Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng (Phyllophaga crinita)

ùng các thực khuẩn thể này để bảo vệ cây không bị một số vi khuẩn (Fulton, 1950; Stolp, 1956; Cross, 1959); và những nghiên cứu về các vi sinh vật khác như hoàn thiện phương pháp nuôi côn trùng vật chủ và các thiên địch của chúng (Hagen và Franz, 1973), ong mắt đỏ Tricogramma (Schepetilnikova, 1974), ong ăn lá Diprion herlyniae (Sommonds và ctv, 1976). Trong thời kỳ này, các nhà côn trùng học đã biết lợi dụng thiên địch tại chỗ trong phòng chống côn trùng hại với những biện pháp bảo vệ thiên địch trong tự nhiên: phun thuốc theo băng, dùng thuốc có thời gian tác dụng ngắn, chuẩn bị nơi qua đông cho chim ăn sâu,… (Coppel và ctv, 1977; Telenga, 1959). Bắt đầu từ thập kỷ 50, cùng với những phát hiện các nấm chuyên tính để trừ cỏ dại: nấm Colletotrichum xanthii trừ cỏ Cuscuta (Leach,1946) và trừ cỏ Xanthium 19 spinosum (Butler, 1951), nấm Alternaria cuscuta (Simmonds và ctv, 1976); thiên địch để trừ cỏ dại được nhập nội taị các nước phát triển (Australia, Canada, Hoa Kỳ,…) lẫn các nước đang phát triển (Nevis, Kenya, Tanzania, Chile,…) (Julien, 1992). Những dẫn liệu về cơ sở khoa học của biện pháp sinh học trừ bệnh hại cây trồng xuất hiện nhiều trên các bào chí khoa học, Stout (1950) tìm thấy một chủng yếu virus gây bệnh khảm ở đào, cây bị nhiễm virus này chỉ gây triệu chứng bệnh rất nhẹ, và cây vẫn có triệu chứng bệnh rất nhẹ khi bị nhiễm chủng mạnh của chính virus đó. Gramann (1950) cũng quan sát thấy hiện tượng tương tự ở nhóm virus X của khoai tây (Snyder, 1976). Như vậy khi nhiễm virus có độc tính gây bệnh yếu cho cây, cây sẽ chống lại được các chủng có độc tính gây bệnh cao. Ngoài ra nấm ký sinh nấm cũng được thực hiện nghiên cứu bởi Aytoun (1953), Boosalis (1954, 1956), Butler (1957). Côn trùng ăn tuyến trùng thực vật cũng được chú ý đến bởi Aguilar (1944), Brown (1954), Hutchinson và ctv (1960),… Một số nhà khoa học phê phán biện pháp hóa học, nghiện cứu biện pháp hóa học với biện pháp sinh học: dùng thuốc có tác dụng chọn lọc, giảm nồng độ, giảm số lần dùng thuốc, chọn thời gian dùng thuốc thích hợp (Michelbacher, Bacon, 1952; Smith, Allen, 1954; Bartlett, 1956). Năm 1959, khuynh hướng sinh thái với các nguyên lý sinh thái học được hình thành và chấp nhận trong bảo vệ thực vật. 2.2.1.4 Giai đoạn phát triển từ năm 1960 đến nay Do yêu cầu phải bảo vệ môi trường, những nhà khoa học phải tăng tốc tìm kiếm những biện pháp bảo vệ thực vật không độc hại, không nguy hiểm cho sức khỏe con người và môi trường sống. Và biện pháp sinh học đã, đang và sẽ là một nhóm biện pháp cần được tập trung tìm kiếm, nghiên cứu trên thế giới. Các lĩnh vực nghiện cứu về biện pháp sinh học được mở rộng và đạt được nhiều thành công. Biện pháp sinh học được coi là biện pháp quan trọng, là cốt lõi của phòng trừ tổng hợp địch hại. 2.2.2 Vai trò của chế phẩm sinh học Theo thống kê của tổ chức Lương - Nông Thế Giới cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với 100 loài sâu hại khác nhau,10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Quả là 20 một lực lượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất cho mùa màng. Hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên thế giới bị mất trắng. Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó ra đời nền công nghiệp hóa học thuốc trừ sâu, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Cho đến nay không ai có thể phủ nhận vai trò tích cực của thuốc hóa học trừ sâu bệnh hại cây trồng. Có thể nói không một biện pháp bảo vệ mùa màng nào hơn biện pháp hóa học về mặt hiệu quả và qui mô. Nhưng biện pháp hóa học cũng có mặt hạn chế của nó. Người ta đã biết quá nhiều trường hợp ô nhiễm môi trường khi dùng chất diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu hóa học, làm cho người bị ngộ độc , súc vật bị chết và cả hệ sinh vật đi kèm quanh cây trồng cũng bị ảnh hưởng. Cân bằng sinh thái bị phá hủy nghiêm trọng. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm bị phân hủy và có thể giữ tác dụng của mình rất lâu trong đất (ví dụ DDT giữ được 25 năm). Như vậy các hợp chất này được tích lũy trong đất và nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đặc biệt nghiêm trọng hơn là sự tùy tiện về liều lượng và thời gian phun thuốc hóa học chồng sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc không cho phép trên các loại rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm rất tai hại cho sức khỏe con người. Trước thực trạng này, con người không chịu bó tay. Những cuộc tìm kiếm, thử nghiệm các biện pháp mới để phòng chống sâu bệnh đã được tiến hành và cuối cùng cũng thu được những kết quả rất khả quan. Cũng từ đó các chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh cho cây trồng có nguồn gốc sinh học được ra đời. Thoạt tiên người ta chỉ chú ý đến những loài côn trùng có lợi cho đấu tranh sinh học như bọ xít, bọ rùa, ong kí sinh… Sau một thời gian người ta lại phát hiện được vai trò tích cực của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của sinh quần. biện pháp sinh học được hoàn thiện thêm dần khi người ta sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng. Ở nhiều nước, chế phẩm sinh học được sản xuất ở qui mô lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác phòng trừ sâu bệnh cho hàng triệu hecta cây trồng và cây rừng. Có thể nói biện pháp đấu tranh sinh học bằng vi sinh vật đã thực sự trở thành một nội dung quan trọng của hệ thống phòng trừ sâu bệnh tổng hợp. 21 2.2.3 Tính ưu việt của chế phẩm sinh học - Không gây độc hại cho người động vật và cây trồng; có khả năng tiêu diệt một cách chọn lọc các loại sâu bệnh. Người ta nói chúng có tính đặc hiệu cao trong việc tiêu diệt các loại côn trùng. Trong khi đó, thuốc trừ sâu hóa học gây độc cho người, gia súc nếu tiếp xúc lâu dài, một số là tác nhân gây ung thư. Do không độc hại đối với con người, lại không ảnh hưởng xấu đến khu hệ sinh vật quanh hệ rễ của cây trồng , nên chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh vật không phá vỡ cân bằng hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường sống. - Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu bệnh cho đến nay chưa phát hiện được hiện tượng “lờn thuốc” ở các loại côn trùng. Đó là điều rất đáng được quan tâm, vì ở các thuốc hóa học trừ sâu bệnh, do đã được sử dụng lâu dài trước nay và việc sử dụng còn quá tùy tiện nên hiện nay tính lờn thuốc xuất hiện ngày một nhiều ở các loại sâu bệnh, bắt buộc người ta phải nâng dần nồng độ sử dụng lên mà hiệu quả lại cứ giảm dần. - Con người đã và đang nghiên cứu mở rộng tác dụng của chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh vật bằng nhiều biện pháp. Một trong những biện pháp đó là thực hiện chuyển các gen chi phối việc tạo tính độc đối với côn trùng gây hại sang cho nhiều loại cây trồng, tạo nên những cây trồng tự nó có khả năng kháng được các loại sâu hại. Đây là tác dụng mà những chế phẩm thuốc trừ sâu hóa học không thể có được. - Các chế phẩm sinh học diệt côn trùng có nguồn gốc vi sinh vật khác với các hợp chất hóa học trừ sâu hại bởi bản chất sống của nó, tức nó chứa các nhân tố gây bệnh, làm chết côn trùng là những sinh vật sống. Do vậy việc bảo quản và xử lý các chế phẩm này ngoài đồng ruộng cũng có những yêu cầu khác biệt so với các hợp chất trừ sâu hại. Một hiện tượng tự nhiên tạo thuận lợi lớn cho con người sử dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc vi sinh vật để diệt sâu hại là khi phun ra ngoài thiên nhiên, các vi sinh vật trong chế phẩm đều có khả năng thích nghi cao, hội nhập vào tự nhiên một cách khá thuận lợi để có thể tham gia vào các hoạt động đấu tranh sinh học một cách khá tích cực. Cụ thể khi ta phun chế phẩm lên một loại cây trồng nào đó, các vi sinh vật trong chế phẩm (ví dụ như vi khuẩn, nấm…) đều 22 có khả năng trở thành một thành viên trong sinh quần nơi đó, và chúng tự sinh sôi nảy nở tăng lên về số lượng. - Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể nhiễm lên côn trùng bằng nhiều cách khác nhau: bằng con đường tiêu hóa (ở vi khuẩn), qua da, tầng cuticum (ở nấm)… Điều đó cho phép tăng cường khả năng nhiễm thành công của vi sinh vật vào côn trùng. - Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt…) ở nhiều dạng khác nhau: dạng bào tử (vi khuẩn thuộc giống Bacillus), dạng hạch nấm hay giả hạch nấm (các giống nấm Beauveria, Metarhizium). - Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên của các giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong việc tăng cường lây lan tạo thành dịch bệnhở côn trùng. Ở một số nấm có khả năng bắn bào tử của nó tới một nơi có khoảng cách gấp ngàn lần kích thước của bào tử. Ngoài ra một số nấm, vi khuẩn, virus còn có thể được lan truyền rộng, nhờ dòng không khí, nước mưa và côn trùng… Với những đặc điểm sinh học như trên, các vi sinh vật diệt côn trùng có thể xuất hiện bất ngờ, với một tốc độ nhanh, mang tính chất một ổ bệnh, dẫn đến gây chết côn trùng trên một địa bàn rộng. Do vậy giúp bảo vệ cây trồng có hiệu quả đáng kể. 2.2.4 Các bước áp dụng biện pháp sinh học  Bảo tồn và gia tăng khả năng hoạt động của quần thể thiên địch sẵn có trên đồng ruộng và trên những cánh đồng lân cận. Sự bảo tồn thiên địch sẵn có trên đồng ruộng là tối cần thiết. Những thiên địch sẵn có trên đồng ruộng thường đã thích nghi với con chủ và với môi trường của chúng, vì vậy bảo vệ chúng những biện pháp canh tác thích hợp là một biện pháp sinh học tốt hơn so với biện pháp nhân nuôi đắt tiền những thiên địch địa phương và nhập nội để thả vào đồng ruộng.  Tặng nhanh quần thể thiên địch địa phương bằng cách nhân nuôi và thả thiên địch vào đồng ruộng. Thu nhập, nhân nuôi và thả các sinh vật ăn mồi và ký sinh: 23 Điều này có tiến hành bằng cách thu thập ký sinh và sinh vật ăn mồi ở những nơi mà mật số của chúng cao để chuyển tới nơi mà mật số cuả chúng thấp. Ký sinh và sinh vật ăn mồi cũng có thể được nhân nuôi, nhưng việc nhân nuôi ở nước ta hiện nay chưa phát triển.  Sử dụng những vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng để phòng trừ sâu hại. Những vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng trong tự nhiên như: vi khuẩn, nấm, siêu vi khuẩn, tuyến trùng là những tác nhân sinh học quan trọng giúp cho việc hạn chế quần thể sâu hại. Trong những loài vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng này nấm trắng và nấm xanh đóng một vai trò quan trọng và đặc biệt các chế phẩm từ các nấm này đã được Viện Lúa ĐBSCL sản xuất ra hàng loạt với số lượng lớn. 2.2.5 Một số chế phẩm sinh học diệt côn trùng hiện nay  Chế phẩm có nguồn gốc vi khuẩn : Agritol (Hoa kì), Bathurin (Tiệp Khắc), Entobakterin (Nga), Japidemic (ở Nhật), Doom (ở Hoa Kì).  Chế phẩm có nguồn gốc từ nấm; Beauverine (Hoa Kì).  Chế phẩm có nguồn gốc từ virus: Biotrol VHZ, Vinex, Viron H, Polyviocide. 2.3 Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae 2.3.1 Nấm kí sinh côn trùng Cũng như vi khuẩn, nhiều loài nấm có quan hệ cộng sinh hoặc hoại sinh với côn trùng, trong đó có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tượng bệnh lý và dẫn đến hủy diệt côn trùng. Nấm gây bệnh cộn trùng có ý nghĩa rất lớn vì có thể gây chết thường xuyên với tỷ lệ chết cao cho nhiều loài côn trùng hại và là những tác nhân điều hòa tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thường, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng. Cơ thể côn trùng bị chết do nấm không bị tan rã, mà thường giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm. Hầu hết nấm gây bệnh côn trùng là Phycomycetes và Deuteromycetes (nấm bất toàn). Bào tử của các nấm này tấn công bên ngoài hoặc bên trong ruột côn trùng. Sau đó bào tử nẩy mầm và sợi nấm xâm nhập vào xoang dịch côn trùng. Cái chết có thể là kết quả của sự sản sinh độc tố của nấm hoặc sau khi sử dụng dịch cơ thể. Tiếp theo các chất dự trữ ở cơ thể côn trùng sẽ được sử dụng, hệ sợi chết và sự 24 hình thành bào tử bắt đầu, còn sinh khối dư sẽ hoạt động như một điểm gây nhiễm sau. Bảng 2.1 Bảng tra phổ tác động của nấm bất toàn trên động vật chân đốt. Loài Côn trùng mục tiêu Aschesonia aleyrodis Beauveria bassiana Beauveria brongniartii Hirsutella thompsonii Metarhizium anisopliae Nomuraea rileyi Verticilium lecanii White fly Colorado beetle Cockchafer Rust mites Bọ cánh cứng, rệp Catepillars Aphids, Whitefly (Nguồn file: ///C/user/THUAN/Fun_Bio.htm) Tác dụng gây bệnh của nấm trên côn trùng là bào tử nẩy mầm, xâm nhập vào cơ thể và sinh sản trong xoang làm yếu và phá hoại chức năng trao đổi chất của côn trùng.  Nhờ gió, mưa bào tử nấm lây lan đến sâu khỏe, gặp điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp phình lên nẩy mầm thành ống mầm, ống mầm tiếp xúc với da côn trùng mà hình thành vòi bám. Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 – 3lần bào tử, có dịch nhầy để dính vào da. Vòi bám hình thành sợi nhỏ chọc thủng da. Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn. Sợi ngắn nhờ áp lực đẩy vào lớp trong cuối cùng đạt đến da thật. Nếu côn trùng lột xác chúng lại hình thành vòi bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm. Nấm thông qua áp lực cơ giới để xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng và nhờ tác dụng của enzyme phân giải mà chọc thủng biểu bì. Những enzyme phân giải là proteaza, lipoaza và kitinaza. Muốn da phân giải hết trước hết là nhờ proteaza rồi lipoaza, cuối cùng mới có tác dụng của kitinaza. Nấm gây bệnh cứng sâu tổng hợp rất nhiều enzyme. Mỗi loài nấm khác nhau sẽ hình thành các enzyme khác nhau nhưng chúng đều có thể tự tạo ra enzyme kitinaza. 25  Sự thay đổi bệnh và sự rối loạn chức năng trong cơ thể côn trùng. Sự sinh sản trong cơ thể côn trùng là cho hoạt động trao đổi chất, các cơ quan mô bị phá hoại, mất chức năng sinh lý và phát sinh sự rối loạn. Trước hết là sợi nấm trong xoang sinh trưởng phát triển. Khác với virus và động vật nguyên sinh, nấm phải tiết các chất độc và enzyme để giết chết vật chủ rồi sinh trưởng phát triển trên xác côn trùng, hình thành các hạch nấm làm cho côn trùng cứng lại, một số loài nấm không tiết chất độc mà sinh sản hàng loạt trong cơ thể côn trùng mà sau khi sâu chết mới làm vỡ và biến dạng các cơ quan. Hầu hết chúng có tính xu mỡ, tập trung quanh cơ quan thể mỡ, sau khi sâu chết chúng mới làm biến đổi thể mỡ. Nấm xâm nhập vào cơ thể côn trùng luôn luôn xuất hiện phản ứng biến màu đen, hình thành các đốm đen. Sự hình thành các đốm đen là do enzyme phenoloxydaza trong dịch thể côn trùng. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử limfa trong máu. Do sinh sản nhiều nấm sẽ làm tắc hệ tuần hoàn côn trùng; gây đói sinh lý tế bào vật chủ; chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm mất đi và làm rối loạn cơ năng sinh lý. Chúng sẽ biểu hiện hô hấp thất thường, giảm sức sinh sản, ức chế sự lột xác. Nhộng ngài tằm trời sau khi bị bệnh nấm mốc sâu tiêu hao lượng oxy xuống 7 lần; sâu non bọ lá khoai tây sau khi bị bệnh nấm bạch cương cường độ hô hấp tăng lên nhiều lần. Phần lớn đều cho rằng sự hô hấp này là do tác dụng phản ứng của vật chủ đối với vật gạy bệnh. Sau khi tiêm chất độc của nấm cho sâu non chúng thường biểu hiện thay đổi biến thái của sâu và ức chế quá trình lột xác, cuối cùng làm cho sâu chết. Sử dụng nấm bạch cương nhiễm vào nhiều loài sâu hại, chúng đều giảm sức sinh sản rõ rệt. Ngài đục táo, mọt cà phê sau khi phun chế phẩm nấm bạch cương tỷ lệ đẻ trứng của con cái giảm xuống 45 – 60%.  Phân loại nấm gây bệnh côn trùng Nấm gây bệnh côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt trong cả 4 lớp nấm: 26 Nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deuteromycetes. Lớp Nấm bậc thấp Phycomycetes: Trong lớp nấm này. Các loài ký sinh trên côn trùng tập trung ở 3 bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng như Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. Những giốn nấm ký sinh sôn trùng quan trọng của lớp nấm bậc thấp là: Coelosporidum, Chytriopsis (bộ Chytridiales), Coelomomyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ Entomophthorales). Lớp nấm túi Ascomycetes: Trong lớp nấm túi có bộ Laboulbiniales là những nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loại nấm khác đều là nội ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là: Cordiceps, Aschersonia (bộ Hypocreales). Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm chỉ có hai giống có các loài gây bệnh trên côn trùng. Đó là giống Septobasidium và Uredinella. Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn các loài nấm bất toàn ký sinh côn trùng đều thuộc bộ Moniliales. Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicarina, Metarhizium, Cephalosporiuma và Solosporella chứa các loài khi xâm nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định. 2.3.2 Nấm Metarhizium anisopliae Bảng 2.2 Bảng tra các loài trong chi nấm lục cương như sau: 1 Bào tử phân sinh hình ống hoặc trứng, giữa lõm, hai đầu bằng, khuẩn lạc màu xanh lá cây, màu đen nhạt hoặc xanh đồng thau 1’ Bào tử hình bầu dục, hai đầu tròn hoặc một đầu bằng, khuẩn lạc màu xanh vàng nhạt hoặc vàng nâu Nấm lục cương lục vàng (M.Flavoviride) 2 Bào tử phân sinh dài 3,5 – 9µm Nấm lục cương bọ hung bào tử ngắn (M.anisopliae var.ansopliae) 2’ Bào tử phân dài 9 – 18µm Nấm lục cương bọ hung bào tử dài (M.anisopliae var.major). (Theo Trần Văn Mão năm 2004) 27 2.3.2.1 Phổ kí chủ của nấm Metarhizium anisopliae Cho đến nay người ta đã biết được trên 70 loài côn trùng bị nấm này tiêu diệt, trong số đó có tới 34 loài côn trùng cánh cứng và chỉ có 5 loài côn trùng cánh vảy. Một số loài côn trùng điển hình mẫn cảm với nấm này là: - Melolontha melolontha - Melolontha hippocastanei - Anisopliae autriaca - Oryctes rhinoceros - Otiorrhychus ligustici - Plusia gamma 2.3.2.2 Tác động của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể côn trùng Nấm lục cương sau khi rơi trên bề mặt của côn trùng trong khoảng 24 giờ sẽ nảy mầm, tạo thành ống mầm chui xuyên qua vỏ của côn trùng, sau đó tiếp tục phân nhánh tạo thành một mạng sợi nấm chằng chịt trên khắp bề mặt của cơ thể côn trùng. Lúc này ngoại độc tố được tiết ra sẽ tác động lên côn trùng khiến cho côn trùng chết. 2.3.2.3 Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium anisopliae Các độc tố diệt côn trùng do nấm sinh ra không phải là enzyme, có trọng lượng phân tử thấp, các sản phẩm này có thể giết chết côn trùng ngay cả khi hiện diện với nồng độ thấp. Độc tố diệt sâu của nấm bao gồm nhiều ngoại độc tố có tên là destrucin A, B C và D. Destrucin A và B có thể tách từ dịch nuôi cấy nấm lục cương. Destrucin A có công thức nguyên là C29H47O7N5, điểm sôi 188 oC (Theo A. Suzuki và những cộng sự 1966, 1970). Destrucin B có công thức nguyên là C30H51O7N5, điểm sôi 234 o C (Theo Tamura, 1965). Đó là những depsipeptid vòng. 2.3.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của M.anisopliae - Không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có kitin. - Sống được ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất bào tử đính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). 28 - Ở dưới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. - M. anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, celluloza và kitin (lông và da côn trùng). 2.3.2.5 Các dạng nấm Metarhizium anisopliae Theo Tulloch (1976), nấm Metarhizium anisopliae có 2 dạng: Metarhizium anisopliae var. major có bào tử dài, Metarhizium anisopliae var. anisopliae có dạng bào tử ngắn. Ngoài ra, Metarhizium anisopliae var. anisopliae Tulloch khác Metarhizium anisopliae var. majus Johnston về hình thái học và phạm vi kí chủ. - Metarhizium anisopliae var. anisopliae thông thường kí sinh bọ cây, sâu ăn lá, bọ xít đen hại lúa Scotinophara sp. Và các dạng côn trùng hại lúa khác. Nó có thể hại nhiều côn trùng trên lúa và bọ nhảy. Thể bình dạng hình trụ, kích thước 6 – 13 x 2 - 4 m gắn vào cuống bào tử đính khỏe trên hệ sợi nấm màu trắng. Bào tử đính hình trụ đến hình elip rộng hay dạng tròn, kích thước 4,5 – 8,5 x 2,5 - 4 m và tạo thành những chuỗi khô dài song song có dạng bột màu xanh tối đến xanh vàng. Nấm này nhìn thấy trong môi trường thuần cũng giống như trên côn trùng. - Metarhizium flavoviride kí sinh trên ấu trùng bọ vòi . Điển hình là Metarhizium flavoviridevar. minus kí sinh trên bọ cây và sâu ăn lá lúa ở Philippines và Solomon Anh. Thể bình hình dùi trống, kích thước 9 – 15 x 3 – 4 m gắn vào cuống bào tử đính trên hệ sợi nấm màu trắng. Bào tử đính hình elip, kích thước 4,5 – 7,5 x 2 - 3 m và tạo thành những khối bào tử màu xanh hơi xám. - Metarhizium album kí sinh sâu Cicadellid Cofana spectra và sâu ăn lá ở Philippines và Indonesia. Cuống bào tử đính dài 80 m, có sự phân nhánh mọc vòng gần chóp đỉnh. Mỗi nhánh sinh ra 2 – 5 thể bình hình trụ đến hình dùi trống. Bào tử đính hình trụ, dài 8 -11 m. 29 2.4 Các nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới 2.4.1 Các nghiên cứu trong nước Năm 1996, Phạm Thị Thùy đã thử nghiệm chế phẩm nấm xanh trên rầy nâu hại lúa Nilaparvata lugens tuổi 2 – 3, sâu đo xanh hại đay Anomis flava tuổi 3 và châu chấu sống lưng vàng Pratanga succineta trưởng thành. Khi thử nghiệm chế phẩm nấm xanh trong phòng thí nghiệm, tỷ lệ rầy chết 65% – 80% sau 10 ngày phun ở nồng độ 6 x 108 bào tử/ml, sâu chết 60%–70% sau 7 ngày phun ở nồng độ 5 x 108 bào tử/ml, châu chấu chết 36.5% - 96.7% sau 10 ngày – 15 ngày phun ở nồng độ 5 x 10 9 bào tử/ml. Phạm Thị Thùy cũng đã thử nghiệm chế phẩm nấm xanh ngoài đồng ruộng cho kết quả như sau: Trên rầy, tỷ lệ sùng chết 50% - 60% sau 10 ngày phun ở nồng độ 5 x 1013 bào tử/ha; trên sâu, tỷ lệ sùng chết 7.3% – 79.5% sau 7 ngày–10 ngày phun; trên châu chấu, tỷ lệ sùng chết 78.1% – 79.2% sau 35 ngày phun Năm 2000, lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thùy đã sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium anisopliae có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre trong phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngoài đồng. Năm 2002, Nguyễn Thị Lộc dùng chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae thử nghiệm trên rầy nâu, bọ xít hôi, sâu cuốn lá nhỏ gây hại ở lúa. 2.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới 1968, Veen đã sưu tập tài liệu trên 200 loài côn trùng bị ký sinh bởi Metarhizium anisopliae trong đó Metarhizium Species - Metarhizium anisopliae, “nấm nho xạ xanh” thường gây bệnh cho côn trùng hại cây trồng. Năm 1978 và năm 1981, Ferron thảo luận về sinh thái học và thực tế sử dụng của Metarhizium anisopliae. Nấm này được sử dụng ở Brazil để phòng trừ spittlebugs của ve sầu vảy như Mahanarva postica (Wlk.) trên bọ cánh lớn. Năm 1986, qua một vài thử nghiệm trong việc sử dụng Metarhizium, Rombach đã đưa ra kết luận dịch bệnh của Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviridae có thể được bắt đầu trong việc bộc phát sâu đục thân bởi dấu hiệu ứng dụng bào tử. 30 Qua thí nghiệm kiểm tra nấm Metarhizium anisopliae lặp lại trên Sogatodes oryzickola (Muir), của Albonoz và Parada (1984), tỷ lệ chết 100% ở nồng độ 109 bào tử/ml và tỷ lệ chết chỉ đạt 50% ở nồng độ 107 bào tử/ml. Năm 1987, Aguda đã tiến hành thử nghiệm với hệ sợi nấm Metarhizium anisopliae khô. Kết quả 3 tuần sau khi phun thuốc, tỷ lệ chết vượt quá 80%. Năm 1991, Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% tại Australia. 31 Chƣơng 3 VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP Thời gian tiến hành: từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 7 năm 2005. Địa điểm nghiên cứu: Phòng 118, phòng kiểm dịch côn trùng và phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.1 Nuôi sùng trắng  Nguồn sùng trắng Sùng trắng được lấy từ trại phân của khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm thành phố HCM và ở Tiền Giang Phân trộn đất lấy tại trại phân nơi sùng sống. Sơ dừa.  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ cần thiết như hộp nuôi sùng, khay nhựa và vật tư trong phòng côn trùng.  Điều kiện nuôi Nhiệt độ: Sùng được nuôi ở nhiệt độ phòng (28oC). Độ ẩm: độ ẩm của môi trường tương đối giống với môi trường sống của sùng trong tự nhiên.  Tiến hành - Chuẩn bị hộp nuôi: hộp tròn hình trụ có đường kính đáy 10cm, đường kính miệng hộp 12cm, chiều cao hộp 12cm. Mỗi hộp nuôi 1 con sùng. - Cho môi trường đất phân vào hộp với độ cao hỗn hợp khoảng 8cm. Sau đó thả sùng vào. Cứ 2 tuần thì thay môi trường cho sùng một lần. Chúng ta có thể tăng cường dinh dưỡng cho sùng bằng cách thêm vào hộp nuôi một lát cam hoặc táo vào mỗi lần thay môi trường. Trong trường hợp môi trường quá khô thì ta có thể phun nước để độ ẩm của môi trường không khác biệt với môi trường sống của sùng trong tự nhiên. 32 3.2 Nhân giống nấm Metarhizium anisopliae  Nguồn nấm Nấm Metarhizium anisopliae với các dòng BDLA8, BDTN15, BXĐTV3, BXDLA8, RBC-Q9-3, SCLLLA4, Ma2, Ma11, Ma13 được phân lập từ bọ dừa, bọ xít đen ở Long An, bọ dừa ở Tây Ninh, rầy bông cúc ở quận 9, sâu cuốn lá lúa ở Long An, bọ xít đen ở Trà Vinh và chế phẩm Ma của Viện Luá Đồng Bằng Sông Cửu Long (CP MA).  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ và vật tư cần thiết trong phòng thí nghiệm như que cấy, dụng cụ cắt thạch, mũi mác, bịch nylon, đĩa petri, bình tam giác, buồng đếm hồng cầu, tủ sấy, máy lắc, nồi hấp autoclave, cân phân tích, bếp điện, khay nhựa và các dụng cụ khác. Các hoá chất cần thiết như glucose, agar,… - Môi trường nuôi cấy: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar): Khoai tây: 200 g Agar: 15 g Đường:20 g Nước cất: 1000 ml Môi trường lỏng: Bã bia: 20 g Glucose: 20 g Nước cất: 1000 ml Có thể thay glucose bằng mật rỉ. - Môi trường nhân giống Môi trường cơm  Qui trình lên men xốp nhân giống Metarhizium anisopliae Có thể sử dụng phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm vi sinh vật diệt sâu, côn trùng có hại từ vi nấm, trong đó sau khi bổ sung dịch dinh dưỡng vào các cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, cám, gạo, lúa, mày ngô,… người ta tiến 33 hành nhiễm giống nấm và cho lên men. Khi sinh khối nấm đạt cực đại tiến hành thu hồi sinh khối, xử lý và tạo sản phẩm chứa cả bào tử và hệ sợi nấm. Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm diệt sau và côn trùng gây hại  Tiến hành - Chuẩn bị môi trường: rửa sạch gạo, ngâm trong nước cất, để qua đêm. Sau đó hấp môi trường ở 121oC trong 30 phút. Hai ngày sau hấp lại cũng ở 121oC trong 30 phút. Để môi trường qua 1 đêm rồi cấy nấm vào. Môi trường dịch thể, lắc 200 vòng/phút, nuôi to = 28 – 30oC Môi trường xốp trong bình 250 ml, nuôi 4 – 5 ngày ở to = 28 – 32oC Môi trường xốp trong chậu thủy tinh so sánh (khử trùng 100oC trong 30 – 40phút) + 10% giống. Nuôi 10 ngày ở toC = 28 – 30 oC. Độ ẩm khoảng 90 – 95%. Làm khô ở nhiệt độ phòng. Có quạt. Độ ẩm 10% hoặc sấy ở 40oC. Nghiềm nhỏ. Đóng bao nhãn. Kiểm tra chất lượng. Bảo quản ở 5 – 10oC trong tối và sử dụng. Ống giống 5 – 7 ngày 34 - Chuẩn bị nấm: Nấm Metarhizium anisopliae 6 ngày sau khi cấy trên môi trường PGA, khi tảng nấm đã phát triển. - Cấy nấm Nấm 6 ngày sau khi cấy trên môi trường PGA từ đĩa petri được băm nhuyễn rồi cho vào bình tam giác chứa 75 ml môi trường. Sau đó đem lắc 170 vòng/phút ở 28 OC trong 3 ngày để chuẩn bị nhân nấm trên môi trường xốp (môi trường cơm). Cho một ít môi trường cơm đã chuẩn bị vào bịch nylon. Hút 5ml dịch nấm trong bình tam giác cho vào mỗi bịch nylon, buộc kín miệng, xoi những lỗ nhỏ trên bịch nylon. Khi nấm phủ xanh hết bề mặt, phơi khô rồi sử dụng ray lọc bào tử nguyên chất ta được bột bào tử. Tính bào tử nấm trong 1 g bột nấm: Pha 1 g bột nấm trong 10ml nước cất vô trùng. Công thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm: 4000 x 1000 x a x 10 -n D = b D: Số bào tử trong 1 g bột nấm. a: Số bào tử đếm được. n: Nồng độ pha loãng. b: Số ô nhỏ của buồng đếm hồng cầu. 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 3.3.1 Phƣơng pháp khảo sát độc tính Phương pháp 1: Bột bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng khác nhau được trộn đều trong đất. Sau đó thả sùng vào môi trường và theo dõi. Phương pháp 2: Pha bào tử thu được với nước đến nồng độ mong muốn. Sau đó phun dung dịch nấm lên đất và lên sùng rồi theo dõi.  Phương pháp 3: Gây vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm lên sùng theo theo phương pháp 1 hoặc 2. - Theo dõi sùng: 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày sau khi gây nhiễm. 35 Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chết. 3.3.2 Bố trí thí nghiệm Giai đoạn 1: Gây nhiễm sùng theo phương pháp 1 với các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 và nghiệm thức đối chứng là sùng để nguyên. Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 1 STT Nghiệm thức Số mẫu 1 BDTN 15 5 2 BDLA 8 5 3 BXĐTV 3 5 4 BXĐLA 8 5 5 Đối chứng 5 Giai đoạn 2: Gây nhiễm theo phương pháp 2 với các dòng MA 2, CP MA và 2 nghiệm thức đối chứng. Đối chứng 1 là môi trường bã bia + mật rỉ, đối chứng 2 là nước. Bảng 3.2 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 2 STT Nghiệm thức Số mẫu 7 MA 2 5 8 CP MA 5 9 Đối chứng 1 5 10 Đối chứng 2 5 Giai đoạn 3: Gây nhiễm theo phương pháp 3 với các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 13 và nghiệm thức đối chứng là sùng gây vết thương. 36 Bảng 3.3 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 3 STT Nghiệm thức Số mẫu 11 BDTN 15 5 12 BDLA 8 5 13 BXĐTV 3 5 14 BXĐLA 8 5 15 SCLLLA 4 5 16 RBC – Q9 – 3 5 17 MA 11 5 18 MA 13 5 19 Đối chứng 5 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giai đoạn nuôi sùng Sùng được nuôi trong mỗi hộp nhựa riêng biệt và giữ ổn định trong ít nhất 2 tuần (Hình 4.1). Hình 4.1 Sùng được nuôi trong điều kiện thí nghiệm 1. Hộp nhựa có các kích thước: đường kính miệng hộp 12 cm; đường kính đáy 10cm, chiều cao 12 cm; 2. Sùng trắng tuổi 3 dài 3 cm; 3. hỗn hợp đất phân (môi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng). Rồi từ sau 2 tuần nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm mới có thể cho gây nhiễm với nấm vì khoảng thời gian từ lúc đem mẫu sùng về nuôi đến lúc nuôi ổn định sùng có thể chết vì nhiều nguyên nhân, có thể chết do shock môi trường, do nhiệt độ thay đổi, do độ ẩm không phù hợp hay do bị thương trong quá trình thu mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm… Cũng có thể chết trong lúc nuôi do môi trường thiếu dinh dưỡng hoặc do không khéo léo trong khi thay môi trường làm sùng bị thương. Nếu trong giai đoạn này đem gây nhiễm với nấm thì kết quả sẽ không chính xác. Do vậy ta cần nuôi sùng ổn định ít nhất 2 tuần để đảm bảo khi gây nhiễm sùng hoàn toàn khỏe mạnh. 4.2 Giai đoạn nhân nấm Nấm sau 6 ngày cấy trên đĩa petri (Hình 4.2a) được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa môi trường bã bia + glucose + nước cất và lắc trong 3 ngày ở 28oC sẽ được nhân trên môi trường xốp (Hình 4.2b). 3 1 2 38 a Nấm M.anisopliae trên môi trường PGA (potato glucose agar) Nấm M.anisopliae trên môi trường cơm Hình 4.2 Hình thái nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường PGA và trên môi trường cơm a. Nấm M.anisopliae trên môi trường PGA sau 9 ngày cấy trên đĩa petri; b. Nấm M.anisopliae trên môi trường cơm sau 9 – 11ngày nuôi cấy. Số lượng bào tử của các dòng nấm M.anisopliae khác nhau là khác nhau. Nhờ buồng đếm hồng cầu, số lượng bào tử của các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong 1g bột nấm thu được từ môi trường xốp (Bảng 4.1)  Phương pháp nhân nấm trên môi trường xốp Trong phương pháp nhân nấm, chúng tôi nhân nấm trên môi trường lỏng rồi mới đưa sang môi trường xốp. Trên thực tế chúng ta có thể đưa thạch trực tiếp từ môi trường thạch sang môi trường xốp. Tuy nhiên thời gian để nấm mọc xanh hết bề mặt môi trường rất lâu (khoảng 11 – 14 ngày) và tốn công cho nhiều lần băm thạch. Thêm vào đó do thời gian tiếp xúc với môi trường không khí lâu (tốn thời b 39 gian nhiều trong việc băm thạch) nên rất dễ nhiễm. Trong khi đó, nếu sử dụng sinh khối nấm từ môi trường lỏng để nhân trên môi trường xốp, thời gian để nấm lên xanh hết bề mặt môi trường là 9 – 10 ngày và chỉ mất thời gian cho một lần băm thạch. Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dòng nấm trong 1g bột nấm Dòng nấm Số lượng bào tử trên 1 g Số lượng bào tử trên 1 ml BDTN 15 3,47 x 10 10 BDLA 8 6,88 x 10 10 BXĐTV 3 4,25 x 1010 BXĐLA 8 8,44 x 109 RBC – Q9 – 3 1,11 x 1010 SCLLLA 4 2,54 x 10 10 MA 2 5 x 10 9 MA 11 5,47 x 10 9 MA 13 8,11 x 10 9 CP MA 5 x 10 9 Mặt khác, khi áp dụng phương pháp nhân nấm trên môi trường xốp, ta có thể thu được chế phẩm khô (tức bột nấm) để thuận tiện cho quá trình gây nhiễm nấm theo phương pháp gây nhiễm khô. Môi trường xốp được sử dụng là môi trường cơm vì môi trường cơm dễ dàng lọc bào tử tinh không chứa môi trường. Nguyên nhân của cách làm này chính là để tránh hiện tượng sùng chết vì môi trường xốp trong quá trình gây nhiễm.  So sánh với phương pháp nhân nấm trên môi trường lỏng. Như chúng ta đã biết, nhân nấm trong môi trường lỏng có ưu điểm là rất dễ làm, thời gian lên men ngắn, lượng nấm đưa vào rất ít trong khi lượng nấm thu được lại rất lớn và dễ phát hiện khi dung dịch nhiễm khuẩn (môi trường nhiễm khuẩn bị đục) tuy nhiên chúng ta không thể sử dụng để gây nhiễm vì bào tử thu được là bào tử chồi nên thời gian lưu trữ ngắn, sức chống chịu kém dễ bị mất hoạt tính trong khi thời gian theo dõi sự nhiễm bệnh lại dài (21 ngày) trong khoảng thời 40 gian đó bào tử nấm có thể đã mất hoạt tính hoặc đã chết trong môi trường chứa hệ sinh vật đất. Trong khi đó phương pháp lên men xốp nấm M.anisopliae mặc dù thời gian lên men dài nhưng hiệu quả lên men cao, lượng nấm đưa vào ít nhưng lượng nấm thu được là khổng lồ, nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền và rất dễ làm. Mặt khác, bào tử nấm thu được là bào tử đính nên có thể lưu trữ lâu và khả năng chịu đựng môi trường bất thuận tốt hơn. Do đó phù hợp với thí nghiệm gây nhiễm nấm phải theo dõi một thời gian dài tuy rằng trong quá trình nhân nấm phương pháp này có một nhược điểm là khó kiểm soát sự nhiễm tạp. 4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 4.3.1 Phƣơng pháp gây nhiễm 1 và 2 4 nghiệm thức ứng với 4dòng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 cho gây nhiễm theo phương pháp 1 và nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên) được kết quả như sau: Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 1 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 0 _ BXĐLA 8 0 _ Đối chứng 0 _ Qua bảng 4.2, các nghiệm thức trên đều cho kết quả tỷ lệ sùng chết là 0%. Điều này đưa chúng tôi đến các giả định như sau: Có thể các dòng nấm M.anisopliae đem gây nhiễm không có khả năng diệt sùng trắng (hay còn gọi là không có độc tính). Nguyên nhân này rất hay gặp phải trong các nghiên cứu vì rất khó tìm được một dòng gây độc tính trên sùng trắng. Cũng có thể phương pháp gây nhiễm chưa phù hợp, có thể do nồng độ gây nhiễm chưa cao? Tuy nhiên nguyên nhân này không không thuyết phục vì nồng độ bào tử gây nhiễm là rất cao hoặc do khi gây nhiễm, nấm được trộn với đất, nấm có thể bị 41 bị ức chế bởi các vi sinh vật đất? Nguyên nhân này cũng xảy ra nhưng không đáng kể. Một nguyên nhân nữa cũng có thể xảy ra là lớp da của sùng quá dày khiến cho nấm không thể xâm nhập qua da để ký sinh và diệt sùng, trong trường hợp này thì cần hỗ trợ thêm chất làm bào mòn da của sùng thậm chí có thể gây vết thương nhẹ giúp nấm dễ dàng xâm nhập vào cơ thể sùng, ký sinh và diệt sùng. Với nhiều giả thuyết đưa ra trên, chúng tôi chú ý đến 2 nguyên nhân: một là các dòng trên không có độc tính; hai là nguyên nhân do lớp da sùng quá dày, nấm không thể xâm nhập qua lớp da để ký sinh và diệt sùng. Do đó chúng tôi tiến hành gây nhiễm tiếp tục theo phương pháp 2 và phương pháp 3. Thử nghiệm phương pháp gây nhiễm 2 đối với 2 dòng nấm MA 11, CP MA và theo đó 2 nghiệm thức đối chứng là môi trường bã bia + mật rỉ + nước và nước. Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 2 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) MA 2 0 _ CP MA 0 _ Đối chứng 1 0 _ Đối chứng 2 0 _ Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae theo phương pháp 2 cũng không khác gì so với phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết vẫn là 0% (Hình 4.3). Với phương pháp 2 trên hai dòng nấm MA 2 và CP MA từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, kết quả vẫn không khác biệt. Từ các kết quả trên, chúng tôi tiếp tục đặt ra giả thuyết các dòng nấm M.anisopliae này có khả năng gây độc trên sùng trắng? Phương pháp gây nhiễm có phù hợp? Và chúng tôi bắt đầu tiến hành gây nhiễm theo phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi cho sùng tiếp xúc nấm). 42 Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước a.Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun nước 21 ngày ; b. Nghiệm thức đối chứng sùng phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun môi trường bã bia + mật rỉ + nước 21 ngày. Kết quả từ nghiệm thức đối chứng (hình 4.3) chứng tỏ sùng vẫn sinh trưởng bình thường khi phun nước và môi trường bã bia + mật rỉ + nước. Điều này cho ta thấy rằng sự sinh trưởng và phát triển của sùng không bị ảnh hưởng bởi nước và môi trường. Từ đây, cho ta lựa chọn nhiều hơn trong quá trình nhân nấm tạo chế phẩm diệt sùng thí dụ ta có thể lựa chọn những môi trường xốp khác cho số lượng bào tử nhiều hơn như môi trường chứa cám, bột ngô, đậu nành và trấu… Kết quả này cũng chứng minh cho kết quả thí nghiệm của chúng tôi là hoàn toàn chính xác. Theo đó, khi gây nhiễm sùng với các dòng MA 2 và CP MA bằng phương pháp 2, sùng vẫn sinh trưởng bình thường. Có nghĩa là theo phương pháp gây nhiễm 2, các dòng này không có thể hiện độc tính trên sùng trắng. Tương tự như vậy, gây nhiễm các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3 và BXĐLA 8 theo phương pháp 1 cũng không có hiệu quả. Do đó, các dòng BDTN 15, BDLA 8,BXĐTV 3 và BXĐLA 8 cũng không thể hiện độc tính. a b 43 Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2 1. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm M.anisopliae BDTN 15 theo phương pháp 1 cho tỷ lệ sùng chết là 0%; 2. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm BDLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 3. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 4. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm MA 2 theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%; 5. Sùng được gây nhiễm với dòng nấm CP MA theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%. 1 2 3 4 5 44 4.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm 3 Sau khi tiến hành gây nhiễm trên phương pháp 1 và phương pháp 2 không có kết quả. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 3 được kết quả như sau: Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 3. Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết (ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 20 7 BXĐLA 8 0 _ SCLLLA 4 20 17 RBC – Q9 – 3 0 _ MA 11 80 5 – 17 MA 13 0 _ Đối chứng 0 _ Từ bảng 4.3, nghiệm thức BXĐTV 3, SCLLLA 4, MA 11 cho tỷ lệ sùng chết lần lượt là 20%, 20% và 80%. Kết quả này chứng tỏ loài nấm này có khả năng ký sinh và diệt sùng. Đặc biệt các dòng có độc tính cao có khả năng diệt sùng rất hiệu quả (dòng MA 11 cho tỷ lệ sùng chết là 80%). Như vậy ta hoàn toàn có thể khẳng định nấm Metarhizium anisopliae có độc tính diệt sùng và có thể sản xuất được chế phẩm nấm diệt sùng tuy nhiên cần phải nghiên cứu nhiều hơn nữa về các dòng nấm M.anisopliae để tìm được dòng có độc tính cao hơn. Các dòng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 13 đều cho tỷ lệ sùng chết là 0%. Đặc biệt, đối chứng gây vết thương trong nghiệm thức đối chứng (Hình 4.5) vẫn sinh trưởng bình thường trong thời gian theo dõi (7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) nên kết quả thí nghiệm của chúng tôi là chính xác. Thêm vào đó kết quả này cũng giúp chúng tôi chắc chắn hơn trong giả thuyết lớp da sùng quá dày khiến nấm không thể xâm nhập để ký sinh và diệt sùng. Như vậy trong phương pháp gây nhiễm 3 này các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 cũng không thể hiện độc tính của nấm trên sùng trắng. 45 Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương Sùng được gây vết thương sau 21 ngày theo dõi, tỷ lệ sùng chết là 0%.  Kết quả phân lập nấm từ sùng nhiễm bệnh. Các dòng có tính độc trên sùng trắng MA 11, BXĐTV 3, SCLLLA 4 được chúng tôi phân lập lại để khẳng định chính xác kết quả thí nghiệm của chúng tôi (Hình 4.8). So với nấm Metarhizium anisopliae mà chúng tôi lấy tù ống nghiệm gốc đem cấy trên đĩa petri, các nấm M.anisopliae mà chúng tôi phân lập từ sùng nhiễm bệnh có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn biểu hiện ở thời gian gia tăng kích thước đường kính khuẩn lạc: thời gian đường kính khuẩn lạc nấm phân lập từ sùng nhiễm bệnh trên môi trường PGA tăng đến 3 cm là 3 ngày trong khi thời gian là 5 ngày với nấm lấy từ ống gốc. Trong khi đó, hình thái nấm vẫn không hề thay đổi. 46 Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3. 1. 1/5 Sùng chết sau 7 ngày gây nhiễm với dòng nấm BXĐTV 3; 2. 1/5 Sùng chết sau 17 ngày gây nhiễm với dòng nấm SCLLLA 4; 3,4,5,6. 4/5 sùng chết khi gây nhiễm với nấm MA 11 N. Vùng nấm ký sinh trên sùng trắng. Vùng có màu xanh là bào tử nấm đã hình thành. Vùng có màu trắng là vùng sợi nấm đang phát triển. 4 N 3 N 5 N N 1 N 2 N 6 47 Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dòng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. BDTN 15. Nghiệm thức BDTN 15, 5/5 Sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDTN 15 theo phương pháp 3; BDLA 8. Nghiệm thức BDLA 8, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BDLA 8 theo phương pháp 3; BXĐLA 8. Nghiệm thức BXDLA 8, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm với dòng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 3; MA 13. Nghiệm thức MA 13, 5/5 sùng nhiễm không chết khi gây nhiễm với dòng nấm MA 13; RBC – Q9 – 3. Nghiệm thức RBC – Q9 – 3, 5/5 sùng không chết khi gây nhiễm dòng nấm RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. 48 Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm a. Nấm M. anisopliae sau 5 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm MA 11; b. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm BXĐTV 3; c. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên môi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm SCLLLA 4. 4.3.3 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp gây nhiễm nấm So sánh nghiệm thức BXĐTV 3 khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1và 2 với chính dòng nấm này theo phương pháp 3 và kiểm tra với 2 nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên và sùng tạo vết thương): Từ dòng MA 11 Từ dòng BXĐTV 3 Từ dòng SCLLLA 4 a b c 49 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp gây nhiễm 1,2 và 3 trên dòng nấm M.anisopliae BXĐTV 3 Nghiệm thức Tỷ lệ gây chết (%) BXĐTV 3 (không gây vết thương) 0 Đối chứng (để nguyên) 0 BXĐTV 3 (gây vết thương) 20 Đối chứng (gây vết thương) 0 Kết quả cho ta thấy phương pháp 3 có hiệu quả hơn khi gây nhiễm nấm M.anisopliae dòng BXĐTV 3 trên sùng trắng. Phương pháp 1 không khác biệt so với phương pháp 2, các dòng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8 cho kết tương tự khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1 và phương pháp 2. 4.3.4 Hiệu quả của các dòng với các phƣơng pháp xử lý Qua thí nghiệm, ba dòng BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 có hiệu quả với phương pháp gây nhiễm 3 (phương pháp tạo vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm). Hiệu quả của các dòng nấm thể hiện ở tỷ lệ sùng chết khi gây nhiễm từng dòng trên sùng trắng, lần lượt là 20%, 20% và 80%. Còn tất cả các dòng còn lại không hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm (tỷ lệ sùng chết là 0%). Kết quả này cũng đặt ra trước chúng tôi những câu hỏi: các dòng nấm này phải chăng không thể hiện độc tính của chúng khi gây nhiễm theo 3 phương pháp trên? Hay chúng không thể thể hiện độc tính trước giai đoạn sùng trắng trong vòng đời của các con bọ cánh cứng? Hay chúng hoàn toàn không có độc tính với tất cả các giai đoạn sống của bọ cánh cứng? 50 Bảng 4.6 Hiệu quả của các dòng nấm với 3 phương pháp gây nhiễm Hiệu quả gây nhiễm (%) Dòng nấm Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3 BDTN 15 0 0 BDLA 8 0 0 BXĐTV 3 0 20 BXĐLA 8 0 0 MA 2 0 CP MA 0 SCLLLA 8 20 RBC – Q9 – 3 0 MA 11 80 MA 13 0 51 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Ở giai đoạn nuôi sùng, thời gian nuôi sùng ổn định phải sau 2 tuần để đảm bảo cho sùng không bị chết bởi các nguyên nhân khác trước khi gây nhiễm nấm có nghĩa là để tránh hiện tượng giảm số lượng sùng không mong muốn. Từ đó chúng ta có thể khẳng định chính xác hơn về kết quả nghiên cứu. Trong giai đoạn nhân nấm, qui trình nhân nấm mà chúng tôi chọn nghiên cứu là lên men trên môi trường xốp (môi trường cơm). Tuy nhiên qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy vẫn có thể chọn nhiều qui trình nhân nấm khác cho số lượng bào tử cao hơn hoặc chọn những qui trình nhân nấm sao cho không làm mất hoạt tính của nấm hoặc giảm đến mức thấp nhất sự mất hoạt tính của nấm bằng cách: chúng ta có thể nuôi nấm trong môi trường chứa bột cào cào chẳng hạn hoặc giảm tối đa các bước cấy chuyền. Qua thí nghiệm khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng, ba dòng nấm có khả năng gây độc trên sùng trắng là BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11, trong đó dòng Ma11 biểu hiện tính độc cao nhất, tỷ lệ sùng chết 80%. Và phương pháp gây vết thương nhẹ trước khi cho tiếp xúc nấm là phương pháp hiệu quả với các dòng nấm BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 khi gây nhiễm trong điều kiện thí nghiệm. Các dòng nấm còn lại BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 2, MA 13, CP MA, RBC – Q9 – 3 có thể không hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm hoặc không có khả năng gây độc trên giai đoạn sùng (một giai đoạn trong vòng đời của bọ cánh cứng) hay có thể chúng hoàn toàn không có độc tính trên tất cả các giai đoạn sống của bọ cánh cứng. 5.2 Đề nghị Cần chọn lọc các phương pháp nhân nấm thích hợp để gây nhiễm trên từng loại sùng khác nhau. Cải tiến phương pháp nhân nấm để tránh hiện tượng nấm giảm hoạt tính qua nhiều lần cấy chuyền. 52 Nghiên cứu nhiều hơn về các dòng nấm Metarhizium anisopliae để chọn lọc nhiều dòng có hoạt tính cao, có khả năng ký sinh trên nhiều giai đoạn sống của sùng trắng và nhiều côn trùng gây hại khác nhau. Từ đó chọn lọc dòng thích hợp làm chế phẩm diệt côn trùng hiệu quả. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. GS.TS. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích, tập II - Ứng dụng nấm cộng sinh và sinh vật phòng trừ sâu hại. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 2. Lê Nguyễn Ngọc Tùng Anh,2004. Luận văn tốt nghiệp Nghiên cứu các qui trình lên men nấm Metarhizium sp. Đại học Nông Lâm tp Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Xuân Thành – Lê Văn Hưng - Phạm Văn Toàn, 2003. Giáo trình Công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 4. PTS Nguyễn Thị Chắt,1999. Côn trùng cơ bản. Đại học Nông Lâm –Tp Hồ Chí Minh. 5. Trần Thị Thanh, 2000. Công nghệ vi sinh. Nhà xuất bản giáo dục. 6. Bùi Xuân Đồng, Nguỵễn văn Huy, 2000. Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội. 7. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Thư Hương, 2004. Nghiên cứu và đánh giá tính độc của nấm Metarhizium spp. ký sinh trên côn trùng gây hại. Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang và Nguyễn Đức Thành, 2002. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng hai chế phẩm sinh học để quản lý các loài sâu hại lúa. Viện lúa ĐBSCL. Trang 274 – 293. 10. Phạm Thị Thùy - Viện Bảo vệ Thực vật Hà Nội, Nguyễn Văn Thiêm và ctv – Chi cục Bảo vệ Thực vật Bến Tre và Võ Hiền Đức – Trung tâm Bảo vệ Thực vật Phía Nam. Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hại dừa (Brontispa sp.) ở Bến Tre năm 2000. 54 Tài liệu tiếng Anh 1. Ferron, P. 1978. Biological control of insect pests by entomogenous fungi. Annu. Rev. Entomol 23: 409-422. 2. Lawrence A. Lacey. Biological techniques, Manual os Techniques in Insect Pathology. Yakima Agricultural Research Laboratory, USDA – ARS, 5230 Konnowac Pass Road, Wapato, WA 98951, USA. 3. Milner R.J, 1989. Recent progress with Metarhizium anisopliae for pest control in Australia. In proceedings of the first Asia/Pacific conference on Entomology – Chiang Mai, November, 1989. 4. Richard J. Milner, 2000. Biocontrol News and Information. Vol. 21 No. 2 47N – 50N. 5. Rombach, M.C., R.M. Aguda and D. W. Roberts,1986b. Biological control of the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae) with dry mycelium applications of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Philipp. Entomol. 8: 613-627. 6. S.P. Singh and P. Rethinam, 2004. Cocoinfo international. Vol 11, No. 2. Trang Web 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. file:///C/user/THUAN/Fun_Bio.htm 12. 13. 55 14. 15. 16.