Khảo sát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật imidacloprid và azoxystrobin trong lá và rễ cây đinh lăng – polyscias fruticosa (l.) harms ở Cần Thơ, An giang và Đồng Tháp

BVTV hiệu quả và an toàn” sang “Chiến lược giảm nguy cơ của thuốc BVTV”. Chiến lƣợc sử dụng thuốc BVTV mới này đã mang lại hiệu quả ở nhiều nƣớc, đặc biệt là các nƣớc Bắc Âu, đã thành công trong việc giảm thiểu sử dụng thuốc BVTV mà vẫn quản lý đƣợc dịch hại tốt. Trong vòng 20 năm (1980 - 2000) Thụy Điển giảm lƣợng thuốc BVTV sử dụng đến 60 %, Đan Mạch và Hà Lan giảm 50 %. Tốc độ gia tăng mức tiêu thụ thuốc BVTV trên thế giới trong 10 năm lại đây đã giảm dần, cơ cấu thuốc BVTV có nhiều thay đổi theo hƣớng gia tăng thuốc sinh học, thuốc thân thiện với môi trƣờng, thuốc ít độc hại, 2.3.2. Tình hình sử dụng HCBVTV ở Việt Nam ( Việt Nam là một trong số những nƣớc có lƣợng tiêu thụ thuốc bảo vệ thực vật rất lớn. Ở một số địa phƣơng đƣợc khảo sát cho thấy có hiện tƣợng một số nông dân còn thiếu hiểu biết cũng nhƣ không tuân thủ đúng những quy định sử dụng thuốc BVTV khi phun cho cây (nhƣ quy định đối với việc sử dụng thuốc BVTV thuộc danh mục hạn chế sử dụng, lạm dụng thuốc BVTV, không thực hiện đúng quy định về xử lý bao bì đựng thuốc BVTV sau khi sử dụng xong và đặc biệt là việc tuân thủ thời gian an toàn cho thu hái dƣợc liệu sau khi phun thuốc điều này có thể dẫn đến lƣợng tồn dƣ thuốc BVTV trong các dƣợc liệu vƣợt ngƣỡng cho phép). 18 Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, danh mục thuốc bảo vệ thực vật đƣợc phép sử dụng trong nông nghiệp đến năm 2015 đã lên tới 1.699 hoạt chất, trong khi, các nƣớc trong khu vực chỉ có khoảng từ 400 - 600 loại hoạt chất nhƣ: Trung Quốc 630 loại, Thái Lan 400 - 600 loại... Từ năm 2011 đến nay, hàng năm Việt Nam nhập và sử dụng từ 70.000 - 100.000 tấn thuốc bảo vệ thực vật. Trong đó, thuốc trừ sâu chiếm 20,4 %, thuốc trừ bệnh 23,2 %, thuốc trừ cỏ 44,4 %, các loại thuốc bảo vệ thực vật khác, nhƣ: thuốc xông hơi khử trùng, bảo quản lâm sản, điều hòa sinh trƣởng cây trồng chiếm 12 %. Khối lƣợng và chủng loại thuốc bảo vệ thực vật trên đã vƣợt gấp nhiều lần nhu cầu sử dụng cho sản xuất nông nghiệp. 2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HCBVTV 2.4.1. Phƣơng pháp truyền thống (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013) Để chống lại các loài sinh vật gây hại, từ lâu ngƣời ta đã sử dụng thuốc trừ sâu một cách rộng rãi trong nông nghiệp nhƣ: trồng lúa, rau, cây ăn quả và phổ biến hiện nay là dƣợc liệu. Mục đích của phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng là phân tích đồng thời nhiều thuốc BVTV trong cùng một lần thực hiện, do đó kỹ thuật chiết cũng hƣớng đến chiết đƣợc càng nhiều thuốc BVTV càng tốt. Đồng thời phƣơng pháp phải đƣợc thực hiện nhanh chóng và dễ dàng, cùng với việc sử dụng một lƣợng dung môi tối thiểu mà vẫn chiết đƣợc tất cả thuốc BVTV có trong nền mẫu. Đã có một vài phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu tồn dƣ trong trái cây và nƣớc ép trái cây nhƣ: chiết lỏng, chiết với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết vi pha rắn, chiết siêu tới hạnCác phƣơng pháp này thƣờng tốn rất nhiều thời gian. Phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng đầu tiên và nổi tiếng nhất là phƣơng pháp Mills đƣợc phát triển vào những năm 1960 bởi Cục quản lý dƣợc và thực phẩm Mỹ (FDA) bởi nhà hóa học P.A.Mills. Vào thời gian đó, các thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ là nhóm chính đƣợc phân tích. Với phƣơng pháp Mills, thuốc trừ sâu nhóm clo và các chất không phân cực khác đƣợc chiết xuất trên mẫu thực phẩm không chứa chất béo bằng acetonitril. Sau đó pha loãng với H2O và các thuốc trừ sâu đƣợc phân vào một dung môi không phân cực (petroleum ether). Vì thế mà các thuốc trừ sâu phân cực trung bình nhƣ là thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ bị mất một phần trong phƣơng pháp này. Sự cần thiết khi phân tích nhiều thuốc trừ sâu phân cực khác nhau và nhóm phospho hữu cơ trong nông nghiệp, là phát triển một số cách thay thế để xác định các hợp chất không đƣợc chiết xuất bởi phƣơng pháp Mills. Những cách này thƣờng chỉ đơn giản thay đổi bằng cách sử dụng dung môi ACN chiết xuất ban đầu nhƣng khác 19 nhau bởi bƣớc phân vùng, làm sạch và xác định thuốc BVTV (Anastassiades et al., 2003). Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng là một phƣơng pháp dùng một dung môi để tách một chất hoặc nhóm hợp chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Sau đó chuyển chất phân tích từ một dung môi sang dung môi thứ hai không đồng tan với dung môi thứ nhất. Cô thu hồi dung môi thu đƣợc chất phân tích. Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà lựa chọn dung môi thích hợp để tránh hao hụt chất cần phân tích. Cần phải chú ý đến các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết nhƣ: độ tan của chất phân tích trong dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác. Ngoài ra việc lựa chọn dung môi thích hợp còn giúp loại bỏ đƣợc một số tạp chất có trong mẫu. Có thể sử dụng một số tác nhân vật lý hỗ trợ nhƣ lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm Đối với các mẫu nhiều tạp chất có thể phối hợp thêm các quá trình làm sạch khác. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng thƣờng đƣợc áp dụng để - Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu. - Phân chia cao thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Năm 2009, Tiến sĩ Nguyễn Thị Bích Thu đã công bố đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khối phổ để phân tích dƣ lƣợng một số hóa chất bảo vệ thực vật thƣờng dùng”. Trong đó sử dụng phƣơng pháp chiết mẫu bằng siêu âm, sau đó làm sạch mẫu bằng cột nhồi silicagel + 10 % than hoạt và đem định lƣợng bằng GC/MS. 2.4.2. Phƣơng pháp QuEChERS (Trần Cao Sơn, 2015) Trong những năm gần đây có sự thay đổi đáng kể là sự ra đời của phƣơng pháp QuEChERS (viết tắt của quick - nhanh, easy - dễ, cheap - rẻ, effective - hiệu quả, rugged - ổn định, và safe - an toàn). Phƣơng pháp QuEChERS đƣợc báo cáo đầu tiên bởi Anastassisdes và Lehotay, đƣợc phát triển bởi United States Department of Agriculture (Sở nông nghiệp Hoa Kỳ) vào năm 2003. Là phƣơng pháp phân tích đa dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trên nhiều loại nền mẫu khác nhau, chỉ cần có khoảng 70 – 100 % nƣớc trong thành phần (mẫu khô đƣợc cho thêm nƣớc). Phƣơng pháp này đƣợc phát triển dùng để chiết xuất thuốc BVTV trên trái cây và rau quả, đồng thời kết hợp với quá trình làm sạch mẫu nhƣ là đƣờng, acid béo, acid hữu cơ, sterol, protein, chất màu và loại nƣớc thừa. Phƣơng pháp này mang đến những thuận tiện hơn so với phƣơng pháp truyền thống nhƣ chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn. Phƣơng pháp này đơn giản và khá hiệu quả trong việc chiết và làm sạch một số mẫu có nền phức tạp. Quá trình này bao gồm hai bƣớc. Đầu tiên, các mẫu đồng nhất đƣợc 20 chiết xuất và phân chia bởi dung môi hữu cơ và dung dịch muối. Sau đó, phần nổi trên mặt đƣợc tách ra và làm sạch bởi kỹ thuật chiết phân tán pha rắn (d-SPE). Năm 2005, Lehotay và các cộng sự nghiên cứu thẩm định phƣơng pháp này cho thấy phƣơng pháp cho kết quả tốt với 207 chất trong số 235 thuốc trừ sâu trong các nền mẫu rau quả. Tuy nhiên, độ thu hồi của những chất nhạy với pH bị ảnh hƣởng rõ rệt. Sau đó Lehotay thay đổi phƣơng pháp gốc bằng cách sử dụng đệm acetat pH 4,8 - 5,0 để tăng độ thu hồi của thuốc trừ sâu. Phƣơng pháp này sau đó đã đƣợc nghiên cứu trong 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia đối với 30 thuốc trừ sâu và trở thành phƣơng pháp chính thức của AOAC 2007.01 vào năm 2007. Cùng thời gian đó, Anastassiades và cộng sự phát triển một phƣơng pháp QuEChERS khác sử dụng đệm citrat ở pH khoảng 5. Phƣơng pháp này đã đƣợc thẩm định liên phòng ở nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và trở thành phƣơng pháp châu Âu CEN 15662. 2ml Hình 2.7. Sơ đồ chiết thuốc BVTV theo QuEChERS Hiện nay có ba quy trình chiết chính của phƣơng pháp vẫn còn đƣợc áp dụng. Đó là phiên bản ban đầu do Anastassiades và Lehotay phát triển; phiên bản dùng đệm acetat theo AOAC và phiên bản dùng đệm citrat theo tiêu chuẩn châu Âu. 15g mẫu/ống ly tâm 50 ml Hút 1 ml/lọ 2 ml Phân tích GC-MS; LC-MS + 15 ml ACN, lắc + 6 g MgSO4; 1,5g NaCl Lắc, ly tâm + 150 mg MgSO4; 25 mg PSA + 50 mg C18; 7,5 mg GCB (lựa chọn thêm) Lắc, ly tâm, lọc Phƣơng pháp gốc ban đầu (Không dùng đệm) 15g mẫu/ống ly tâm 50 ml Hút 1 ml/lọ 2 ml Phân tích GC-MS; LC-MS + 15ml ACN (1% acid acetic) + 6 g MgSO4; 1,5 g NaOAc Lắc, ly tâm + 150mg MgSO4; 50mg PSA + 50mg C18; 7,5mg GCB (lựa chọn thêm) Lắc, ly tâm, lọc Phƣơng pháp AOAC 2007.01 (Đệm acetat pH 4,8-5) 15g mẫu/ống ly tâm 50 ml Hút 1 ml/lọ Phân tích GC-MS; LC-MS + 15 ml ACN, lắc + 6 g MgSO4; 1,5 g Na3citrat + 1,5 g Na2citrat; 1,5g NaCl Lắc, ly tâm + 150 mg MgSO4; 50 mg PSA + 50 mg C18; 7,5 mg GCB (lựa chọn thêm) Lắc, ly tâm, lọc Phƣơng pháp EN 15662 (Đệm citrat pH 5) 21 Ƣu điểm của phƣơng pháp QuEChERS (Michelangelo Anastassiades, 2003)  Nhanh (8 mẫu trong khoảng 30 phút).  Đơn giản (các bƣớc thực hiện không quá khó, sai số tối thiểu).  Rẻ (không tốn kém nhiều khi chuẩn bị mẫu).  Lƣợng dung môi sử dụng thấp (10 ml acetonitril).  Hầu nhƣ không cần dụng cụ thủy tinh.  Đƣợc dùng trên phạm vi rộng các thuốc trừ sâu (chất phân cực, chất phụ thuộc vào pH).  Chiết xuất với acetonitril (đƣợc phân tích bởi sắc ký khí và sắc ký lỏng). Ở Việt Nam hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến cũng đã có một số tác giả áp dụng phƣơng pháp mới trong phân tích đa dƣ lƣợng thuốc BVTV trong nông nghiệp. Trên cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp QuEChERS, tác giả có thay đổi một số bƣớc cho phù hợp với điều kiện thực tế, tối ƣu hóa qui trình một cách hợp lý nhất. Năm 2005, Ths. Trần Việt Hùng thực hiện nghiên cứu xác định thuốc BVTV trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp chiết nóng, chiết lạnh hoặc chiết Sohxlet kết hợp với sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) để làm sạch và làm giàu mẫu. Sau đó đem phân tích bởi sắc ký khí. 2.5. KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS HPLC là từ viết tắt của High Performance Liquid Chromatography, còn đƣợc gọi là phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phƣơng pháp này ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Áp dụng rất lớn cho ngành kiểm nghiệm đặc biệt là kiểm nghiệm thuốc. Là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lƣợng. Ngày nay cũng đã ứng dụng nhiều trong dƣợc liệu. 2.5.1. Nguyên tắc Phƣơng pháp HPLC là một phƣơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lƣợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhƣng không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đƣa vào cột, chúng sẽ đƣợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện 22 gọi là detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc hiển thị trên màn hình. 2.5.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách đƣợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Việc tách xảy ra khi hỗn hợp các chất tƣơng tác khác nhau với pha tĩnh. Do tính chất lí hóa và cấu trúc phân tử nên chúng tƣơng tác khác nhau và di chuyển với tốc độ khác nhau để tách ra khỏi nhau. 2.5.3. Cấu tạo của hệ thống HPLC Hình 2.8. Cấu tạo hệ thống HPLC Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động. 2 - Bộ phận khử khí. 3 - Bơm cao áp. 4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler). 5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trƣờng hay có thiết bị điều nhiệt. 6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu). 7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống. 8 – Thiết bị in dữ liệu. Pha động là một yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký quyết định việc tách đƣợc các chất ra khỏi hỗn hợp hay không. Các dung môi pha động có độ phân cực khác nhau, cần phải lựa chọn sao cho phù hợp với nghiên cứu hoặc có thể phối hợp 2 đến 3 dung môi trong một lần phân tích. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến pha động sẽ gây ra kết quả phân tích không đạt yêu cầu nhƣ: pH, tỷ lệ pha động, thành phần pha động, bọt khí, dung môi không tinh khiết còn lẫn tạp Dung môi chạy sắc ký đòi hỏi phải tinh 23 khiết dùng cho HPLC. Tất cả các mẫu thử phải đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 µm trƣớc khi tiêm vào cột. Trong HPLC, bơm đƣợc xem là bộ phận quan trọng hàng đầu. Vì thế đòi hỏi yêu cầu khá cao: phải có khả năng cung cấp chính xác và nhịp dòng chảy tự do, có khả năng chịu đƣợc áp lực cao lên đến 5000 psi, cung cấp đƣợc số lƣợng lớn các dung môi pha động. Bộ phận tiêm mẫu giúp đƣa mẫu với một lƣợng nhất định vào cột sắc ký,với dung tích từ 5 – 100 µl. Có hai cách tiêm mẫu: tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động. Cột sắc ký đƣợc xem là trái tim của quá trình sắc ký. Thƣờng đƣợc làm bằng thép không gỉ, với hình dạng thẳng và thể tích có thể thay đổi. Pha tĩnh nhồi trong cột đƣợc lựa chọn tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký. Trƣớc khi mẫu đi qua cột chính thì cần phải qua tiền cột hay còn gọi là cột bảo vệ để đảm bảo tuổi thọ của cột phân tích. Detector là bộ phận phát hiện chất cần phân tích, là não bộ của HPLC. Tùy thuộc vào bản chất cần phân tích mà sử dụng detector phù hợp. Ngày nay có rất nhiều đầu dò khác nhau nhƣ: detector khối phổ (MS), detector chuỗi diod quang (DAD), detector huỳnh quang (FLD), detector khúc xạ, detector ion hóa ngọn lửa Nhƣng sử dụng rộng rãi nhất là đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) với độ nhạy rất cao. 2.5.4. Ứng dụng của HPLC trong dƣợc liệu - Ứng dụng quan trọng nhất là định tính các thành phần các chất trong dƣợc liệu, trong dịch chiết dƣợc liệu hay phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dƣợc liệu hoặc các thành phẩm dƣợc liệu. - Xác định hàm lƣợng các chất thông dụng trong các phƣơng pháp phân tích hiện đại. Có thể định lƣợng một chất hay định lƣợng đồng thời nhiều chất trong một lần định lƣợng nếu chọn đƣợc điều kiện thích hợp. - Có thể dùng để theo dõi, đánh giá sự thay đổi thành phần (hàm lƣợng) các chất của dƣợc liệu trong quá trình bảo quản hay trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất. - Dùng để phân lập các chất tinh khiết từ dƣợc liệu. 24 Chƣơng 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Khảo sát dƣ lƣợng hai HCBVTV là imidacloprid và azoxystrobin trong dƣợc liệu tƣơi, khô của rễ và lá của cây Đinh lăng đƣợc lấy vào tháng 06/2017 tại các địa điểm khác nhau bao gồm: - Dƣợc liệu lá tƣơi và rễ tƣơi lấy tại một số vƣờn trồng Đinh lăng ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp. - Dƣợc liệu lá khô và rễ khô thu mua tại một số cửa hàng dƣợc liệu ở Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp. 3.1.2. Chất chuẩn – Hóa chất – Dung môi Silicagel cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck). Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck). Dung môi: methanol, petrolium ether (60-90), diclorometan, cloroform, ethylacetat, aceton và một số dung môi cơ bản trong phòng thí nghiệm. Nƣớc cất 2 lần, acetonitril, methanol JK Baker (Merck). Chất chuẩn imidacloprid với độ tinh khiết 99,82%. Chất chuẩn azoxystrobin với độ tinh khiết 99,60%. Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch hai chuẩn gốc azoxystrobin 160 µg/ml và imidacloprid 40 µg/ml (Dung dịch 1): Cân chính xác một lƣợng chất chuẩn khoảng 8,0 mg azoxystrobin và 2,0 mg imidacloprid. Hoà tan bằng acetonitril, cho vào bình định mức 50 ml và bổ sung acetonitril đến vạch. Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc đƣợc tính toán theo lƣợng cân thực tế và độ tinh khiết của các chất chuẩn. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh. - Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp với azoxystrobin 4 µg/ml và imidacloprid 1 µg/ml (Dung dịch 2): lấy chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn gốc 1 cho vào bình định mức 100 ml và thêm acetonitril đến vạch. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh. - Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp với azoxystrobin 0,8 µg/ml và imidacloprid 0,2 µg/ml (Dung dịch 3): lấy chính xác 10 ml dung dịch 2 cho vào bình định mức 50 ml và thêm acetonitril đến vạch. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh. 3.1.3. Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, Nhật và đầu dò UV-Vis. Cột C18 RP ( 250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột tƣơng ứng. 25 Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 1800. Máy lắc siêu âm Elma S 100 H – Đức. Cân phân tích với độ chính xác 0,1 – 0,0001 g. Bếp đun cách thủy Memmert – Đức. Màng lọc 0,45 µm Bình định mức, pipet thủy tinh và các dụng cụ cần thiết khác 3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Lựa chọn phƣơng pháp Tùy theo tính chất của đối tƣợng nghiên cứu (dƣợc liệu) và của đối tƣợng phân tích (thuốc BVTV) mà sử dụng phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp gồm có: Chiết Làm sạch Làm giàu đối tƣợng phân tích trong mẫu Đối với mẫu là dƣợc liệu khô thì cần có phƣơng pháp xử lý thích hợp vì mẫu có pH đa dạng, chứa nhiều chất diệp lục. Do vậy giai đoạn làm sạch mẫu rất quan trọng, giúp cho việc tăng khả năng phát hiện, giảm ảnh hƣởng của nền mẫu. Phân tích dƣ lƣợng thuốc BVTV trong các nền mẫu dƣợc liệu và sản phẩm từ dƣợc liệu thƣờng gặp phải khó khăn do sự khác nhau về thành phần của các loại dƣợc liệu. Vì thế, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu ngoài việc chiết đƣợc tối đa thuốc BVTV, còn phải làm giảm đƣợc càng nhiều tạp chất càng tốt. Có nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã đƣợc sử dụng bao gồm chiết bằng dung môi, chiết siêu tới hạn, chiết pha lỏng dƣới áp suất, chiết vi sóng, chiết pha rắn, chiết phân tán pha rắn, vi chiết pha rắn và QuEChERS. 3.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu đƣợc xay nhỏ, rửa sạch để khô (đối với mẫu tƣơi). Xử lý mẫu:  Qui trình chiết mẫu HCBVTV trên nền mẫu dƣợc liệu tƣơi: 26 Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu tƣơi  Qui trình chiết mẫu HCBVTV trên nền mẫu dƣợc liệu khô: Đối với nền mẫu dƣợc liệu khô, theo Anastassiades thì độ ẩm dƣợc liệu khoảng 80 % thì cho hiệu suất cao nhất. Do đó với dƣợc liệu khô cần bổ sung nƣớc trƣớc khi chiết. Với mỗi lần chiết là khoảng 3 g dƣợc liệu khô, cần thêm nƣớc để làm ẩm bột dƣợc liệu. 5g mẫu/bình nón 100 ml Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn + 20 ml dung môi chiết/ 3 lần Cô cắn ở khoảng 50 oC Lắc với khoảng 10 ml H2O (lớp dƣới) Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dƣới) Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 µm + Hòa cắn với 10 ml ACN Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút 27 Hình 3.2. Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu khô. 3.2.3. Khảo sát dung môi chiết: Trong kỹ thuật chiết bằng dung môi, yếu tố cần quan tâm nhất là độ phân cực của dung môi phải phù hợp với chất phân tích. Trong các loại dung môi, acetonitril là dung môi đƣợc dùng phổ biến. Ngoài ra, nhiều loại dung môi khác cũng đã đƣợc sử dụng để chiết thuốc BVTV từ dƣợc liệu nhƣ n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether, methanol, dicloromethan và aceton. 3 g mẫu/bình nón 100 ml (Làm ẩm vừa đủ) Lọc lấy dịch chiết/ bình lắng gạn + 20 ml dung môi chiết/ 3 lần Cô cắn ở khoảng 50 oC Lắc với khoảng 10 ml H2O (lớp dƣới) Lắc với khoảng 10 ml PE (lớp dƣới) Cô dịch chiết còn 3 ml và lọc qua đầu lọc 0,45 µm + Hòa cắn với 10 ml ACN Mẫu phân tích trên HPLC/UV-Vis Lắc siêu âm 10 phút 28 Dựa vào độ tan của hai hoạt chất trong dung môi để chọn dung môi chiết thích hợp. Tiến hành trên mẫu thử thêm chuẩn, với mục đích chiết tối đa hai hoạt chất và tối thiểu tạp chất. Đánh giá sơ bộ bằng quan sát trên SKLM. Bảng 3.1. Độ tan của hai hoạt chất trong nƣớc và dung môi hữu cơ (Ursula Banasiak, 2011) Độ tan ở 20 oC Imidacloprid (g/L) Azoxystrobin (g/L) n-hexan < 0,1 0,057 Octan-1-ol 1,4 Methanol 20 Toluene 0,69 55 Acetone 50 86 Ethyl acetat 6,7 130 Acetonitril 50 340 Diclorometan 67 400 2-propanol 2,3 Dimethylfornamide > 200 Dimethyl sulfoxide > 200 H2O 0,61 0,006 3.2.4. Khảo sát phƣơng pháp làm sạch mẫu thử Chấm dịch chiết mẫu thử lên SKLM để quan sát hai chất imidacloprid, azoxystrobin và các chất khác có trong nền mẫu. Đối với nền mẫu dƣợc liệu tƣơi hoặc với các bộ phận nằm trên mặt đất thì cần có phƣơng pháp xử lý thích hợp vì mẫu có pH đa dạng, chứa nhiều chất diệp lục, nhựa, chất béo... Do vậy giai đoạn làm sạch mẫu rất quan trọng, giúp cho việc tăng khả năng phát hiện, giảm ảnh hƣởng của nền mẫu 29 3.2.4.1. Loại tạp bằng SPE (chiết pha rắn) Chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) là một phƣơng pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất đƣợc chiết từ pha lỏng vào pha rắn. Pha rắn thƣờng là các hạt nhỏ, xốp đƣợc đóng vào các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tƣơng tác với pha rắn sẽ đƣợc giữ lại trên ống. Các chất này đƣợc rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp. Thông thƣờng thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dịch ban đầu. Vì thế qua SPE, ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bƣớc làm giàu mẫu. Từ lâu kỹ thuật này còn đƣợc dùng để tinh chế dịch chiết lỏng – lỏng. Nhƣng ngày nay không những là kỹ thuật tách chiết độc lập mà còn đƣợc cài đặt vào hệ thống GC hoặc HPLC. Kỹ thuật này có nguyên tắc cơ bản giống nhƣ sắc ký cột. Thƣờng đƣợc áp dụng để đạt mục đích khác nhau: - Để xác định mức độ phân cực của hợp chất chƣa biết. - Để làm đậm đặc một hợp chất đang ở trong một dung dịch rất loãng với thể tích lớn. - Để phân chia cao thô ban đầu thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau. - Để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên cần khảo sát ra khỏi cao thô ban đầu, hoặc ở giai đoạn cuối muốn tinh chế mẫu hợp chất. Ƣu điểm của kỹ thuật SPE: - Đơn giản, nhanh, không tạo nhũ, tiết kiệm dung môi. - Khả năng tinh chế cao, không hƣ hay mất mẫu thích hợp với GC, HPLC đặc biệt với các mẫu phân cực - Kết quả lặp lại, tỷ lệ hồi phục cao. - Tin cậy, không nhiễm vì không sử dụng lại. - Có thể làm hàng loạt, có thể tự động hóa Nhƣợc điểm: đắt Ngày nay, kỹ thuật này đƣợc dùng rất phổ biến do khả năng làm sạch và làm giàu mẫu tốt. Tuy nhiên, ứng dụng này còn có một số hạn chế trong phân tích đa dƣ lƣợng thuốc BVTV. Do mỗi loại chỉ thích hợp với từng loại hoạt chất khác nhau nên gây khó khăn trong quá trình phân tích đồng thời nhiều thuốc BVTV thuộc các nhóm khác nhau. 3.2.4.2. Loại tạp bằng sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lƣợng lớn từ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần. 30 Tách sản phẩm bằng sắc ký cột silicagel, cỡ hạt 40-60 micromet, hệ dung môi rửa giải là cloroform – methanol (97:3). Xác định phân đoạn chứa hai chất phân tích bằng HPLC so sánh với hỗn hợp hai chuẩn, loại bỏ các phân đoạn chứa các chất khác trong nền mẫu. Tập trung các phân đoạn dung dịch chứa sản phẩm, cô thu hồi dung môi thu đƣợc cắn chứa mẫu phân tích. Hòa mẫu vào dung môi thích hợp để tiến hành phân tích. 3.2.4.3. Loại tạp bằng than hoạt tính Có thể tẩy màu của dung dịch chiết bằng cách cho dung dịch này chảy ngang qua một cột tƣơng đối ngắn có chứa than hoạt tính hoặc sử dụng một becher chứa dung dịch chiết, cho than hoạt tính vào. Để yên rồi lọc bỏ bột than. Việc sử dụng than hoạt tính này có tác dụng hấp phụ rất tốt các chất màu có trong thực vật đối với các bộ phận trên mặt đất nhƣ clorophyll a và b, caroten, xantophyl nhƣng có nhƣợc điểm là có thể hấp thu luôn các hợp chất cần khảo sát. Ví dụ có thể hấp thu alcaloid nhƣ morphin, strychnin, quinin 3.2.5. Đánh giá phƣơng pháp chiết và làm sạch Dựa vào hiệu suất hay tỷ lệ thu hồi (ký hiệu là R %) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm đƣợc tạo ra từ mẫu dƣợc liệu (mẫu trắng) bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phƣơng pháp đã nêu, phân tích sắc ký xác định hiệu suất thu hồi. - Mẫu trắng: mẫu dƣợc liệu không có chứa chất cần khảo sát. - Mẫu tự tạo: đƣợc tạo ra từ mẫu dƣợc liệu (mẫu trắng) bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Cho vào bình nón 5 g dƣợc liệu sạch đã thêm hai chuẩn azoxystrobin và imidacloprid với nồng độ lần lƣợt là 4 ppm và 1,6 ppm để tạo mẫu nhiễm chứa chất phân tích có nồng độ mong muốn. - Tiến hành khảo sát độ thu hồi: chiết và làm sạch theo các phƣơng pháp đã nghiên cứu. Tiến hành phân tích trên HPLC/UV-Vis để đánh giá độ thu hồi. - Tiêu chuẩn đánh giá phương pháp chiết: áp dụng tiêu chuẩn ghi trong USP hoặc Dƣợc điển Châu Âu, phƣơng pháp chiết trong phân tích dƣ lƣợng đƣợc chấp nhận nếu nhƣ 70 % ≤ R % ≤ 110 %. 3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP Việc thẩm định qui trình định lƣợng gồm các tiêu chí: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng dựa theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, Quyết định của Cục trƣởng Cục Quản lý Dƣợc, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013. 3.3.1. Tính phù hợp hệ thống 31 Tính phù hợp hệ thống là phần không thể thiếu của một phƣơng pháp. Đƣợc dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp. Pha dung dịch hai chuẩn với nồng độ azoxystrobin là 0,8 µg/ml và nồng độ imidacloprid là 0,2 µg/ml. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. Tính phù hợp của hệ thống đƣợc xác định dựa trên các thông số sắc ký nhƣ diện tích pic (S), thời gian lƣu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS). Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tối đa đƣợc phép cho các lần tiêm lặp lại là 2%. Ngoài ra, hệ thống phải đạt các yêu cầu sau: - Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5). - Độ phân giải giữa pic chính và pic phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5). 3.3.2. Tính đ c hiệu Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu tự tạo ở mục 3.2.5 Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của chất chuẩn. - Sắc ký đồ mẫu tự tạo: phải cho pic có thời gian lƣu tƣơng tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Nếu trên sắc ký đồ mẫu tự tạo có xuất hiện thêm một pic khác (pic tạp), phải đáp ứng yêu cầu về độ phân giải giữa pic chính và pic phụ lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5) của phƣơng pháp sắc ký lỏng đƣợc quy định trong Dƣợc điển Việt Nam IV. 3.3.3. Tính tuyến tính Chuẩn bị các mẫu thử có nồng độ azoxystrobin/imidacloprid là 0,32/0,08 µg/ml; 0,64/0,16 µg/ml; 0,8/0,2 µg/ml; 0,96/0,24 µg/ml; 1,28/0,32 µg/ml tƣơng ứng với 40 %, 80 %, 100 %, 120 % và 160 % so với nồng độ sử dụng ở thử tính phù hợp hệ thống, mỗi mẫu tiêm 3 lần, xác định diện tích pic, tính giá trị trung bình. Đánh giá: - Vẽ đƣờng biểu diễn của diện tích pic trung bình theo nồng độ phân tích. - Xác định các hệ số Bo (độ dốc), B (tung độ gốc), R 2 (bình phƣơng của hệ số tƣơng quan) của phƣơng trình hồi quy (ŷ = B0x + B). Thƣờng chấp nhận sự tuyến tính khi 0,995 ≤ R2 ≤ 1. - Sử dụng “phân tích hồi quy” để kiểm tra tính thích hợp của phƣơng trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy. 32 3.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng Phƣơng pháp phân tích thuốc BVTV phải đáp ứng yêu cầu để phân tích đƣợc ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng MRL (0,01 mg/kg hay 10 µg/kg). LOD là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng không nhất thiết để có thể định lƣợng đƣợc. LOQ là lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫ thử để có thể định lƣợng đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ là một thông số của phép định lƣợng các chất có nồng độ thấp trong mẫ thử, đặc biệt thƣờng đƣợc dùng để xác định tạp chất và hoặc sản phẩm phân hủy. Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) đƣợc sử dụng để đánh giá LOD và LOQ. Trong đó, S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền. - LOD đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 3. - LOQ đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 10. 3.3.5. Độ chính xác Độ chính xác của phƣơng pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian. - Độ lặp lại Thực hiện bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần. - Độ chính xác trung gian Tiến hành nhƣ độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau với cùng điều kiện làm việc và ngƣời thực hiện. Yêu cầu: phƣơng pháp phân tích đạt độ chính xác khi giá trị RSD của hàm lƣợng hai hoạt chất đƣợc xác định từ 6 mẫu thử trong một ngày và 6 mẫu thử trong ngày khác đều có RSD ≤ 2 %. 3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) Chuẩn bị 9 mẫu thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120%. Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu. Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần. Tính diện tích pic và dựa vào phƣơng trình hồi quy suy ra nồng độ tìm thấy. So với nồng độ khi pha sẽ tính ra tỷ lệ phục hồi. t s R% x100M M  Ms: nồng độ khi pha (µg/ml) 33 Mt: nồng độ tìm thấy (µg/ml) từ phƣơng trình hồi quy của đƣờng tuyến tính Yêu cầu: - Tỷ lệ phục hồi phải trong khoảng 98 –102%. - RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ Trƣờng hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp. 34 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT MẪU HCBVTV TRONG DƢỢC LIỆU RỄ, LÁ ĐINH LĂNG TƢƠI VÀ KHÔ Để phân tích HCBVTV bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò UV-Vis, các bƣớc cơ bản trong qui trình phân tích bao gồm: - Tách chiết HCBVTV ra khỏi mẫu bằng dung môi. - Loại màu và tinh chế mẫu. - Làm giàu mẫu phân tích. - Phân tích HPLC với điều kiện tối ƣu. 4.1.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu Cho vào bình nón 5 g dƣợc liệu lá Đinh lăng đã thêm hai chuẩn, cho tiếp khoảng 20 ml dung môi chiết. Lắc siêu âm khoảng 10 phút. Lọc lấy dịch chiết lần 1. Lặp lại qui trình 3 lần. Gộp dịch chiết 3 lần lại. Tiến hành loại tạp sơ bộ bằng cách lắc với 10 ml H2O. Loại bỏ lớp nƣớc, lớp còn lại đem đi cô thu hồi dung môi bằng bếp đun cách thủy ở nhiệt độ 50 oC. Hòa cắn với 10 ml ACN, lắc với khoảng 10 ml PE. Lấy lớp ACN đem cô còn khoảng 3 ml. Chấm dịch chiết lên bản mỏng và tiến hành SKLM với hệ dung môi cloroform – ethylacetat = 1 : 1. Sau đó quan sát dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 nm. Hình 4.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết 1 2 3 4 5 C 35 Nhận xét: Qua khảo sát 5 dung môi chiết trên SKLM theo thứ tự lần lƣợt là aceton, ethyl acetat, acetonitril, diclorometan và methanol. Cho kết quả nhƣ sau: - Dung môi aceton và methanol: dịch chiết chứa nhiều tạp và có màu xanh rất đậm. Do dung môi chiết chất phân tích và đồng thời chất luôn cả chất diệp lục, chất màu có trong lá. - Dung môi ethyl acetat, acetonitril và diclorometan: dịch chiết chứa ít tạp. Nhƣng với cả ba dung môi này thì chỉ có diclorometan là tan tốt nhất hai chất cần phân tích. Vậy chọn dung môi chiết thích hợp nhất là diclorometan. 4.1.2. Khảo sát phƣơng pháp loại tạp Cũng giống nhƣ đối với các mẫu rau quả, dịch chiết HCBVTV từ dƣợc liệu thƣờng có màu, lẫn nhiều tạp chất (đặc biệt là các dƣợc liệu có bộ phận dùng phía trên mặt đất) nên cần phải loại màu và tạp trƣớc khi phân tích. Có nhiều phƣơng pháp làm sạch khác nhau, mỗi phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm riêng và cần khảo sát để áp dụng một cách kinh tế, hiệu quả nhất và phù hợp với trang thiết bị có sẵn. Ở đây chúng tôi không khảo sát phƣơng pháp loại tạp bằng SPE, do không đủ điều kiện và trang thiết bị. 4.1.2.1. Chiết lỏng – lỏng Cho vào bình nón 5 g dƣợc liệu lá Đinh lăng đã thêm hai chuẩn, cho tiếp khoảng 20 ml DCM. Lắc siêu âm khoảng 10 phút. Lọc lấy dịch chiết lần 1. Lặp lại qui trình 3 lần. Gộp dịch chiết 3 lần lại. Tiến hành loại tạp sơ bộ bằng cách lắc với 10 ml H2O. Loại bỏ lớp nƣớc, lớp còn lại đem đi cô thu hồi dung môi bằng bếp đun cách thủy ở nhiệt độ 50 oC. Hòa cắn với 10 ml ACN, lắc với khoảng 10 ml PE. Lấy lớp ACN đem cô còn khoảng 3 ml. Chấm dịch chiết lên bản mỏng và tiến hành SKLM với hệ dung môi cloroform – ethylacetat = 1 : 1. Sau đó để quan sát dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 nm. 36 Hình 4.2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp loại tạp bằng chiết lỏng – lỏng Nhận xét: Qua quá trình chiết lỏng - lỏng nhận thấy dịch chiết vẫn còn tạp nhƣng không đáng kể và không ảnh hƣởng đến kết quả nên lấy trực tiếp dịch chiết sau khi đã chiết lỏng - lỏng đem cô bớt dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC/UV-Vis. 4.1.2.2. Chiết lỏng – lỏng và than hoạt Qui trình chuẩn bị mẫu tƣơng tự nhƣ trên. Sử dụng thêm phƣơng pháp loại tạp bằng than hoạt. Cho khoảng 0,1 g than hoạt vào dịch chiết, sau đó rửa giải 3 phân đoạn. Mỗi phân đoạn sử dụng 10 ml ACN. Gộp các phân đoạn, đem cô còn 3 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC/UV-Vis. T I A Chú thích T: mẫu dịch chiết I: chuẩn imidacloprid A: chuẩn azoxystrobin 37 Hình 4.3. Kết quả khảo sát loại tạp bằng than hoạt Nhận xét: kết quả cho thấy than hoạt có khả năng hấp phụ tốt chất màu cho kết quả sắc ký đồ tách tốt nhƣng độ thu hồi thấp chỉ khoảng 50 – 70% 4.1.2.3. Chiết lỏng – lỏng và silicagel Khả năng loại màu phụ thuộc vào bản chất chất hấp phụ và dung môi rửa giải. Trong phân tích sắc ký, silicagel là chất hay đƣợc sử dụng để loại tạp, khử màu do có diện tích bề mặt lớn và có khả năng hấp phụ cũng nhƣ lƣu giữ các chất màu. Hình 4.4. Kết quả khảo sát loại tạp bằng silicagel 38 Nhận xét: kết quả cho thấy silicagel giữ lại chất nhựa và loại bỏ đƣợc một số chất màu trong dịch chiết. Độ thu hồi của phƣơng pháp này khoảng 70 - 80% tùy vào loại nền mẫu. 4.1.3. Đánh giá phƣơng pháp chiết và làm sạch Bảng 4.1. Kết quả độ thu hồi của phƣơng pháp chiết và làm sạch HCBVTV Bộ phận của cây Đinh lăng Phƣơng pháp sử dụng Hàm lƣợng chuẩn thêm (ppm) Hàm lƣợng thu đƣợc (ppm) Độ thu hồi (%) Azoxystrobin Lá LLE 4 3,6 90 LLE + than hoạt 4 2,35 59 LLE + SKC silicagel 4 3,06 76,5 Rễ LLE 4 3,48 87 LLE + than hoạt 4 2,45 61,25 LLE + SKC silicagel 4 3,34 83,5 Imidacloprid Lá LLE 1,6 1,5 94 LLE + than hoạt 1,6 1,1 68,75 LLE + SKC silicagel 1,6 1,25 78 Rễ LLE 1,6 1,45 91 LLE + than hoạt 1,6 1,17 73 LLE + SKC silicagel 1,6 1,23 77 39 Hình 4.4. Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên rễ Đinh lăng Hình 4.5. Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên lá Đinh lăng 91 73 77 87 61.25 83.5 0 20 40 60 80 100 LLE LLE + than hoạt LLE + SKC Độ thu hồi (%) của hai thuốc BVTV trên rễ Đinh lăng Imidacloprid Azoxystrobin 94 68.75 78 90 59 76.5 0 20 40 60 80 100 LLE LLE + than hoạt LLE + SKC Độ thu hồi (%) của hai thuốc BVTV trên lá Đinh lăng Imidacloprid Azoxystrobin 40 Nhận xét: qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy độ thu hồi của phƣơng pháp LLE + than hoạt thấp chỉ khoảng 50 – 70 %. Tiếp đến là độ thu hồi của LLE + SKC và LLE gần bằng nhau đều nằm trong khoảng từ 75 – 95 %. Ở đây, lựa chọn phƣơng pháp LLE để chiết mẫu đồng thời loại tạp sơ bộ. 4.2. QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI HAI HCBVTV BẰNG HPLC/UV-VIS Trong các bƣớc phân tích trên, đầu tiên cần nghiên cứu những điều kiện tối ƣu để phân tích chất chuẩn HCBVTV trên thiết bị HPLC/UV-Vis. Tiến hành sắc ký với điều kiện đã đƣợc xây dựng nhƣ sau: - Cột sắc ký LiChrospher® RP – 18 (5 µm; 250 x 4,6 cm) LiChroCART®. - Detector UV-Vis: bƣớc sóng 250 nm - Pha động: ACN – H2O (55:45) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Quét phổ từ 250 nm 4.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 4.3.1. Tính phù hợp hệ thống Pha dung dịch hai chuẩn với nồng độ azoxystrobin là 0,8 µg/ml và nồng độ imidacloprid là 0,2 µg/ml. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. Hình 4.7. Kết quả sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống 41 Bảng 4.2. Kết quả tính phù hợp hệ thống với chất chuẩn imidacloprid Bảng 4.3. Kết quả tính phù hợp hệ thống chất chuẩn azoxystrobin Số lần tiêm mẫu tR (phút) S (µAU x giây) AS 1 3,945 22006 1.223 2 3,926 22883 1.210 3 3,937 22677 1.214 4 3,937 22535 1.213 5 3,944 23048 1.221 6 3,935 22838 1.180 Trung bình 3,937 22664 1.210 RSD 0,176 % 1,622 % Số lần tiêm mẫu tR (phút) S (µAU x giây) AS 1 12,105 45479 1.060 2 12,027 46030 1.058 3 12,078 45638 1.057 4 12,054 45057 1.054 5 12,117 45528 1.056 6 12,126 45448 1.060 Trung bình 12,084 45530 1.058 RSD 0,321 % 0,691 % 42 Nhận xét: Kết quả ở bảng 4.2 và 4.3 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối của thời gian lƣu (tR); diện tích pic (S) đều không quá 2 %; hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5. Khẳng định rằng hệ thống có tính phù hợp, có thể tiếp tục tiến hành những bƣớc đánh giá tiếp theo với điều kiện sắc ký tƣơng tự. 4.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng (Lê Hữu Bảo Trân, 2017) Bảng 4.4. Kết quả giới hạn định lƣợng và giới hạn phát hiện của hai HCBVTV trên thiết bị phân tích HPLC/UV-Vis HCBVTV LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) Azoxystrobin 0,048 0,16 Imidacloprid 0,0048 0,016 Nhận xét: Các kết quả cho thấy, đối với HPLC/UV-Vis cả hai chất có thể định lƣợng trên nền mẫu nghiên cứu tƣơi và khô tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng giá trị MRL (10 µg/kg hay 0,01 mg/kg). 4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG HAI HCBVTV TRÊN CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP Áp dụng các qui trình xử lý mẫu và phân tích dƣ lƣợng thuốc BVTV trong dƣợc liệu đã xây dựng, đề tài đã tiến hành phân tích sàng lọc dƣ lƣợng thuốc BVTV trong 12 mẫu, bao gồm hai loại: - Rễ tƣơi và khô - Lá tƣơi và khô 43 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát HCBVTV trong cây Đinh lăng lá nhỏ STT Kí hiệu Bộ phận dùng Hoạt chất Hàm lƣợng (mg/kg) S (µAU x giây) I A I A I A 1 M1 Rễ khô + - 0,27 51256 2 M2 Rễ tƣơi + - 0,16 30088 3 M3 Rễ khô + - 0,5 88859 4 M4 Rễ tƣơi + - 0,48 91086 5 M5 Rễ khô + - 0,14 27498 6 M6 Rễ tƣơi + +* 0,2 38022 5170 7 M1 Lá tƣơi - - 8 M2 Lá tƣơi + + 1,3 0,56 246966 52650 9 M3 Lá khô + - 1,76 335499 10 M4 Lá khô + - 0,3 54075 11 M5 Lá tƣơi + - 0,5 95910 12 M6 Lá khô - - Chú thích: + : dƣơng tính, mẫu có chất phân tích - : âm tính, mẫu không có chất phân tích + * : dƣơng tính nhƣng hàm lƣợng thấp I : imidacloprid A : azoxystrobin Nhận xét: qua kết quả khảo sát ở Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp cho thấy trong tổng số 12 mẫu, có đến 10/12 phát hiện thấy imidacloprid và 2/12 mẫu phát hiện có azoxystrobin. 44 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP Việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc ở các địa phƣơng là một hiện tƣợng phổ biến giúp tăng năng suất cây trồng. Nhƣng do thiếu hiểu biết và có thể không đƣợc hƣớng dẫn một cách cụ thể nên đã sử dụng tùy tiện với nồng độ vƣợt quá mức qui định cho phép, gây ra những hệ lụy lớn cho môi trƣờng sinh thái xung quanh, cho ngƣời tiêu dùng và cho chính cả những ngƣời nông dân đang tiếp xúc hằng ngày với chất độc. Ngày nay, thuốc BVTV đƣợc sử dụng rất đa dạng do sự phát triển của công nghệ hóa học hóa chất mới đƣợc tổng hợp rất nhiều, cùng với công thức pha trộn và phối hợp các hoạt chất đã tạo ra nhiều loại thuốc BVTV mới. Trong đó cũng có một số thuốc BVTV có độc tính thấp và thân thiện với môi trƣờng. Nhìn chung sự hiểu biết của ngƣời nông dân về độc hại và quy trình sử dụng thuốc BVTV còn nhiều hạn chế do đó cần phải tuyên truyền, giải thích và hƣớng dẫn đầy đủ hơn nhằm đảm bảo chất lƣợng và năng suất dƣợc liệu, an toàn cho ngƣời sử dụng và giảm gây ô nhiễm môi trƣờng. 5.2. VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV Trong nghiên cứu này lựa chọn hai HCBVTV là imidacloprid và azoxystrobin vì đây là hai loại sử dụng nhiều trong trồng cây thuốc, đặc biệt ở cây Đinh lăng lá nhỏ. Trong đó, hai chất này chƣa có qui định MRL trên nền mẫu dƣợc liệu. Vì vậy đã tham khảo một số MRL của một số loại rau, củ đƣợc ngƣời tiêu dùng sử dụng hằng ngày. Trong đó, mức MRL của imidacloprid trong khoảng 0,5 – 2 mg/kg, mức MRL của azoxystrobin trong khoảng 0,1 – 5 mg/kg. Qua tham khảo các phƣơng pháp xử lý mẫu đã đƣợc công bố, đối với phân tích dƣ lƣợng, phƣơng pháp đƣợc ƣu tiên lựa chọn là chiết lỏng – lỏng, sau đó đem mẫu phân tích bằng HPLC/UV-Vis. Kỹ thuật đều đáp ứng yêu cầu về khả năng làm sạch, làm giàu mẫu tốt, thời gian xử lý mẫu không kéo dài, hiệu suất chiết và khả năng lặp lại của kết quả phân tích tƣơng đối tuy chƣa đƣợc cao. 5.3. VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV TRONG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ: Qua kết quả khảo sát ở Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp cho thấy trong tổng số 12 mẫu, có 10/12 phát hiện thấy imidacloprid và 2/12 mẫu phát hiện có azoxystrobin. Trong đó có một mẫu có phát hiện azoxystrobin nhƣng với hàm lƣợng quá thấp chƣa đến ngƣỡng định lƣợng nên chỉ định tính và phát hiện. Đối với một số mẫu có hàm 45 lƣợng cao thì có thể do mới vừa đƣợc phun thuốc nhƣng đều nằm trong ngƣỡng cho phép. Nhƣ vậy, cho thấy rằng việc sử dụng thuốc BVTV trong trồng cây thuốc có để lại dƣ lƣợng. Vì thế hiện nay, việc kiểm tra dƣ lƣợng thuốc BVTV là một quá trình phức tạp, tốn kém nhƣng thực sự cần thiết vì nó ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khoẻ của ngƣời sử dụng. Hơn bao giờ hết, vấn đề chất lƣợng dƣợc liệu và nông sản đảm bảo đƣợc những tiêu chuẩn của quốc tế về an toàn thực phẩm, đặc biệt là đạt đƣợc chuẩn về dƣ lƣợng thuốc BVTV tối đa cho phép phải đƣợc đặt lên hàng đầu. 46 KIẾN NGHỊ Ngày nay có rất nhiều loại thuốc BVTV ra đời. Cần thiết phải có những qui định về kiểm soát một số thuốc BVTV mới hiện nay. Song song, cần phải tăng cƣờng giám sát, hậu kiểm về dƣ lƣợng HCBVTV trong dƣợc liệu và các sản phẩm dƣợc liệu. Cần đẩy mạnh việc diệt sâu bọ, mốibằng các loài thiên địch để hạn chế việc sử dụng thuốc BVTV ở mức thấp nhất nhằm tránh đƣợc việc tồn dƣ thuốc BVTV trên cây trồng. Khuyến cáo ngƣời dân thực hiện đúng qui định về sử dụng an toàn thuốc BVTV. Cần bổ sung, hoàn thiện các mức MRL đối với dƣợc liệu và các sản phẩm từ dƣợc liệu. Tuân thủ chặt chẽ các tiêu chuẩn quốc tế về nông sản và thực phẩm. Tăng cƣờng quản lý nhà nƣớc về thuốc BVTV, cũng nhƣ tuyên truyền, khuyến cáo cho nông dân về thiệt hại do thuốc trừ sâu gây ra, niêm yết cấm sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật không nằm trong Danh mục đƣợc phép sử dụng ở Việt Namlà những việc cần làm tích cực, thƣờng xuyên. Tiếp tục nghiên cứu phân tích dƣ lƣợng các thuốc BVTV khác trong các cây thuốc dƣợc liệu. Hƣớng đến mục tiêu phân tích đồng thời đa dƣ lƣợng thuốc BVTV trong một lần phân tích nhằm rút ngắn thời gian, đạt hiệu quả về kinh tế. Bên cạnh đó phải lƣu ý đến khả năng có thể áp dụng rộng rãi ở Việt Nam, chi phí nguyên vật liệu không quá đắt, chọn các kỹ thuật đơn giản, kinh tế, sử dụng dung môi ít độc hại, có thể áp dụng rộng rãi để xây dựng qui trình chiết chính thức phục vụ công tác kiểm tra đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu về mặt dƣ lƣợng thuốc BVTV. Thiết nghĩ, việc kiểm soát dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm là một hƣớng đi bền vững trong nông nghiệp nói chúng, cũng nhƣ phát triển dƣợc liệu nói riêng, giúp Việt Nam có đƣợc vị thế trên thị trƣờng dƣợc liệu quốc tế. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anastassiades M., Lehotay S.J., Stajnbaher D., and Schenck F.J. (2003). Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC international, 86(2). p. 412 – 431. 2. AOAC Official Method 2007.01(2007). Pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate gas chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography/tandem mass spectrometry. AOAC International Institute. 3. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013). Thông tƣ số: 21/2013/TTBNNPTNT ngày 17 tháng 4 năm 2013 Ban hành danh mục thuốc bảo vệ thực vật đƣợc phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng và danh mục bổ sung giống cây trồng đƣợc phép sản xuất, kinh doanh ở Việt Nam. 4. Bộ Y Tế (2016). Thông tƣ số 50/2016/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2016 Về việc ban hành: Qui định giới hạn tối đa dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm. 5. Đỗ Huy Bích và cs. (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc, tập I. NXB. Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 6. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học.p. 828. 7. Ehab M.H. Abdelraheem, Sayed M. Hassan, Mohamed M.H. Ariefc, Somaia G. Mohammad (2015). Validation of quantitative method for azoxystrobin residues in green beans and peas. Food Chemistry 182. p. 246–250. 8. EN 15662 (2009). Foods of plant origin - Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE – QuEChERS –method, Austrian Standards Institute. 9. Fishel F.M. (2013). Pesticide toxicity profile: Neonicotinoid pesticides, University of Florida. 10. Dr. Katerina Mastovska (2011). First draft prepared. Agricultural Research Service. United States Department of Agriculture, Wyndmoor, PA, USA. 11. Lê Hữu Bảo Trân (2017). Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phƣơng pháp HPLC/UV-Vis. Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, trƣờng Đại học Tây Đô. 12. Michelangelo Anastassiades, Ellen Scherbaum and Dorothea Bertsch (2003). Validation of a simple and rapid multiresidue method (QuEChERS) and its implementation in routine pesticide analysis. Poster presented at the MGPR Symposium. Aix en Provence, France. 13. Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2009). Tìm hiểu thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Polyscias họ Nhân Sâm (Araliaceae). Luận án Tiến sĩ, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM. 14. Nguyễn Thị Bích Thu (2009). Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khối phổ để phân tích dƣ lƣợng một số hóa chất bảo vệ thực vật thƣờng dùng. Viện Dƣợc liệu, Bộ Y Tế. 15. PGS.TS. Nguyễn Thƣợng Dong, TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2007). Sâm Việt Nam và một số cây thuốc thuộc họ Nhân Sâm. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 16. Olalla López-Fernández, Raquel Rial-Otero, Jesus Simal-Gándara (2015). High-throughput HPLC–MS/MS determination of the persistence of neonicotinoid insecticide residues of regulatory interest in dietary bee pollen. Anal Bioanal Chem 407. p. 7101–7110. 17. P.V. Shah and David Ray (2011). First draft prepared. United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticide Programs,Washington DC, USA and School of Biomedical Sciences, University of Nottingham, Queens Medical Centre,Nottingham, England. 18. Raihanah, C., Zailina, H., Ho, Y. B., Saliza, M. E. and Norida, M. (2015). Ultra high performance liquid chromatography technique to determine imidacloprid residue in rice using QuEChERS method. International Food Research Journal. p. 1396-1402. 19. Robert Krieger (2001). Handbook of Pesticide Toxicology, Two volume set: Principles ang agents. Volume 1. p.1125. 20. Trần Cao Sơn (2015). Nghiên cứu xác định dƣ lƣợng hoá chất bảo vệ thực vật trong dƣợc liệu và sản phẩm từ dƣợc liệu bằng sắc ký khối phổ. Luận văn Tiến Sĩ, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 21. T. Nageswara Rao, A. Ramesh , T. Parvathamma And G. Suresh (2012). Development and validation of a HPLC-UV method for simultaneous determination of strobilurin fungicide residues in tomato fruits followed by matrix solid-phase dispersion (MSPD). Indian J.Sci.Res.3(1). p. 113-118. 22. Trần Văn Hai (2009). Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật. Trƣờng Đại học Cần Thơ. 23. Ursula Banasiak (2011). First draft prepared. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry (BBA), Kleinmachnow, Germany. 24. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, and Cristina Delerue-Matos (2011). Determination of pesticides in Fruit and Fruit Juices by Chromatographic Methods. An Overview. Journal of Chromatographic Science, Vol. 49. Website 25. Truy cập ngày 12 tháng 5 năm 2017. 26. cay-sam-cua-nguoi-ngheo/c/22142466.epi.Truy cập ngày 12 tháng 5 năm 2017. 27. nguoi/.Truy cập ngày 15 tháng 5 năm 2017. 28. 2016012806252923.htm. Truy cập ngày 15 tháng 5 năm 2017. 29. ve-thuc-vat.html. Truy cập ngày 10 tháng 5 năm 2017. 30. trang-su-dung-thuoc-bao-ve-thuc-vat-trong-nong-nghiep-o-Viet-Nam- 47911.html. Truy cập ngày 12 tháng 5 năm 2017. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ mẫu Rễ tƣơi Đinh lăng tR (phút) S (µAU x giây) M4RT-01 3,964 90121 M4RT-02 3,984 92051 Chuẩn imidacloprid 0,2 µg/ml 3,945 22006 Chuẩn azoxystrobin 0,8 µg/ml 12,105 45479 Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu Rễ khô Đinh lăng tR (phút) S (µAU x giây) M1RK-01 3,990 51460 M1RK-02 3,999 51051 Chuẩn imidacloprid 0,2 µg/ml 3,945 22006 Chuẩn azoxystrobin 0,8 µg/ml 12,105 45479 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu Lá tƣơi Đinh lăng tR (phút) S (µAU x giây) M3LT-01 3,977 335162 M3LT-02 3,984 335836 Chuẩn imidacloprid 0,2 µg/ml 3,945 22006 Chuẩn azoxystrobin 0,8 µg/ml 12,105 45479 Phụ lục 4: Sắc ký đồ mẫu Lá tƣơi Đinh lăng không chứa thuốc BVTV tR (phút) S (µAU x giây) M1LT-01 3,437 80240 M1LT-02 3,385 79867 Chuẩn imidacloprid 0,2 µg/ml 3,945 22006 Chuẩn azoxystrobin 0,8 µg/ml 12,105 45479 Phụ lục 5: Sắc ký đồ mẫu Rễ khô Đinh lăng khi thêm hai chuẩn B1: Mẫu rễ khô có chứa imidacloprid B2: Mẫu rễ khô có chứa imidacloprid và thêm chuẩn azoxystrobin B3: Mẫu rễ khô có chứa imidacloprid và thêm chuẩn imidacloprid B4: Mẫu rễ khô có chứa imidacloprid và thêm chuẩn imidacloprid, azoxystrobin tR (phút) S (µAU x giây) B1 3,989 7629 B2 4,008 12,368 7509 14537 B3 3,968 34665 B4 3,976 12,303 35026 15975