Khai thác dữ liệu est (Expressed sequence tags ) nhằm phát hiện microsattellte phục vụ cho công tac phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của ong mật

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002-2006 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 iii LỜI CẢM TẠ Cảm ơn công lao nuôi dƣỡng, dạy dỗ của cha mẹ Xin chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin cảm ơn CN. Lƣu Phúc Lợi đã giúp đỡ, hỗ trợ tài liệu chuyên môn. Cảm ơn các anh chị tại phòng Sinh Hóa đã tạo điều kiện tốt cho tôi khi tiến hành thực hiện công việc tại Trung Tâm. Xin cảm ơn bạn bè thân yêu của lớp DH02SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Sinh viên thực hiện Trần Ngọc Việt iv TÓM TẮT TRẦN NGỌC VIỆT, Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm - trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Ở Việt Nam, nghề nuôi ong mật đã hình thành rất lâu và hiện nay các sản phẩm của ong mật hầu hết là đƣợc xuất khẩu. Hiệu quả kinh tế mang về từ nghề nuôi là khá cao. Tuy nhiên, việc nuôi ong chỉ tập trung chủ yếu ở một số vùng nhất định nhƣ Tây Nguyên (Đak Lak), miền Đông Nam Bộ, chƣa tận dụng đƣợc hết nguồn tài nguyên có sẵn. Sự hạn chế này là do chƣa xác định đƣợc loài ong cho mật nào phù hợp với từng vùng địa lý cụ thể tại Việt Nam. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu về việc thiết lập nên primer chạy phản ứng PCR dựa vào chỉ thị microsatellite của các loài ong cho mật để làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu định danh và xác định đặc điểm di truyền của ong mật phục vụ cho việc mở rộng nghề nuôi ong mật ở các vùng ở Việt Nam. Những kết quả đã đạt đƣợc: ۰ Chúng tôi đã chọn đƣợc một nguồn dữ liệu (EST) tốt cho nghiên cứu ۰ Thiết lập đƣợc phƣơng pháp để tìm kiếm microsatellite từ nguồn EST ۰ Thiết kế đƣợc những cặp primer dựa vào vùng bảo tồn hai bên những loại microsatellite tìm đƣợc Kết luận: Sự thành công của việc thiết kế primer đã làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu xa hơn về đặc điểm di truyền của các loài ong cho mật. Thành công này mở ra một triển vọng cho việc ứng dụng lĩnh vực Bioinformatic hỗ trợ cho nghiên cứu thực nghiệm, làm giảm đáng kể chi phí và đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu thực nghiệm tại Trung Tâm. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ……………………………………………………………………………..iii Tóm tắt …………………………………...………….………………………………..iv Mục lục …………………………………………………………………………..…….v Danh sách các chữ viết tắt............................................................................................viii Danh sách các bảng .......................................................................................................ix Danh sách các hình .........................................................................................................x 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề...........................................................................................................1 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu........................................................................2 1.2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ...................................................................................2 1.3. Giới hạn .............................................................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3 2.1. Giới thiệu chung về ong mật .............................................................................3 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật........................................................................3 2.1.1.1. Hình thái cơ thể ................................................................................3 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong ......................................................................6 2.1.2. Tổ chức của đàn ong ..................................................................................6 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong .....................................................................7 2.1.4. Các sản phẩm của ong ...............................................................................7 2.1.4.1. Mật ong .............................................................................................7 2.1.4.2. Phấn hoa .................................................................................................7 2.1.4.3. Sữa ong chúa ..........................................................................................7 2.1.4.4. Sáp ong ..................................................................................................8 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) ....................................................8 2.2.1. EST là gì? ..................................................................................................8 2.2.2. Phƣơng pháp tạo EST ................................................................................8 vi 2.3. Microsatellite là gì? .........................................................................................10 2.3.1. Các dạng microsatellite ...........................................................................10 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite .............................................................11 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite ....................................................................12 2.3.4. Marker phân tử (molecular markers) .......................................................13 2.3.5. Vì sao chọn marker microsatellite? .........................................................14 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) .............15 2.4.1. Nguồn gốc của Perl ......................................................................................15 2.4.2. Cấu trúc của Perl ..........................................................................................16 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scala data) ..............................................................16 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển ...............................................................................16 2.4.2.3. Các List, Array và Hash .......................................................................19 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con .........................................19 2.4.2.5. Package và Module ..............................................................................20 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) ....................................................................................21 2.5.1. Khái quát về mồi ..........................................................................................21 2.5.2. Đặc điểm của mồi .........................................................................................21 2.5.2.1. Tính chuyên biệt ...................................................................................21 2.5.2.2. Tính ổn định .........................................................................................22 2.5.2.3. Tính tƣơng thích ...................................................................................23 2.6. Tin sinh học ...........................................................................................................24 2.6.1. Khái niệm tin sinh học ..................................................................................24 2.6.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học ...........................................24 2.6.2.1. Genomics - Hệ gen học ........................................................................24 2.6.2.2. Sinh học tiến hóa ..................................................................................26 2.6.2.3. Phân tích chức năng gen .......................................................................26 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................29 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu ...................................................29 3.1.1. Thời gian nghiên cứu ...............................................................................29 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu ...............................................................................29 3.2. Vật liệu và công cụ nghiên cứu .......................................................................29 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................29 vii 3.2.2. Công cụ nghiên cứu .................................................................................29 3.3. Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu .................................................................30 3.3.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát ...............................................................30 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................................31 3.3.2.1. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu .............................................31 3.3.2.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chi tiết ..........................................32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................42 4.1. Kết quả tìm kiếm và tải trình tự EST về máy tính cá nhân .............................42 4.1.1. Kết quả tìm kiếm EST .............................................................................42 4.1.2. Kết quả tải trình tự EST về máy tính cá nhân .........................................43 4.2. Kết quả tìm và phân loại microsatellite ...........................................................44 4.2.1. Kết quả tìm microsatellite qua xử lý của EST_TRIMMER ....................44 4.2.2 Kết quả xử lý qua MISA ..........................................................................45 4.3. Kết quả thiết kế primer ....................................................................................49 4.3.1. Kết quả thiết kế primer qua 6 Script Perl ................................................49 4.3.2. Kết quả so sánh và chọn lọc primer đƣợc thiết kế ...................................56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................59 5.1. Kết luận ...........................................................................................................59 5.1.1. Sơ đồ phƣơng pháp thực hiện ..................................................................59 5.1.2. Kết quả đạt đƣợc .....................................................................................60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................60 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................61 7. PHỤ LỤC .................................................................................................................64 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplified Length Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer –Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tools CEB Computional Evolution Biology DAF DNA Amplification Fringerprinting DDBJ DNA Data Bank of Japan EMBL the European Molecular Biology Laborary EST Expressed Sequence Tags NCBI the National Center for Biotechnology Information MPSS Massively Parllel Signatur Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction PDA Primer Design Assitant PERL Practical Extraction and Reporting Language RAPD Radom Aplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism SSCP Single Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Sites ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA ..................................................................13 Bảng 4.1. Kết quả xử lý qua MISA ........................................................................47 Bảng 4.2. Thành phần của các dạng microsatellite .................................................47 Bảng 4.3. Tỷ lệ phần trăm các dạng microsatellite .................................................48 Bảng 4.4. Phần trăm các loại microsatellite chiếm tỷ lệ cao ..................................48 Bảng 4.5. Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR ............................................54 Bảng 4.6. Kết quả primer của dạng trinucleotide SSR ...........................................55 Bảng 4.7. Kết quả primer của dạng tetranucleotide SSR .......................................56 Bảng 4.8. Kết quả primer sau cùng của dạng dinucleotide SSR ............................57 Bảng 4.9. Kết Quả primer sau cùng của dạng tri/tetra-nucleotide SSR ..................57 Bảng 4.10. Trình bày loại SSR và mã số truy cập của EST ...................................58 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật .......................................................................3 Hình 2.2. Thể hiện ba phần chính của ong .....................................................................4 Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong .....................................................................4 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong ...................................................................5 Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong ...................................................................5 Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST ..............................................................................9 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST .................................................................................10 Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ............................................................11 Hình 2.9. Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ........................................................12 Hình 3.1. Trình bày qui trình nghiên cứu tổng quát .....................................................30 Hình 3.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chính ..........................................................31 Hình 3.3. Giao diện trên trang NCBI với từ khóa honeybee ........................................32 Hình 3.4. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER ........................................................35 Hình 3.5. Cú pháp thực thi của MISA ..........................................................................36 Hình 3.6. Giao diện của Primer3 ..................................................................................38 Hình 3.7. Giao diện của PrimerQuest ...........................................................................40 Hình 3.8. Giao diện của PDA .......................................................................................40 Hình 3.9. Giao diện của DNAClub ..............................................................................41 Hình 4.1. Kết quả tìm thấy EST trên NCBI .................................................................42 Hình 4.2. Kết quả download với tùy chọn có sẵn của NCBI .......................................43 Hình 4.3. Kết quả thực thi 4 tác vụ của EST_TRIMMER ...........................................45 Hình 4.4. File chứa kết quả trình tự EST đƣợc chọn ....................................................45 Hình 4.5. File định dạng FASTA .................................................................................45 Hình 4.6. Thể hiện kết quả thực thi của MISA ............................................................46 Hình 4.7. Kết quả của file new_ids170404 ..................................................................49 Hình 4.8. Kết quả trình diễn của ssrout170404 ............................................................50 Hình 4.9. Kết quả trình diễn của labdbout170404 ........................................................50 Hình 4.10. Xuất kết quả các thông số thiết lập từ script ..............................................51 Hình 4.11. Trình bày primer đƣợc thiết kế ...................................................................51 xi Hình 4.12. Trình diễn của rescreened170404 ...............................................................52 Hình 4.13. Kết quả màn hình xử lý qua 4_ssr_blast ....................................................52 Hình 4.14. Thể hiện EST và primer sau cùng ..............................................................53 Hình 4.15. Trình bày primer đạt đƣợc sau cùng ...........................................................53 Hình 5.1. Qui trình nghiên cứu thiết kế primer ............................................................59 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong thế giới động vật, ong mật là loài thuộc lớp côn trùng. Chúng xuất hiện cách đây 40 triệu năm vào thời kỳ Eocene. Ong mật có ở khắp nơi trên thế giới gồm nhiều loài khác nhau. Mỗi loài có điều kiện môi trƣờng phát triển khác nhau và hiệu quả sản xuất cũng khác nhau. Sản phẩm đƣợc làm ra bởi ong mật nhƣ phấn hoa, mật ong, sáp ong, sữa ong chúa, keo ong, nọc ong là các loại thực phẩm dƣợc liệu độc đáo có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra, ong mật còn có tác động hữu ích đến nhiều loài động vật và đặc biệt là tác động rất cần thiết trên thực vật đó là thụ phấn hoa. Sự đa dạng và giá trị di truyền học của ong mật cần phải có phƣơng pháp để định danh chính xác từng loài và dƣới loài (thứ). Điều này rất cần thiết, nó có tác động quyết định đến hiệu quả kinh tế trong nghề nuôi ong nói riêng và ý nghĩa về bảo vệ đa dang sinh học nói chung. Công việc này sẽ phục vụ đắc lực trong việc tuyển chọn đƣợc loài ong phù hợp nhất cho nghề nuôi ong ở từng vùng địa lý riêng (nhƣ nguồn mật hoa, thời tiết…), đảm bảo bảo vệ “thuần khiết” đặc điểm di truyền ban đầu của mỗi loài ong. Hiện nay, marker microsatellite là một chọn lựa tốt trong việc phân tích sự đa dạng di truyền, lập bản đồ di truyền, nhận biết giữa các loài và các cá thể trong một loài. Dựa trên nguồn dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) chúng ta có thể tìm ra đƣơc những vị trí microsatellite có ở trên các EST một cách nhanh chóng nhờ vào lĩnh vực nghiên cứu gọi là tin sinh học (bioinformatics). Việc ứng dụng bioinformatic sẽ làm cho công việc nghiên cứu trở nên dễ dàng và chính xác hơn rất nhiều. Bioinformatic là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê và khoa học máy tính để giải quyết các vấn đề sinh học. Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khai thác dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác so sánh và phân tích đặc điểm di truyền của ong mật” 2 Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí. Đối tƣợng nghiên cứu là các loài ong cho mật. 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp nhận diện marker microsatellite từ dữ liệu EST có tìm thấy microsatellite của các loài ong cho mật. - Thiết kế đƣợc primer từ hai vùng bảo tồn của microsatellite cho việc chạy phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch đại trình tự microsatellite đặc trƣng nhất. - So sánh lựa chọn, thiết kế đƣợc các công cụ tin học phù hợp nhất cho công việc nghiên cứu. 1.2.2. Yêu cầu - Tập hợp đƣợc toàn bộ và nhanh nhất dữ liệu EST hiện có của các loài ong mật để cho xác suất tìm thấy microsatellite là lớn nhất. - Phải có phƣơng pháp nhanh nhất trong việc xác định và phân loại microsatellite có trong các EST. - Xây dựng đƣợc một qui trình trong nghiên cứu về thiết kế mồi (primer) để thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại microsatellite đặc trƣng có trong EST. - Mồi đƣợc thiết kế phải đảm bảo nghiêm ngặt về tiêu chuẩn các thông số kỹ thuật và tính đại diện cao, đảm bảo cho việc chạy phản ứng PCR có đƣợc kết quả tốt. 1.3. Giới hạn - Đề tài chỉ thực hiện trên loài ong mật. - Chỉ tiến hành thiết kế mồi và khảo sát toàn bộ qui trình trên lý thuyết mà chƣa đƣợc tiến hành kiểm tra lại bằng thực nghiệm. - Năng lực và thời gian có giới hạn nên việc nghiên cứu sẽ có những hạn chế nhất định. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về ong mật Trong thế giới động vật, ong mật thuộc ngành chân đốt (Athropoda), lớp côn trùng (Insecta), bộ cánh màng (Hymenoptera), họ ong mật (Apisdae), giống ong mật (Apis). Ong mật xuất hiện cách đây khoảng 40 triệu năm đƣợc tìm thấy trong mẫu hóa thạch vào thời kỳ Eocene (Mark L. Winston, 1987). Trên thế giới có 7 loài ong cho mật, ở Việt Nam có 4 loài chính: 1. Apis mellifera: Ong Ý 2. Apis cerena: Ong ruồi 3. Apis dorsata: Ong khoái hay ong gác kèo 4. Apis florae: Ong muỗi Trong đó hai loài Apis mellifera và Apis cerena có giá trị kinh tế cao, đang đƣợc nuôi rộng rãi. Hai loài còn lại chỉ đƣợc khai thác tự nhiên. 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật 2.1.1.1. Hình thái cơ thể Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật Ong có bộ vỏ bao ngoài đƣợc cấu tạo bởi chất chitin có vai trò nhƣ khung xƣơng ngoài nâng đỡ các cơ quan bên trong và chống lại các nhân tố bất lợi bên ngoài. Cơ thể ong gồm ba phần khớp động với nhau: đầu, ngực và bụng. Trong quá trình phát triển cơ thể ong phải trải qua những lần lột xác. 4 Hình 2.2. Thể hiện 3 phần chính của ong Phần đầu Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong Đầu con ong có cấu tạo hình hộp, trên đầu có hai mắt kép. Đỉnh đầu có ba mắt đơn phân bố dạng tam giác. Trƣớc đầu có một đôi râu có nhiều đốt (râu ong đực có 12 đốt, râu ong chúa và ong thợ có 11 đốt), râu của ong là cơ quan xúc giác rất nhạy. Miệng và vòi ong có đặc điểm khác với những loài côn trùng khác có chức năng cắn, nghiền, hút. Ong dùng hàm trên cắn vật cứng, nghiền phấn hoa… Vòi hút của ong đặc trƣng cho từng giống, ong dùng vòi hút để hút mật hoa, sirô, nƣớc. Phần ngực Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. 5 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong Nửa lƣng có 2 đôi cánh: đôi cánh trƣớc lớn hơn đôi cánh sau, khi ong bay đôi cánh trƣớc móc lại với đôi cánh sau thông qua hệ thống móc cánh. Nửa bụng của phần ngực có 3 đôi chân gắn vào 3 đốt ngực tƣơng ứng. Phần bụng Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong Bụng ong có 6 đốt và nối với phần ngực qua đốt chuyển tiếp. Mỗi đốt gồm hai nửa: nửa lƣng và nửa bụng, các đốt bụng nối với nhau bằng màng kitin mỏng và đàn hồi (nhờ màng này ong có thể thay đổi thể tích bụng), hai bên mỗi đốt bụng có lỗ thở. Ở phần bụng của 4 đốt bụng cuối cùng có cơ quan tiết sáp, cuối bụng có ngòi đốt (ong đực không có ngòi đốt, ong chúa trƣởng thành thì ngòi đốt có tác dụng nhƣ một máng đẻ trứng và là một vũ khi đánh nhau với các con ong chúa khác). Giữa đốt bụng thứ 5 và thứ 6 của ong có tuyến Naxonop tiết ra mùi đặc trƣng cho đàn ong (ở ong chúa tuyến này phát triển mạnh và tiết ra mùi đặc trƣng gọi là chất chúa để điều khiển hoạt động bìng thƣờng của đàn ong). 6 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong Cơ quan tiêu hóa Ong mật thuộc vào các côn trùng ding dƣỡng chuyên tính, cơ quan tiêu hóa còn là nơi dự trữ tạm thời mật khi thu và chuyển về tổ. Cơ quan hô hấp Gồm hai lỗ thở, hệ thống khí quản phân nhiều nhánh, các túi khí và hệ thống mao quản trao đổi khí với các tế bào, mô trong cơ thể. Cơ quan tuần hoàn Hệ thống tuần hoàn của ong là hệ thống mở, tim gồm 5 ngăn, hai bên sƣờn của mỗi ngăn có các cửa để máu lƣu thông. Cơ quan thần kinh Cơ quan thần kinh của ong mật phát triển cao, bảo đảm mối liên hệ của đàn ong với môi trƣờng xung quanh, điều khiển mọi hoạt động thống nhất trong cơ thể ong. Cơ quan thần kinh của ong chia làm ba phần: thần kinh trung ƣơng, thần kinh ngoại biên, thần kinh thực vật. Cơ quan sinh dục Cơ quan sinh dục của ong chúa gồm hai buồn trứng hình quả lê, mỗi buồn trứng có rất nhiều ống dẫn trứng nằm song song với nhau. Cơ quan sinh dục của ong thợ về cấu tạo giống nhƣ cơ quan sinh dục của ong chúa, nhƣng không đƣợc phát triển hoàn chỉnh, hai buồn trứng ong thợ có dạng dải. Cơ quan sinh dục của ong đực gồm hai đôi dịch hoàn: ống dẫn tinh, tuyến phụ và bộ phận giao phối. 2.1.2. Tổ chức của đàn ong Đàn ong là một tổ chức phức tạp gồm hàng nghìn con liên kết với nhau thành một đơn vị thống nhất bằng quá trình trao đổi chất. Nhờ có sự thống nhất giữa các cá thể, đàn ong có thể giữ đƣợc nhiệt độ tối ƣu trong tổ, thu đƣợc nhiều mật và phấn hoa, bảo vệ tổ chống kẻ thù và phát triển. Mỗi đàn ong có những đặc điểm cá thể riêng: mùi đặc thù, khả năng khai thác mật và tiết sáp, khả năng chia đàn, sức chống bệnh truyền nhiễm… 7 Đàn ong chỉ sống và phát triển khi có đủ các thành phần. Mỗi cá thể trong đàn (ong chúa, ong thợ, ong đực) thực hiện một chức năng nhất định theo hƣớng bảo tồn và kéo dài cuộc sống của cả đàn. Ong chúa: ong chúa làm nhiệm vụ đẻ trứng Ong thợ: ong thợ làm nhiệm vụ nuôi ấu trùng, lấy mật và phấn hoa, xây bánh tổ, điều chỉnh nhiệt độ, làm sạch tổ, bảo vệ tổ, chăm sóc ong chúa… Ong đực: nhiệm vụ của ong đực là giao phối với ong chúa tơ 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong Khẩu phần ăn tự nhiên của ong mật trƣởng thành phải có: protein (amino acid), carbonhydrate (đƣờng), lipid (acid béo, sterol), vitamin, chất khoáng (muối), nƣớc. Những nguồn dinh dƣỡng này trong khẩu phần ăn phải đƣợc xác định rõ tỉ lệ về số lƣợng và chất lƣợng để đạt đƣợc mức dinh dƣỡng cao nhất. 2.1.4. Các sản phẩm của ong mật 2.1.4.1. Mật ong Thành phần mật ong có trên 65% dạng đƣờng khử gồm glucose và fructose, còn saccharose ít, chỉ có khoảng 5%. Ngoài ra trong quá trình luyện mật hoa, con ong còn tiết ra một số acid hữu cơ có tác dụng làm cho đƣờng trong mật ong không bị lên men. 2.1.4.2. Phấn hoa Phấn hoa là sản phẩm giàu dinh dƣỡng đƣợc ong thu từ nhị hoa của các loài hoa khác nhau để làm thức ăn cho chúng. Phấn hoa chứa 30 – 35% protein, trong đó 10% là acid amin tự do, các enzyme, vitamin… (phấn hoa chứa 21 acid amin cần thiết cho cơ thể, trong đó có 10 acid amin không thay thế). Dùng phấn hoa có tác dụng tốt cho cơ thể, tăng cƣờng sức khỏe vì phấn hoa có nhiều chất dinh dƣỡng dễ hấp thụ… 2.1.4.3. Sữa ong chúa Sữa ong chúa (tên gọi có nguồn gốc lịch sử) là nguồn dinh dƣỡng cao cấp, là sản phẩm đặc biệt. Nó là nguồn thức ăn duy nhất để nuôi ong chúa và ấu 8 trùng của ong chúa do ong thợ non tiết ra. Sữa ong chúa có thành phần dinh dƣỡng nhƣ sau: protein (18%), lipid (6,46%), các vitamin, chất khô (39,95%), tro (0,83%). Sữa ong chúa kích thích quá trình trao đổi lipid và protein giúp cơ thể khỏe mạnh. Sữa ong chúa giàu hormon, vitamin E có tác dụng kích thích sinh lý, tái tạo tế bào, chống sự già cỗi của các hệ thống tế bào. Sữa ong chúa dùng để chữa các bệnh đƣờng tiêu hóa, gan, thận, nâng cao sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm. 2.1.4.4. Sáp ong Sáp ong là dẫn xuất của acid béo no và không no có phân tử lƣợng lớn, các acid tự do và rƣợu gồm 50 hợp chất, 75% là este, carbonhydrate 12 – 15%, acid béo tự do 13 – 15%. Ngoài ra còn có nọc ong và keo ong là những sản phẩm dƣợc liệu thiên nhiên có giá trị cao do ong mật tạo ra. 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) 2.2.1. EST là gì? EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thƣờng dài từ 200 – 500 nucleotide) đƣợc tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5‟ hay 3‟ của cDNA). Gồm có 5‟EST và 3‟EST 5‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 5‟ của cDNA, có khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài và không thay đổi nhiều trong một họ gen. 3‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 3‟ của cDNA, dạng này có thể sẽ rơi vào vùng không mã hoá (non-coding) hay vùng không dịch mã (Untranslated Regions, UTRs). Do đó khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài thấp hơn những trình tự mã hóa. Một Expressed Sequence Tag (EST) có thể sử dụng giúp cho việc xác đinh những gen chƣa biết và lập bản đồ của chúng trong một bộ gen (genome). 9 2.2.2 Phƣơng pháp tạo EST Sơ đồ nguồn gốc của EST Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST Sử dụng mRNA để tạo cDNA cDNA là gì? cDNA là một dạng của DNA đƣợc tạo ra trong các phòng thí nghiệm, sử dụng một loại enzyme gọi là reverse transcriptase. Tạo cDNA đi ngƣợc với tiến trình bình thƣờng của sự sao mã trong tế bào. Bởi vì, ngƣời sản xuất sử dụng mRNA làm khuôn (template) chứ không phải DNA. Không giống nhƣ DNA của bộ gen, cDNA chỉ chứa exon hay gen biểu hiện. mRNA là một chìa khóa để tìm thấy những gen biểu hiện trong bộ gen. Tuy nhiên, mRNA không bền vững ở bên ngoài tế bào. Do đó, các nhà khoa học đã sử dụng một loại enzyme đặc biệt để biến đổi nó thành dạng DNA (cDNA) bổ sung (complementary DNA). cDNA có cấu tạo bền vững hơn rất nhiều so với mRNA. Vì đƣợc tạo ra từ mRNA, các intron đã đƣợc bị loại bỏ nên cDNA chỉ đại diện cho những trình tự DNA biểu hiện. Từ cDNA đến EST Một cDNA đại diện cho một gen biểu hiện đƣợc phân lập, sau đó các nhà khoa học có thể giải trình tự từ hai đầu của phân tử này thƣờng khoảng 100 đến vài trăm nucleotide (khoảng 500 nucleotide) để tạo ra hai loại EST. Đó có thể là 5‟EST và 3‟EST. 10 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST 2.3. Microsatellite là gì? Microsatellite là trình tự đơn lặp lại (Simple Sequence Repeats - SSR) từ 1 – 10 nucleotide. Chúng xuất hiện khắp trong các loài sinh vật bậc cao, mặc dù tần số xuất hiện của SSR có sự biến đổi giữa các loài. SSR rất phong phú, nằm rải rác khắp nơi trong bộ gen và cho thấy mức độ đa hình cao hơn so với các marker di truyền khác. Những đặc điểm này, kết hợp lại làm cho SSR đƣợc xác định một cách dễ dàng, chúng đƣợc sử dụng làm marker phân tử. Khả năng tự thừa kế của SSR trong những tính trạng trội, đó là những thuận lợi mà chúng có đƣợc khi so sánh với các loại marker phân tử khác. SSR gần đây đã trở thành marker di truyền quan trọng, đặc biệt là với các loài ngũ cốc nhƣ lúa mì và lúa mạch. 2.3.1. Các dạng microsatellite Dạng mononucleotide SSR là dạng chỉ có 1 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ AAAAAAAAAA Dạng dinucleotide SSR là dạng trong trình tự lặp lại có 2 loại base. Ví dụ nhƣ GTGTGTGTGTGT Dạng trinucleotide SSR là dạng có đến 3 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ ATGATGATGATGATG Dạng tetranucleotide SSR là dạng có tới 4 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ ACGTACGTACGTACGT 11 Dạng trinucleotide xuất hiện ít hơn dạng dinucleotide tới 10 lần, dạng tetranucleotide thì ít hơn dạng trinucleotide (Ma và ctv., 1996) Sự lặp lại của polyA/T là rất phổ biến ở các loài. Tuy nhiên, sự phân bố giữa các loài rất khác nhau. Dạng này thƣờng không ổn định vì vậy trong phân tích di truyền và lập bản đồ di truyền… là không phù hợp. Dạng CA/GT thƣờng gặp trong các loài có vú, gấp đôi dạng AT và gấp 3 dạng AG/CT. Ở thực vật dạng thƣờng gặp là AA/TT và AT/TA. Chúng có thể đƣợc phần thành ba dạng, sau đây là 3 ví dụ cụ thể: Dạng liên tục: ATATATATATATAT Dạng kết hợp: GCGCGCGC TATATA Dạng ngắt quảng: CACACACA TGCT CACACACA Loại đa hình cao nhất là dạng không bị ngắt quãng. Tuy nhiên, trong thực tế dạng kêt hợp và ngắt quãng đƣợc tìm thấy nhiều hơn. 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên, di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân ( unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 12 Quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trƣợt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.9 . Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite SSR đƣợc sử dụng để lập bản đồ di truyền. Chúng dễ dàng sử dụng và chứa đựng thông tin cao có thể thay thế tốt cho RFLP trong kỹ thuật lập bản đồ di truyền ở ngƣời (Dib và ctv., 1996). Sự phát triển SSR trong thực vật là rất nhanh, và vị trí SSR hiện giờ đƣợc hợp nhất để thành lập bản đồ di truyền của tất cả các loài ngũ cốc (Liu và ctv., 1996; Korzun và ctv., 1997; Smith và ctv., 1997; Stephenson và ctv., 1998). SSR có thể đƣợc sử dụng trong công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của các loài. Sự đa hình của SSR đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR với 13 mồi đƣợc thiết kế ở vùng bảo tồn hai bên SSR (flanking regions) trên cơ sở sự khác nhau về kích thƣớc của các băng khi điện di của trình tự lặp lại. 2.3.4. Marker phân tử (molecular marker) Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho đời sau, giống nhƣ các nhân tố di truyền Meldel, nhƣng lại có thể định lƣợng đƣợc. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt đƣợc hai cá thể, hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem nhƣ là một marker DNA. Marker DNA có nhiều ƣu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trƣờng. Các chỉ thị di truyền phân tử đƣợc sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dƣới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài (Ahn và ctv, 1993; Dunforal và ctv, 1995). Chúng có thể đƣợc dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair và ctv, 1995; Zhang và ctv, 1995). Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004): - Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS - Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization-based): RFLP, minisatellite. Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random amplified polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary primer-PCR DAF DNA amplification fingerprinting AFLP Amplified fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism SSR Simple sequence repeat (microsatellite) SSCP Single strand conformation polymorphism RFLP Restriction fragment length polymorphism 14 STS Sequence-tagged sites Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lƣợc đƣợc thế giới ủng hộ từ năm 1995, là phƣơng pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phƣơng pháp (Bùi Chí Bửu, 2002). 2.3.5. Vì sao chọn marker SSR? Hiện nay marker SSR là một công cụ mạnh (powerful tool) đƣợc ứng dụng rộng rải trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài; phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dƣới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt; tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh (các gen có liên quan đến bệnh Alzheimer, ung thƣ ruột kết và nhiều bệnh khác) từ đó nghiên cứu ra phƣơng pháp điều trị. Marker SSR có các ƣu điểm nổi bật sau Di truyền đa allen và đồng trội Có tính chỉ thị cao (non- abundant) Có ở tận hai đầu của bộ gen (tính chỉ thị rộng) Marker RAPD thì dễ dàng phát triển nhƣng giới hạn trong nhiều mục đích ứng dụng (Haymer 1994). Microsatillite (Simple Sequence Repeats, SSRs) có độ đa hình cao, marker đồng trội, hiệu quả này đã đƣợc chứng minh qua nhiều mục đích ứng dụng bao gồm kỹ thuật finger-printing (Smith và Devey, 1994), nghiên cứu di truyền quần thể (Haymer 1994; Tsumura và ctv, 1996; Thomas và ctv, 1999), kiểm tra sƣ phân bố di truyền cho đời sau (Dow và ctv, 1995), kiểm tra sự thuần hóa (Morchen và ctv, 1996). SSR dễ dàng sử dụng hơn sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs) chỉ giải quyết đƣợc số lƣợng nhỏ DNA, sự đa hình cao và khả năng phân tích nhanh. Marker SSR có thể dễ dàng thay đổi giữa 15 các nhà khoa học bởi vì mỗi locus đƣợc xác định bởi trình tự mồi riêng. SSR phân tích nhanh hơn sự khuyếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) và sự chuyển đổi tốt hơn AFLP. SSR hiện giờ thay thế cho RFLP trong lập bản đồ di truyền các cây trồng nông nghiệp. Sự kết hợp của SSR với AFLP tạo nên bản đồ di truyền chi tiết. Sự đồng trội tự nhiên của SSR cũng là điểm mạnh trong lập bản đồ di truyền. 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) 2.4.1. Nguồn gốc của Perl Trƣớc khi Java hay JavaScript chiếm lĩnh Internet, và thậm chí trƣớc khi Web xuất hiện, Perl đã có một vai trò rất quan trọng. Từ viêc tự động hóa các tác vụ quản lý UNIX cho đến việc thực hiện thƣờng trình phân tích file, Perl đƣợc sử dụng nhƣ một ngôn ngữ tiện ích thực sự. Vào ngày 18 tháng 10 năm 1987, Larry Wall, tác giả của ngôn ngữ này, lần đầu tiên đƣa Perl vào sử dụng tại nhóm usenet comp.sourse. Ngôn ngữ mới này phát sinh từ ngôn ngữ lập trình C và bị ảnh hƣởng bởi các ngôn ngữ khác nhƣ BASIC, awk, sed, và UNIX shell. Perl là sự kết hợp các ƣu điểm của những ngôn ngữ trên. Những ngƣời có ít hay không có kinh nghiệm lập trình đều có thể học và sử dụng Perl để lập trình một cách dễ dàng. Ngoài việc dễ dàng học, Perl còn là một ngôn ngữ hữu dụng. Ngay từ đầu, Perl đã có một khả năng rất lớn trong việc thao tác text, file, và các tiến trình hệ thống. Từ lúc khai sinh đến nay, Perl đã có nhiều phiên bản, sau Perl 1.0 là Perl 2.0, …Perl 5.6. Perl 5.6 xuất hiện vào tháng 3 năm 2000. Bênh cạnh một cú pháp mới đƣợc dùng để diễn dịch và khai báo các thuộc tính thƣờng trình phụ, Perl 5.6 còn bổ sung khá nhiều đặc tính nhỏ mà những ngƣời lập trình yêu cầu vốn không có trong các phiên bản trƣớc. Các đặc tính này bao gồm: Hỗ trợ Unicode và UTF-8 Hỗ trợ 64 bit Hỗ trợ các file lớn hơn 2GB 16 Có nhiều khả năng chẩn đoán hơn Các loại cảnh báo theo phạm vi từ vựng Hàm open có thêm một số đối số Hàm pack đƣợc cải tiến thêm 2.4.2. Cấu trúc của Perl 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scalar data) Dữ liệu vô hƣớng (scalar data) ám chỉ một kiểu dữ liệu duy nhất gồm số và chuỗi. Đây là kiểu dữ liệu cơ bản nhất mà Perl đã quen xử lý. Biến vô hƣớng phải đƣợc đặt tên với ký tự “$”. Các số Theo quan điểm của ngƣời sử dụng, thƣờng có hai dạng khác nhau. Kiểu số thứ nhất là một interger, tức là một số nguyên. Các số nguyên này đƣợc trình bày với các cơ số 10. Kiểu thứ hai là số thập phân. Ngoài ra còn có hai kiểu số đặc biệt khác là các số bách phân và thập lục phân. Các số bách phân đƣợc trình bày với cơ số 8 và các số thập lục phân với các chữ số cơ số 16. Các chuỗi Một chuỗi là một loạt các ký tự liên tiếp. Một chuỗi có thể đƣợc tạo thành bởi bất kỳ tổ hợp ký tự nào từ bộ 256 ký tự. Chuỗi có hai dạng khác nhau, gồm chuỗi có dấu trích dẫn đơn và chuỗi có dấu trích dẫn kép. Khi viết một chƣơng trình cần phải lƣu một số các dữ liệu vô hƣớng cho nhiều muc đích lập trình khác nhau. Và nó sẽ đƣợc lƣu vào các biến vô hƣớng (scalar variable). Một biến vô hƣớng có thể đƣợc xem nhƣ là một thùng chứa. Ngƣời lập trình có thể đặt một giá trị vô hƣớng vào thùng này và lấy nó ra bất kỳ lúc nào khi cần nó. Ngƣời lập trình có thể thay đổi những gì họ có trong thùng chứa vào bất kỳ lúc nào trong khi một chƣơng trình đang thực thi. 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển 17 Cấu trúc điều khiển là tập hợp các câu lệnh điều kiện. Các câu lệnh điều kiện đƣợc sử dụng trong ngôn ngữ lập trình khi một quyết định cần đƣợc thực hiện trƣớc khi một phần mã đƣợc thƣc thi. Các khối câu lệnh Một khối lệnh là một chuỗi các câu lệnh thƣc thi đƣợc đƣợc nhóm lại với nhau bằng các dấu ngoặc „{„ và „}‟. Một khối lệnh trong một chƣơng trình trông giống nhƣ thế này: { $a = 12; $a + = 5; print “a equals $a\n”} Câu lệnh điều kiện if-then-else Câu lệnh điều kiện if-then-else nhận một biểu thức và đánh giá nó với một giá trị là đúng/sai. Nếu việc xác định của một biểu thức là giá trị đúng, khối lệnh cho phần câu lệnh then đƣợc thực thi. Nếu phần xác định của biểu thức là sai, khối lệnh else sẽ đƣợc thực thi. Cú pháp của câu lệnh điều kiện if-then-else nhƣ sau: if ( biểu thức) ví dụ: { #!/usr/bin/perl khối lệnh „then‟ $a = 20; } if($a =15){print “a is equal to 15.\n”;} else else{print “a is not equal to 15.\n”;} { khối lệnh „else‟ } Việc bỏ đi phần else của câu lệnh này là hoàn toàn hợp lệ nếu chúng ta không cần nó. Dƣới đây là cú pháp câu lệnh if-then mà không có else. If (biểu thức) { khối lệnh „then‟ } Việc có một khối lệnh else mà không có khối lệnh if trƣớc đó là không hợp lệ trong Perl. Câu lệnh điều kiện while 18 Câu lệnh điều kiện while là một câu điều kiện hữu ích bởi vì nó cho phép ngƣời lập trình lặp lại một khối lệnh bao nhiêu lần tùy ý. Lệnh while hoạt động giống nhƣ câu lệnh điều kiện if-then-else ở chỗ xác định một biểu thức cho việc đánh giá đúng/sai. Một khác biệt lớn là nó tiếp tục thực thi khối lệnh khi biểu thức là đúng. Dƣới đây là cú pháp cho câu lệnh điều kiện while. While (biểu thức) ví dụ: #!/usr/bin/perl { $a = 15; khối lệnh „while‟ while ($a<25) { } print“$a is still less than 25\n”;} Câu lệnh điều kiện until Câu lệnh điều kiện until ngƣợc với câu lệnh while. Khối lệnh until chỉ thực thi khi biểu thức xác định là sai. Dƣới đây là cú pháp cho câu lệnh điều kiện until. until (biểu thức) ví dụ: #!/usr/bin/perl { $a = 15; khối lệnh „until‟ } until ($a >25) { print “the value of is $a \n”; $a; } Câu lệnh điều kiện do while-until Trong một số trƣớng hợp, ngƣời lập trình có thể cần khối lệnh phải đƣợc thực thi ít nhất một lần. Perl cho phép ngƣời lập trình thực hiện điều này bằng cách sử dụng câu lệnh điều kiện do while-until. Câu lệnh có cú pháp nhƣ sau: do { khối lệnh „do‟ } until (biểu thức) Câu lệnh điều kiện do while–until cho phép bạn thƣc thi khối lệnh ít nhất một lần, bất kể biểu thức xác định nhƣ thế nào (đúng hay sai). Ví dụ #!/usr/bin/perl $a = 12; do { print “ the statement block has been excuted \n”; while ($a < 10) Câu lệnh điều kiện for 19 Câu lệnh for đƣợc sử dụng rộng rãi bởi các nhà lập trình trong tất cả các ngôn ngữ. Lý do của điều này là câu lệnh for cung cấp cho ngƣời lập trình một phƣơng pháp nhanh chóng xác định số lần mà một khối lệnh đƣợc thực thi. Cú pháp câu lệnh điều kiện for nhƣ sau. For (câu lệnh 1;biểu thức điều kiện; câu lệnh 2) { khối lệnh „for‟ } Ví dụ #!/usr/bin/perl for ($a=1;$a<10;$a++){# the for conditional statement print “the statement block has been executed $a times \n”;} 2.4.2.3. Các List, Array và Hash Danh sách (list) Danh sách là một nhóm dữ liệu vô hƣớng sắp xếp theo thứ tự, nó là một chuỗi các giá trị vô hƣớng đƣợc đặt trong các dấu ngoặc đơn, nó có dạng: (1, 2, 3, 6, 7, 12); (1, 2, “hello”, 3, 6 , “again”); (4, 5, “$name”, 7, 10). Các Array Một biến mảng (array variable) giống nhƣ một biến vô hƣớng trong đó nó đƣợc tạo ra để lƣu trữ dữ liệu. Sự khác biệt là biến mảng đƣợc thiết kế để lƣu trữ một danh sách trong khi một biến vô hƣớng đƣợc thiết kế để lƣu trữ một dữ liệu vô hƣớng số ít. Biến mảng đƣợc biểu thị bằng ký tự @ đầu tiên (@number). Các hash (băm) Một hash là một biến khác mà ngƣời lập trình có thể sử dụng để lƣu trữ dữ liệu vô hƣớng. Đối với các array, phần tử đâu tiên có một index là 0, phần tử thứ hai có một index là 1,… Mỗi trong các phần tử đƣợc chứa trong một hash có những gì đƣợc gọi là các khóa (key), các khóa đƣợc sử dụng làm index. Những khoá này có thể đƣợc ấn định bởi ngƣời dùng và chúng có thể là bất kỳ nếu muốn. Cú pháp của hash nhƣ sau. %hash = (key, element, key, element) 20 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con là một cách để giúp cho ngƣời lập trình phân chia mã của mình thành các đoạn. Bằng cách thực hiện điều này, ngƣời lập trình thƣờng có thể tổ chức chƣơng trình của mình tốt hơn theo chức năng. Ngoài ra, điều này còn cho phép ngƣời lập trình tạo các phần hay chức năng để sử dụng lại thay vì phải viết lại. Dòng chƣơng trình Khi bàn về dòng chƣơng trình lôgic, chúng ta ám chỉ đến dòng mà chƣơng trình đi qua khi nó giải quyết một tác vụ. Ví dụ, khi bạn thức dậy vào buổi sáng, bạn có thể tắm rửa, mặc đồ, ăn sáng, và sau đó đi làm. Một chƣơng trình đƣợc thiết kế logic sẽ tuân theo tiến trình tƣơng tự đó, bất kể bất kỳ điểm chung giữa các bƣớc nhƣ mở cửa hay đi bộ. Do đó, bằng cách tuân theo kiểu phƣơng pháp này, ngƣời lập trình sẽ khai báo các biến này thay vì tại phần trên cùng – và các thƣờng trình con thay vì tại phân dƣới cùng – khi cần thiết. Một dòng chức năng là nơi mà ngƣời lập trình nhóm các chƣơng trình lại với nhau. Ví dụ, tại cuối chƣơng trình, ngƣời lập trình kéo tất cả thƣờng trình con, đƣợc sắp xếp bằng chức năng tƣơng tự. Các thủ tục đi bộ, mở cửa, và lái xe có thể nằm kề nhau, trong khi đó nói chuyện và các dạng giao tiếp khác có thể theo sau. Thƣờng trình con Một thƣờng trình con là phƣơng pháp để tạo các hàm của Perl. Những hàm này cho phép ngƣời lập trình thực hiện mọi thứ từ việc truyền các đối số và chỉnh sửa các giá trị đến việc cho ra giá trị. Sự khai báo các thƣờng trình con trong ngôn ngữ Perl đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng từ khóa ngôn ngữ sách. Theo sau từ khóa này là một mã nhận dạng tên dùng để gọi thƣờng trình con khi cần đến. Sau đây là cú pháp cơ bản, trong đó NAME tham chiếu tên mà ngƣời lập trình muốn gọi thƣờng trình con và code là mã mà ngƣời lập trình muốn thực thi khi thƣờng trình con đƣợc gọi. Sub NAME { Code } 21 2.4.2.5 Package và Module Package Một package là một tập hợp các hàm Perl đƣợc nhóm thành một file đơn. File này, cũng đƣợc gọi là một thƣ viện (library) và có phần mở rộng .pl (đôi khi là .pm), đƣợc chỉ ra bởi tên file của nó trong mã. Một package khai báo một namespace khác của các biến và/hoặc các thƣờng trình con bên trong nó. Mục đích là để các biến tránh ghi đè lên nhau. Module Module không có gì hơn là một package. Điểm khác biệt duy nhất là một Module đƣợc thiết kế để sử dụng lại. Điều này đƣợc thực hiện bằng cách cho phép xuất một số hay tất cả các biến và thƣờng trình con của một Module sang các package khác. Trên đây, tôi chỉ trình bày sơ lƣợt một vài thành phần trong cấu trúc hoạt động của ngôn ngƣ lập trình Perl. Còn rất nhiều các yếu tố cấu tạo - nguyên tắc chi tiết ứng dụng của từng thành phần trong Perl mà do mục đích và yêu cầu của đề tài nên tôi không thể trình bày hết đƣợc. 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) 2.5.1. Khái quát về mồi Mồi (primer) là một thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5‟ hay 3‟ của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi đƣợc thiết kế dựa vào vùng trình tự đã đƣợc biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Trong phản ứng PCR bao giờ cũng cần có cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngƣợc). Có rất nhiều tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp mồi nhƣ chiều dài mồi, tính chuyên biệt của cặp mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi, nhiệt độ bắt cặp, sự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi… để đảm bảo phản ứng PCR thành công và thu đƣợc sản phẩm nhân bản (một số lƣợng lớn bản sao của đoạn DNA khuôn ban đầu). 2.5.2. Đặc điểm của mồi (primer) 22 2.5.2.1 Tính chuyên biệt Duy nhất: chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA, nghĩa là trình tự primer chỉ xuất hiện một lần trên trình tự khuôn. Ngoài ra, cũng phải cần đảm bảo prime