Khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm (Phytophthora capsici ) và các tác nhân hóa lý dến sự sinh trưởng và khả năng tạo đột biến của cây tiêu (Piper nigrum L.) nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TÔ THỊ NHÃ TRẦM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TÔ THỊ NHÃ TRẦM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY *****000***** EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Supervisor Student MSc. NGUYEN THI KIM LINH TO THI NHA TRAM Dr. LE DINH DON TERM: 2003 - 2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Lê Đình Đôn và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phƣợng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Cám ơn Thầy và các chị thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em tận tình. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Các bạn Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Bích Uyển, Nguyễn Hoàng Quân, Trần Nguyễn Mỹ Châu khoa Nông Học thực hiên đề tài ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, bạn Văn Đào, Quốc Dũng CNSH30 và Anh Khoa, Tuyết Nhung, Ngọc Lợi CNSH31 cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Sinh viên thực hiện TÔ THỊ NHÃ TRẦM iv TÓM TẮT TÔ THỊ NHÃ TRẦM, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora sp. VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Đại Học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tƣợng hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro. Những kết quả đạt đƣợc: Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Ở nồng độ dịch nấm 30 và 40 % thì mô sẹo bị chết hoàn toàn. Nồng độ 20 % tạo nhiều tế bào bất thƣờng, mô vẫn còn khả năng sống sót và ở nồng độ này cho kết quả đột biến tế bào mô nhiều hơn. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Nồng độ 10 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l IBA và 20 mg/l BA với 1 mg/l IBA cho kết quả tạo chồi cao trong đó tối ƣu nhất vẫn là BA sử dụng ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với 1 mg/l IBA. Mặt khác, nồng độ 20 mg/l IBA kết hợp với 1 mg/l BA và 1mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l TDZ lại cho kết quả đột biến cao. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu Ở liều xạ 20 Gy thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo hơn nhƣng để tạo đột biến thì ở liều xạ 40 Gy cho tỉ lệ biến dị cao hơn. Trên chồi thì liều xạ 20 Gy kích thích tạo sẹo nhiều và cả mô xốp nhƣng ở liều xạ 40 và 60 Gy cho nhiều thể đột biến hơn vì tạo đƣợc nhiều mô bất thƣờng và cấu trúc tế bào thay đổi nhiều. v SUMMARY The thesis titled “EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.)” was carried out at Biotechnology Department and Plant Protection Department – Nong Lam University, HCMC from March 2007 to August 2007 under the supervision of MSc. Nguyen Thi Kim Linh and Dr. Le Dinh Don. The thesis contents three experiments. The first experiment was “effects of Phytophthora capsici on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with Phytophthora capsici extract at 20%, 30% and 40% for 21 days. The results showed that: On the medium having Phytophthora capsici extract at 30% and 40%, the mutation ratio were highter than that on the third medium on the day 14 t after culture. However, on these two mediums all black pepper callus were died on the day 21 st after culture. The second experiment was “effects of growth regulator on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with BA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with IBA (1 mg/l); IBA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with BA (1 mg/l); and TDZ (1 mg/l, 2 mg/l) combined with IBA (1 mg/l). The results showed that: The medium supplemented with BA (10 mg/l) combined with IBA (1 mg/l) had highest shoot ratio. The medium supplemented with IBA (1 mg/l) combined with TDZ (1 mg/l) gave highest mutation ratio. The last experiment was “effects of Gamma ray on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus and shoot were treated by gamma ray at 20, 40 and 60 Gy. The results showed that: Callus formation in 20 Gy treatment was higher than that the treatments of 40 and 60 Gy. However, the mutation ratio in gamma ray at 40 and 60 Gy treatments were higher than that the treatments of 20 Gy. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm tạ ............................................................................................................ iii Tóm tắt ................................................................................................................ iv Mục lục ................................................................................................................ vi Danh sách các bảng ............................................................................................. ix Danh sách các hình .............................................................................................. x Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... xii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 3 1.3. Giới hạn của đề tài ....................................................................................... 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu ................................................................... 4 2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu ............................................................................... 4 2.1.2. Tình hình phân bố ..................................................................................... 5 2.1.3. Tình hình sản xuất tiêu thụ trên thế giới và trong nƣớc ............................ 5 2.1.3.1. Tình hình sản xuất .................................................................................. 5 2.1.3.2. Tình hình tiêu thụ ................................................................................... 6 2.1.4. Tình hình bệnh trên cây tiêu...................................................................... 9 2.1.4.1. Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra ............ 9 2.1.4.2. Bệnh tuyến trùng .................................................................................... 10 2.1.4.3. Bệnh khô đầu ngọn thối trái ................................................................... 10 2.1.4.4. Bệnh vằn lá do virus ............................................................................... 10 2.1.4.5. Các bệnh do dinh dƣỡng bất thƣờng ...................................................... 11 2.1.5. Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế ................................................... 11 2.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora capsici ..................................................... 12 2.3. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật ....................... 13 vii 2.3.1. Khái niệm bức xạ ...................................................................................... 13 2.3.2. Bức xạ gamma ........................................................................................... 14 2.3.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) .................................................................. 14 2.3.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống ...................................... 14 2.3.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa ................................................... 15 2.3.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ .................................. 16 2.3.6.1. Ngoài nƣớc ............................................................................................. 16 2.3.6.2. Trong nƣớc ............................................................................................. 17 2.4. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào tực vật .................................. 18 2.4.1. Khái niệm .................................................................................................. 18 2.4.2. Ứng dụng ................................................................................................... 18 2.4.3. Phƣơng pháp nhân phôi vô tính ................................................................ 19 2.4.3.1. Khái niệm ............................................................................................... 19 2.4.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính .......................................................... 19 2.4.3.3. Sự hình thành phôi vô tính ..................................................................... 19 2.4.3.4. Các kiểu phát sinh phôi soma ................................................................ 20 2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh truonwgr trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...... 21 2.5.1. Chất điều hòa sinh trƣởng ......................................................................... 21 2.5.2. Một số chất điều hòa sinh tƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô ........... 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................... 24 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 24 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 24 3.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy ..................................................................... 24 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng ................................................................... 24 3.3.1.2. Phòng cấy ............................................................................................... 24 3.3.1.3. Phòng cấy nấm ....................................................................................... 24 3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng .................................................................................. 24 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy .................................................................. 25 viii 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................. 25 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ .................................................................... 25 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 28 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy................................................................... 28 3.4.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 28 3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch nấn Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ............................................ 28 3.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu .......................................... 31 3.4.2.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu ......................................................... 32 3.5. Phân tích thống kê ........................................................................................ 33 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 34 4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsicci đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ........................................... 34 4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro ...................................................... 34 4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici.................................................................................................................. 34 4.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ................................................................ 42 4.3. Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo, chồi tiêu .............................................................. 51 4.3.1 Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ..................................................................................... 51 4.3.2. Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của chồi tiêu .......................................................................................... 58 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 64 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 64 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 66 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 69 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 21: Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) .................................................... 6 Bảng 2.2: Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 ................... 7 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 – 1999) ........................ 8 Bảng 2.4: Năng suất và sản lƣợng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 .............. 11 Bảng 3.1: Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ............................................................................ 30 Bảng 3.2: Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu .................................................................................... 31 Bảng 3.3: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu .................................................... 32 Bảng 3.4: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu ......................................................... 33 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo ...... 37 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy .................................................................................................................. 38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo ........... 42 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo phôi của mô sẹo tiêu ............................................................................... 43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu ................................................................................ 44 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia γ đến khả năng sống sót của mô sẹo tiêu ........................................................................................................... 51 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến khả năng tạo phôi của mô sẹo ............... 52 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ sống của chồi tiêu ...................... 58 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ tạo chồi của chồi tiêu ................ 59 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 4.1: Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D ................................................................................................. 34 Hình 4.2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy ............ 35 Hình 4.3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy ......... 36 Hình 4.4: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy .. 37 Hình 4.5: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 39 Hình 4.6: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 41 Hình 4.7: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) ......................................................... 41 Hình 4.8: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy .......................................................................................... 45 Hình 4.9: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy ............................................................................... 46 Hình 4.10: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................... 47 Hình 4.11: Mô xốp trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................................................... 48 Hình 4.12: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (độ phóng đại 40  10) ........................................................................................................ 48 Hình 4.13: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) .............................................. 49 Hình 4.14: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) .............................................. 50 xi Hình 4.15: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 2 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 53 Hình 4.16: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 3 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 54 Hình 4.17: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 4 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 55 Hình 4.18: Mặt cắt mô sẹo sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ...... 56 Hình 4.19: Mặt cắt mô sẹo sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ....... 57 Hình 4.20: Mặt cắt mô sẹo sau 4 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ......57 Hình 4.21: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ................................................................................................................... 60 Hình 4.22: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ........................................................................................................ 60 Hình 4.23: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ........................................................................................................ 61 Hình 4.24: Mặt cắt chồi tiêu sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ....... 62 Hình 4.25: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ..... 63 Hình 4.26: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ..... 63 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA: N 6 – benzyladenine 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid Gy: đơn vị đo năng lƣợng hấp thụ IBA: Indole – 3 – butyric Acid MS: Murashige & Skoog, 1962 TDZ: Thidiazuron Ctv: cộng tác viên GA: Gibberellin A 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ, nhất là công nghệ gen và công nghệ tế bào đã đóng góp to lớn vào lĩnh vực cải tiến giống cây trồng nông nghiệp phục vụ cho nhu cầu của con ngƣời. Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là một mặt hàng xuất khẩu trọng yếu, mang lại nhiều lợi nhuận cho ngƣời nông dân Việt Nam. Sau những năm 1998, 1999, khi giá hồ tiêu tăng cao (60.000 đồng/kg), nhiều địa phƣơng đã tăng rất nhanh diện tích trồng hồ tiêu. Đến năm 2003, Việt Nam có tổng diện tích cây tiêu cả nƣớc tăng gần 5.000 ha so với năm 2002, dẫn đầu về sản lƣợng xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới với 85.000 tấn (IPC). Việt Nam chiếm tỷ trọng xuất khẩu cao nhƣng chủ yếu là mặt hàng tiêu đen cấp thấp, bình quân năm 2003 xuất với giá 1.419 USD/tấn. Tháng 4 đầu năm 2004, lƣợng tiêu xuất khẩu của Việt Nam giảm 28% so với cùng kỳ năm 2003, đồng thời giá xuất khẩu cũng giảm mạnh (Phạm Thị Chín và Nguyễn Xuân Vinh, 2005). Nguyên nhân là do những năm gần đây, năng suất hạt giảm đáng kể so với những năm trƣớc, có khi mất trắng. Mặt khác, giá tiêu khô cân tại vƣờn lại bấp bênh (khoảng từ 16.000 – 20.000 ngàn đồng/kg) làm ngƣời dân không tự tin để tiếp tục canh tác. Do đó, nếu không có những giải pháp đúng đắn, kịp thời, mặt hàng tiêu xuất khẩu của Việt Nam sẽ ngày càng giảm sút về số lƣợng lẫn chất lƣợng. Nhìn chung, hiện trạng trồng tiêu của Việt Nam đang gặp phải một số hạn chế cần đƣợc khắc phục. Trong số đó, quan trọng nhất là khâu giống, vì hiện nay phần lớn các giống tiêu đang đƣợc trồng ở nƣớc ta đã lâu đời, chƣa đƣợc phục tráng tuyển chọn nên không ổn định về năng suất và khả năng kháng bệnh kém. Bên cạnh đó, kỹ thuật chọn và nhân giống còn tự phát, đơn điệu, trồng dựa vào truyền thống 2 là chủ yếu, chƣa áp dụng đƣợc tiến bộ khoa học kỹ thuật (Trần Văn Hòa, 2001). Tuy vậy đối với cây tiêu, tạo giống theo cách cổ điển là phƣơng pháp chủ đạo ở nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới. Biện pháp tạo giống cổ điển dựa trên các biến dị di truyền do tổ hợp hoặc do đột biến. Các biến dị có lợi cho sản xuất đƣợc chọn lọc, duy trì và củng cố qua hàng loạt thế hệ để phát triển thành giống mới. Đặc điểm nổi bậc về hình thái, sinh trƣởng, năng suất, chất lƣợng, tính chống chịu, đặc tính thích nghi, tính kháng bệnh, ổn định là những tiêu chuẩn quan trọng đƣợc định tính hay định lƣợng bằng phƣơng pháp chuẩn để đƣa một giống tiêu mới ra sản xuất hoặc xác nhận bản chất di truyền làm nguồn vật liệu cho công tác cải tiến giống. Ứng dụng những phƣơng pháp trong nuôi cấy mô bằng cách sử dụng dịch nấm (Phytopthora capsici), sử dụng chất kích thích sinh trƣởng và chiếu xạ gamma tạo đột biến để khai thác biến dị có lợi từ nguồn tài nguyên di truyền thực vật bản địa nhằm mong muốn tạo ra giống tiêu có kiểu di truyền mới chứa những đặc tính tốt về sinh trƣởng và phát triển cũng nhƣ khả năng thích nghi, tính chống chịu bệnh và cho năng suất cao. Để tiến xa hơn trong công tác giống, cung cấp số lƣợng lớn cây giống tiêu có những đặc điểm tốt và nhu cầu sản xuất – xuất khẩu giống tiêu này bằng cách áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật đồng thời cùng với sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình TS Lê Đình Đôn và ThS Nguyễn Thị Kim Linh, chúng tôi tiến hành đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ” 3 1.2. Mục tiêu và yêu cầu Mục đích Tìm ra những cá thể lạ trong điều kiện nuôi cấy bất thƣờng. Yêu cầu Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong dịch nấm Phytophthora capsici. Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo đựơc nuôi cấy trong môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng ở nồng độ cao . Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo và chồi tiêu đƣợc chiếu xạ tia gamma. 1.3. Giới hạn của đề tài Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chỉ chiếu xạ chƣa kết hợp với các hóa chất khác để tăng hiệu quả gây đột biến. Chƣa thực hiện kiểm tra sinh học phân tử để xác định loại biến dị. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu 2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae, có nguồn gốc ở vùng Ghats miền Tây Ấn Độ, ở đây có nhiều giống tiêu hoang dại, mọc rất lâu đời. Sau đó, tiêu đƣợc ngƣời Hindu mang tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu đƣợc trồng ở Mã Lai. Đến thế kỷ 18, tiêu đƣợc trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ 20 thì tiêu đƣợc trồng nhiều ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu Mỹ với Brazil, Mexico. Tiêu du nhập vào Đông Dƣơng từ thế kỷ 17 nhƣng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh (Trần Văn Hòa, 2001). Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo đƣợc phân thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có một lá đơn, hình trái tim, mọc cách. Ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tƣợc, cành lƣơn, cành ác (cành cho trái) tùy theo từng giai đoạn phát triển của cây tiêu. Hệ thống rễ thƣờng gồm từ 3 – 6 rễ cái và một chùm rễ phụ ở dƣới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu đƣợc sử dụng làm gia vị, trong y dƣợc, trong công nghiệp hƣơng liệu và làm chất trừ côn trùng. Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho việc chế biến các món ăn. Vì vậy mà tiêu đã trở thành gia vị đƣợc dùng rất phổ biến trên thế giới. Trong y dƣợc: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm, cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng. 5 2.1.2. Tình hình phân bố Tiêu là một loại cây đặc trƣng của miền nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp cho cây tiêu là từ 10 – 35 0C. Ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầu sinh lý về sinh trƣởng và phát dục, ra hoa đậu quả của cây tiêu và kéo dài tuổi thọ của vƣờn. Tiêu ƣa thích điều kiện khí hậu nóng ẩm, lƣợng mƣa trong năm cần từ 1500 – 2500 mm. Tiêu cũng cần một giai đoạn hạn tƣơng đối ngắn sau vụ thu hoạch để phân hóa mầm hoa tốt và ra hoa đồng loạt vào mùa mƣa năm sau. Do đó, ở Việt Nam tiêu đƣợc trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình, Kiên Giang (Phú Quốc), Đồng Nai (Long Khánh), Bình Phƣớc (Lộc Ninh). 2.1.3. Tình hình sản xuất tiêu thụ tiêu trên thế giới và trong nƣớc 2.1.3.1. Tình hình sản xuất Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 nƣớc trồng tiêu. Tổng sản lƣợng tiêu hột tăng dần theo thời gian: năm 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn tiêu hột, năm 1978 là 160.000 tấn tiêu hột và 1983 là 180.000 tấn tiêu hột. Sau 1982 sản lƣợng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết. Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trƣờng gây ảnh hƣởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu. Trƣớc những năm 90, các nƣớc có sản lƣợng tiêu lớn là Brazil, Indonesia và Malaysia. Đến năm 2000, Ấn Độ đã vƣơn lên đứng vị trí thứ nhất, kế đến là Việt Nam (FAO, 2000). Đến năm 2001, Việt Nam đã vƣợt lên Ấn Độ để trở thành nƣớc có sản lƣợng tiêu lớn nhất thế giới. Với tốc độ sản xuất tiêu nhanh chóng ở Việt Nam và Ấn Độ, lƣợng cung trên thế giới đã vƣợt quá lƣợng cầu khiến giá tiêu trên thị trƣờng thế giới giảm mạnh hơn 50% từ 3.000 – 4.000 USD/tấn còn 1.500 – 1.800 USD/tấn (Bảng 2.2). Theo thống kê của Cộng đồng hạt tiêu thế giới IPC, lƣợng cung năm 2003 giảm 4% trong bối cảnh giá thấp và điều kiện canh tác không thuận lợi. Ngoài Việt Nam, nƣớc sản xuất hàng đầu, tăng 13% đạt mức 85.000 tấn, sản lƣợng lại giảm mạnh tại các nƣớc nhƣ Ấn Độ, Brazil và Malaysia do sâu bệnh và thời tiết. So với năm 2002 sản lƣợng và xuất khẩu của 6 nƣớc sản xuất 6 hạt tiêu chính trên thế giới. Trong những năm gần đây Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam là những nƣớc có diện tích trồng tiêu lớn nhất thế giới. Ở Việt Nam, năm 1997 - 1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha. Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nƣớc) Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam chủ trƣơng tập trung thâm canh, cải tạo các vƣờn cây già cỗi, loại bỏ những giống tiêu kém hiệu quả và thay vào đó là các giống tiêu năng suất cao, chất lƣợng tốt (trồng giống tiêu Ấn Độ tại Vĩnh Linh, Quảng Trị, đẩy mạnh thâm canh tiêu tại các vùng Đông Nam Bộ), giữ ổn định diện tích từ 45.000 ha đến 50.000 ha và chỉ phát triển trên các vùng đất đƣợc xác định thích hợp cũng nhƣ khuyến khích nhân rộng mô hình sản xuất tiêu sạch (Bảng 2.3). 2.1.3.2. Tình hình tiêu thụ Nƣớc ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trƣờng tiêu thụ trong nƣớc hàng năm chỉ đạt khoảng 3.500 - 4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lƣợng tiêu dành cho xuất khẩu. Thị trƣờng tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996 - 6/2000) là các nƣớc: Mỹ, các nƣớc EU, Singapore. Bảng 2.1 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) Năm Số lƣợng (tấn) Thị trƣờng nhập 1996 1997 1998 1999 6 tháng đầu năm 2000 Tổng cộng 24.776 20.815 7.669 28.593 28.801 110.656 Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp, Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel, Hy lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000. 7 Bảng 2.2 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) Quốc gia 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Trung bình Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320 India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R. 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983 Brunei Darus 15 15 15 15 15 15 15 South Pacific 158 159 164 168 168 168 197 Fiji 140 145 145 150 150 150 176 Samoa 5 5 6 6 6 6 7 Micronisea 13 9 13 12 12 12 14 Latin America 51,774 30,615 26,427 25,303 21,940 21,690 29,625 Brazil 50,000 27,500 25,000 23,000 20,000 19,500 27,500 Mexico 894 2,395 734 1,363 1,000 1,250 1,273 Guatemala 360 370 380 380 380 380 375 Honduras 420 160 213 400 400 400 332 Saint Lucia 100 190 100 160 160 160 145 Africa 5,427 4,543 4,665 4,565 4,565 4,565 5,833 Madagasca 2,160 2,000 2,300 2,300 2,500 2,500 2,327 Malawi 1,000 900 700 700 700 700 900 Zimbabue 700 800 900 700 700 700 750 Benin 894 150 150 150 150 150 299 Kenya 200 300 400 300 300 300 300 Cote di Voire 100 100 100 100 100 100 100 Cameroon 63 63 65 65 65 65 64 Ethiopia 100 200 50 Zambia 30 30 50 50 50 50 43 Tổng 239,038 219,038 176,232 188,064 195,862 180,411 199,975 Nguồn: Proc. Peper Tech. Meet, 1997. 8 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn) Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000. Số thứ tự Hạng Mục Năm 1997 Năm 1998 Năm 1999 Diện tích Tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng Cả nƣớc 9777 6243 2.08 13007 12783 7609 2.09 15883 15641 8939 2.12 18970 A Miền Bắc 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 I Bắc TBộ 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 1 Nghệ An 279 226 0.70 158 279 230 0.70 161 284 230 0.75 172 2 Quảng Bình 181 149 0.64 95 199 153 0.48 73 209 156 0.55 86 3 Quảng Trị 842 702 0.70 491 1153 798 0.82 652 1284 870 0.80 696 B Miền Nam 8372 5090 2.40 12212 11029 6348 2.36 14951 13741 7602 2.36 17968 I DH Trung bộ 329 306 1.14 348 424 312 1.10 344 476 322 1.15 369 1 Quảng Nam 37 33 0.48 16 42 35 0.46 16 47 37 0.49 18 2 Bình Định 60 47 0.68 32 79 47 0.55 26 107 56 0.55 31 3 Phú Yên 97 97 1.92 186 166 105 1.91 201 186 115 1.95 224 4 Khánh Hòa 11 10 1.40 14 9 8 0.88 7 12 9 0.89 8 II Tây Nguyên 1712 999 1.63 1626 2492 1585 1.66 2638 3551 1833 2.00 3666 1 Gia Lai 303 128 0.70 89 695 238 0.75 179 1274 333 2.45 816 2 Đắc Lắc 1409 871 1.76 1537 1797 1347 1.83 2459 2277 1500 1.90 2850 III Đông Nam bộ 5893 3415 2.76 9412 7726 4080 2.75 11230 9115 5061 2.55 12925 1 Lâm Đồng 52 31 2.06 64 129 49 1.96 96 190 47 1.64 77 2 Bình Phƣớc 3437 704 10.06 7080 911 2100 3.78 7943 4816 2405 3.80 9139 3 Tây Ninh 245 185 1.25 231 298 240 1.63 391 495 263 1.82 478 4 Bình Dƣơng 244 138 2.21 305 249 143 2.30 329 262 145 2.30 334 5 Đồng Nai 52 520 0.92 480 611 428 1.07 457 630 430 1.07 461 6 Bình Thuận 270 150 1.93 289 656 291 1.65 480 850 496 1.71 846 7 BR-Vũng Tàu 996 565 1.38 780 1743 705 1.91 1349 1743 1150 1.22 1404 IV Đồng Bằng SCL 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 1 Kiên Giang 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 9 2.1.4. Tình hình bệnh trên cây tiêu Tiêu là một loại cây rất dễ bị bệnh, nhất là tại những vùng đã trồng tiêu lâu năm. Các bệnh chủ yếu thƣờng gặp trên cây tiêu gồm (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). 2.1.4.1. Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra Thành phần bệnh hại trên tiêu rất đa dạng và phong phú nhƣ: thán thƣ (Colletotrichum gloeosprioides), đen lá (Lansiondiplodia theobromce), đốm lá (Rosellina sp.), khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh chết nhanh dây tiêu (Phytophthora parasitica), bệnh chậm lớn cây lùn, bệnh tiêu điên và bệnh do tuyến trùng gây ra, chúng làm cho cây suy yếu, héo vàng rồi làm chết cây hay làm cho cây không phát triển. Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu thật sự là một tai họa cho nhà vƣờn, bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thƣờng làm tiêu chết hàng loạt gây mất trắng hay làm giảm năng suất trầm trọng. Bệnh thƣờng do nấm Phytophthora capsici sống trong đất gây ra, đôi khi còn kết hợp với các nấm khác nhƣ Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia solami cùng tấn công làm cây tiêu chết nhanh chóng. Bệnh thƣờng xảy ra trong mùa mƣa khi thời tiết ẩm (Trần Văn Hòa, 2001). Theo kết quả nghiên cứu của bộ môn Bảo Vệ Thức vật, Viện Kỹ Thuật Khoa Học Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên năm 1999 thì bệnh này xuất hiện với tỷ lệ thấp (0,11% ở Gia Lai), chƣa đƣợc coi là bệnh nguy hiểm cho cây tiêu ở vùng Tây Nguyên nhƣng đến năm 2000 - 2001 bệnh đã gây thành dịch ở một số vùng EaHLeo, Easup, CƣM’gar thuộc tỉnh Đắc Lắc. Ở tỉnh Gia Lai, vùng bị thiệt hại nặng là Mang Yang (Tạp chí thông tin khoa học kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp, số 1/2001). Từ khi cây tiêu rũ lá vàng và rụng hàng loạt chỉ trong 5 - 7 ngày. Bệnh lây lan rất nhanh, qua đất, qua nƣớc tƣới, cả vƣờn tiêu bị hại chỉ trong vòng vài tuần hay vài tháng. Khi thấy triệu chứng héo dây thì bộ rễ đã bị nấm tấn công trƣớc 1,5 - 2 tháng, do đó bệnh rất khó phòng trị (Trần Văn Hòa, 2001). Bệnh này hại hầu hết các bộ phận của cây tiêu: thân, rễ, lá, cổ rễ, trái. Bộ phận rễ và phần thân ngầm bị nấm tấn công thối đen, vỏ bong ra khỏi rễ, phần dây trên mặt đất bị héo, lá chuyển sang màu vàng và rụng hàng loạt trong 7 - 14 ngày, để lại cành trơ trụi và khô đi, sau đó toàn cây bị 10 héo đen và chết. Vào mùa mƣa bệnh xuất hiện ở lá dƣới những vòng nâu đen, tập trung ở đầu lá, các đốm lớn dần, có màu nâu sậm và rất dễ rụng. Đến nay chƣa có biện pháp hữu hiệu để trị nấm Phytophthora capsici khi đã bị xâm nhập vào cây tiêu. Khi bệnh đã biểu hiện thì không còn chữa trị đƣợc nữa, cho nên hiện nay phòng bệnh là biện pháp chủ yếu để làm giảm tối thiểu thiệt hại do nấm Phytophthora capsici gây ra. 2.1.4.2. Bệnh tuyến trùng Đây là bệnh thƣờng thấy ở các vƣờn tiêu. Triệu chứng ban đầu là cây tiêu bị vàng, sinh trƣởng kém, năng suất giảm dần, khả năng hút phân kém hẳn mặc dù trƣớc đó có bón phân đạm đầy đủ. Cây bị bệnh có rễ bị sƣng, bị thối từng phần một, rễ ngắn lại và thúi đầu chóp rễ, ít phát triển rễ phụ. Vào mùa nắng nếu bị tuyến trùng cây khô héo rất nhanh, cây rất dễ bị các bệnh khác tấn công do đó chết rất nhanh. Tác nhân gây bệnh gồm có: nhóm tuyến trùng nội ký sinh gây bệnh bƣớu rễ, phổ biến là hai giống tuyến trùng có tên là Meloidogyne arenaria và Meloidogyne incognita. Hai loại này đục lỗ chui vào trong rễ để sống, chích hút dịch cây làm cho cây không hút đƣợc thức ăn, cây khô héo tạo thành bƣớu rễ. Nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh chích hút rễ cây thƣờng gặp nhất là Pratylenchus, sống trong đất, chích rễ non hút chất dinh dƣỡnglàm cây suy yếu, mở đƣờng cho các loại vi sinh vật khác xâm nhập vào (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). Cách phòng trị tuyến trùng: có thể dùng Furadan để giới hạn bệnh 2.1.4.3. Bệnh khô đầu ngọn thối trái Bệnh này do Collextotrichum sp. gây ra làm cây ngƣng phát triển, các lá trên cùng úa vàng, trên lá và trái tiêu non xuất hiện những chấm và đốm đen làm lá, trái rụng sớm. Cây bị mất sức suy yếu (Plakidas A.G, 1954) 2.1.4.4. Bệnh vằn lá do virus Bệnh này do virus gây ra, trên lá nổi những vết xanh đậm xen kẽ với những đƣờng gân xanh nhạt bản lá bị cong, vẹo lại, rõ nhất là ở các lá non. Bệnh này thƣờng do rầy truyền từ cây bị bệnh sang. Khi cây bị bệnh này, tốt nhất là nhổ bỏ để 11 khỏi lây lan sang cây khác đồng thời phun thuốc diệt rầy để cắt môi giới truyền bệnh cho các cây còn lại (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). 2.1.4.5. Các bệnh do dinh dƣỡng bất thƣờng Phần lớn các triệu chứng thiếu dinh dƣỡng ở cây tiêu đều bắt đầu bằng sự đổi thành màu vàng nhiều hoặc ít ở các lá non, khoảng giữa các gân lá (Phan Hữu Thịnh và ctv, 1987) 2.1.5. Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế Tiêu là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao, do đó mà diện tích trồng tiêu của nƣớc ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng, nhất là trên các vùng đất ở miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Sự gia tăng qua các năm từ 1995 đến năm 1999 theo niên giám thống kê 1999 đƣợc ghi nhận ở bảng 2.4 Bảng 2.4 Năng suất và sản lƣợng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 Năm Diện tích (*1.000 ha) Năng suất (tấn/ ha) Sản lƣợng (*1.000 tấn) 1995 70,0 1,23 9,3 1996 7,5 1,4 10,5 1997 9,8 1,3 13,0 1998 12,8 1,24 15,9 1999 15,0 1,18 17,8 Năng suất bình quân trên 1 ha của Việt Nam là 1,24 tấn còn thấp so với một số nƣớc trồng tiêu trên thế giới. Vì tiêu là mặt hàng có giá trị cao so với các nông sản khác nên diện tích trồng tiêu của nƣớc ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng từ 9.800 ha năm 1997 đã lên 12.800 ha năm 1998 (niên giám thống kê, 1998). Tuy nhiên nhìn chung hiện trạng trồng tiêu của nƣớc ta đang gặp phải một số hạn chế phải đƣợc khắc phục, nhất là về vấn đề khâu giống trồng của nƣớc ta đã lâu đời, chƣa đƣợc phục tráng tuyển chọn để tìm ra các giống tốt ổn định về mặt năng suất và kháng sâu bệnh. Kỹ thuật chọn và sản xuất giống còn tự phát và đơn điệu. Còn kỹ thuật trồng dựa vào truyền thống là chủ yếu, truyền từ đời này sang đời khác, chƣa áp dụng đƣợc các tiến bộ khoa học kỹ thuật. Việc chăm sóc còn nhiều giới hạn nhƣ việc bón phân chƣa cân đối, thời kỳ bón chƣa hợp lý. Về mặt phòng trừ sâu 12 bệnh nông dân cũng chƣa quan tâm đúng mức, trong lúc đó bệnh là đối tƣợng nguy hại nhiều nhất cho tiêu (Trần Văn Hòa, 2001). Từ đó, vấn đề cây tiêu ngày càng đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm hơn đặc biệt là vấn đề giống. Để tạo ra giống tiêu đạt yêu cầu về mặt năng suất cũng nhƣ phòng trừ sâu bệnh thì phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc quan tâm nhiều hơn cả. Trong đó, phƣơng pháp tạo phôi vô tính cây tiêu nhằm nhân nhanh giống và tạo ra giống tiêu sạch bệnh để đáp ứng nhu cầu thực tế của các nhà sản xuất. 2.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora Phytophthora (Gr. Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại), đƣợc đặt bởi Bary (1876). Nấm Phytophthora là loại khá phổ biến của lớp Oomycetes thuộc họ Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thƣớc không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốm hoặc không có nuốm, không màu, trong suốt. Bào tử hình cầu hoặc hình thận có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nƣớc, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trƣởng và phát triển từ 25 - 30oC, pH 6 - 7. Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới – điển hình nhƣ bệnh mốc sƣơng mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những năm 1840, nguyên nhân do nấm P. infestans (Bourke, 1964). Bệnh Phytophthora đã đƣợc nghiên cứu sâu tại Châu Âu. Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; nhƣ bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái. Nấm P. palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen vỏ cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu. Trên cây tiêu dòng nấm Phytophthora gây hại đƣợc xác định là nấm Phytophthora capsici gây hại chủ yếu trong mùa mƣa, nhất là vào cuối mùa mƣa khi có khí hậu ấm và ẩm. Nấm Phytophthora sp. có thể tấn công riêng lẻ nhƣng đa số có sự kết hợp với các nấm khác nhƣ Fusarium, Pythium và Rhizoctonia. 13 Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P. palmivora, P. paracitica (P. nicotianae) và P. citrophthora là đặc trƣng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P. infestans, P. syringae và P. fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp. tấn công trên cây tiêu thƣờng xảy ra trong mùa mƣa, khi có khí hậu nóng và ẩm. Bệnh xảy ra trên những vƣờn thoát nƣớc kém, đất bị úng nƣớc hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát triển. Nấm Phytophthora sống trong đất dƣới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất. Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm (mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores). Các động bào tử chỉ phóng thích ra ngoài bào tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nƣớc hoàn toàn. Khi ra ngoài các động bào tử dùng roi (flagella) bơi tới các rễ cây để gây bệnh hay bơi theo dòng nƣớc mƣa để tới các nơi khác trong vƣờn, làm bệnh lây lan rất nhanh. Vƣờn bị ngập úng nƣớc càng lâu thì áp lực bệnh càng lớn. Ngoài ra tuyến trùng cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển, tuyến trùng xâm nhập vào rễ tạo vết thƣơng hở cho nấm xâm nhập vào gây bệnh (Trần Văn Hòa, 2001). 2.3. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật 2.3.1. Khái niệm bức xạ Bức xạ là sự phát năng lƣợng vào môi trƣờng dƣới dạng tia (tia bức xạ). Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đƣờng đi đều coi là tia ion hóa. Tia ion hóa đƣợc chia làm 2 loại: Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ). Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron. (Cục kiểm soát và An toàn Bức xạ, 2005). 14 2.3.2. Bức xạ Gamma Bức xạ gamma là bức xạ điện từ. Nó đi đƣợc khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh. Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tƣơng tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp. Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tƣợng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể. Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lƣợng của bức xạ gamma theo hàm mũ. 2.3.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) Coban (Co 60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học. Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị. Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn. Nguồn Co60 hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhƣng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao. Nhiều sinh vật sống (kể cả ngƣời) phải cần đến một lƣợng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại. Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12. Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ. Tên này do những ngƣời thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trƣờng. 2.3.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thƣơng bức xạ ở mức phân tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật. Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật có những biến đổi về hóa học. Khi bị tác động thì gene bị biến đổi. Tùy theo mức độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau. Sau khi nhận năng lƣợng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:  Giai đoạn hóa lý Giai đoạn này rất ngắn (10-13 - 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa. 15 Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thƣơng các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thƣơng đến chức năng của tế bào. Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nƣớc trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ nhƣ các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác. Khi số tế bào bị hại, bị chết vƣợt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hƣởng đến cơ thể sinh vật. Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng nhƣ enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thƣơng, ngƣời ta gọi đó là những tổn thƣơng hóa sinh  Giai đoạn sinh học Nếu những tổn thƣơng hóa sinh không phục hồi đƣợc, những tổn thƣơng chuyển hóa dẫn đến những tổn thƣơng hình thái và chức năng. Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa. Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ. 2.3.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau: Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tƣợng đột biến nhiễm sắc thể. Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới. Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau: Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi: Làm biến tính base trên DNA nhƣng không phá hủy DNA. Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide. Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tƣơng xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA. 16 Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi: Tạo các chất tƣơng tự base của DNA. Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base. Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các b