Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trứng cá

h là nồng độ của cao chiết nhỏ nhất mà ở đó không thấy sự phát triển của vi khuẩn P. acnes chính là giá trị MIC của cao chiết trên vi khẩn P. acnes. 3.3.4.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết cho khả năng kháng khuẩn cao nhất Mục tiêu: xác định một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết có hiệu quả kháng khuẩn cao nhất từ cây Trứng cá Tiến hành thí nghiệm: tiến hành xác định một số hợp chất trong cao chiết Trứng cá như: nhóm flavonoid, saponin, tanin. Các hợp chất flavonoid, saponin, tanin được định tính bằng phương pháp trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết Trứng cá Hợp chất Thực nghiệm Hiện tượng Flavonoid 1 g cao chiết + 2 ml methanol + vài hạt bột Mg + 0,5 ml HCl đđ Dung dịch màu hồng tới đỏ Saponin 5 g cao chiết + 5 ml nước cất, đun ấm, lắc mạnh Xuất hiện bọt bền Tanin 1 g cao chiết + 20 ml nước cất, thêm vài giọt NaCl và FeCl3 10 % Xuất hiện tủa xanh lá cây, xanh đen Puguh et al., 2014 31 Cao chiết 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu thí nghiệm được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS Satistics 20, phân tích ANOVA với độ tin cậy 95 %, các giá trị trung bình được so sánh bằng Duncan, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm được trình bày trong hình 3.4 Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm 3.6. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ - Đưa ra các tiêu chí chọn mẫu. - Hiệu chỉnh các thiết bị trước khi sử dụng - Sử dụng các thiết bị độ chính xác cao - Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình Nuôi cấy/ TYEG agar Bốc hơi trên bếp cách thủy Dịch chiết Đun hồi lưu Ethanol 96 % trong 3 giờ ở 70 oC Bộ phận cây Trứng cá Vi khuẩn P. acnes Nhận diện Kháng khuẩn Định tính bộ phận kháng khuẩn cao nhất 32 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Chiết cao Sử dụng phương pháp chiết nóng đun hồi lưu và dung môi ethanol 96 % thu được các loại cao chiết với kết quả thể hiện như sau Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá Cao chiết Độ ẩm (%) Độ ẩm cao (%) Lá Vỏ thân Quả chín Quả non 12,8 13,0 - - 17,38 15,00 19,05 18,82 Nhận xét: độ ẩm nguyên liệu khô lá và vỏ thân cây Trứng cá dưới 13 % đạt theo mô tả độ ẩm dược liệu theo DĐVN IV. Độ ẩm trung bình của cao ở các bộ phân đều không quá 20 %, cao thu được ở dạng cao đặc theo PL1.1 DĐVN IV. Độ ẩm trong cao quả, chín là cao nhất trong bốn loại cao khảo sát (19,05 %). Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá Cao chiết Khối lượng khô (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng cao toàn phần (g) Hiệu suất chiết (%) Lá Vỏ thân Quả chín Quả non 207,75 212,65 - - - - 300 300 90,04 70,74 102,16 74,45 43,34 33,27 34,05 24,82 Nhận xét: khối lượng cao thu được cao nhất là ở quả chín (102,16 g) hiệu suất chiết các lá, vỏ thân, quả non và quả chín với dung môi ethanol 96 % bằng phương pháp đun hồi lưu lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 % và 24,82 % (so với khối lượng khô). Hiệu suất chiết cao từ lá Trứng cá cao nhất trong bốn loại cao (43,34 %) 4.1.2. Nuôi cấy và nhận diện vi khuẩn Propionibacterium acnes 4.1.2.1. Kết quả đặc điểm hình thái của dòng vi khuẩn nuôi cấy Đặc điểm khuẩn lạc Quan sát khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple cho thấy: dòng vi khuẩn sinh trưởng chậm, khuẩn lạc xuất hiện rõ sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, kích thước khuẩn lạc nhỏ. Dòng vi khuẩn 134N có màu vàng đậm, tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên. 33 Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên. Màu sắc khuẩn lạc: khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple đều có màu vàng nhạt đến đậm. Kích thước khuẩn lạc: đường kính khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N có kích thước dao động 0,8 - 1,3 mm sau 5 - 7 ngày nuôi cấy. Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple. a. Dòng vi khuẩn 134N màu vàng đậm b. Dòng vi khuẩn 134N chụp nghiêng Đặc điểm tế bào vi khuẩn Quan sát hình thái của các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X (độ phóng đại 1000 lần) cho thấy dòng vi khuẩn có dạng que ngắn. Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi a b 34 4.1.2.2. Kết quả đặc điểm sinh hoá dòng vi khuẩn nuôi cấy Dòng vi khuẩn 134N thuộc vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím xanh của crystal violet), catalase dương tính (khuẩn lạc làm sủi bọt H2O2 3 %) Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn phân lập Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường trypticase soyar borth trong 24 giờ ở 37 oC, sau đó kiểm tra khả năng sinh indol bằng thuốc thử Kovac’s. Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn tạo được indol từ môi trường nuôi cấy chứa trytophan vì làm biến đổi màu thuốc thử Kovac’s từ vàng sang đỏ. Trong khi dòng đối chứng Staphylococcus aureus không có khả năng này. Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn a. Dòng vi khuẩn 134N tạo indol b. Đối chứng không tạo indol 35 Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường pepton và KNO3 ở 37 oC, sau đó kiểm tra khả năng phản nitrat hóa. Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn phân lập có khả năng khử NO3- môi trường sinh khí NH3 và vẫn phát triển bình thường. Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn phân lập a. Dòng vi khuẩn 134N tạo phản ứng phản nitrat hóa b. Đối chứng âm Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 oC trở xuống. Dòng vi khuẩn 134N làm một phần bề mặt môi trường gelatin hoá lỏng lõm xuống phản ứng dương tính, đối chứng âm môi trường gelatin không chứa dòng vi khuẩn 134N. Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N a. Dòng vi khuẩn 134N làm dịch hóa gelatin b. Đối chứng âm 36 4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết ethanol lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua kích thước khoảng vô khuẩn được trình bày bảng 4.3. Hiệu quả kháng khuẩn của các loại cao được khảo sát ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả cho thấy các loại cao lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá có khả năng ức chế dòng vi khuẩn P. acnes. Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao cây trứng cá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Ghi chú: số liệu đường kính vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột, có số liệu có ít nhất 1 chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở ý nghĩa 5%. Đối chứng (-): DMSO cho đường kính kháng khuẩn bằng 0. Loại cao Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Đối chứng dương Nồng độ cao chiết bằng ethanol (mg/ml) 50 100 200 DMSO Levofloxacin Vỏ thân 10,33 ± 0,577a 11,67 ± 1,155a 16,67 ± 2,309a 0 0 Quả chín 11 ± 0,000a 13,33 ± 1,528a 20 ± 1,000a 0 0 Quả non 11,67 ± 0,577b 18 ± 1,000b 20,67 ± 1,155b 0 8,67 ± 0,577b Lá 16,33 ± 2,082c 19 ± 0,000b 23 ± 1,732b 0 8,67 ± 0,577b p 0,032 0,000 0,010 0,000 37 Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml. Ghi chú: (1) nồng độ 200 mg/ml; (2) nồng độ 100 mg/ml; (3) nồng độ 50 mg/ml; (4) đối chứng âm DMSO; (5) đối chứng dương levofloxacin Quả chín Quả sống 38 Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml a. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 200 mg/ml b. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 100 mg/ml c. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 50 mg/ml Nhận xét: qua kết quả thí nghiệm ở bảng 4.3 cho thấy cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N với kích thước khoảng vô khuẩn dao động từ 10,33 mm đến 23 mm. Các nồng độ cao Trứng cá đều có khoảng vô khuẩn lớn hơn so với kháng sinh đối chứng levofloxacin, cho thấy khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % cao hơn kháng sinh đối chứng.. Khi so sánh giữa các nồng độ, ở nồng độ 200 mg/ml tạo khoảng vô khuẩn cao nhất trong 3 nồng độ khảo sát đạt giá trị 16,67 ± 2,309 mm ở vỏ thân, 20 ± 1,000 mm ở trái chín, 20,67 ± 1,155 mm ở trái non và 23 ± 1,732 mm ở lá (mức ý nghĩa p = 0,032). Ở nồng độ 200 mg/ml cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96% tạo khoảng vô khuẩn trên dòng P. acnes 134N từ 16,67 mm đến 23 mm trong đó ức chế mạnh nhất ở cao chiết lá (khoảng vô khuẩn 23 mm) kế đến là trái non, trái chín và vỏ thân. Ở nồng độ 100 mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 19 ± 0,000 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 16,33 ± 2,082 mm. Kết quả phân tích cho thấy cao lá Trứng cá ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml hiệu quả ức chế dòng vi khuẩn 134N cao nhất, kích thước khoảng vô khuẩn trung bình ở từng nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml cao lá lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082mm. Từ đó sử dụng cao lá cho các thí nghiệm tiếp theo tìm MIC và định tính một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong cao lá Trứng cá. 4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes Dựa trên kết quả thí nghiệm trên, cao chiết từ lá Trứng cá được chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn P. acnes và nồng độ được khảo sát lần lượt là 40 mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml và 5 mg/ml. Đối chứng sử dụng: đối chứng âm 39 là DMSO và đối chứng dương là levofloxacin (5µg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất mà tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn nên nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P. acnes. Nồng độ cao chiết (mg/ml) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 40 11 ± 1 20 9 ± 1 10 6 ± 0 5 - Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. (-) là không kháng khuẩn Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes Ghi chú: (1) nồng độ 5 mg/ml; (2) đối chứng dương levofloxacin; (3) nồng độ 10 mg/ml; (4) nồng độ 20 mg/ml; (5) nồng độ 40 mg/ml; (6) đối chứng âm DMSO. Nhận xét: ở nồng độ 40 mg/ml cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes với vòng vô khuẩn đạt 11 ± 1 mm. Nồng độ 20 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 9 ± 1 mm Nồng độ 10 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 6 ± 0 mm. Nồng độ 5 mg/ml không quan sát thấy hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết lá trứng cá vòng vô khẩn bằng 0 mm. Từ kết quả ta thấy nồng độ 10 mg/ml là nồng độ thấp nhất của cao chiết lá trứng cá có khả năng ức chế vi khuẩn P.acnes. 40 4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá Để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết ethanol, tiến hành định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học như flavonoid và saponin, tanin. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá Hợp chất Hiện tượng Kết quả Hình Flavonoid Dung dịch màu đỏ + Saponin Xuất hiện bọt + Tanin Dung dịch màu xanh đen + Ghi chú: +: kết quả dương tính; 1: mẫu thử; 2: mẫu chứng. 1 2 41 4.2. THẢO LUẬN 4.2.1. Chiết cao Độ ẩm nguyên liệu khô lá Trứng cá (12,8 %) và vỏ thân cây Trứng cá (13 %) dưới 13 % đạt mức độ ẩm an toàn dược liệu theo tiêu chuẩn DĐVN IV.Việc xác định độ ẩm của mẫu khô trước khi tiến hành chiết xuất giúp biết được các điều kiện để xác định phương pháp chiết xuất phù hợp, nhằm thu được lượng cao chiết tối ưu. Ngoài ra, việc xác định độ ẩm của nguyên liệu còn tạo điều kiện để xác định nhiệt độ và thời gian sấy mẫu thích hợp để tiến hành chiết xuất có hiệu suất cao hơn theo Dương Phượng Liên và Nguyễn Nhật Minh Phương (2014) trong suốt quá trình sấy mẫu, nhiệt độ cao làm phá vỡ các cấu trúc tế bào bên trong của nguyên liệu, tạo điều kiện cho dung môi và nguyên liệu tiếp xúc tốt hơn, tăng hiệu suất chiết. Bên cạnh đó, quá trình sấy còn có tác dụng làm giảm độ ẩm của nguyên liệu giúp tăng tỷ lệ dung môi sử dụng với nguyên liệu. Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết, người ta thường dựa trên hiệu suất cao chiết. Hiệu suất chiết cao phản ánh sự tối ưu của việc kết hợp các điều kiện khác nhau trong phương pháp chiết. Kết quả hiệu suất chiết các lá, vỏ thân, quả non và quả chín với dung môi ethanol 96% bằng phương pháp đun hồi lưu lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 % và 24,82 % (so với khối lượng khô). Các kết quả hiệu suất chiết cao lá cao hơn so với nghiên cứu (Puguh et al., 2014) bằng phương pháp ngâm với dung môi ethanol hiệu suất chiết là 9,572 %, bên cạnh đó hiệu suất chiết cao nước là 11,928 % cao hơn khi chiết bằng ethanol. Nguyên nhân những khác biệt do phương pháp đun hồi lưu gia tăng hiệu quả hòa tan các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt hơn nên cho hiệu quả cao chiết cao hơn phương pháp ngâm. Hiệu suất chiết còn bị ảnh hưởng bởi các điều kiện khác nhau như nhiệt độ, thời gian sấy mẫu, mẫu thu hái những vùng khác nhau, thời gian thu hái khác nhau, loại dung môi. Độ chín của cấu tạo tế bào quả trứng cá ảnh hưởng quá trình chiết, mức độ phá vỡ mô tế bào một nhân tố cơ bản đẩy nhanh và làm triệt để tiến hành chiết xuất bởi dung môi, làm giải phóng nhiều chất hơn. 4.2.2. Phân lập và nhận diện vi khuẩn Qua kết quả thí nghiệm kiểm tra một số đặc điểm hình thái và sinh hoá của dòng vi khuẩn phân lập cho thấy những đặc điểm sau: 42 - Trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple sau 72 giờ khuẩn lạc có hình dạng tròn, bìa nguyên, nhô cao hoàn toàn trên môi trường, màu vàng đậm . - Tế bào hình que, Gram dương, catalase dương tính, tạo indol từ trytophan, phản ứng phản nitrat hóa và làm dịch hóa gelatin. Những đặc điểm này phù hợp với công bố của Kishishita et al., 1980; Higaki et al., 2004 về đặc điểm của loài P. acnes. Theo Kishishita et al., 1980; Higaki et al., 2004 P. acnes có khuẩn lạc hình tròn, bìa nguyên, nhô cao hoàn toàn, màu vàng nhạt hoặc đậm trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple (khuẩn lạc phát triển chậm). Trong điều kiện kỵ khí tế bào hình que, Gram dương, không sinh bào tử. Vi khuẩn P. acnes có khả năng sản xuất nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hóa gelatin. Các loài giống Propionibacterium hiện diện trên da khác như: Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum có những đặc điểm chung của giống Propionibacterium như khuẩn lạc có dạng tròn, bìa nguyên, mô, tế bào hình que, Gram dương và catalase dương tính. Ngoài ra các loài trong giống Propionibacterium có những đặc điểm khác biệt như: trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0.002% bromocresol purple, loài P. granulosum có màu nâu khuẩn lạc to (2 - 3mm). Cả hai loài P. avidum và P. granulosum không tạo được indol từ tryptophan. Vì vậy có thể kết luận rằng dòng vi khuẩn 134N từ nghiên cứu “ Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu tại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô là vi khuẩn Propionibacterium acnes. 4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá Khảo sát khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của các bộ phận cây Trứng cá cho thấy cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N với kích thước khoảng vô khuẩn dao động từ 10,33 mm đến 23 mm. Cây Trứng cá có tiềm năng kháng khuẩn vi khuẩn P. acnes trên các bệnh nhân trứng cá. Hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết cây Trứng cá có khả năng kháng khuẩn là do chứa các hợp chất flavonoid. Theo Cushnie và Andrew (2005) hầu hết các hợp chất flavonoid có tác dụng kháng khuẩn do: kiềm 43 hãm và ngăn sự phân chia của vi khuẩn, ức chế enzym transpeptidase ngăn quá trình tổng hợp mucopeptid (yếu tố tạo sự bền vững của thành vi khuẩn); khi gắn lên màng vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng; ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic và RNA của vi khuẩn và ức chế hoạt động của hyaluronidase (enzym giúp vi khuẩn tấn công sang các tế bào lân cận) Kích thước khoảng vô khuẩn càng tăng khi nồng độ cao càng tăng cho thấy nồng độ cao sẽ tỷ lệ thuận với kháng khuẩn của cao. Ở từng nồng độ, cao Trứng cá tạo khoảng vô khuẩn với dòng vi khuẩn 134N có sự khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5 %. Trong các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml cao chiết từ lá trứng cá có kích thước khoảng vô khuẩn trung bình ở từng nồng độ lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082mm cho thấy khả năng kháng khuẩn dòng vi khuẩn 134N ở cao lá Trứng cá là cao nhất so với các loại cao còn lại. Kết quả kháng khuẩn dòng 134N ở cao chiết từ lá trứng cá nồng độ 200 mg/ml (khoảng vô khuẩn đường kính bằng 23 ± 1,732 mm) cao hơn với nghiên cứu của Sukatta et al., 2010 trên cao chiết vỏ trái chôm chôm (khoảng vô khuẩn đường kính bằng 18,83 ± 0,98 mm) và gần với kết quả cao chiết vỏ trái măng cụt khả năng kháng P. acnes với đường kính khoảng vô khuẩn 23,83 ± 0,98 mm cứu của Sukatta et al., 2010. Các nồng độ cao Trứng cá đều có khoảng vô khuẩn lớn hơn so với kháng sinh đối chứng levofloxacin, cho thấy khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % cao hơn kháng sinh đối chứng. Sự đề kháng của vi khuẩn P. acnes với các loại kháng sinh ngày càng gia tăng do sự lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá trong thời gian kéo dài (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013). Theo 2 nghiên cứu của Ross et al., 2001 và Ross et al., 2002 đột biến gen 16S và 23S rRNA chính là nguyên nhân gây ra việc đề kháng của P. acnes đối với các loại kháng sinh. Đặc biệt các kháng sinh như erythromycin và clindamycin tỷ lệ đề kháng càng gia tăng. Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolon (ciprofloxacin, levofloxacin..) đã được báo cáo gần đây với tỷ lệ đề kháng 9,6 % tại Ấn độ năm 2016 (Kabir et al., 2016). 4.2.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes của cao chiết từ lá cây Trứng cá là 10 mg/ml. Nhiều nghiên cứu khác của lá cây Trứng cá có khả năng ức chế 44 vi khuẩn gây bệnh, theo Yasunaka (2005) cho rằng hoạt tính khác khuẩn của cao chiết lá Trứng cá được xác định bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chống lại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli (C600) và Staphyloccocus aureus (209 P) có nồng độ lần lượt là 512 µg/ml và 1024 µg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Trứng cá so sánh với các loại cao chiết khác trên cùng vi khuẩn P. acnes thông qua giá trị MIC. Giá trị MIC (10 mg/ml) trong thí nghiệm này cao hơn so với một số thực vật khác đã được công bố. Theo Kumar et al., 2007 dịch chiết hoa Lài trong dung môi ethanol ức chế vi khuẩn P. acnes với giá trị MIC là 5 mg/ml. Hay ở nghiên cứu khác của Fu et al., 2007 tinh dầu hoa Hương thảo (Rosmarinus offcinalis L.) hoạt tính kháng P. acnes có giá trị MIC 0,56 mg/ml. Dịch chiết nước từ E. cochinchinesis và S. offcinalis hoạt tính kháng P. acnes có giá trị MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml. Mặc khác khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Trứng cá cao hơn so với cao chiết ethyl acetat lá Ô môi có giá trị MIC = 30 mg/ml (Phùng Thị Yến Thanh, 2015) Trong thí nghiệm thực hiện, khảo sát hoạt tính kháng P. acnes của dịch chiết được tiến hành trên một dòng vi khuẩn không có sự khảo sát khả năng chống chịu của dòng vi khuẩn và kháng với kháng sinh levofloxacin là kháng sinh phổ kháng khuẩn rộng; điều này có thể giải thích tại sao khả năng kháng P. acnes của cao chiết ethanol lá Trứng cá này cao hơn so nghiên cứu khác. Mặc khác, giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá cao hơn so với các công bố trước là so phương pháp chiết xuất khác nhau, thành phần hoạt chất có trong các loài khác nhau và sử dụng loại dung môi khác nhau. 4.2.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá Kết quả phân tích định tính cho thấy trong cao chiết dịch chết ethanol của lá Trứng cá có sự hiện diện của các hợp chất như flavonoid, saponin, tanin. Kết quả này tương ứng với nghiên cứu của Puguh (2014). Theo Puguh (2014) dịch chiết lá Trứng cá có hàm lượng cao phenol cao như flavonoid, tanin, polyphenol. Flavonoid: là chất có cấu tạo khung kiểu C6-C3-C6. Flavonoid được biết là chất có tác dụng hạ đường huyết và phục hồi tế bào β của tuyến tụy, chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống dị ứng, điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh, kháng oxy hóa (Harleen et al., 2011). Saponin: trong tự nhiên nó thường tồn tại chủ yếu dạng vô định hình, hòa tan tốt trong cồn và nước, nhưng không hòa tan trong các dung môi hữu cơ không phân 45 cực như benzen và n-hexan. Saponin có vị đắng chát và vô cùng độc hại, vì chúng gây chứng thiếu máu tán huyết. Tuy nhiên, ở một lượng nhỏ, dịch chiết thực vật chứa hợp chất saponin có khả năng ức chế sự gây viêm (Karr, 2007). Tanin: đặc trưng bởi vị đắng chát do đó những dịch chiết từ cây có tanin luôn có những vị này. Ngoài ra, hợp chất tanin có khả năng kháng E. coli và những vi khuẩn Gram dương gây hại là một đặc tính nổi bật của tanin (Kunwar, 2010). Tanin có nhiều hiệu quả sinh học cao như khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, chống đột biến, chống đái tháo đường và có vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mãn tính. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol lá trứng cá là do chứa hợp chất flavonoid, tanin, saponin. Theo Cushine và Andrew (2005) hầu hết các hợp chất flavonoid có tác dụng kháng khuẩn do: kiềm hãm và ngăn sự phân chia của vi khuẩn, ức chế enzym transpeptid ngăn quá trình tổng hợp mucopeptid (yếu tố tạo nên sự bền vững thành vi khuẩn), khi gắn lên màng vi khuẩn làm cho thay đổi tính thấm của màng, ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic và RNA của vi khuẩn và ức chế sự hoạt động của hyaluronidase (enzym giúp cho vi khuẩn tấn công sang các tế bào lân cận). Bên cạnh đó các vòng carbon 6 cạnh có gắn các nhóm OH cũng gây ảnh hưởng đến thành tế bào vi khuẩn. Các nhóm hợp chất này sẽ xuyên qua thành tế bào vi khuẩn sau đó bám chặt vào những cấu trúc ở kích thước phân tử trong tế bào vi sinh vật như protein và glycoprotein, điều này làm rối loạn quá trình sinh tổng hợp của các vi sinh vật đó gây chết vi sinh vật (Immin, 2006). Bên cạnh đó hợp chất tanin có khả năng kháng những vi khuẩn Gram dương gây hại là một đặc tính nổi bật của tanin (Kunwar, 2010). 46 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN - Bốn bộ phận cây Trứng cá lá, vỏ thân, quả chín và quả non chiết suất bằng phương pháp đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % hiệu suất chiết thu được lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 %; 24,82 %. - Các loại cao chiết từ cây Trứng cá đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N P. acnes. Trong đó cao chiết từ lá Trứng cá cho thấy hiệu quả kháng khuẩn cao nhất trong 4 loại cao với đường kính khoảng vô khuẩn dao động ở 3 nồng độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml từ 16,33 mm đến 23 mm. - Nồng độ MIC cao chiết lá trứng cá đối với dòng vi khuẩn 134N là MIC = 10 mg/ml. - Cao chiết ethanol từ lá trứng cá có chứa các hợp chất flavonoid, saponin và tanin. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá là do chứa hợp chất flavonoid, tanin, saponin. 5.2. ĐỀ NGHỊ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cây Trứng cá để gia tăng hiệu suất chiết. Nghiên cứu chiết xuất các phân đoạn từ lá Trứng cá và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Propionibacterium acnes của các cao phân đoạn. Phân lập các hợp chất tinh khiết cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất từ lá Trứng cá từ đó làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất dược phẩm có khả năng điều trị bệnh trứng cá. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arunasindhe M., Yadav D. and Chandrashekaz A. (2013). Antiodant and in vivo anti-hyperghicemic activity of Muntingia calabura leaves extracts. Der Pharmacia Lettre. Vol. 5. p. 427-435. 2. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nxb Y học Hà Nội. Hà Nội. PL1.1 3. Brovelli E. E. , Chansakaow S., Farias D., Hongratanaworakit T., Botero M., Vejabhikul S., Craker L. E. (2005). Antimicrobial Activity of Herbal extracts on Staphyloccocus aureusand Propionibacterium acnes. Proc. WOCMAP III, Vol. 5 .p. 97-104 4. Chanwitheesuk, Teerawutgulrag A. and Rakariyatham A. (2005). Screening of antioxidant activity and antioxidant compounds of some edible plants of Thailand. Food Chem. Vol. 92. p. 491-497 5. Charde Y. M., Sharma P. H., Choudhary N. G. and Avari J. G. (2012). Development and evaluation of herbal formulation for the treatment of acne. p. 2250-2260. 6. Chen J. J, Lin R.W., Duh (2004). Flavones and cytotoxic constituens from the stem bark of Muntingia calabura. Journal Chin Chem Soc. Vol. 51. p. 655-670. 7. Chen J.J, Lee H. H, Duh C. Y, Chen I. S (2005). Cytotoxic chalcones and flavonoids from the leaves of Muntingia calabura. PlantaMod.Vol. 7. p. 970. 8. Chin, W. Y. (1989). Aguide to the wayside trees of Singapore. BP Singapore sciene centre. p-145. 9. Coates P., Vyakrnam S., Eady E. A., Jones C. E. , Cove J. H., Cunliffe W. J. (2002). Prevalence of antibiotic-resistant propionibacteria on the skin of acne patients: 10-year servillance dât and snapshot distribution study. Br J Dermatol. Vol. 146. p. 840-848. 10. Csukas, Baniz B. ,Rozgonyi F. (2004). Studies on the cytotoxic effects of Propionibacterium acnes strains isolated from cornea. Microb Pathog.Vol. 36. p.171-174. 11. Cushnie and Andrew (2005). Antimicrobial activity of flavonoid. International Journal of Antimicrobial Agent. Vol. 26. p. 343-356. 48 12. Crawford, W. W., L. P. Crawford, R. B. Stoughton and R. C. Cronrll (1979). Laboratory induction and clinical occurrence of combined clindamycin and erythromycin resistance in Corynebacterium acnes. Journal Invest Dermatol. Vol. 72. p. 187-190. 13. Degitz, K., M. Placzek., C. Borelli and G. Plewig (2007). Pathophysiology of ance. J Dtsch Dermatol Ges Vol. 5. p. 316-320. 14. Đỗ Trung Đàm (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Viên Dược Liệu. Nhà Xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 15. Douglas and Gunter (1946). Propioibacterium acnes. Name and taxonomic classification. p. 1 16. Downie, M. M. T., R. Guy and T. Kealay (2004). Advance in sebaneous gland research: potential new approaches to acne management. International journal of cosmetic science.Vol. 26. p. 291-311. 17. Dreno, B., A. Reynaud, D. Moyse, H. Habert and H. Richet (2001). Erythromycin- resistant of cutaneous bacterial flora in acne. Eur journal Dermatol. Vol. 11. p. 549-553 18. Dương Thị Phượng Liên và Nguyễn Nhật Phương (2014). Ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến từ khả năng ly trích và sự ổn định anthocyanin từ bắp cải tím (Brassica oleracea). Tạp chí Nghiên cứu khoa học, trường Đại học Cần Thơ. Số 1. tr. 1-7 19. Eady and E. Ingham (1994). Propionibacterium acnes friend or foe. Rev Med Microbiol. Vol. 5. p. 163-173. 20. Fu, Y., Zu, Chen, Efferth, T., Liang, H., Liu, Z. (2007). Investigation of antibacterial activity of rosemary essential oil against Propionibacterium acnes with atomic force microscopy. Planta Medica. Vol.73.p.1275-1280 21. Funke, G., A.V. Graevenitz, J.E. Clarridge, and K.A. Bernard (1997). Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clinical Microbiol. Vol. 10. p.1 25-159. 22. Hamnerius, N. (1996). Acnes-aetiology and pathogenesis. Treatment of Acne. Vol.32.p.29-39 23. Hans B. , Kilian M. (2010). Population Genetic analysis of Propionibacterium acnes identifies a subpopulation and epidemic clones associates with Acne. PloS ONE.5. 49 24. Hana M. H., Camelia A., Suzan A.M., Simona-Carmen Litescu, Hala I., and Fatma U. A. (2013). Biological activities of the hydro-alchoholic and aqueous extracts of Achillea bieberster Afan. (Asteraceae) grown in Jordan. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. Vol.7. p. 1686-1694. 25. Harleen, K.S., Bimlesh, Sunil P., Prashant T., Manoj S., Pardeep S. (2011). A review of phytochemistry and pharmacology of flavonoid. Internationale pharmaceuricasciencia. 26. Hayashi N., Akamatsu H., Kawashima M. (2008). Acne Study Group. Establishment of grading criteria for acne severity. J Dermatol. Vol. 35. p. 255- 260. 27. Higaki S., Nakamura M., Morohashi M., Yamagishi T. (2004). Propionibacterium acnes biotypes and susceptibility to minocyline and keigai-rengyno-to. Int J Dermatol. Vol. 42. p. 103-107. 28. Holdeman, L.V., E.P. Cato and W.E.C. Moore. (1977). Anaerobe laboratory manual, 4th ed. Anaerobe Laboratory. 29. Hywel, C.W., P.D. Robert and G.Sarah. (2011). Acnes vulgaris Vol.379.p.361-372. 30. Humgra T., Tanzeel A., Farzama A. and Hina R. (2013). The historic panorama of ance vulgaris. International Journal of Advanced. Vol. 2. p.99-104. 31. Ibrahim , Abdulla M.A., Abdewahab S.I. (2012). Leaves extract of Muntingia calabura protects against gastric ulcer induced by ethanol in Sprague-Dawley rats. Clin Exp Pharmacol. 32. Immin P., Sinning C. H. and Meyer A. (2006). Drugs, their targets and the nature and number of drug targets. Drug Discovery. Vol.5.p.821-834. 33. Jappe, U., E. Ingham, J. Henwood and K.T.Holland (2002). Propionibacterium acnes and inflammation in acne. P.Acne Has T-cell Mitogenic Activity. British Journal of Dermatology. 34. Johnson, J.L and C.S Cummin. (1972). Cell wall composition and deoxyribonucleic acid similarities among the anaerobic coryneform, Classical propionibacterial and strains of Archnia propionica. J Bacteriol.Vol.109.p.1047-66. 35. John Harley and Lansing Prescott (2002). Laboratory Exercises in Microbiology 5th editon. The McGraw-Hill Companies. French. 50 36. Kabir Sardana, Tanvi Gupta, Bilpul Kumar, Hemant K.G. and Vijay K.G. (2016). Cross-sectional pilot study of antibiotic resistance in Propionibacterium acnes strains in Indian acne patients using 16S-RNA polymerase chain reaction: A comparison a mong treatment modalites inclucing antibiotics benzoyl peroxide and iso tretionin. Indian Journal of Dermatology. Vol. 61. p. 45-52. 37. Gomthi R., Anusuya N. and Mainan S. (2013). A dietary antioxidant supplementation of Jamaican cherries (Muntingia calabura L.) attenuates inflammatory related disorders. Food science an biotochnology. Vol. 22. p. 787- 794 38. Kar, A. (2007). Pharmaocgnosy and Pharmacobiotechnology. Revised-Expanded Second Edition. New Age International Limited Publishres New Delpji.p. 332-336. 39. Karthyaini, Suresh K. (2012). Pharmacognostic evaluation, in vitro antioxidant and in vivo anti-inflammatory studies of Muntingia calabura L.. J Global Trends Pharm Sci. Vol. 3. p. 805-811. 40. Kishishita, M., T.Ushijima, Y. Ozaki and Y.Ito. (1980). New Medium for Isolating Propionibacteria and Its Application to Assay of Normal Flora of Human Facial Skin. Applied and environment Microbiolog.p. 1100-1105 41. Keneda N., Pezzuto JM, Soejarto DD, Kinghorm AD, Farmsworth NR, Santisuk J, Tuchinda P, Udchachon J, Reutrakul V. (1991). New cytotoxic flavonoids from Muntingia calabura L. roots. Plant anticancer agents. 42. Kennedy, S.H., Y. Manevich and J. Biaglow. (1995). Benzoyl peroxide acts as a promoter of radiation induced maligant transformation in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 212 p.1118-1125. 43. Kunwar, R.M., Shrestha K.P. and Bussmann R.W. (2010). Traditional herbal medicine in far-west Nepal: a pharmacological appraisal. Journal of Ethnobiolology and Ethnomedicine. Vol. 6. p.35 44. Kumar, Jayaveera, Ashok Kumar, Umachigi, Vrushabendra Swamy, Kishore Kumar (2007). Antimicrobial effect of Indian medicinal plants against acne- inducing bacteria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. Vol.6.p.717-723. 45. Layton AM (2006). A review on the treatment of acne vulgaris. Int J Clin Pract. Vol.60.p.64-72. 46. Leyden, JJ. (1976). Antibiotic resistant acne.Vol.17.p.593-596. 51 47. Leyden J.J, McGinley K.J, and Vowels B. (1998). Propionibacterium acnes colonization in acne and noacne. Dematogogy. Vol.196.p.55-58. 48. Leyden, J. (2003). A review of combinatination therapies for the treatment of acne vulgaris. J. Am Acad Dermatol. Vol.49.p.200-210. 49. Lê Kinh Duệ (2000). Bệnh trứng cá. Bách khoa tòa thư bệnh học. Tập 3. NXB từ điển bách khoa.Tr 72-74 50. Loveckova, Y. and I. Havlikova (2002). A microbiological approach to acne vulgaris. Biomes Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. p. 29-32 51. Luangnarumitchai S., LamLerthon and Tiyaboonchai (2007). Antimicrobial activity of essential oils against five strains of Propionibacterium acnes. Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 34. p. 60. 52. Mahmood N., Nasir N.L.M., Rofiee M.S, Tohid S.F.M, Ching S.M (2013). Muntingias calabura: A review os its traditinal uses, chemical properties and pharmacological observations. 53. Mallon E., Newton JN., Klasen A, Stewart-Brown SL, Ryan T., Finlay AY (1999). The quality of life in acne: comparison with genaral medical conditions using generic question naire. British Journal of Dematology.Vol. 140. p. 672-676. 54. McDowell, A., S. Valanne and G. Ramage (2005). Propionibacterium acnes type I and II represent phylogenetically distinct groups. J Clin Microbiol. Vol. 43. p. 326- 34 55. Morton, J.F. (1987). Jamaica cherry. In Fruits of warm climates. Miani.p. 65-69. 56. Nishijima, S., I. Kurokama, N. Katoh, and K. Watanabe (2000). The bacteriology of acne vulgaris and antimicrobial susceptibility of Propionibacterium acnes and Staphylococcus epidermidis isolated from acne lesions. J Dermatol. Vol. 27. p. 318-323 57. Nivethetha M., Jayasris J., Brimaha P. (2009). Effects of Muntingia calabura L. on isoproterneol incluced myocardial infarcton. Singapore medical Journal. Vol. 50. p. 300-306. 58. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyển và Phạm Văn Ty (2009). Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục. Hà Nội. 59. Ngô Thu Vân và Trần Hùng (2011). Dược liệu học tập 1.tr. 42-43, 354-382. 52 60. Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng (2013). Tỷ lệ mắc Propionibacterium acnes và sự đề kháng in vitro đối với kháng sinh ở bệnh nhân mụn trứng cá thông thường tại bệnh viện da liễu TPHCM năm 2011-2012. Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 17. Phụ bản số 1. 61. Nguyễn Hữu Sáu (2010). Cập nhật điều trị mụn trứng cá. Tạp chí thông tin Y Dược. Số 7.Tr3-5 62. Nguyễn Trọng Tuân (2007). Bài giảng chiết xuất-Phần Phương pháp chiết xuất. Trường Đại học Cần Thơ. Khoa Khoa học-Cần Thơ.tr32. 63. Park Jumho, Lee Jongsung, Jung Eunsun, Park Yumi, Kim Kukhyun, Park Byughwa, Kim Jieun, Park Deokhoon (2004). In vitro antibacterial an anti- inflammatory effects of honokiol and magnolol against Propionibacterium sp.. European journal of Pharmacology. Vol. 496. p. 189-195. 64. Pawin, H., C. Beylot and M. Chivot (1998). Physiopathology of acnes vulgaris, new understanding of the treatments. Eur J Dermatol. Vol. 14. p. 4-12. 65. Plewig G, Kligman AM, editors. Acne and Rosacea. 3rd ed. New York: Springer- Verlag (2000). p. 744. 66. Priyam S., Shruti S., Nidhi M. and Naraya P.Y. (2014). New perpective on antiacne plant drug. Contribution to modern thẻapeutics. Biomed Res Int. 67. Preethi K., Vijayalaskshimi N., Shamma R. and Sasikumar J.M. (2010). Invitro antioxidant activity of extracts of fruits of Muntingia calabura L. From India. Pharmacognosy Journal. Vol. 2. p. 11-18. 68. Ross J. I., E. Carnegie, A. M. Snelling, P. Coates, J. H. Cove an E. A. Eady (2001). Prevalence of antibiotic resistant propionibacteria on the skin of acne patients form six Europan countries. JEASV.15. 69. Ross J. I., E. Carnegie and J. H. Cove (2002). Detection of transposons Tn5432- mediated macrolide- lincosamidestreptogramin B (MLSB) resistance in cutaneous propionibacteria from six European cities. J Antimicrob Chemother. Vol.49.p.165- 170. 70. Roebuck H (2006). Acne- intervence early. The nurse Practitioner. p. 24-45. 71. Phạm Văn Hiển (1997). Bệnh trứng cá. Nội san da liễu. số 4. 1997. 53 72. Phạm Hoàng Khâm và Ngô Văn Hòa (2010). Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh trứng cá thông thường tại bệnh viện 103 (1998-2007). Tạp chí Y học Việt Nam. Số 1.tr 39-42 73. Phạm Thu Hiền, Nguyễn Quang Thái, Nguyễn Thị Thu Đoài (2011). Đặc điểm lâm sàng bệnh trứng cá và mối liên quan đến chuyển hóa trên bệnh nhân trứng cá đến khám tại bệnh viện ĐHYD Thái Nguyên. Tạp chí khoa học và công nghệ. Số 89. Tr.21-26. 74. Phùng Thị Yến Thanh (2015). Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây mụn trứng cá (Propionibacterium acnes) của các cao chiết và một số hợp chất phân lập từ lá cây Ô Môi (Cassia grandis L.P). Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại học Cần Thơ. 75. Puguh Surijowar, Sarwiyono, Imam Thohari, Aswah Ridhowi (2014). Quantitative and qualitative phytochemicals analysis of Muntingia calabura. Journal of Biology, Agriculture and Healthcare. 76. Sakamoto, F. H., Loppes J. D. and Anderson R. (2010). Photodynamic therapy for acne vulgaris. J. Am Acad Dermatol. Vol. 6. p. 183-193. 77. Saising. S., and S. P. Voravuthikunchai (2012). Anti Propionibacterium acnes activity of rhodomyrtone, an effective compound from Rhodomyrtus tomentosa Hassk. Leaves. Anaerobo.Vol. 18. p. 400-404. 78. Scheafer T., Nienhaus A., Vieluf D., Berger J., Ring J (2001). Epidemiology of acne in the general population the risk of smoking. British Journal of Dermatology. 79. Shimonart, T and M. Dramaix (2005). Treatment of acne with topical antibiotics: leson from clinical studies. Br J Dermatol. Vol. 153. p. 395-403 80. Siddiqua A., Premakumari K. B. and Sultana R. (2010). Antioxidant activity and estimation of total phenolic content of Muntingia calabura by colorimetry. Int J Chem Tech Res. Vol. 2. p. 205-208 81. Sridhar M., Thirupathi K., Chaitanya G. (2011). Antidiabetic effect of leaves of Muntingia calabura L., in normal and alloxan- induced diabetic rats. J Pharmacol. Vol. 2. p. 626-632. 82. Su BN., Jung Park E., Vigo JG, Cabieses F., Fong HH, Pezzuto JM, Kinghorn AD (2003). Activity-guided isolation of chemical constiflents of Muntingia calabura using a quinone reductase induction assay. Pytochemistry. 54 83. Thiboutot, D., Gollnick, V. Bettoli (2009). Gobal alliance to improve outcome acne. J. Am Acad Dermatol. Vol. 60. p. 279-284. 84. Trần Hùng (2010). Phương pháp nghiên cứu dược liệu.Trường ĐHYD TPHCM. tr.119-127 85. Tutakne, M.A and K.V.R. Chari (2003). Acne, rosacea and perioral dermatitis In. IADVL Textbook and atlas of dermatology. Mumbai: Bhalani publishing House, 2nd ed. p. 689-710 86. Vijayanand S., Thomas A.S (2015). Screening of Michelia chanpacca and Muntingia calabura extracts for potential bioactivities. Internatinal Journal of Pharma Scienes and Research. p. 266-273. 87. Vijayalakashmi A., Tripura A. and Ravichandiran V. (2011). Development and evaluation of anti-acne products from Terminalia arjuna bark. International of chemTech research. Vol. 3. p. 320-327. 88. Võ Thị Bạch Sương (2004). Liệu pháp isotretinoin đường uống trong điều trị mụn trứng cá. Chuyên đề da liễu. Bộ môn gia liễu-Đh Y dược Thành phố Hồ Chí Minh.tr. 10-15 89. Võ Văn Chi (2004). Từ điển Cây thuốc Việt Nam. Tập 1. Nhà xuất bản Hà Nội. Hà Nội. 90. Weeks, J. G., M. Carty and T. Black (1977). The inability of a bacterial lipase inhibitor to control acne vulgaris. J invest Dermatol. Vol. 69. p. 236-43 91. Webster, G.F, 1995. Inflammation in acne vulgaris. J. Am Acad Dermatol. Vol. 33. p. 247-53. 92. Yasunaka K., Abe F., Nagayama A. (2005). Antibacterial activity of crude extracts from Mexican medicinal plants and puified counarins and anthones. Journal of Ethnopharmacology. Vol. 97. p. 293-299. 93. Yentzer, B. A., R. W. McClain and S.R. Feldman (2009). Do topical retinoids cause acne to “flare”. J Drugs Dermatol Vol. 8. p. 799-801. 94. Zakaria Z. A., Sulaiman M. R., Jais (2006).The antinociceptive activity of Muntingia calabura aqueous extract and the involvement of L-arginine/nitric oxide/cylic guanosine monophosphate pathway in its observed activity in mice. Fundam Clin Pharmacol. Vol. 20. p. 365-372. 55 95. Zakaria Z. A., Jais A. M. M, Mastura (2007a). In vitro anti-staphylococcal activity of extracts of several neglected plants in Malaysia. J Pharmaco. Vol. 3. p. 428-431. 96. Zakaria Z. A., Hasan M. H. , Aqmar (2007b). Effects of various nonopioid receptor antagoniston the antinocieptive activity of Muntingia calabura extracts in mice. Methods Find Exp Clin Pharmacol. Vol. 29. p. 515-520. 97. Zakaria Z. A. , Sufian A. S., Ramasamy K. (2010). In vitro antimicrobial activity of Muntingia calabura extracts and fractions. Afr J Microbiol Res 4. p. 304-308. 98. Zakaria Z. A., Mohamed A.M., Jamil (2011). In vitro antiproliferative and antioxidant activities of the extracts of Muntingia calabura leaves. Am J Chin Med. Vol. 39. p.1-18. 99. Zoulboulis C. C. (2001). Is acne vulgaris a genuine inflammatory disease. Dermatology.Vol. 203. p. 277-279. 56 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết cây trứng cá Cao vỏ thân Cao quả chín Cao quả non Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ (mg/ml) Dòng vi khuẩn Trung bình 50 10 11 10 10,33 100 11 13 11 11,67 200 18 18 14 16,67 Levofloxacin 0 0 0 0 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ (mg/ml) Dòng vi khuẩn Trung bình 50 11 11 11 11 100 13 15 12 13,33 200 19 21 20 20 Levofloxacin 0 0 0 0 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ (mg/ml) Dòng vi khuẩn Trung bình 50 12 11 12 11,67 100 19 17 18 18 200 20 22 20 20,66 Levofloxacin 9 8 9 8,67 57 Cao lá 2. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây trứng cá tên vi khuẩn P. acnes Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ (mg/ml) Dòng vi khuẩn 134N Trung bình 5 0 0 0 0 10 6 6 6 6 20 10 9 8 9 40 11 12 10 11 Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê 1. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết cây trứng cá Nồng độ 50 mg/ml One way Descriptives DKVVK N Mean Std. Deviation Std. Error 95% cofnidence Interval for Mean Minimum Maximum Lover Bound Upper Bound 501 3 10.33 .577 .333 8.90 11.77 10 11 502 3 11.00 .000 .000 11.00 11.00 11 11 503 3 11.67 .577 .333 10.23 13.10 11 12 504 3 16,33 2,082 .333 10.23 13.10 11 12 Total 12 11.17 .718 .207 10.71 11.62 10 12 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ (mg/ml) Dòng vi khuẩn Trung bình 50 14 18 17 16,33 100 19 19 19 19 200 22 25 22 23 Levofloxacin 9 8 9 8,67 58 Test of Homogeneity of Variances DKVVK Levene Statistic df1 df2 Sig. 5.333 3 8 0.026 ANOVA DKVVK Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 3.667 3 1.222 4.889 .032 Within Groups 2.000 8 .250 Total 5.667 11 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: DKVVK (l) Nongdo (J) Nongdo Mean Difference (l- J) Std. Eror Sig. 95% cofnidence Interval Lower Bound Upper Bound Dunnett T3 501 502 503 504 -.667 -1.333 -1.333 .333 .471 .471 .482 .183 .183 -3.22 -3.39 -3.39 1.88 .72 .72 502 501 503 504 .667 -.667 -.667 .333 .333 .333 .482 .482 .482 -1.88 -3.22 -3.22 3.22 1.88 1.88 503 501 502 504 1.333 .667 .000 .471 .333 .471 .183 .482 1.000 -.72 -1.88 -2.06 3.39 3.22 2.06 504 501 502 503 1.333 .667 .000 .471 .333 .471 .183 .482 1.000 -.72 -1.88 -2.06 3.39 3.22 2.06 59 Homogeneous Subsets DKVVK loaicao N Subset for anpha =0.05 1 2 3 Duncana 501 3 10.33 502 503 3 3 11.00 11.67 504 3 16,33 Sig. .141 .156 Nồng độ 100 mg/ml One way Descriptives DKVVK N Mean Std. Deviation Std. Error 95% cofnidence Interval for Mean Minimum Maximum Lover Bound Upper Bound 501 3 11.67 1.155 .667 8.80 14.54 11 13 502 3 13.33 1.528 .882 9.54 17.13 12 15 503 3 18.00 1.000 0.577 15.52 20.48 17 19 504 3 19.00 .000 .000 19.00 19.00 19 19 Total 12 15.50 3.344 .965 13.38 17.62 11 19 Test of Homogeneity of Variances DKVVK Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.872 3 8 .104 60 ANOVA DKVVK Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 113.667 3 37.889 32.476 .000 Within Groups 9.333 8 1.167 Total 123.000 11 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: DKVVK (l) loaicao (J) loaicao Mean Difference (l-J) Std. Eror Sig. 95% cofnidence Interval Lower Bound Upper Bound Dunnett T3 501 502 503 504 -1.667 -6.333 -7.333 1.106 .882 .667 .625 .009 .025 -6.69 -10.23 -12.43 -3.36 -2.44 -2.24 502 501 503 504 1.667 -4.667 -5.667 1.106 1.054 .882 .625 .062 .070 -3.36 -9.68 -12.41 6.69 .35 1.08 503 501 502 504 6.333 4.667 -1.000 .882 1.054 .577 .009 .062 .569 2.24 -.35 -5.41 10.23 9.68 3.41 504 501 502 503 7.333 5.667 1.000 .667 .882 .577 .025 .070 .569 2.24 -1.08 -3.41 12.43 12.41 5.41 61 Homogeneous Subsets DKVVK loaicao N Subset for anpha =0.05 1 2 Duncana 501 502 3 11.67 13.33 503 3 18.00 504 3 19.00 Sig. .095 .290 Nồng độ 200 mg/ml One way Descriptives DKVVK N Mean Std. Deviation Std. Error 95% cofnidence Interval for Mean Minimum Maximum Lover Bound Upper Bound 501 3 16.67 2.309 1.333 10.93 22.4 14 18 502 3 20.00 1.000 .577 17.52 22.48 19 21 503 3 20.67 1.155 .667 17.80 23.54 20 22 504 3 23.00 1.732 1.000 18.70 27.30 22 25 Total 12 20.08 2.746 .793 18.34 21.83 14 25 Test of Homogeneity of Variances DKVVK Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.070 3 8 .183 ANOVA DKVVK Sum of df Mean Square F Sig. 62 Squares Between Groups 61.583 3 20.528 7.698 .010 Within Groups 21.333 8 2.667 Total 82.917 11 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: DKVVK (l) loai cao (J) Nongdo Mean Difference (l-J) Std. Eror Sig. 95% cofnidence Interval Lower Bound Upper Bound Dunnett T3 501 502 503 504 -3.333 -4.000 -6.333 1.453 1.491 1.667 .356 .255 .087 -11.53 -11.92 -13.92 4.86 3.92 1.26 502 501 503 504 -3.333 -.667 -3.000 1.453 .882 1.155 .356 .954 .259 -4.86 -4.56 -8.77 -11.53 3.23 2.77 503 501 502 504 4.000 .667 -2.333 1.491 .882 1.202 .255 .954 .438 -3.92 -3.23 -8.02 11.92 4.56 3.35 504 501 502 503 6.333 3.000 2.333 1.667 1.155 1.202 .087 .259 .438 -1.26 -2.77 -3.35 13.92 8.77 8.02 Homogeneous Subsets DKVVK Loaicao N Subset for anpha =0.05 1 2 Duncana 501 502 3 3 16.67 20.00 503 3 20.67 504 3 23.00 Sig. 1.000 .063 Kháng sinh 63 One way Descriptives DKVVK N Mean Std. Deviation Std. Error 95% cofnidence Interval for Mean Minimum Maximum Lover Bound Upper Bound 1 3 .00 .000 .000 .00 .00 0 0 2 3 .00 .000 .000 .00 .00 0 0 3 4 3 3 8.67 8.67 .577 .577 .333 .333 7.23 7.23 10.10 10.10 8 8 9 9 Total 12 4.33 4.539 1.310 1.45 21.91 14 25 Test of Homogeneity of Variances DKVVK Levene Statistic df1 df2 Sig. 10.667 3 8 .004 ANOVA DKVVK Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 225.333 3 75.111 450.667 .000 Within Groups 1.333 8 .167 Total 226.667 11 64 Homogeneous Subsets DKVVK N Subset for anpha =0.05 1 2 Duncana 1 3 .00 2 3 .00 3 4 3 3 8.67 8.67 Sig. .082 1.000 2. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây trứng cá tên vi khuẩn P. acnes One way Descriptives DKVVK N Mean Std. Deviation Std. Error 95% cofnidence Interval for Mean Minimum Maximum Lover Bound Upper Bound 5 3 .00 .000 .000 .00 .00 0 0 10 3 6.00 .000 .000 6.00 6.00 6 6 20 3 9.00 1.000 .577 6.52 11.48 8 10 40 3 11.00 1.000 .577 8.52 13.48 10 12 Total 12 6.50 4.380 1.264 3.72 9.28 0 12 Test of Homogeneity of Variances DKVVK Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.667 3 8 .119 ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 207.000 3 69.000 138.000 .000 Within Groups 4.000 8 .500 65 DKVVK Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: DKVVK (m) Nongdo (J) Nongdo Mean Difference (l-J) Std. Eror Sig. 95% cofnidence Interval Lower Bound Upper Bound Dunnett T3 50 200 -6.667 1.277 .004 -10.32 -3.01 100 200 -4.000 1.277 .035 -7.65 -.35 (l) Nongdo (J) Nongdo Mean Difference (l- J) Std. Eror Sig. 95% cofnidence Interval Lower Bound Upper Bound Dunnett T3 5 40 -11.000 .577 .000 -12.66 -9.34 10 40 -5.000 .577 .000 -6.66 -3.44 20 40 -2.000 .577 .021 -3.66 -.34 Homogeneous Subsets DKVVK Nongdo N Subset for anpha =0.05 1 2 3 4 Ducana 5 3 .00 10 3 6.00 20 3 9.00 40 3 11.00 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 Total 211.000 11 66