Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase từ aspergillus niger và aspergillus oryza

iống lúa kháng sâu bệnh đã có ý nghĩa hết sức to lớn. Những nghiên cứu đã được Hội đồng Khoa học Bộ nông Nghiệp công nhận và cho phép phổ biến. Về trồng trọt: giống lúa cạn, giống Bắp lai, giống Đậu xanh, hạt Điều mới, giống rau, cải ngọt, ớt… Về chăn nuôi: giống heo Yorkshire thuần chủng, Thuộc Nhiêu, Heo lai tỷ lệ cao, giống gà thả vườn… Những giống bò sữa ở Tp. Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam. Những công thức phối hợp khẩu phần ăn cho chăn nuôi công nghiệp. Với những cống hiến liên tục trong 30 năm qua của Viện (1975 – 2005), Đảng và Nhà Nước đã trao tặng Viện KHKTNNMN Huân Chương Độc Lập Hạng II. Năm 2005 Viện được trao tặng 2 giải thưởng Khoa Học cấp nhà nước là chọn tạo giống lúa ĐB VND95-20. 2.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MỐC 2.2.1.1. Lịch sử Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm học (Mycology) được khai sinh bỡi nhà thực vật học người Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874). Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất. Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như động vật, thực vật, đặc biệt trên con người, cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc đã qua chế biến, bảo quản. Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đã được đưa vào sản xuất công nghiệp và có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu về di truyền học. 2.2.1.2. Hình thái, cấu tạo sợi mốc Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm). Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có thể cấu tạo gấp nếp hay xoắn lại. Người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus. a. 1 lớp, b. 2 lớp, c. phiến, d. tia, e. tể (theo Samson và ctv., 1995 2.2.1.3. Thành phần tế bào của một số loại nấm mốc Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu chí quan trọng khi định loại nấm. sau đây là các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm: Chi nấm l 2 3 4 5 6 Thành phần thành tế bào Glucan 16 54 0 43 29 6 Cellulose - 36 0 0 0 0 Chitine 58 0 9 19 1 10 Chitosan - 10 33 - 0 - Mannan - <1 2 2 31 <3 Protein 10 5 6 11 13 7 Lipid - 3 8 5 9 3 Chú thích: 1- Allomyces  2- Phytophthora  3- Mucor 4- Aspergillus 5- Saccharomyces  6- Schizophyllum 2.2.1.4. Vị trí và vai trò chung của nấm mốc Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trongchế biến, bảo quản. Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo... hay gây bệnh cho người, động vật khác và cây trồng. Tuy nhiên, các qui trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật trong đó có nấm mốc. Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acit hữu cơ (acit oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược, nông nghiệp và chăn nuôi ... đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Ngoài ra, nấm còn giử vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng. Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger). Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương và tương do Aspergillus oryzae lên men ngon hơn các tương khác vì loại mốc này có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt. Hai loài không độc làm tương là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2 loài rất nguy hiểm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố Aflatoxin gây bệnh ung thư. Nấm Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, các enzyme… 2.2.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MỐC ASPERGILUS Ngày nay, bên cạnh vi khuẩn và virus là các tác nhân gây bệnh đã từng được đề cập rất nhiều, người ta còn thấy nhóm vi nấm cũng bắt đầu gây tác hại lên cơ thể con người. Do việc sử dụng kháng sinh không đúng cách hoặc dùng nhiều thuốc ức chế miễn dịch, do sự xuất hiện ngày càng nhiều các bệnh gây suy giảm sức đề kháng và do điều kiện sống thấp, dinh dưỡng kém, thiếu vệ sinh... nên vi nấm ngày càng có cơ hội phát triển và gây bệnh. Aspergillus fumigatus là một loại nấm thuộc giống Aspergillus và là một trong những loài nấm Aspergillus thường gặp nhất và gây bệnh ở những đối tượng suy giảm miễn dịch. A. fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, không có biết rõ chu kỳ hữu tính của loài nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính (conidiospores) và giải phóng vào trong môi trường. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng thân nhiệt của người), bào tử là các chất ô nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở người; tuy nhiên, chúng cũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch ở trên những người khỏe mạnh. Aspergillosis là một nhóm bệnh từ hệ quả nhiễm Aspergillus spp. gồm dạng bệnh Asperrgillus thể xâm nhập (invasive aspergillosis), ABPA và u nấm (aspergilloma). Một số bệnh nhân hen phế quản có thể trở nặng do nhiễm nấm này. Thường nấm tồn tại trong không khí, không gây thành bệnh, nhưng khi cơ thể suy giảm miễn dịch như mắc các bệnh ung thư bạch cầu, bệnh nhân đang dùng corticosteroides, bệnh nhân có ghép tạng, xơ hóa nang, HIV/AIDS, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, lao, bệnh u hạt mạn tính, hen nặng và cơ địa mẫn cảm với nấm. Phân loại học nấm thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, giống Aspergillus. Canh thang nuôi cấy nấm A. fumigatus được lựa chọn Một số indolic alkaloids với đặc tính chống nguyên phân (anti-mitotic) đã được nhận biết. Những hợp chất thích hợp được phân loại là tryprostatins, với spirotryprostatin B. Aspergillus là loại nấm có hình giống sợi, có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Chúng thường phân lập thấy trong đất, mảnh vụn cây cỏ, môi trường trong và ngoài nhà. Giống Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài đã được báo cáo như là tác nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội ở người. Trong số này, Aspergillus fumigatus là loài được phân lập phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus và Aspergillus niger. Nhóm Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus và Aspergillus versicolor là những loài khác mà khi phân lập ít gặp hơn và ít nhận ra là đóng vai trò trong các bệnh nhiễm trùng cơ hội. 2.2.2.1. Đặc điểm đại thể (Marcoscopic featues) Đặc điểm đại thể chính trong các loài nấm này là các chỉ điểm như tỷ lệ phát triển của nấm, màu sắc, khuẩn lạc và sự dung nạp với nhiệt độ. Ngoại trừ Aspergillus nidulans và Aspergillus glaucus, tỷ lệ phát triển là từ nhanh đến trung bình. Trong khi Aspergillus nidulans và Aspergillus glaucus phát triển chậm và đạt đến kích cỡ khuẩn lạc 0.5-1cm sau khi ủ ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày trên môi trường thạch Czapek-Dox, các loài còn lại thì đạt kích thước đường kính 1-9cm trong môi trường đặc biệt. Sự khác biệt về tỷ lệ phát triển như vậy đã giúp các nhà khoa học định loài rõ ràng hơn. Các khuẩn lạc của Aspergillus thì lấm chấm đến bột trên sợi. Màu sắc bề mặt có thể khác nhau tùy theo loài và đảo ngược màu sắc về vàng nhạt trong hầu hết các phân lập. Tuy nhiên, đảo màu sắc có thể từ màu tí đến màu oliu trên một vài dòng của nấm Aspergillus nidulans và từ màu cam sang màu tía trên dòng Aspergillus versicolor. Aspergillus fumigatus là một loại nấm dung nạp tốt với nhiệt độ và phát triển tốt ở nhiệt độ trên 400C. Đặc tính này là duy nhất chỉ có ở riêng Aspergillus fumigatus trong số các loàiAspergillus. Aspergillus fumigatus có thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 20-50°C. 2.2.2.2. Đặc điểm vi thể (Microscopic features). Về vi thể, các loài nấm này tương đối giống nhau. Tuy nhiên, một số cấu trúc vi thể khác đặc trưng cho một vài loài và có các chỉ điểm riêng biệt cho xác định loài, dựa trên màu sắc bề mặt và khuẩn lạc nấm. Đặc điểm chung cho tất cả loài nấm Trụ nấm tách biệt và có hyalin. Các bào tử có nguồn gốc xuất phát từ các tế bào chân đáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu. Túi này là một sự hình thành đặc trưng cho giống nấm Aspergillus. Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa các loài. Bao phủ toàn bộ bề mặt túi nấm hoặc từng phần chỉ trên đầu túi (dạng radiate head hoặc columnar head) tính với túi trực tiếp hoặc dính thông qua một tế bào nâng đỡ, gọi là metula. Đặc điểm riêng chỉ có trên một vài loài nấm Cấu trúc vi thể khác gồm có tế bào Hulle, tế bào xơ,thể quả dạng cầu. Các cấu trúc này là dấu quan trọng và chính yếu giúp định loại các loài nấm Aspergillus. Dạng cầu là một bộ phận tròn, dính liền với nang nấm, mang các bào tử nấm. Các nang nấm lan rộng ra xung quanh khi dạng cầu vỡ ra. Dạng cầu được sinh ra trong giai đoạn sinh sản hữu tính của một vài loài Aspergillus. Bào tử đính bên là một loại bào tử đính hay hạt đính (conidium) được sinh ra bởi sự ly giải tế bào nâng đỡ nó. Chân nấm thường cắt cụt và mang cái mảnh còn lại của các tế bào ly giải. Các tế bào Hulle là các tế bào lớn vô trùng mang ruột nhỏ. Tương tự như dạng cầu, nó gắn với giai đoạn hữu tính của một vài loài Aspergillus. 2.2.3. GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER 2.2.3.1. Phân loại Sinh giới: Eukaryote Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Ngành phụ:Pezizomycotina Lớp: Ascomycetes Bộ: Plectascales Họ: Aspergillaceae Giống: Aspergillus Loài: Aspergilus Niger 1.a Thể bình hai tầng 2.a Khuẩn lạc (bông) trên môi trường thạch czapeck nhìn mắt thường có màu đen như than. 3.a Conidi trưởng thành có đường kính 6-10mm. A. carbonarius (Bainier) Thom 3.b Conidi trưởng thành có đường kính 5,0 mm trở xuống 4.a Cuống conidi không quá 4mm chiều dài 5.a Khuẩn lạc lan rộng nhanh chóng trên thạch czapeck A . ficuum (Reich) Hennings 5.b. Khuẩn lạc mọc chậm trên thạch czapeck 6.a Conidi trưởng thành dẹt ra theo chiều dài hoặc vạch kẻ sọc A . phoenicis (Cda) Thom 6.b Conidi trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,0-5,0 mm xù xì không đều, với những gờ rõ và gai không xếp thành vạch kẻ sọc theo chiều dài. A .niger V. Tiegh 4.b Cuống conidi trưởng thành dài quá 5mm tới 1cm, nhưng thường cũng có những thân ngắn hơn mang những bông tiêu giảm. A . pulverulentus (Mc. Alp) Thom 2.b Khuẩn lạc (bông) màu nâu ôliu hơi xám hoặc nâu – ôliu đậm khi còn non thường trở thành màu nâu hơi đỏ cho đến đen hơi nâu, nhưng với màu ôliu hoặc hơi màu xám thường giữ mãi. 3.a Bông mau chóng có màu đen nâu đậm hoặc nâu hơi đỏ 4.a Conidi có đường kính dưới 5mm, dẹt theo chiều ngang và có kẻ sọc khi trưởng thành 5.a Bông mau chóng có màu đen nâu đậm khuẩn lạc mặt trái không màu, cuống conidi phần lớn dài 2-3 mm, có thể dài tới 5,0 mm, conidi phần lớn đường kính 3,0 mm-3,5 mm. A.awamori Nakazawa 4.b Conidi đường kính 6,0 đến 8,0 mm, hình cầu đến hình gần cầu, nối cục khô A . flavo- fureatis Batista và Maia (xem nhóm A.flavus) 3.b.Bông giữ mãi màu nâu đậm hơi xám hoặc nâu ôliu 4.a Conidi hình elip, có gai rõ 5,0-5,3x3,3-3,8mm A .ellipticus sp. Nov 4.b Conidi chín hình cầu gần như hình cầu, đôi khi hình elip non 5.a Conidi chín có gai rõ A .heteromorplus Batista và Mais 5.b Conidi chín xù xì nhẹ không đều 6.a Bông nói chung nhỏ, khi già trên thạch mạch nha tách ra thành khá nhiều cột dày đặc phân kì A foetidus (Naka) Thom và Raper 6.b Bông to, cột ít không rõ rệt trên thạch mạch nha 7.a Nền hệ sợi trên thạch mạch nha không có màu hoặc chỉ hơi vàng A foetidus (Naka) T và R.var.acidus N,S, và W 1b Thể hai tầng 2.a Conidi hình cầu đến gần cầu, có gai rõ, bọng thường 20-35mm nhưng có thể từ 15-45mm 2.b Conidi gần cầu elip rõ,bọng thường đến 60-80mm, có thể từ 35-100mm A .aculeatus Lizuca 2.2.3.2. Cấu trúc vi thể Bào tử dính dài trơn không màu hay nâu, thể bình 2 đáy, túi nấm tròn đầu xòe 2.2.3.3. Hình thái Xác định tên nấm mốc Tên nấm mốc Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể A.niger Khóm nấm mốc có đường kính 4 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày. Khóm nấm mốc màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cafe. Bông hình cầu có màu đen. Bọng hình cầu. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình 2 tầng, Metulae dài gấp đôi tầng Phialides. Vách cuống conidi trơn. Hạt đính hình cầu đến gần cầu, có gai rõ. Trụ nấm tách biệt và có hyalin. Các bào tử có nguồn gốc xuất phát từ các tế bào chân đáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu. Túi này là một sự hình thành đặc trưng cho giống nấm Aspergillus. Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa các loài. Aspergillus có bào tử màu đen. Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium). Khuẩn ty của nấm mốc A.niger tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra vừa ngăn vách tạo thành nhánh. Khuẩn ty có 2 loại: Khuẩn ty cơ chất (hay khuẩn ty dinh dưỡng) có kích thước nhỏ, màu trắng, bám chặt vào cơ chất môi trường và hấp thu các chất dinh dưỡng. Các khuẩn ty nay bện thành khối. Khi già hệ sợi nấm mốc ngả sang màu vàng. Khuẩn ty khí sinh (hay khuẩn ty sinh sản) có kích thước lớn hơn khuẩn ty cơ chất nhiều lần, trong suốt trên bề mặt cơ chất và từ khuẩn ty khí sinh sẽ có 1 sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bào tử. Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính là chitin và glucan. Ở A.niger cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc nên được gọi là “nấm cúc”. Cuống bào tử trơn nhẵn, trong suốt hoặc nâu nhạt, cuống bào tử có phần phình to rõ rệt ở đầu, tạo thành bọng lớn dạng hình cầu thường được gọi là bọng đỉnh giá hình cầu(vesicle), trên có mọc lên những thể bình là cơ quan tạo bào tử đính (conidi) và từ ngọn thể bình sinh ra các chuỗi bào tử đính (conidia). 2.2.3.4. Đặc điểm sinh lý Loại Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác bã thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp. Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc kí sinh, không có khả năng quang hợp tạo chất hưu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty. 2.2.3.5. Đặc điểm sinh hóa Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau A.niger đồng hóa tốt các loại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose. Đối với đường sorbose, galactose, A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đường lactose thì đồng hóa ở mức trung bình. Nguồn dinh dưỡng nitơ A.niger có khả năng sử dụng ure làm nguồn N và chất điều chỉnh pH, duới tác dụng của enzyme urease, ure phân hủy thành CO2 và NH3. A.niger đồng hóa các muối amon. Việc sử dụng nguồn N hữu cơ, urease và các muói amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hâp thu vào cơ thể. Như vậy NH3 là trung tâm của con đường dinh dưỡng nitơ của vi sinh vật. Nguồn dinh dưỡng khoáng phospho Sự có mặt của các hợp chất phospho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật. Thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào và chất nhân. Ngoài ra, phospho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các loại thức ăn cacbon. Khả năng sinh tổng hợp enzyme A.niger có khả năng sinh các enzyme như amylase, protease, peptinase, và đặc biệt là hệ enzyme cellulase. 2.2.3.6. Đặc điểm sinh sản. A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính: Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệ sợi nấm. Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triễn thành khuẩn lạc mới. Sinh sản vô tính: Reaper và thơm (1968) cho rằng A.niger sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidium). Hầu như các bào tử trần là các bào tử ngoại sinh, nghĩa là được hình thành ở bên ngoài tế bào sinh bào tử trần (conidiogenóu cell). Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone). 2.2.3.7. Ứng dụng Hiện nay, A.niger được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong 1 ngành kinh tế khác để thu nhận các chế phẩm sinh học như acid hữu cơ, enzyme, protein. Trong chăn nuôi, ứng dung lên men thu enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp vật nuôi tăng khả năng tiêu hóa, tăng sức đề kháng, cải thiện năng suất vật nuôi giúp vật nuôi phát triển tốt hơn, tăng trọng nhanh hơn tăng lợi nhuận kinh tế,… 2.2.4. GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. 2.2.4.1. Phân loại Sinh giới: Eukaryote Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Ascomycetes Bộ: Plectascales Họ: Aspergillaceae Giống: Aspergillus Loài: Aspergilus Oryzae 2.2.4.2. Cấu trúc vi thể Bào tử dính dài trơn không màu hay vàng hoa cau, thể bình 2 đáy, túi nấm tròn đầu xòe 2.2.4.3. Hình thái học và sinh lý học Aspergilus Oryzae là một loại nấm vi thể, cơ chế sinh trưởng của nó là 1 hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử Asp.oryzae thường dài 1 – 2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ thuôn dài gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau nên gọi là đính bào tử. đính bào tử có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau. Thường gọi là mốc màu vàng hoa cau. Khi mới phát triển, hệ sợi có màu trắng sau đó chuyển sang màu vàng, khi già chuyển sang màu lục. Có khả năng sinh enzyme rất mạnh chủ yếu là. Amylase, invertase, maltose, protease, lipase, cellulase, các enzyme oxy hóa khử… Ta thường hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết hay chưa được rữa sạch. ở cặn bã bia , rượu, ở lõi ngô, bã sắn…chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng. Màu do các bào tử già có màu sắc. các bào tử này dễ bị gió cuốn bay đi xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc Aspergilus Oryzae, Có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt 2.2.5. ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYME 2.2.5.1. Định nghĩa về enzyme Trong cơ thể sống ( các tế bào ) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình tro đổi chất của một chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau. Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. Chúng có trong hầu hết các loại tế bào củ cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators ) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học. Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein. Hay nói cách khác enzyme học là khoa học nghiên cứu tính chất chung, điều kiện và tính đặc hiệu của các enzyme. 2.2.5.2. Lịch sử hình thành và phát triển enzyme Enzyme đã được sử dụng rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, rượu vang là thứ nước uống được mọi người ưa thích trong quá khứ…Nướng bánh mì, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao,…ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Quan sát đầu tiên về quá trình phân rã xúc tác bởi enzyme được thực hiện bởi Spallaazani (1729-1799). Năm 1815 Kirchhoff phát hiện thấy ở mầm đại mạch có chứa protein làm tan tinh bột. Năm 1833 Payen và Persoz đã đặt tên cho dịch này là diastase (tiếng hy lạp có nghĩa là tách rời ). Vào 1857 Pasteur chứng minh rằng quá trình lên men do nấm men thực hiện. Kuhne vào năm 1878 đặt tên là enzyme ( theo tiếng hy lạp có nghĩa là bột chua – sourdough). Năm 1879 Buchner đã chứng minh là dịch chiết tế bào nấm men cũng có khả năng lên men tạo cồn từ đường. Quyển sách đầu tiên tập hợp những hiểu biết về enzyme được Green viết vào năm 1901. Việc sử dụng enzyme cho mục đích công nghiệp được người mỹ gốc nhật tên là Okishi Takamine khởi xướng dựa trên nguồn enzyme từ nấm mốc. Năm 1894 ông được nhận bằng sang chế cho sản phẩm là Takadiastase chừa diastase từ nấm sợi ( fungi). Năm 1895 Ausguste Boidin phát minh ra phương pháp sản xuất cồn từ ngũ cốc. Năm 1907 Otto Rohm đã phát hiện ra tác dụng tẩy lông trong quá trình thuộc da của enzyme protease Wallerstein (1911) là người đầu tiên sử dụng papain để giữ chất lượng bia ổn định, ngăn tạo váng làm bia bị đục ở nhiệt độ thấp. Boidin và Effront ( 1917) đã nhận bằng sang chế ( patent ) sản xuất amylase từ baccilus subtilis. Năm 1934 pectinase lần đầu tiên được sử dụng để làm trong và tăng hiệu xuất chiết nước tái cây. Năm 1958 công bố danh sách những chế phẩm enzyme thương mại Sau đại chiến lần thứ II là thời kì phát triển mạnh mẽ của lên men chìm được khởi động bằng công nghệ sản xuất kháng sinh. Năm 1960 hãng Novo Noridisk ( NO ) bắt đầu sản xuất protease kiềm từ bacillus licheniformis, để bổ sung vào chất tây rửa. hiện nay protease chiếm tới 60% thị phần toàn bộ enzyme đang được sử dụng trong công nghiệp. 2.2.5.3. Ứng dụng của công nghệ enzyme ngày nay Công nghệ enzyme hiện đại tập trung vào công nghệ bảo quản sau thu hoạch thực phẩm, sử dụng có hiệu quả nguyên liệu và gia tăng chất lượng cũng như mùi vị thực phẩm trong chế biến thực phẩm. nhằm mục đích giảm giá thành, giảm năng lượng tiêu hao trong sản xuất. Thời gian sau này enzyme bắt đầu được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất hóa chất, dược phẩm và xử lý môi trường Các phương pháp của công nghệ enzyme đang có xu thế thay thế phương pháp hóa học truyền thống. Ngày nay công nghệ enzyme phát triển theo hướng: Sử dụng enzyme trong môi trường khan nước tạo chất có cấu trúc lập thể đặc hiệu, tạo polymer đặc hiệu dễ phân hủy. Trong xử lý tái sử dụng phế thải thực phẩm và nước thải Sử dụng cellulae và lipase trong sản xuất chất tẩy rửa Trong sản xuất cyclodetrin từ tinh bột Sản xuất enzyme động vật bằng lên men vi sinh vật chuyển gen Sản xuất công nghiệp enzyme bằng kỹ thuật gen 2.2.5.4. Giới thiệu về enzyme cellulase Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong thiên nhiên có ý nghĩa rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường và đặc biệt là trong chế biến thức ăn chăn nuôi. Trong tự nhiên, lượng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase là rất lớn và rất phong phú. Chúng thuộc nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong cả một số loại nấm men. Trong đó, có những vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp nhiều enzyme: A.niger, A.oryzae, aspergiluss spp,… 2.2.5.4.1. Phân loại enzyme. Enzyme tham gia phân hủy cellulase phân ra làm 3 nhóm chủ yếu: 1,4β-D-glucan cellobiohydrolase. Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. 1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: Enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4glucosid trong cellulase trong lichenin và β-D-glucan. Tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh. Β-D-glucoside glucohydrolase: Tham gia phân giải cellobiose, tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. 2.2.5.4.2. Tính chất của enzyme cellulase Dựa vào đặc tính phân giải cơ chất, các enzyme tham gia phân giải cellulose được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu: endocellulase; exocellulase và β-1,4-glucosidase. - Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lignin và β-D-glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải các cellulose phân tử nhỏ,cellobiose, glucose. Nhiệt độ, pH hoạt động của endocellulase từ vi sinh vật khác nhau cũng có sự khác nhau, nhưng nói chung hầu hết các enzyme này đều có nhiệt độ hoạt động khá cao. Các endocellulose của các vi sinh vật thường có tính chất khác biệt nhau nhiều. - Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellulose dạng kết tinh mà có tác dụng làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng, giúp cho endocellulose phân giải chúng. - Cellobiose: tham gia phân giải cellobiose và cellotetrose thành glucose. Chúng không có khả năng phân giải cellulose dạng nguyên thủy enzyme này còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase, β-1,4-glucosidase. 2.2.5.4.3.Cơ chất của cellulase Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật, ngoài ra chúng còn được tìm thấy ở một số tế bào vi sinh vật. Cellulose không có trong tế bào động vật. Cellulose là một loại homopolyme của β-1,4-glucose, các gốc β-D-glucose nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside. Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi rất nhiều. Từ vài trăm đến 15.000, trung bình khoảng 3000 phân tử β-D-glucose. Vì vậy khối lượng phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vander war và liên kết hydro tạo thành hệ sợi. Trong tự nhiên, các hệ sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng: vùng kết tinh và vùng vô định hình. Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng 50.000-2.500.000 Dalton. 2.2.5.4.4. Cơ chế tác dụng của cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của phức hệ cellulase xảy ra theo ba giai đoạn chủ yếu: Trong giai đoạn thứ nhất: dưới tác dụng của cellulose và các tác nhân của môi trường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulase, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành dạng hoạt động. Thực tế, cho đến nay người ta cũng chưa rõ enzyme nào, tác nân nào tham gia vào quá trình này, người ta gọi các yếu tố này là C1. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan. Giai đoạn thứ hai, các cellulose đã biến đổi sau giai đoạn một bị phân giải các cellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase. Giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. Quá trình phân giải cellulose chỉ có thể tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme trong hệ enzyme cellulase. Hình: Quá trình phân giải cellulose của cellulase 2.2.5.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của cellulose Hoạt động xúc tác phân giải cellulose của phức hệ cellulase chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, cơ chất. Các cellulase từ các vi sinh vật khác nhau cũng có nhiệt độ, pH, hoạt động không giống nhau. Ở cùng một giá trị pH thích hợp( tối thích) với một loại cơ chất dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau, hoạt tính phân hủy cơ chất của cellulase cũng khác nhau. pH Nhiệt độ (oC) Hoạt tính(%) 2.0-3.5 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 18-40 19-60 18-83 10-65 3.5-5.5 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 40-50 60-72 83-100 65-82 8.0-5.5 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 18-40 19-62 18-83 10-72 Bảng: ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính phân giải cellulose kết tinh của cellulase pH Nhiệt độ (oC) Hoạt tính(%) 3.0-4.0 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 22-30 42-55 30-82 0-11 4.0-4.5 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 30-25 55-50 83-100 11-36 4.5-7.0 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 25-5 50-10 100-30 36-5 Bảng: ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính phân giải cellulose giấy của cellulase 2.2.5.4.6. Ứng dụng của cellulase Hiện nay việc sản xuật chế phẩm cellulase từ vsv đã được tiến hành ở quy mo công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi vào nhiều lĩnh vực khác nhau ở nhiều nước trên thế giới. Cellulose có ứng dụng rất rông rãi trong có các ngành công nghiệp như dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc,… Các ứng dụng chủ yếu của cellulase như sau: Cellulase áp dụng trong sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu giàu cellulose dung trong thức ăn cho động vật hoạc làm nguyên liệu trong công nghiệp thực phẩm. Dịch đường sau khi thủy phân bởi cellulase làm môi trường nuôi cấy nấm men rất tốt. Trong chăn nuôi (đối với động vật ăn cỏ ) nếu thức ăn có bổ sung cellulase sẽ tăng sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn cho động vật, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn. Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần để lai tạo giữa các tế bào, cellulase được dung để phá vỡ thành tế bào thực vật. Trong xử lý ô nhiễm môi trường, đặc biệt là xử lý rác thải, sau khi thu gom rác, người ta tiến hành phân loại rác để loại bỏ các thành phần không phải hữu cơ. Rác được phân hủy bằng hỗn hợp vi sinh vật. Dưới tác dụng của các enzyme do vi sinh vật sinh ra sử dụng làm phân bón. Một số nghiên cứu ứng dụng thuộc enzyme cellulase - Hàng năm, nước ta sản xuất khoảng 500 tấn agar, tuy nhiên lượng phế thải hữu cơ trong quá trình chế biến agar rất cao khoảng 6 tấn phế thải trên 1 tấn sản phẩm. Trong bã thải agar, cellulose là thành phần hữu cơ chiếm tỷ lệ cao và rất khó bị phân hủy bởi cấu trúc phức tạp của nó. Trên thế giới hiện nay, người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong biển để làm thức ăn gia súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. - Trong chế biến cà phê hiện nay vấn đề tách chiết hầu hết các chất hòa tan có trong hạt cà phê gặp trở ngại do 2 thành phần pectin và cellulose chiếm chủ yếu trong hạt cà phê gây ra. Đề tài nghiên cứu của trường đại học quốc tế ĐHQG - TP.HCM, trường ĐH bách khoa ĐHQG – TP.HCM, trường ĐH Nông Lâm – TP.HCM Đã nghiên cứu chế phẩm Biocoffee – 1 chứa hoạt tính pectinase và enzyme cellulase được thu nhận từ nấm mốc Aspergillus - ứng dụng enzyme cellulase trong xử lý nước thải của nhà máy giấy do: Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng. viện hóa học, viện khoa học và công nghệ việt nam, trường đại học khoa học tự nhiên ĐHQG, Hà Nội nghiên cứu và ứng dụng - Nghiên cứu và bổ sung enzyme vào thức ăn cho gia suc, gia cầm của viện sinh học nhiệt đới - Enzyme cellulase kỹ thuật từ nấm Aspergillus Niger và từ vi khuẩn. ở nhật thời kỳ đầu enzyme cellulase được sản xuất bằng lên men bề mặt hiện vẫn còn được sử dụng. Hàng năm từ Aspergillus Niger người ta sản xuất khoảng 70-80 tấn enzyme cellulase sản xuất bằng lên men chìm bắt đầu áp dụng ở nhật năm 1964. enzyme cellulase được sản xuất ở dạng bột và cả dạng nước. Dạng nước chứa 5-10 FPU/ml, dạng bột chứa 10-50 FPU/g tương ứng 100-1500 CU/ml và 200-4000CU/g Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. THỜI GIAN-ĐỊA ĐIỂM Thời gian: 2 tháng (01/03/2010 đến 01/05/2010) Địa điểm: Viên Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam 3.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Hai chủng nấm mốc được phân lập từ các nguồn phế phụ phẩm: lõi bắp, bã mía, vỏ đậu phộng do phòng Nghiên cứu Dinh dưỡng Chăn nuôi cung cấp để nghiên cứu khả năng phân giải cellulose. Aspergillus Niger : A1 Aspergillus Oryzae: A2 3.3. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG Môi trường nuôi cấy nấm mốc Môi trường Czapek - Dox NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g MgSO4. 7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4. 7H2O 0,1 g D – Glucose 30 g Agar 20 g H2O 1000 ml Môi trường xác định khả năng phân giải cellulose Môi trường Czapek cơ bản có bổ sung nguồn cacbon là CMC với các nồng độ khác nhau (0,5%, 1% và 1,5%) Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, đến khả năng phân giải cellulose Môi trường Czapek cơ bản có bổ sung 1% CMC với giống A1, 0,5 % CMC với giống A2 . Thuốc thử KI 2 g Iodine tinh thể 1 g Nước cất 300 ml Môi trường lên men thử nghiệm: Bã khoai mì Cám gạo 3.4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Vật liệu - Hai chủng nấm mốc được phân lập từ các nguồn phế phụ phẩm: lõi bắp, bã mía, vỏ đậu phộng do phòng Nghiên cứu Dinh dưỡng Chăn nuôi cung cấp để nghiên cứu khả năng phân giải cellulose. Aspergillus Niger : A1 Aspergillus Oryzae: A2 - Dụng cụ, hóa chất và công thức pha môi trường do phòng dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi cung cấp. 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1. Tăng sinh hoạt hóa giống Tăng sinh A1 và A2 trong môi trường czapek lỏng, lắc trong khoảng 24-48 h để tăng sinh hoạt hóa giống. 3.4.2.2. Cấy chuyền giữ giống Giống A1 và A2 sau khi đã được tăng sinh hoạt hóa, ta tiến hành cấy giống vào ống thạch nghiêng czapek để giữ giống và tạo dịch huyền phù. 3.4.2.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của 2 chủng A1 và A2 Nguyên tắc: Dựa vào đường kính phân giải cellulose để xác định khả năng sinh enzyme cellulase mạnh hay yếu của 2 chủng A1 và A2. Vòng phân giải trên môi trường càng lớn chứng tỏ hai chủng nấm mốc này sinh enzyme càng nhiều. Bố trí thí nghiệm Kiểu thí nghiệm: thí nghiệm 1 yếu tố Yếu tố : nồng độ CMC ( 0,5%, 1%, 1,5%) Số lần lặp lại: 3 lần Tổng đơn vị thí nghiệm: A x 3 x 3 = 9A (đĩa) (A: hai chủng nấm mốc thí nghiệm) Cách tiến hành Tạo dịch huyền phù bào tử nấm mốc Cho 10 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy đã vô trùng để tách bào tử cho vào nước cất tạo dịch huyền phù. Sau đó đổ dịch huyền phù vào trong ống nghiệm vô trùng và pha loãng đến những mức xác định để có được lượng tế bào đồng nhất trước khi thí nghiệm. Định lượng bào tử nấm mốc của dịch huyền phù Xác định lượng tế bào đồng nhất bằng phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu. Số tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức sau: Số tế bào/ ml = a*4000*103*10n/ b Trong đó: a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) b: số ô con trong 5 ô lớn (80 ô con) 103: là chuyển từ mm3 sang ml (1000 mm3 = 1ml) n: số lần pha loãng mẫu Chú ý: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn phải trên 200 mới bảo đảm sự chính xác của các phương pháp. Cấy mẫu Sau khi đã xác định được lượng bào tử đồng nhất ở mỗi chủng ta sẽ lắc đều dịch huyền phù nấm mốc, dùng pipet và đầu típ vô trùng hút 20ml dịch bào tử cho vào giữa đĩa petri có chứa môi trường Czapek cơ bản với các nồng độ CMC khác nhau. Làm lần lượt như vậy cho tất cả các chủng. Sau đó sẽ cho vào tủ ấm, ủ ở 280C/ 3 ngày. Quan sát, đánh giá khả năng phân giải cellulose của từng chủng. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Đường kính vòng phân giải cellulose (mm) Sử dụng thuốc thử Iod để đánh giá vòng phân giải cellulose Nhỏ thuốc thử Iod vào trong mỗi đĩa mẫu sau đó dùng thước để đo đường kính phân giải cellulose của mỗi mẫu và ghi nhận lại kết quả. 3.4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải cellulose của 2 chủng Aspergillus A1 và A2 Từ kết quả của thí nghiệm trên rút ra được nồng độ CMC thích hợp để tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải cellulose. Nguyên tắc: Dựa vào đường kính phân giải cellulose để xác định khả năng sinh enzyme cellulase mạnh hay yếu của 2 chủng A1 và A2. Vòng phân giải trên môi trường càng lớn chứng tỏ hai chủng nấm mốc này sinh enzyme càng nhiều. Bố trí thí nghiêm Kiểu thí nghiệm: thí nghiệm 1 yếu tố Yếu tố pH= 4, 5 và 6 Số lần lặp lại: 3 lần Tổng đơn vị thí nghiệm: A x 3 x 3 = 9A (đĩa) (A: hai chủng nấm mốc thí nghiệm) Cách tiến hành Chuẩn bị môi trường Czapek – CMC, đổ đĩa petri. Xác định lượng bào tử đồng nhất, dùng pipet hút 20 ml cho lên đĩa. Làm lần lượt như vậy cho tất cả các chủng. Sau đó ủ ở 300C. Quan sát và đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải cellulose của từng chủng bằng thuốc thử Iod ở các mốc thời gian cần thí nghiệm. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Đường kính vòng phân giải cellulose (mm) Sử dụng thuốc thử Iod để đánh giá vòng phân giải cellulose Nhỏ thuốc thử Iod vào trong mỗi đĩa mẫu sau đó dùng thước để đo đường kính phân giải cellulose của mỗi mẫu và ghi nhận lại kết quả. 3.4.2.5. Lên men thử nghiệm 2 chủng A1 và A2 trong quy mô phòng thí nghiệm: Bố trí thí nghiệm Kiểu thí nghiệm: thí nghiệm hai yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên Yếu tố 1: 2 chủng nấm mốc A1 và A2 Yếu tố 2: môi trường cám gạo và bã khoai mỳ Số lần lặp lại: 2 lần Tổng đơn vị thí nghiệm: 2 x 2 x 2 = 8 Cách tiến hành Nhân sinh khối Từ 2 chủng tiến hành nhân sinh khối trên môi trường Czapek cơ bản có bổ sung nồng độ CMC thích hợp, ủ ở 280C/5 ngày. Chuẩn bị môi trường Phân tích hàm lượng xơ tổng số Xác định độ ẩm cơ chất Mẫu đem thí nghiệm là cám gạo và bã khoai mỳ khô. Cân chính xác 10 g mẫu đựng trong đĩa nhôm có mặt thoáng. Mẫu được đem đi sấy ở 100 – 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Trong quá trình sấy có thể dùng đũa đảo trộn cho nước bốc hơi hết. Sau khi sấy xong đem ra để nguội trong bình hút ẩm cho nguội trong khoảng thời gian 20 – 30 phút. Sau đó đem cân. Độ ẩm được tính bằng công thức: W (%) = (a – b) x 100 / a Trong đó: W: Độ ẩm của mẫu (%) a: Trọng lượng mẫu trước khi sấy (g) b: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g) Bổ sung lượng nước thích hợp để ẩm độ của môi trường đạt khoảng 55 – 60% Hấp khử trùng môi trường ở 1210C/ 60 phút. Chuẩn bị bột bào tử Cấy giống nấm mốc vào môi trường bột mỳ vô trùng (có ẩm độ A% = 55 – 60%), tỷ lệ 10 % giống, ủ ở 280C trong 5 ngày. Các chủng sau khi nhân sinh khối đem sấy ở 550C trong 3 ngày, sau đó đem nghiền nhỏ tạo thành dạng bột bào tử. Lên men thử nghiệm Môi trường cám gạo, bã khoai mì khô sau khi đã hấp khử trùng được cấy một lượng bột bào tử với tỉ lệ 10% , ủ ở 280C/ 5 ngày. Sau đó đem phân tích hàm lượng xơ còn lại trong mẫu. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Hàm lượng xơ Phương pháp phân tích Nguyên tắc Dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin … ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic. Tiến hành Cân 2g mẫu (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100-1050C), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml. Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp gồm 1,5 ml acid nitrit đặc và 15 ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa xơ 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 đến 15 ml) Rửa bằng rượu etylic 96% 1-2 lần, mỗi lần từ 10-15 ml. Rửa bằng ete etylic Sấy giấy lọc có chứa kết tủa ở nhiệt độ 100-1050C đến trọng lượng không đổi (2-3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose. Do đó lượng xơ xác định gọi là xơ thô. Tính kết quả Hàm lượng cellulose được tính bằng công thức: X = a x 100/ w Trong đó: X: hàm lượng cellulose tính bằng % a: trọng lượng cellulose (g) w: trọng lượng mẫu thử nghiệm (g) Phần IV KẾT QUẢ 4.1. Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng phân lập Từ 2 chủng ban đầu chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm thăm dò và rút ra được khả năng phân giải cellulose của 2 chủng Sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 280C trên môi ttrường Czapek cơ bản có bổ sung các nồng độ CMC khác nhau, kết quả đường kính phân giải cellulose được ghi nhận như sau: Bảng 1: Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A1 trên các môi trường CMC (mm). Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 33 34,33 1 35 35 37 35,67 1,5 29 29 31 29,67 Biểu đồ 1 Bảng 2: Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A2 trên các môi trường CMC (mm) Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 39 36 1 34 30 32 32 1,5 30 29 29 29,33 Biểu đồ 2 Hình 1. Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A1 ở các nồng độ CMC Hình 2. Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A2 ở các nồng độ CMC Qua kết quả ở biểu đồ 1 cho thấy vòng phân giải cellulose của chủng A1 ở nồng độ CMC 1% (35,67 mm) là lớn nhất, kế đến là nồng độ CMC 0,5% (34,33 mm) và nhỏ nhất là nồng độ CMC 1,5% (29,67 mm). Ở CMC 1% chủng A1 đã cho đường kính vòng phân giải cellulose mạnh nhất. Nhưng nếu tăng CMC lên 1,5% thì hiệu suất phân giải cellulose của chủng A1 lại kém đi (29,67 mm). Ở CMC = 0,5%, đường kính vòng phân giải của chủng A1 cao (34,33 mm) nhưng vẫn thấp hơn so với đường kính vòng phân giải ở CMC = 1%. Đối với chủng A2, qua kết quả ở biểu đồ 2 cho thấy vòng phân giải cellulose ở nồng độ CMC 0,5% (36 mm) là lớn nhất, kế đến là nồng độ CMC 1% (32 mm) và nhỏ nhất là nồng độ CMC 1,5% (29,33 mm). Ở CMC 1% chủng A1 đã cho đường kính vòng phân giải cellulose tương đối cao nhưng vẫn thấp hơn đường kính vòng phân giải ở nồng độ CMC 0,5%. Như vậy, môi trường có chứa CMC 1% tỏ ra rất thích hợp đối với khả năng phân giải enzyme của chủng A1 và nồng độ CMC 0,5% là thích hợp với chủng A2. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ CMC 1% làm cơ sở để bổ sung cellulose vào môi trường nuôi cấy Czapek để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo cho chủng A1 và nồng độ CMC 0,5% làm cơ sở bổ sung vào môi trường cho chủng A2. 4 .2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải cellulose Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường Czapek cơ bản có bổ sung CMC tối ưu đã khảo sát ở các giá trị pH khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C phân giải cellulose cho kết quả như sau: Bảng 3: Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A1 trên các môi trường pH khác nhau (mm) Lặp lại pH Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB pH 4 41 40 45 42 5 40 38 39 39 6 31 37 40 36 Biểu đồ 3 Bảng 4: Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng A2 trên các môi trường pH khác nhau (mm) Lặp lại pH Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB pH 4 40 40 38 39,33 5 37 35 39 37 6 33 36 31 33,33 Biểu đồ 4 Hình 3. Đường kính vòng phân giải CMC của chủng A1 ở pH 4, 5 và 6 Hình 4. Đường kính vòng phân giải CMC của chủng A2 ở pH 4, 5 và 6 Qua kết quả ở biểu đồ 3 và biểu đồ 4 cho thấy khả năng phân giải cellulose của các chủng ở pH = 4 là cao nhất (chủng A1: 42 mm, Chủng A2: 39,33 mm) Ở giá trị pH = 4 các chủng khảo sát có đường kính vòng phân giải cellulose mạnh nhất. Tuy nhiên nếu tăng pH lên giá trị 6 thì khả năng phân giải của các chủng lại kém đi (chủng A1: 36 mm, chủng A2: 33,33 mm). Ở giá trị pH = 5 đường kính trung bình của vòng phân giải cellulose của các chủng tương đối cao đạt 39mm đối với chủng A1 và 37 mm chủng A2. Kết quả còn cho thấy, chủng A1 và A2 có thể phát triển tốt và có hoạt tính phân giải cellulose ở khoảng biến thiên lớn của pH từ 4 – 6 với đường kính vòng phân giải cellulose từ 33 – 42 mm. Điều này cho thấy 2 chủng A1 và A2 thích hợp với những môi trường có pH thấp. Tóm lại: Chủng A1 và A2 có khả năng phân giải cellulose ở các giá trị pH khảo sát và đặt biệt tốt ở pH = 4 4.3. Lên men thử nghiệm 2 chủng nấm mốc A1 và A2 trong quy mô phòng thí nghiệm. Thành phần hóa học của cơ chất trước khi lên men Kết quả phân tích hàm lượng cellulose của hai môi trường cám gạo và bã khoai mỳ khô lúc ban đầu như sau: Bảng 5: hàm lượng cellulose của hai môi trường cám gạo và bã khoai mỳ khô lúc ban đầu: Cơ chất Cellulose (%) A% pH Cám gạo 5,75 10,25 4,7 Bã khoai mỳ 12,5 17,91 5,3 Bã khoai mỳ có hàm lượng cellulose cao gấp đôi so với hàm lượng cellulose của cám gạo. A (%) ban đầu thấp, phải điều chỉnh để đạt ẩm độ thích hợp (55 – 60%) cho nấm mốc phát triển. pH tự nhiên của cơ chất thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc. Hình 5: Môi trường cám gạo và môi trường bã khoai mì trước khi lên men Hàm lượng cellulose của cơ chất sau khi lên men Hai chủng A1 và A2 được chọn để thử nghiệm lên men trên hai môi trường cám gạo và bã khoai mỳ cho kết quả sau 5 ngày lên men ở nhiệt độ phòng như sau: Bảng 6. Hàm lượng cellulose của cơ chất sau khi lên men (%) NT LL A2 + cám gạo A2 + khoai mỳ A1 + cám gạo A1 + khoai mỳ 1 5,37 4,15 1,99 2,89 2 4,12 3,49 2,73 4,38 TB 4,745 3,82 2,36 3,635 Các chủng có 1 mẫu tự giống nhau là sự khác biệt không có ý nghĩa. Hai chủng khảo sát có khả năng phân giải cellulose tốt trên môi trường cám gạo và bã khoai mỳ. Đặc biệt là chủng A1 có hoạt tính cellulase mạnh trên cả hai môi trường. Riêng chủng A2 hầu như không có khả năng phân giải cellulose khi phát triển trên môi trường cám gạo mặc dù nấm mốc vẫn phát triển tốt. Hình 6: Chủng A1 lên men trên môi trường cám gạo Hình 7: Chủng A2 trên môi trường cám gạo và bã khoai mì PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Nuôi cấy trên môi trường Czapek cơ bản có bổ sung các nồng độ CMC khác nhau các chủng khảo sát có hoạt lực enzyme cao nhất với đường kính vòng phân giải cellulose đo được trung bình là 35,67 mm ở nồng độ CMC 1% đối với chủng A1 và 36 mm ở nồng độ CMC 0,5% đối với chủng A2. Nuôi cấy trên môi trường Czapek cơ bản có bổ sung nồng độ CMC 1% đối với giống A1 và CMC 0,5% đối với chủng A2, ở pH = 4 các chủng có khả năng phân giải cellulose cao nhất với đường kính vòng phân giải đo được trung bình là 42mm đối với A1 và 39,33 đối với chủng A2, kế tiếp là môi trường pH = 5 và thấp nhất là môi trường pH = 6. Hai chủng khảo sát có khả năng phân giải cellulose tốt trên môi trường cám gạo và bã khoai mỳ. Đặc biệt là chủng A1 có hoạt tính cellulase mạnh trên cả hai môi trường. Riêng chủng A2 hầu như không có khả năng phân giải cellulose khi phát triển trên môi trường cám gạo mặc dù nấm mốc vẫn phát triển tốt. Theo kết quả nghiên cứu của Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh (Viện Nghiên cứu Hải sản), vòng phân giải cellulose khoảng 8 đến 13 mm, còn theo kết quả nghiên cứu của Lê Hoàng Bảo Vi (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam), vòng phân giải khoảng 29 đến 45 mm, theo Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010, kết quả khảo sát khoảng 20 đến 25 cm, vậy kết quả khảo sát trên là tốt. 5.2. KIẾN NGHỊ Nếu có thời gian và điều kiện em muốn khảo sát thêm ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng phân giải cellulose của các chủng. Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme. Bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để sản xuất ra các sản phẩm thức ăn chăn nuôi chất lượng tốt. Sau đó ứng dụng vào phát triển với quy mô công nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, Gíao trình Vi sinh Vật học, NXB. Khoa học Kỹ thuật. Nguyễn Hữu Chấn , Enzyme Xúc Tác Sinh Học, NXB Y Học Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đông, Lê Đình Lương, 1982, Vi nấm, NXB KH&KT, Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, 1976, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật (tập 2&3), NXB KH&KT, Hà Nội. TS. Hoàng Hải,TS. Dư Ngọc Thạch, Vi Sinh Vật Đại Cương, Trường ĐH Nông lâm, ĐH Thái nguyên. Đỗ Ngọc Liên, Phan Thị Trân Châu, Enzyme I, II, 1972, ĐH Tổng Hợp Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB ĐH Quốc Gia TP.HCM. PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình công nghệ enzyme, 2009, TP.HCM. Đồng Thị Thanh Thu, 1998, Sinh hóa ứng dụng, tủ sách ĐHKHTN TpHCM. Lược Sử Nghiên Cứu Vi Sinh Vật – ebook.edu.vn sdh.udn.vn/zipfiles/08.tbCNMT/08.02.r.tuyet-huy.pdf+%C4%91o+%C4%91%E1%BB%99+%C4%91%E1%BB%A5c+%C4%91%C4%A9a+t h%E1%BA%A1ch+%2B+cellulose&cd=1&hl=vi&ct=clnk&gl=vn s