Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây hồ đằng rễ mành (cissus verticillata (l.) nicolson & c.e.jarvis)

tiếng Anh) Tên khoa học: Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis Đồng danh: Cissus sicyoides L. Họ: Nho (Vitaceae) Vị trí phân loại theo hệ thống Armen Takhtalan (Takhtalan A, 2009). Thực vật bậc cao (Cormobionta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Họ Nho (Vitaceae) Bộ Nho (Vitales) Hình 2.1. Sơ đồ vị trí phân loại thực vật của HĐRM Chi Cissus Loài Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Javis 3 2.1.2. Đặc điểm họ Nho (Vitaceae) (Trương Thị Đẹp, 2007) Thân: Cây bụi leo hay dây leo thân gỗ bằng vòi cuốn mọc đối diện với lá. Lá: Đơn, mọc cách, có khía răng hoặc có thùy hình chân vịt hoặc lá kép hình chân vịt với 3 – 5 lá chét. Lá kèm nhỏ, dễ rụng. Cụm hoa: Xim, tán, ngù, chùm, đôi khi chùm kép ở nách lá hay đối diện với lá (do sự phát triển cộng trụ của thân). Hoa: Nhỏ, đều, lưỡng tính hay đơn tính vì trụy, mẫu 4 hay 5, 4 vòng. Bao hoa: 4 – 5 lá đài, 4 – 5 cánh hoa, tiền khai van; cánh hoa có thể rời hay dính nhau ở chóp như một cái nón. Bộ nhị: Số nhị bằng số cánh hoa, rời và mọc trước cánh hoa. Đĩa mật dày nằm ở phía trong vòng nhị. Bộ nhụy: 2 lá noãn dính nhau thành bầu trên 2 ô, mỗi ô 2 noãn. Quả: Mọng, chứa 2 – 4 hạt, hạt có nội nhũ. 2.1.3. Sơ lược về chi Cissus Cây bụi leo, có tua cuốn đối diện với lá. Lá đơn, thường có răng, có khi chia thùy; lá kèm 2, nhỏ. Cụm hoa có cuống, thành tán hay ngù, đối diện với lá; hoa có cuống. Đài hình đấu. Cánh hoa 4, xếp van, tách ra ở đỉnh khi hoa nở. Nhị 4, đối diện với cánh hoa, đính xung quanh đĩa; bao phấn hướng trong. Đĩa mật nguyên, lượn sóng hay chia thùy. Bầu dính suốt chiều cao với đĩa mật; 2 ô, 2 noãn cong; vòi dạng cột; đầu nhụy ít rõ. Quả mọng hơi nạc; hạt độc nhất, có 2 hố nhỏ ở gốc (Võ Văn Chi, 2004; Phạm Hoàng Hộ, 2000). Gồm tới 350 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới và vùng nóng. Ở nước ta có một số loài được sử dụng (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000): - Cissus adnata Roxb. Dây nôi. - Cissus annamica Gagn. Hồ đằng trung bộ. - Cissus assamica (Laws.) Craib. Hồ đằng assam. - Cissus astrotricha Gagn. Hồ đằng lông sao. - Cissus bachmaensis Gagn. Hồ đằng bạch mã. - Cissus evrardii Gagn. Hồ đằng evrad. - Cissus hastata Pl. Hồ đằng mũi giáo. - Cissus hexangularis Thor. ex Gagn. Hồ đằng 6 cạnh. - Cissus javana DC. Hồ đằng Java, Hồ đằng hai màu. - Cissus modeccoides Pl. Chìa vôi. - Cissus quadrangulus L. Hồ đằng 4 cánh. - Cissus repens Lamk. Hồ đằng bò. - Cissus rosea Royle. Hồ đằng hường. 4 2.1.4. Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis 2.1.4.1. Mô tả hình thái - HĐRM là cây leo tua cuốn, cao 5 – 7 m hoặc hơn, phân nhiều cành mảnh, nhẵn, có hệ thống rễ bất định mọc ở các nách lá chạy dọc suốt thân cành. Những rễ này buông thòng mềm mại, màu hồng thắm khi còn non rồi chuyển qua màu vàng xám khi già dần. - Lá mọc đơn so le, phiến lá hình tim hẹp, dài 6 – 10 cm, rộng 4 – 6 cm, cuống lá dài 2 – 3 cm, đậm màu, tua cuốn mảnh đối diện với cuốn lá. - Cụm hoa là một xim ngắn dạng tán đứng đối diện với lá, mang nhiều hoa nhỏ lưỡng tính với 4 cánh hoa màu vàng lục, 4 nhị đứng đối diện cánh hoa, bầu trên. - Quả mọng, gần hình cầu, đường kính 8 – 10 cm, chứa 1 – 4 hạt, khi chín màu đen (Nguồn dẫn: 2.1.4.2. Phân bố, sinh thái - HĐRM là cây di thực phân bố tự nhiên ở nhiều vùng của châu Mỹ, từ Bắc Mỹ cho đến Trung và Nam Mỹ. - Ở nước ta, cây được trồng làm cảnh ở nhiều nơi. 2.1.4.3. Cách trồng - Cây rất dễ trồng, chọn phần thân bánh tẻ, bỏ lá, chỉ chừa một phần cuống, cắt thành từng đoạn có từ hai đến ba mắt lá để làm hom giâm, cắm trong những túi bầu (Nguồn dẫn: Hình 2.2. Cây Hồ đằng rễ mành 5 - Che nắng và theo dõi để tưới nước bổ sung sao cho vừa đủ ấm. Sau một thời gian, các chồi nách phát triển thành cành mới thì đem túi bầu đi trồng (Nguồn dẫn: ; 2.1.4.4. Thu hái, chế biến - Lá tươi, thân hay rễ rửa sạch, đun với nước để ngâm chân (Nguồn dẫn: . - Thân, lá, rễ giã lấy nước giữ luôn bã để đắp lên vết bỏng hay vết ngứa, ngoài ra có thể phơi khô để nguyên hoặc nghiền thành bột (Nguồn dẫn: 2.2. Thành phần hóa học Các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây HĐRM không nhiều. Theo Barbosa W.L.R. et al (2002); Beltrame F.L. et al (2001), trong cây HĐRM có flavonoid với 2 cấu trúc chính là: Kaemferol – 3 – O – rhamnosid và quercetin – 3 – O – rhamnosid. Luteolin, kaempferol, luteonin – 3 – sulfat được chiết từ dung dịch nước sau khi thủy phân. 2.3. Một số tác dụng dược lý của HĐRM 2.3.1. Tác dụng hạ đường huyết Theo Almeida E.R., et al (2007), dịch chiết lá tươi của cây HĐRM làm giảm đáng kể lượng đường trong máu ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Theo Pepato M.T., et al (2003), việc sử dụng lâu dài dịch của lá cây HĐRM ảnh hưởng đến các biến đổi sinh lý và trao đổi chất của carbohydrat, lipid, protein của chuột bị bệnh tiểu đường. Kaempferol – 3 – O – rhamnosid CTPT: C21H20O10 Quercetin – 3 – O – rhamnosid CTPT: C21H21O11 6 Theo Viana G.S.B., et al (2004), chỉ ra lợi ích tiềm năng của dịch chiết nước từ cây HĐRM trong việc làm giảm đường huyết trong máu trên chuột bị bệnh tiểu đường type 2. 2.3.2. Tác dụng chống dị ứng và chống viêm Theo Quilez A.M., et al (2004), cho thấy tác dụng chống dị ứng và chống viêm thông qua thử nghiệm in vitro phóng thích histamin từ tế bào mast của dịch chiết methanol trong cây HĐRM. 2.4. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa 2.4.1. Khái niệm về gốc tự do Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (ROS và RNS), là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do. Bảng 2.1. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học O2•– Gốc superoxyd 1O2 Oxy đơn OH• Gốc hydroxyl NO• Oxyd nitrid ROO• Gốc peroxyd ONOO- Peroxynitrid H2O2 Hydrogenperoxyd HOCl Acid hypochlorique Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh nó do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989; Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998). Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể. Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: Điều hòa phân ly tế bào, kích hoạt các yếu tố phiên mã cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm và điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: Đột biến ở ADN, biến tính protein, oxy hóa lipid (Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998). Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm. Sự oxy hóa của các LDL dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh tăng huyết áp và nhiều bệnh tim mạch. Các ROS và RNS tấn công phospholipid màng tế bào làm thay đổi tính mềm dẻo của màng, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên màng do đó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng cũng như việc trao đổi thông tin giữa tế bào và môi trường. Sự oxy hóa 7 các ADN bởi các ROS và RNS gây nên biến dị di truyền là một trong những nguy cơ phát triển ung thư. Nhiều enzym và protein vận chuyển cũng bị oxy hóa và vô hoạt bởi ROS và RNS (Favier A., 2003; Gardès – Albert M., et al, 2003; Pincemail J., et al, 1998). Sự tích lũy các sản phẩm của sự oxy hóa các cấu tử tế bào gây nên hiện tượng lão hóa sớm. Các ROS và RNS cũng tham gia vào quá trình gây các bệnh suy giảm hệ thần kinh như Alzheimer, trong đó hiện tượng chết của các tế bào thần kinh gắn liền với hiện tương phân ly tế bào gây nên bởi các ROS và RNS (Gardès – Albert M., et al, 2003). Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của các ROS và RNS, tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ gồm các chất chống oxy hóa. 2.4.2. Chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic S.V., et al 2000; Lachman J., et al, 2000; Singh N., et al, 2004). Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: Các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo thành gốc tự do như đồng, sắt; vô hoạt oxy đơn). Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn: Bên trong và bên ngoài. Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritin, transferrin, albumin, protein sốc nhiệt) và các enzym chống oxy hóa (superoxyd dismutase, glutathion peroxidase, catalase). Các chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamin E, vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki E., et al, 1995; Lachman J., et al, 2000; Pincemail J., et al, 1998; Vansant G., et al, 2004). Các chất này có nhiều trong rau và quả. Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa. 2.4.3. Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử. Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzym hoặc không enzym, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp (Viện Dược liệu, 2006). 8 2.4.3.1. Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy. Trong ty lạp thể có một hệ thống enzym và các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy. Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyền nối tiếp nhau gọi là chuỗi hô hấp tế bào (Viện Dược liệu, 2006). Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai đoạn. Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận được một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo ra gốc superoxyd (O2•–). Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể. Khoảng 80 % lượng O2•– hình thành chuyển vào trong ty lạp thể, còn 20 % thoát ra bào tương. O2•– có các chức năng như sau: Là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO2 và các chất phóng thải từ tế bào thành tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch (Viện Dược liệu, 2006). Các gốc O2•– hình thành nhanh chóng được enzym SOD chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử: H2O2 là tác nhân oxy hóa và dễ dàng bị phân hủy theo phản ứng: Như vậy, ở cơ thể bình thường, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2•–, H2O2 để thực hiện các chức năng sinh lý. Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.3.2. Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên Rất có thể do chuyển động nhiệt hoàn toàn ngẫu nhiên mà các gốc O2•– và H2O2 va đập với nhau, không có men đặc hiệu xúc tác tạo ra một số phản ứng phụ sau (Viện Dược liệu, 2006):  Sự hình thành gốc tự do không có enzym SOD xúc tác Các gốc O2•– có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện không có enzym SOD xúc tác theo phản ứng sau: O2•– + O2•– + 2H+ → H2O2 + O2 Cơ chất 9 Oxy đơn bội (1O2) có tính oxy hóa rất mạnh. Nó có thể phản ứng với bất kỳ một chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd.  Phản ứng Harber – Weiss Các gốc O2 •– va đập với H2O2: O2•– + H2O2 → 1O2 + OH• + OH- Phản ứng này xảy ra chậm, nhưng có mặt Fe2+, Cu2+ xúc tác thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton). Hai tiểu phân O2•– và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2, OH• là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm có hại cho cơ thể.  Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp Ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2 thành gốc OH•. H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH• + OH- Bình thường phản ứng này trong sinh học ít xảy ra, vì H2O2 ở nồng độ thấp còn Fe2+, Cu2+ thường bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do. Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2•–. Phản ứng này đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do xảy ra. Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2•– Cu+1 + O2 → Cu2+ + O2•– Như vậy, từ 4 tiểu phân O2•–, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp biến sinh ra gốc OH• và 1O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh. Gốc OH• phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn thương lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra. 2.4.4. Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do 2.4.4.1. Ảnh hưởng của các xenobiotic Đây là các chất hóa học, cơ thể không tổng hợp sẵn ra được, ví dụ như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, các hợp chất nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm. Khi xâm nhập vào cơ thể, các hóa chất này có giai đoạn trung gian tạo ra các gốc tự do (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.4.2. Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan Các hợp chất halogen hữu cơ, điển hình là CCl4 là chất gây viêm hoại tử gan. Khi vào gan được chuyển hóa như sau: Chính các dạng gốc trung gian này làm tăng quá trình peroxy hóa lipid. Quá trình peroxy hóa lipid mãnh liệt sẽ gây phá vỡ màng tế bào, gây viêm và có khả năng gây hoại tử gan (Viện Dược liệu, 2006). 10 2.4.4.3. Ảnh hưởng của tác nhân tiêu máu và bầm huyết Điển hình là các diazonaphtol, diphenylhydrazin, các chất này phản ứng với oxyhemoglobin tạo ra methemoglobin và gốc phenylhydrazin. Gốc này nhường điện tử cho oxy tạo ra O2•– (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.4.4. Ảnh hưởng của điều kiện sống  Ảnh hưởng của sự ô nhiễm môi trường Khí thải của các động cơ dùng xăng, dầu có nhiều chất độc như: CO, NO, carbuahydro tetraethyl chì. Những chất này phân hủy tạo gốc tự do như sau (Viện Dược liệu, 2006):  Ảnh hưởng của stress Cơ thể hoạt động một cách bình thường là do cân bằng nội môi đã được thiết lập. Nếu có một yếu tố nào phá vỡ cân bằng nội môi thì được gọi là tác động của stress. Khi cơ thể bị các stress như sự di chuyển và thay đổi môi trường sống, sự thay đổi nhiệt độ quá nóng hay quá lạnh, môi trường quá ồn hay bị ô nhiễm, áp lực và sự căng thẳng – lo lắng trong công việc,thì hàm lượng gốc tự do của oxy thường cao hơn 1,5 đến 2 lần so với đối chứng. Thông qua các dây thần kinh hướng tâm và vùng dưới đồi, cơ thể có những đáp ứng với các stress. Sự giải phóng ra adrenalin và noradrenalin, khi cơ thể bị stress tác động sẽ dẫn tới khả năng chuyển hóa tương tác với oxy tạo ra các gốc O2•. Đồng thời nhiều acid béo chưa no được giải phóng ra từ các lipid. Những yếu tố đó (gốc O2• tăng, acid béo chưa no tăng,) thúc đẩy quá trình peroxy hóa tăng khi bị stress (Viện Dược liệu, 2006).  Ảnh hưởng của khu vực địa lý Các bức xạ mặt trời, bức xạ nền ở một miền nào đó có phát ra những tia ảnh hưởng tới sự hình thành các gốc tự do của oxy theo cơ chế như sau: 11 (hv: Tia cực tím, tia phóng xạ) Tóm lại, do ảnh hưởng của các điều kiện sống như bị ô nhiễm quá nhiều, nhiều stress,thì gốc tự do gia tăng. Nếu sự gia tăng quá mức và kéo dài sẽ dẫn đến tình trạng mất cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy hóa. Lượng các dạng oxy hoạt động tăng sẽ gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều bệnh tật (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.5. Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do 2.4.5.1. Hệ thống phòng vệ các gốc tự do trong cơ thể Do việc sinh ra các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc bảo vệ chống lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu. Đó là sự phòng vệ của các chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể với hai phương cách tác động sau (Viện Dược liệu, 2006):  Phòng ngừa sinh ra các gốc Khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc bao gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy và sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein như: Transferrin, lactoferin, ferritin.  Phòng vệ loại bỏ các gốc đã sinh ra Ở trong tế bào quan trọng nhất là enzym SOD và hệ thống glutathion. Ở tổ chức màng thì quan trọng nhất là các chất kiểu vitamin E, ubiquinon, β – caroten loại bỏ các gốc LOO•, LO• theo phản ứng mỗi phân tử vitamin E này loại bỏ hai gốc LOO•. Ở pha nước có vai trò của vitamin C và một số chất như acid uric. Việc sửa chữa loại bỏ các phân tử sinh học đã bị tổn thương trước khi chúng tích tụ lại hoặc trước khi chúng đủ mức gây ra những biến đổi chuyển hóa và định hướng đến sự sống của tế bào. Ví dụ: Các protein đã bị oxy hóa sẽ bị proteinase phân hủy; các lipid màng sẽ bị các lipase phân hủy, acyl transferase tác động. 2.4.5.2. Hệ thống enzym chống oxy hóa ở gan Gan là cơ quan có nhiều enzym trong đó có những enzym đóng vai trò quan trọng trong nhiều việc chống oxy hóa là: Các chất chống peroxyd, enzym SOD, phân hủy các gốc tự do khác, những ion khóa kim loại chuyển tiếp, trong đó các chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu ở gan (Viện Dược liệu, 2006).  Các chất chống peroxyd 12 Đó là các chất glutathion (GSH), enzym glutathion peroxidase (GSH – Px) xúc tác phân hủy các peroxyd với hằng số tốc độ phản ứng k = 108 mol/giây theo phản ứng sau: Như vậy, hàm lượng GSH, hoạt tính enzym GSH – Px liên quan đến việc phân hủy các peroxyd. Khẩu phần ăn đủ protein và hàm lượng selen liên quan chặt chẽ với GSH và hoạt tính enzym GSH – Px. Nếu hàm lượng selen không đủ thì GSH giảm, hoạt độ enzym GSH – Px thấp. Ngoài ra, peroxysom còn có catalase phân hủy H2O2 nồng độ cao theo phản ứng sau:  Enzym superoxyd dismutase (SOD) Enzym này có khả năng phân hủy đặc hiệu các gốc O2•- với hằng số tốc độ rất lớn (k = 109 mol/giây). Bản chất enzym này là một protein có hai đồng phân là MnSOD (có trong ty lạp thể) còn có CuZnSOD có ở bào tương. Cả hai đều xúc tác phân hủy gốc O2•-.  Phân hủy các gốc tự do khác Vitamin E (α – tocopherol) là chất chống oxy hóa quan trọng ở các tổ chức màng. Mỗi phân tử vitamin E có khả năng loại bỏ bớt hai gốc LOO• theo phản ứng sau: Ngoài phản ứng trực tiếp với gốc tự do vitamin E có khả năng loại bỏ oxy đơn bội theo phản ứng sau: (vitE•: dạng oxy hóa (dạng kích thích)). Trong tế bào có nhiều chất có cấu trúc tương tự vitamin E như ubiquinon (coenzym Q10) cũng có tính chất này. Các gốc kiểu semiquinon là những gốc bền, có nồng độ khá lớn (10-8 M) so với các gốc tự do của oxy là những gốc không bền. Vì thế những gốc này có thể phản ứng với nhau tạo ra các sản phẩm không phải là gốc. 13 Vitamin C là những chất có khả năng loại bỏ các gốc tự do ở pha nước của tế bào. Ngoài ra, vitamin C còn có khả năng tái tạo vitamin E dạng oxy hóa trở về dạng khử. Những chất như acid uric huyết tương, GSH ở dịch tế bào cũng có tính chất loại bỏ các gốc tự do. Phân tử β – caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lượng kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thường và bản thân β – caroten trở thành dạng kích thích, sau đó có thể trở về trạng thái bình thường hoàn toàn bằng hiện tượng vật lý là năng lượng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng dưới dạng nhiệt. 2.4.6. Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 2.4.6.1. Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu. Nguyên tắc: - Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ dùng hydrogen làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại ở 517 nm và làm tím của DPPH nhạt dần với chất đối chiếu là acid ascorbic (vitamin C) (Amarowiez R., et al, 2004). Phản ứng minh họa: 2.4.6.2. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2- (Superoxyd scavenging) Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2-. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước + AH Chất kháng oxy hóa + A• 14 sóng λ = 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím (Lee S.M., et al, 2003). 2.4.6.3. Phương pháp xác định hàm lượng MDA MDA (Malonyl dialdehyd) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào (Viện Dược liệu, 2006). Nguyên tắc: - MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH bằng 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 OC, thời gian 10 – 15 phút. Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức, ta tính được khả năng kháng oxy hóa của hoạt chất (Viện Dược liệu, 2006). Phản ứng minh họa: 2.4.6.4. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II Nguyên tắc: - Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Khi cho ion Fe2+ phản ứng với thuốc thử Ferrozin tạo phức màu có cực đại hấp thu ở bước sóng 562 nm. - Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại dưới dạng tự do, làm mất khả năng xúc tác của kim loại. - Việc ngăn chặn tạo thành phức có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất (Lapenna D., et al, 2002). 2.4.6.5. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2- và H2O2 sinh ra từ chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng độ 15 cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra 1O2, OH• là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzym peroxydase từ cải gia vị (horseradish)) (Hosoea H., et al, 2002). 16 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Nguyên liệu Dược liệu: Toàn cây HĐRM (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis), thu hái vào tháng 10 năm 2016, tại địa bàn tỉnh Bạc Liêu. Dược liệu được cắt nhỏ, sấy ở 50 – 60 OC đến khô, xay thành bột thô. Định danh dược liệu bằng cách so sánh hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột với các thông tin trên tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành. 3.1.2. Dung môi, hóa chất - Dung môi: Cồn 96 %, ethyl acetat, PE. - Hóa chất: DPPH (Hungari), vitamin C (Ấn Độ), bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), một số hóa chất, thuốc thử thường quy dùng trong phòng thí nghiệm. 3.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu - Đèn UV. - Máy quang phổ UV – Vis. - Kính hiển vi. - Cân hồng ngoại. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Mô tả định danh 2.2.1.1. Hình thái Dựa vào hình dạng bên ngoài của mẫu tươi và mẫu khô kết hợp với các tài liệu mô tả hình thái thực vật của cây để làm cơ sở đối chiếu, sơ bộ xác định loài cây cần khảo sát. 2.2.1.2. Vi học  Vi phẫu (Trần Hùng, et al, 2010) - Chọn mẫu thích hợp. - Tiến hành cắt vi phẫu. - Nhuộm vi phẫu theo các bước:  Ngâm lát cắt vào nước Javel 15 – 20 phút cho đến khi lát cắt trắng, rửa nhiều lần với nước cất.  Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch acid acetic 3 – 5 phút, rửa nhiều lần với nước cất.  Nhuộm lát cắt bằng dung dịch son phèn lục iod 2 phút, rửa nhiều lần với nước cất.  Ngâm lát cắt vừa nhuộm trong nước cất. - Tiến hành soi trên kính hiển vi. 17  Soi bột (Trần Hùng, et al, 2010) - Rây bột dược liệu thô qua rây thích hợp 0,25 – 0,5 mm. Phần còn lại tiếp tục được xay và rây cho đến khi tất cả bột dược liệu đều trở thành bột mịn. - Lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên lame, nhỏ 1 – 2 giọt nước cất, khuấy kỹ. - Đậy lamelle bằng cách đặt nghiêng một cạnh lamelle lên lame rồi hạ dần đầu kia của lamelle cho đến khi lamelle nằm ngang trên mặt lame. - Dùng ngón tay gì nhẹ trên lamelle cho bột phân tán đều. - Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle. - Soi trên kính hiển vi lần lượt với các vật kính 10x, 40x để quan sát các đặc điểm của bột dược liệu. 18 3.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học Quy trình chiết và định tính các nhóm hợp chất từ dược liệu bằng phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa học Ciulei. Bã dược liệu Ether ethylic / Sohxlet Mẫu thử Dịch chiết ether Mẫu thử Ethanol / hồi lưu Dịch chiết cồn thủy phân Nước / cách thủy Bã dược liệu Dịch chiết nước Dịch chiết cồn HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether Dịch chiết nước thủy phân Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết 19 3.2.3. Chiết xuất dược liệu Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 96 %. Quy trình chiết xuất theo sơ đồ sau: Lắc phân bố với EtOAc Cô thu hồi dung môi Dược liệu HĐRM (3 kg khô) Cao cồn Cao PE Cao cồn còn lại Cao cồn còn lại Cao EtOAc Ngấm kiệt với cồn 96 %, tốc độ xả 10 – 15 giọt/phút Cô thu hồi dung môi Lắc phân bố với PE Cô thu hồi dung môi Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu HĐRM 20 Sau khi chiết xuất dược liệu, tiến hành xác định độ ẩm của bột dược liệu và các cao với sự hỗ trợ của cân xác định độ ẩm. 3.2.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH Trong tất cả các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa đã nêu ở trên, phương pháp ức chế gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cho kết quả ổn định nhất. Vì vậy, ta chọn phương pháp này để làm thực nghiệm trên cây HĐRM. 3.2.4.1. Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử - Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol bằng cách hòa tan 5,915 mg DPPH với một lượng methanol tối thiểu, sau đó cho vào bình định mức và thêm methanol vừa đủ 25 ml. Pha xong dùng ngay, đựng trong chai thủy tinh màu (Viện Dược liệu, 2006). - Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các mẫu cao PE, cao EtOAc, cao cồn nước của mẫu nguyên liệu dược liệu HĐRM. Các cao được hòa tan trong methanol để đạt nồng độ ban đầu là 1 mg/ml đối với dược liệu khô. Nếu khó tan có thể dùng DMSO trợ tan (Viện Dược liệu, 2006). - Đối chứng dương sử dụng là vitamin C. 3.2.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH Phương pháp hiện màu trực tiếp trên bản mỏng đã chạy sắc ký là phương pháp đơn giản và rẻ tiền nhất, dễ dàng thực hiện và đòi hỏi rất ít các trang thiết bị để phát hiện các thành phần có hoạt tính. Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong việc định vị và xác định các đặc tính của chất trong quá trình phân lập các chất theo định hướng hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có tác dụng chủ yếu là phát hiện ra các chất mới có hoạt tính, thường là các chất dẫn đường cho nghiên cứu tiếp theo (Wang J., et al, 2012; Muselik J., et al, 2007) - Bản mỏng: Silica gel 60 F254. - Dung dịch thử: Lấy 0,1 g cao hòa tan với 2 ml MeOH. - Dung môi khai triển: Chloroform – methanol – nước (100:17:13). Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm. Sau đó, nhúng bản mỏng với thuốc thử DPPH 0,05 %/ MeOH trong 5 giây. Sau khi nhúng 2 phút, những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa sẽ hiện màu vàng sáng trên nền tím của bản mỏng do chất chống oxy hóa làm mất màu tím của thuốc thử DPPH. So sánh bằng mắt thường giúp ta định hướng được những phân đoạn và vết chất nào thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. 21 3.2.4.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis Đây là phương pháp giúp khẳng định chính xác hơn về hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn. Quy trình thử nghiệm (Viện Dược liệu, 2006): Bảng 3.1. Phản ứng thử nghiệm DPPH Ống Dung dịch thử (ml) Dung dịch MeOH (ml) Dung dịch DPPH (ml) Trắng 0 4 0 Chứng 0 3,5 0,5 Thử 0,5 3 0,5 Hỗn hợp sau khi pha để trong bóng tối, ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng 517 nm. Tính kết quả: Hoạt tính đánh bắt gốc tự do HTCO (%) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(Abschứng – Absthử)/Abschứng] x 100 Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau. Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn tính được IC50 (khả năng đánh bắt 50 % DPPH của mẫu) bằng cách thay y = 50 vào phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b. Giá trị IC50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngược lại. 22 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Mô tả định danh 4.1.1. Hình thái - Dây leo nhờ tua cuốn mọc đối diện với cuống lá. Tua cuốn màu xanh, phân thành 2 nhánh. - Thân có tiết diện bầu dục, màu xanh. - Lá: Hình tim, đơn, mọc cách. - Rễ bất định: Tiết diện gần tròn, mọc ở các nách lá chạy dọc suốt thân và cành, màu hồng khi còn non, màu vàng xám khi già, phân nhiều nhánh. - Cụm hoa: Xim, nhiều ngã dạng tán. Lá Hình 4.1. Các bộ phận của cây HĐRM Cụm hoa Rễ Cành non 23 4.1.2. Vi học 4.1.2.1. Vi phẫu Phiến lá: Gân hai mặt lồi, mặt trên lồi hơi nhọn, mặt dưới lồi tròn. Biểu bì trên 2 lớp, biểu bì dưới có 1 lớp nhưng có vách dày hơn biểu bì trên. Mô dày góc ở mặt trên hơn 5 lớp, tập trung ở phần chóp của chỗ lồi, đôi khi có xuất hiện tinh thể calci oxalat kèm theo. Mô dày mặt dưới 2 – 4 lớp tế bào. Mô mềm đặc gồm những tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Mô mềm giậu xuất hiện dày đặc hai bên phiến lá. Bó libe – gỗ nằm thành từng bó riêng rẽ, xếp thành vòng tròn, mỗi bó gồm gỗ và libe liền kề, có tinh thể calci oxalat hình cầu gai xung quanh các bó libe – gỗ. Tinh thể calci oxalat hình kim nằm thành từng bó. Hình 4.2. Vi phẫu phiến lá HĐRM và sơ đồ kèm theo 24 Biểu bì trên Mô mềm đặc Mô dày góc Biểu bì dưới Bó gỗ Bó libe Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Tinh thể calci oxalat hình kim Hình 4.3. Chi tiết các bộ phận trong phiến lá Mô mềm giậu 25 Cuống lá: Mô dày góc 2 – 4 lớp, chỗ dày, chỗ mỏng khác nhau, xếp thành vòng. Mô mềm đạo chiếm phần lớn diện tích từ vỏ vào vùng trung trụ, gồm những tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Bó libe – gỗ nằm rời rạc, bó libe gần như bao quanh lấy bó gỗ. Xuất hiện nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Hình 4.4. Vi phẫu cuống lá HĐRM và sơ đồ kèm theo 26 Biểu bì Mô dày góc Mô mềm tủy Hạ bì Bó libe – gỗ Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Hình 4.5. Chi tiết các bộ phận trong cuống lá Tinh thể calci oxalat hình cầu gai 27 Thân già: Tiết diện hình bầu dục. Lớp biểu bì hóa bần. Mô dày góc gồm 4 – 5 lớp tế bào hình bầu dục xếp thành vòng liên tục. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai xuất hiện rải rác khắp thân. Mô mềm đạo ở phần vỏ và mô mềm đặc ở phần tủy. Mô mềm đặc ở tủy là những tế bào hình tròn chiếm phần lớn diện tích của thân. Bó libe – gỗ gồm bó libe không phát triển lắm, libe 1 ở trên đỉnh, libe 2 ở dưới; bó gỗ với gỗ 2 khá phát triển, gỗ 1 vẫn còn tồn tại. Bao quanh bên ngoài gỗ 1 là vòng mô cứng. Xung quanh bó libe – gỗ có rải rác tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Đám mô cứng gồm những tế bào hình đa giác, xếp khít nhau, kích thước không đều, nằm ngay trên đầu các bó libe – gỗ. Hình 4.6. Vi phẫu thân già HĐRM và sơ đồ kèm theo 28 Bần Mô dày góc Libe 1 Libe 2 Mô mềm vỏ Đám mô cứng Gỗ 2 Mô mềm tủy Gỗ 1 Hình 4.7. Chi tiết các bộ phận trong thân già Vòng mô cứng Tinh thể calci oxalat hình cầu gai 29 Cấu trúc vi phẫu thân non HĐRM khá giống với thân già. Tuy nhiên, ở thân non, lớp biểu bì chưa hóa bần. Vòng mô cứng khá dày và xếp thành vòng bao quanh bó gỗ. Biểu bì Gỗ 2 Gỗ 1 Đám mô cứng Mô dày góc Mô mềm tủy Vòng mô cứng Libe 2 Libe 1 Mô mềm vỏ Hình 4.9. Chi tiết các bộ phận trong thân non Hình 4.8. Vi phẫu thân non HĐRM và sơ đồ kèm theo 30 Rễ già bất định: Tiết diện tròn. Lớp bần hơi dày gồm 4 – 6 lớp tế bào hình chữ nhật xếp sát, chồng lên nhau, vách tẩm suberin dày. Mô mềm khuyết ở vỏ có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác. Đám trụ bì được tẩm mộc tố, là những tế bào hóa mô cứng. Các bó libe – gỗ đan xen nhau xếp thành vòng tròn ngay tâm. Hình 4.10. Vi phẫu rễ già bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo 31 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Bần Mô mềm vỏ Đám mô cứng Mô mềm tủy Bó libe Bó gỗ Hình 4.11. Chi tiết các bộ phận trong rễ già bất định HĐRM 32 Rễ non: Lớp bần chỉ gồm 2 – 3 lớp tế bào, vách mỏng. Mô mềm khuyết ở vỏ và tủy đều có nhiều lớp, kích thước to nhỏ khác nhau. Bó libe – gỗ gồm bó libe không phát triển xen kẽ bó gỗ, đặc biệt là gỗ 1 khá phát triển. Không có tinh thể calci oxalat. 4.1.2.2. Soi bột Bần Bó gỗ Mô mềm vỏ Mô mềm tủy Hình 4.13. Chi tiết các bộ phận trong rễ non Bó libe Hình 4.12. Vi phẫu rễ non bất định HĐRM và sơ đồ 33 Bột lá có màu xanh đậm, mịn, có mùi thơm nhẹ. Soi kính hiển vi: - Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 3 dạng: Hình cầu gai, hình kim và hình hạt có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó, đám. - Lỗ khí. - Mạch có nhiều dạng: Mạch vạch, mạch xoắn. - Lông che chở đa bào bị gãy. Tinh thể calci oxalat hình kim và hình cầu gai Mạch xoắn Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Đám tinh thể calci oxalat hình hạt Mạch vạch Lỗ khí Lông đa bào Hình 4.15. Các cấu tử trong bột lá HĐRM Sợi Hình 4.14. Bột lá 34 Bột thân có màu nâu, hơi mịn có dạng sợi, mùi thơm nhẹ. Soi kính hiển vi: - Hạt tinh bột nhiều nằm rải rác khắp nơi. - Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 2 dạng: Hình cầu gai, hình kim có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó. - Mạch xoắn, mạch vạch. - Xuất hiện khối màu có màu cam. - Bần. Tinh thể calci oxalat hình kim Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và tinh bột Mạch vạch, khối màu và tinh bột Mạch xoắn Bần Hình 4.17. Các cấu tử trong bột thân HĐRM Hình 4.16. Bột thân 35 Bột rễ bất định có màu nâu nhạt, hơi mịn và có sợi, mùi thơm nhẹ. Soi kính hiển vi: - Trong sợi có tinh thể calci oxalat hình cầu gai. - Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 2 dạng: Hình cầu gai, hình kim có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó. - Bần dày. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Tinh thể calci oxalat hình kim Sợi Bần Hình 4.19. Các cấu tử trong bột rễ HĐRM Hình 4.18. Bột rễ 36 4.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học Nhận xét: Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học theo phương pháp Ciulei, ta nhận thấy trong cây HĐRM có các hợp chất: Flavonoid, carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronid. Trong đó, hợp chất flavonid là nhiều nhất và là thành phần quan trọng nhất có trong cây. 37 Nhóm hợp chất Thuốc thử cách thực hiện Phản ứng hóa học Kết quả định tính trên dịch chiết Kết luận chung Dịch chiết ether Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân Thủy phân Không thủy phân Thủy phân Chất béo Nhỏ dung dịch lên giấy Vết trong mờ - - Carotenoid Carr – price Xanh chuyển sang đỏ - - H2SO4 Xanh dương hay xanh lục ngả sang xanh dương + + Tinh dầu Bốc hơi đến cắn Có mùi thơm + + Triterpennoid tự do Liebermann – burchard Đỏ nâu – tím, lớp trên có màu xanh lục - - Alkaloid TT chung alkaloid Kết tủa - - Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn - - - Anthraquinon NaOH 10 % Dung dịch kiềm có màu hồng đến đỏ - - - Flavonoid Mg/HCl đậm đặc Dung dịch có màu hồng đến đỏ ++ ++ Bảng 4.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 38 Glycosid tim TT vòng lacton Tím - - TT Baljet Đỏ mận Tanin Dung dịch FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen (polyphenol) + + Dung dịch gelatin muối Tủa bông trắng (tanin) - - Triterpenoid thủy phân Liebermann – burchard Đỏ nâu – tím, lớp trên có màu xanh lục + + Saponin TT Liebermann Có vòng tím nâu Lắc mạnh dung dịch nước Bọt bền trong 15 phút + + + Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt - - Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch + + Hơp chất polyuronid Pha loãng với cồn 90 % Tủa bông trắng – vàng nâu + + Ghi chú: ( ): Không thực hiện phản ứng (-): Âm tính (+): Dương tính (++): Dương tính mạnh (+++): Dương tính rất mạnh 39 4.3. Chiết xuất dược liệu Từ 3 kg dược liệu HĐRM, sử dụng 1,6 lít cồn 96 % để làm ẩm dược liệu và 33 lít cồn 96 % chiết ngấm kiệt với tốc độ xả 10 – 15 giọt/ phút. Rút được 13 lít dịch chiết, sau đó cô cạn trên bếp cách thủy thu được cao tổng. Tiến hành lắc phân bố, cô thu hồi dung môi lần lượt thu được:  47,15 g cao PE  19,43 g cao EtOAc  27,53 g cao cồn nước còn lại Bảng 4.2. Kết quả xác định độ ẩm Mẫu Độ ẩm trung bình (%) Bột dược liệu 4,700 Cao PE 0,740 Cao EtOAc 1,270 Cao cồn nước 1,360 4.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH 4.4.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH Hệ dung môi khai triển: Chloroform – methanol – nước (100:17:13). Hình 4.20. SKLM thăm dò hoạt tính chống oxy hóa UV 254 nm UV 365 nm Nhúng với TT DPPH 40 Nhận xét: Trong các cao phân đoạn được thử tác dụng chống oxy hóa, nhận thấy các cao đều làm mất màu tím của thuốc thử DPPH và hiện màu vàng sáng trên nền tím. Tuy nhiên, chỉ có cao EtOAc làm mất màu tím của DPPH nhiều nhất nên sơ bộ kết luận cao EtOAc có tác dụng chống oxy hóa cao nhất. 4.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis Để khẳng định chính xác hơn khả năng chống oxy hóa của các cao, tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên gía trị IC50. Khảo sát 3 cao thu được ở nồng độ 1 mg/ml. Tính HTCO (%) trung bình của mỗi cao. Sau đó, chọn ra cao có HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đường chuẩn và tính IC50 ở 5 nồng độ khác nhau. So sánh kết quả với IC50 của chất đối chứng vitamin C. Bảng 4.3. Kết quả thăm dò khả năng chống oxy hóa của 3 cao ở nồng độ 1 mg/ml Abs trung bình HTCO (%) Cao PE Ống chứng 1,030 17,18 % Ống thử 0,853 Cao EtOAc Ống chứng 1,030 86,79 % Ống thử 0,136 Cao cồn nước Ống chứng 1,030 2,14 % Ống thử 1,008 Bảng 4.4. Kết quả đo độ hấp thu của cao EtOAc ở 5 nồng độ Abs trung bình HTCO (%) Ống chứng 0,918 Nồng độ 1000 µg/ml 0,115 87,47 % Nồng độ 800 µg/ml 0,222 75,82 % Nồng độ 500 µg/ml 0,575 37,36 % Nồng độ 400 µg/ml 0,664 27,67 % Nồng độ 200 µg/ml 0,773 15,8 % 41 Bảng 4.5. Kết quả đo độ hấp thu của chất đối chứng vitamin C ở 5 nồng độ Abs trung bình HTCO (%) Ống chứng 0,918 Nồng độ 50 µg/ml 0,038 95,86 % Nồng độ 40 µg/ml 0,074 91,94 % Nồng độ 30 µg/ml 0,154 83,22 % Nồng độ 20 µg/ml 0,338 63,18 % Nồng độ 10 µg/ml 0,581 36,71 % y = 0.0967x - 7.2489 R² = 0,9799 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 500 1000 1500 Độ hấp thu độ hấp thu Linear (độ hấp thu) nồng độ (µg/ml) HTCO (%) y = 1.4706x + 30.064 R² = 0,9041 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 Độ hấp thu độ hấp thu Linear (độ hấp thu) HTCO (%) nồng độ (µg/ml) Hình 4.21. Biểu đồ đường chuẩn của cao EtOAc Hình 4.22. Biểu đồ đường chuẩn của vitamin C 42 Nhận xét: Qua các thông số của bảng 3.4 và bảng 3.5, vẽ vào phần mềm Excel ta có phương trình tuyến tính hoạt tính dạng y = ax + b. Thay y = 50 ta được kết quả IC50 như bảng sau: Bảng 4.6. Kết quả xác định giá trị IC50 của các mẫu Mẫu Phương trình hồi quy IC50 (µg/ml) Vitamin C y = 1,4706x + 30,064 13,55 Cao EtOAc y = 0,0967x – 7,2489 592,03 Kết luận: Giá trị IC50 của cao EtOAc là 592,03 (µg/ml) (< 1 mg/ml). Từ đó cho thấy cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. 0 100 200 300 400 500 600 700 Vitamin C Cao EtOAc IC50 IC50 µg/ml Hình 4.23. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các mẫu 43 4.5. Bàn luận Trên thế giới, có rất nhiều bài viết nghiên cứu về HĐRM. Tuy nhiên, ở Việt Nam, đây là một loại cây mới nên rất ít tài liệu nghiên cứu về nó. Theo tài liệu Huỳnh Minh Đạo (2012), xác định tên khoa học, các đặc điểm thực vật học của cây Hồ đằng rễ mành. Trên thực tế, cũng đã xác định được tên khoa học và các đặc điểm thực vật học của cây đúng như tài liệu tham khảo (Huỳnh Minh Đạo, 2012). Điểm đáng chú ý của cây là những tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình kim xuất hiện ở hầu hết các bộ phận của cây: Lá, rễ và thân. Điều này khá đặc biệt trong giới thực vật. Theo Barbosa W.L.R. et al (2002); Beltrame F.L. et al (2001), trong cây HĐRM có flavonoid với 2 cấu trúc chính là: Kaemferol – 3 – O – rhamnosid và quercetin – 3 – O – rhamnosid. Luteolin, kaempferol, luteonin – 3 – sulfat được chiết từ dung dịch nước sau khi thủy phân. Mặc dù không tiến hành xác định cấu trúc hóa học các chất có trong cây và cây được khảo sát tại một đất nước khác nhưng có làm khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật để xác định các hợp chất có trong cây. Qua đó, nhận thấy hợp chất flavonoid có nhiều nhất và là thành phần hóa học chính trong cây. Ngoài ra, trong cây còn có những hợp chất khác như: Carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronid. Có những nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới như: Almeida E.R., et al (2007); Pepato M.T., et al (2003); Viana G.S.B., et al (2004); Quilez A.M., et al (2004) và ở Việt Nam như: Huỳnh Minh Đạo (2012) đã thử tác dụng hạ đường huyết, kháng viêm, chống dị ứng của cây HĐRM. Tuy nhiên, cho đến nay chưa tìm được tài liệu nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cây. Đây cũng là một thử nghiệm hoạt tính sinh học rất hay và cần thiết. Kết quả thử nghiệm cho thấy cây có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao. 44 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1.1. Thực vật học Đã tiến hành khảo sát về đặc điểm hình thái, so sánh với tài liệu tham khảo, định danh chính xác tên khoa học của mẫu thực vật thu hái được dùng trong nghiên cứu là Cissus verticilla (L.) Nicolson & C.E.Jarvis, họ Nho (Vitaceae). 5.1.2. Hóa học Mẫu dược liệu được sơ chế và kiểm tra độ ẩm trước khi sơ chế. Khảo sát thành phần hóa thực vật của cây cho thấy sự hiện diện của các hợp chất: Flavonoid, carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronid. Từ 3 kg dược liệu khô chiết với cồn 96 % được cao tổng. Tiến hành lắc phân bố, cô thu hồi dung môi được các cao phân đoạn như sau: 47,15 g cao PE; 19,43 g cao EtOAc và 27,53 g cao cồn nước còn lại. 5.1.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa Kết quả thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa bằng sắc ký lớp mỏng có thể sơ bộ kết luận cao EtOAc cho kết quả rõ nhất. Tiến hành thăm dò khả năng chống oxy hóa của các cao bằng phương pháp đo điểm trên máy quang phổ UV – Vis cũng giúp khẳng định cao EtOAc chống oxy hóa mạnh nhất trong các cao và tính được giá trị IC50 bằng cách xây dựng đường chuẩn của cao EtOAc ở 5 nồng độ khác nhau (IC50 = 592,03 µg/ml). 5.2. Kiến nghị - Chiết xuất, phân lập thêm thành phần hóa học trong cao EtOAc của cây. - Tiến hành thêm các thử nghiệm dược lý khác hoặc thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa trên in vivo nhằm góp phần chứng minh giá trị trị liệu của cây. - Thử nghiệm lâm sàng để sản xuất chế phẩm phục vụ việc điều trị các căn bệnh thời đại. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Almeida E.R., Oliveira J.R.G., Lucena F.RS, Silva C.V.N.S., Soares R.P.F., Cavalcanti J.B. and Couto G.B.L. (2007). Embriofetotoxic effect and offspring postnatal development exposed to hydroalcoholic fraction extract of Cissus sicyoides L. during wistar rats pregnancy. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 1(5). p. 109 – 112. 2. Amarowiez R., Pegg R.B., Rahimi – Moghaddam P., Barl B., Weil J.A. (2004). Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies. Food Chemistry. 84. p. 551 – 562. 3. Barbosa W.L.R., Santos W.R.A.S., Pinto L.N. and Tavares I.C.C. (2002). Flavonóides de Cissus verticillata a atividade hipoglicemiante do chá de suas folhas. Rev. Bras. Farmacogn. v. 12. p. 13 – 15. 4. Beltrame F.L., Sartoretto J.L., Bazotte R.B., Cuman R.N. and Cortez D.A.G. (2001). Estudo fitoquímico e avaliação do potencial antidiabético do Cissus sicyoides L. (Vitaceae). Química Nova. Vol. 24. p. 783 – 785. 5. Favier A. (2003). Le stress oxydant: Intéréte conceptuel et expérimental dans la compréhension des mécanismes des maladies et potentiel thérapeutique. L’actualité chimique, novembre – décembre 2003. p. 108 – 115. 6. Gardès – Albert M., Bonnefont – Rousselot D., Abedinzadeh Z. et Jore D. (2003). Espèces réactives de l’oxygène. Comment l’oxygène peut – il devenir toxique? L’actualité chimique. p. 91 – 96. 7. Hosoea H., Kaiseb T., Ohmori K. (2002). Effects on the Reactive Oxygen Species of Erdosteine and its Metabolite in vitro Arzneimittelforschung. 52(6). p. 435 – 440. 8. Huỳnh Minh Đạo (2012). Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E. Jarvis., Vitaceae). Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Jovanovic S. V. and Simic M. G. (2000). Antioxidants in nutrition. Annals of the New York Academy of Sciences. 899. p. 326 – 334. 10. Lachman J., Hamouz K., Orsak M. and Pivec V. (2000). Potato tuber as a significant source of antioxidants in human nutrition. Rostlinna vyroba. 46. p. 231 – 236. 11. Lapenna D., Ciofani G., Festi D., Neri M., Pierdomenico S.D., Giamberardino M.A., Cuccurullo F. (2002). Antioxidant properties of ursodeoxycholic acid. Biochem Pharmacol. 64. p. 1661 – 1667. 46 12. Lee S.M., Na M.K, An R.B., Min B.S., Lee H.K. (2003). Antioxidant activity of two phloroglucinol derivatives from dryopteris crassirhizoma. Biol. Pharm. Bull. 26 (9). p. 1354 – 1356. . 13. Muselik J., Garcia – Alonso M.G., Martin – López M.P., Zemlicka M., Rivas – Gonzalo J. (2007). Measurement of antioxidant activity of wine catechins, procyanidins, pnthocyanins and pyranoanthocyanins. p. 797 – 809. 14. Niki E., Noguchi N., Tsuchihashi H. and Gotoh N. (1995). Interaction among vitamin C, vitamin E, and beta – carotene. American Journal of Nutrition. 62. p. 1322 – 1326. 15. Pepato M.T., Baviera A.M., Vendramini R.C., Perez M.D.P.M.D.S., Kettelhut I.D.C., Brunetti I.L. (2003). Cissus sicyoides (princess vine) in the longterm treatment of streptozotocin diabetic rats. Biotechnol. Appl. Biochem. 37. p. 15 – 20. 16. Phạm Hoàng Hộ (2000). Cây cỏ Việt Nam, quyển 2. Nhà xuất bản trẻ. tr 464 – 467. 17. Pincemail J., Dafraigne, Meurisse M., Limet R. (1998). Antioxydants et prévention des maladies cardiovasculaires, lère partie: la vitamine C. Médi – Sphere. 89. p. 27 – 30. 18. Proctor P. H. (1989). Free radicals and human disease. CRC handbook of free radicals and antioxidants. 1. p. 209 – 221. 19. Quilez A.M., Saenz M.T., Garcia M.D. and Puerta R.D.L (2004). Phytochemical analysis and anti – allergicstudy of Agave intermixta Trel and Cissus sicyoides L. JPP. 56. p. 1185 – 1189. 20. Singh N., Rajini P. S. (2004). Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel. Food chemistry. 85. p. 611 – 616. 21. Takhtalan A. (2009). Flowering Plants. Springer. p. 316. 22. Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Bùi Mỹ Linh, Võ Văn Lẹo, Ngô Thị Xuân Mai, Phạm Thanh Tâm, Huỳnh Ngọc Thụy, Võ Thị Bạch Tuyết (2010). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Bộ môn Thực vật, khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. tr. 2 – 5. 23. Trương Thị Đẹp (2007). Thực vật dược. Bộ môn Thực vật, khoa Dược. Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. tr. 354. 24. Vansant G., Pincemail J., Defraigne J. O., Van Camp J., Goyens P. et Hercberg S. (2004). Antioxidants and csimentation. Institut Danone. p. 67. 25. Viana G.S.B., Medeiros A.C.C., Lacerda A.M.R., Leal L.K.A.M., Vale T.G., Matos F.J.A. (2004). Hypoglycemic and anti – lipemic effects of the aqueous extract from Cissus sicyoides. BMC Pharmacology. p. 1 – 7. 47 26. Viện Dược liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. tr. 279 – 292. 27. Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 1131 – 1134. 28. Võ Văn Chi (2004). Từ điển Thực vật thông dụng, tập 1. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. tr. 628. 29. Wang J., Yue Y.D., Tang F. and Sun J. (2012). TLC screening for antioxidant activity of extracts from fifteen bamboo species and identification of antioxidant flavone glycosides from leaves of bambusa textilis McClure. p. 12297 – 12311. TRANG WEB 30. Công ty TNHH Cảnh quan Ý tưởng mới. Cây Liêm hồ đằng. Truy cập ngày 15 tháng 02 năm 2017. 31. Dây Liêm Hồ Đằng. Truy cập ngày 14 tháng 02 năm 2017. 32. Đỗ Xuân Cẩm. Liêm hồ đằng - dây leo làm cảnh có nguy cơ xâm hại. nguy-co-xam-hai. Truy cập ngày 14 tháng 02 năm 2017. 33. Liêm Hồ Đằng – dây tơ hồng – cây mành mành. Truy cập ngày 14 tháng 02 năm 2017.