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  COMPLETING PROTOCOL OF TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO E.coli DH5α BACTERIAL CELLS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE ĐINH ĐON BUI THI THANH TINH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, anh chị và ngƣời thân luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài Các anh, chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi. Và cuối cùng là các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Bùi Thị Thanh Tịnh ii TÓM TẮT BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội dung: Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hoá chất. Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.. Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi cắt. Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α. Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi. iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ......................................................................................................................iii Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ vii Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2 1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp ................................................................ 3 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp ................................ 3 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp .............................................................. 5 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp ..................................................... 6 2.2.1 Khái niệm chung các vector ......................................................................... 6 2.2.2 Plasmid ......................................................................................................... 7 2.2.2.1 Cấu trúc ............................................................................................... 7 2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8 2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8 2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9 2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11 iv 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn ........................................................................... 11 2.3.1.2 Tên gọi các RE .................................................................................. 11 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn .................................................................... 12 2.3.1.4 Các RE loại II .................................................................................... 12 2.3.2 Các enzym thông dụng khác ...................................................................... 15 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ........................................................ 15 2.3.2.2 Taq polymerase ................................................................................. 15 2.3.2.3 Terminal transferase .......................................................................... 15 2.3.2.4 Các DNase ......................................................................................... 15 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa ......................................................... 16 2.3.3 Các enzym nối DNA .................................................................................. 16 2.3.3.1 E.coli DNA ligase .............................................................................. 16 2.3.3.2 T4 DNA ligase ................................................................................... 16 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp .......................................................... 17 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 17 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................ 17 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ............................................................... 18 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ................... 18 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid ............................................................................ 19 2. 5 Điện di (Electrophoresis) ................................................................................... 19 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc .................................. 20 2.6.1 Ngoài nƣớc ................................................................................................. 20 2.6.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ....................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 22 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α............................................................................... 22 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................ 22 3.2.3 Đoạn DNA ................................................................................................. 23 3.3 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................... 23 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................... 23 v 3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29 3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ...................................... 32 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 38 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 38 4.2 Tách chiết DNA plasmid .................................................................................... 40 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ........................................................................... 40 vi 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit ..................... 42 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV ................................... 42 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII ................................ 44 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA.................................................................................. 44 4.4.2 Tinh sạch plasmid ...................................................................................... 45 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp ................................................................................ 46 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................................. 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 48 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 49 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair CFU Colony Form Unit DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside MCS Multiple cloning Site OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Kb kilobase dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride UV Ultraviolet (light) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glactopyranoside viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp .................................................................. 6 Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................ 8 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli ................................................................. 10 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn ................................................................. 13 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA ................................. 35 Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 ............................ 38 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 .............................. 39 Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) ............................ 41 Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) ......................... 41 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% ................................................... 42 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) ................................................................. 42 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) ........................ 43 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% ................. 43 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% .................... 43 Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ............................................. 45 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ....................................................... 45 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% ................................ 46 Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) .................................................................... 55 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ......................................................... 56 ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) ......................... 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................ 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra ...................................................................... 26 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt đƣợc những thành quả quan trọng và hứa hẹn đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tƣơng lai cho con ngƣời. Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những giống mới có tính năng vƣợt trội. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành 2 thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện - Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. - Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt. - Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn để kiểm tra. - Chuẩn bị đoạn DNA để chèn. - Cắt và tinh sạch vector. - Phản ứng sữa chữa sai sót trên đoạn DNA từ sản phẩm PCR chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu bằng. - Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid sau khi cắt bằng enzyme giới hạn - Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn. - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào. - Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào. Trong trƣờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA plasmid vào trong tế bào. Biến nạp còn đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là đƣa bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào. Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lí biến nạp”. Trên thực tế phát minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đƣợc cấu thành từ DNA. Tuy nhiên không phải tất cả vi khuẩn đều biến nạp một cách dễ dàng. Để cho biến nạp ở E. coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, ngƣời ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chloride lạnh đông đá, khi đó các tế bào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chƣa rõ nguyên nhân. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, rồi ủ trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C), làm nhƣ vậy DNA sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ trong nƣớc thịt dinh dƣỡng ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001). 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ. Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào. Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG 4 của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998). ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào. Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kích hoạt sự phiên mã. ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và linh động dọc theo sợi xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT. ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp. 5 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một giai đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt của tế bào có hiện diện những điểm tiếp nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (competent factor). Nhân tố này có khả năng tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ môi trƣờng bên ngoài để đƣa vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ đó xảy ra tái tổ hợp. Muốn thực hiện sự biến nạp cần phải có 2 điều kiện: (1) Phải có trong môi trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận. Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần phải sử dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ: CaCl2 50mmol, LiCl. Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn: - Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận - Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận - Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận - Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp - Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật. 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con ngƣời. Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiện những nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đoạn gen đƣợc dễ dàng. 6 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp 2.2.1 Khái niệm chung các vector Vector có bản chất là DNA, thƣờng dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mƣợn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau: - Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép bộ gen tế bào chủ. - Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thƣờng là các gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline). Ngoài ra, gen chọn lọc cũng có thể là gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa cơ chất cho phép quan sát một cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự). Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp 7 - Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. - Có kích thƣớc càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kích thƣớc vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh và hiệu quả. - Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ. - Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu hiện gen trong sinh vật chủ. Ngoài ra các vector này cũng cần mang các vector chọn lọc đặc biệt nhằm dễ dàng chọn lọc cá thể sinh vật chủ có mang vector tái tổ hợp. Các vector thƣờng sử dụng trong biến nạp là plasmid và phage 2.2.2 Plasmid Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kích thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn và vi sinh vật khác, có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất có ích cho vi khuẩn. Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillin hoặc Chloramphenocol sẽ giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để nhận diện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai. 2.2.2.1 Cấu trúc Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replication) giúp quá trình nhân nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. 8 Vùng chèn DNA Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài liệu T.A. Brown, 1997). 2.2.2.2 Tính chất của plasmid - Plasmid có DNA là chu trình kín độc lập với tế bào vi khuẩn. - Plasmid mang một gen hay nhiều gen. - Plasmid có khả năng sống sót trên môi trƣờng có nồng độ một số chất hóa học ví dụ nhƣ ampicilin. - Khi plasmid mang gen kháng, ngƣời ta dùng chất kháng này nhƣ một marker chọn lọc. 2.2.2.3 Phân loại plasmid Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó. Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau: Loại 1: F plasmid (Fertility) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp. Ví dụ F plasmid của E. coli. Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào kí chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas. Loại 3: Col plasmid tạo ra colicin gây chết vi khuẩn khác. Ví dụ ColE1 trong E. coli. Loại 4: Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc xit. Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida. 9 Loại 5: Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm. Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có ba đặc tính cơ bản sau: - Trọng lƣợng phân tử thấp. - Khả năng thăm dò các tính trạng chọn lọc trên tế bào chủ. - Có cloning site đủ cho một lƣợng lớn restriction enzyme. 2.2.3 Phage Là vật liệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn công DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào. Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kích thƣớc tới 10kb (pEMBL9, pBluescript). 2.2.4 Chủng chủ E. coli E. coli là một vi khuẩm Gram âm, hình que dài khoảng 2.5µm, có roi (flagella) và bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hóa ít nhất cho 4000 gen. E. coli là loài đƣợc chọn trong các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử bởi vì dễ nuôi cấy, bộ gen đơn giản và đã đƣợc giải trình tự. Giống nhƣ tất cả các vi khuẩn Gram âm khác, E. coli không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép (origin of replication). Các tế bào E. coli có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu nhƣ Xgal-β galactosidase. 10 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E. coli dùng để tạo dòng đƣợc cải tiến thành các chủng theo các hƣớng cơ bản sau: - Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế (restriction modification) vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn nhờ đó vi khuẩn sẽ phân giải DNA lạ theo nhƣ cách DNA bacteriophage bị phân giải do hệ thống phòng vệ tự nhiên. Do vậy các chủng E. coli dùng cho tạo dòng sẽ bị gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh (hsdR-) hay gây đột biến trong phức hợp mcrA/mcrB/mrr là phức hợp phân giải DNA lạ không đƣợc methyl hóa một cách chính xác. - Hệ thống tái tổ hợp DNA đƣợc sữa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp. Gen recA của E. coli mã hóa cho một DNA-dependent-ATPase cần thiết cho sự tái tổ hợp ở E. coli. Các chủng chủ E. coli dùng để tạo dòng có đột biến recA- thƣờng không thực hiện đƣợc sự tái tổ hợp. - Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích lũy trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải biến chất lƣợng DNA đƣợc chiết tách bằng cách sử dụng các phƣơng pháp sinh hóa chuẩn. 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector. 11 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này có thể do một trong hai nguyên nhân là: - DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không hoạt động trong một thời gian dài hay ngắn - DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây chính là hiện tƣợng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kích thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage. Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành những đọan có kích thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này. Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote. 2.3.1.2 Tên gọi các RE Tên gọi thống nhất cho các RE đƣợc qui định nhƣ sau: - Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn từ đó RE đƣợc li trích. - Hai chữ kế không viết hoa tƣơng ứng với loài của vi khuẩn nói trên. - Tiếp theo là chữ số la mã chỉ thứ tự RE đƣợc phát hiện (trong trƣờng hợp RE cùng đƣợc tìm thấy ở 1 loài vi khuẩn). 12 - Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng. Ví dụ: Escherichia coli Ry13 Giống Loài Chủng EcoRI: enzyme đầu tiên đƣợc tìm thấy ở E. coli EcoRV: enzyme thứ 5 đƣợc tìm thấy ở E. coli 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II. 2.3.1.4 Các RE loại II Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 13 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2 Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 ligase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG + CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá Enzym cắt giới hạn EcoRI Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không đƣợc methyl hoá DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính 14 EcoRI 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATTC 3’ 3’ C TTAA G 5’ Một số qui tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE Mỗi RE hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyên cáo của hãng sản xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thƣờng cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl. Do đó khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều RE: Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể đƣợc sử dụng đồng thời. Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải đƣợc cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trƣớc, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thủy giải. RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cắt trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. Ứng dụng Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử eukaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật eukaryote. Các enzyme cắt giới hạn chủ yếu đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lƣợng lớn. Ngoài ra, chúng còn đƣợc dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so 15 sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – tính đa hình kích thƣớc của các trình tự). 2.3.2 Các enzym thông dụng khác 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzyme sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I (từ E. coli) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzyme: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải), 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’. Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’. 2.3.2.2 Taq polymerase Là một loại DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một vi khuẩn suối nƣớc nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. 2.3.2.3 Terminal transferase Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 2.3.2.4 Các DNase Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp 16 các oligonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay Mg 2+. Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ. 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973). 2.3.3 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E. coli DNA ligase hay T4 DNA ligase. 2.3.3.1 E. coli DNA ligase Enzym đƣợc ly trích từ E. coli xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu so le 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT 5’ E. coli DNA ligase 5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’ 2.3.3.2 T4 DNA ligase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này có cùng chức năng với ligase trích từ E. coli nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên là ligase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử. 17 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp Vi khuẩn là vật chủ lý tƣởng nhất cho việc đƣa DNA tái tổ hợp vào và biến chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn. Những ƣu điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng nhƣ những vật chủ để đƣa DNA tái tổ hợp vào nhƣ sau: - Vi khuẩn có khả năng biến nạp. Khả năng này đƣợc Federick Griffith đƣa ra từ năm 1928. Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ nhƣ nhau. - Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi chất rất mạnh. Do đó nếu đƣa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể thu nhận một lƣợng vật chấ lớn khổng lồ. - Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men. Do đó ta hoàn toàn có khả năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất. Từ những ƣu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra những phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện. 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp Phƣơng pháp này có sự trợ giúp của CaCl2 kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng khả năng biến nạp của vi khuẩn. Theo đó vi khuẩn chủ sẽ đƣợc trộn với DNA tái tổ hợp. Ngƣời ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl2 lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh đến 420C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần. Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phƣơng pháp biến nạp bằng cách hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium. Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp. Tuy nhiên, việc đầu tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy thành tế bào thực vật. Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt của CaCl2 và polyethylenglycol. Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trƣờng thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy. Khi đó tế bào này mới phát triển thành cây trong những điều kiện tƣơng ứng. 18 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp. Bằng phƣơng pháp này ta thu đƣợc hiệu quả biến nạp rất cao. 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E. coli biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc. Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau: - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc). - Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal 19 (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kích hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. C