Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone

MỤC LỤC CHưƠNG TRANG Trang tưa ị Lơi cam ơn .iiì ̉ T́m tắt .iv Summary .v Ṃc luc .vị Danh sach cac chư viế t tắ t ix́ ́ ̃ Danh sach cac hinh . x́ ́ ̀ Danh sach cac sơ đồ và biểu đồ xií ́ Danh sach cac bang xiií ́ ̉ Chương1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Ṃc tiêu 2 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Ý nghĩa đề tài 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 3 2.1.1. Ṿ trí phân lọi 3 2.1.2. Phân bố . 3 2.1.3. Mô tả hình th́i . 4 2.1.4. Đặc tính sinh học 6 2.1.5. Đặc điểm sinh th́i 7 2.1.6. Thành phần h́a học . 8 2.1.7. Phương ph́p nhân giống 11 2.1.8. Tầm quan trọng 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh th́i 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến h́a thực vật . 12 2.1.8.3. Gía tṛ dược tính . 12 2.1.8.4. Ứng ḍng trong công nghiệp 14 2.1.8.5. Gía tṛ kinh tế 15 2.1.9. Ćc nghiên cứu trong và ngoài nước 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền ph̀ tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp 17 2.2.1. Kh́i niệm hợp chất thứ cấp . 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo . 18 2.2.2.1. Kh́i niệm mô sẹo . 18 2.2.2.2. Ứng ḍng c̉a nuôi cấy mô sẹo 19 2.2.3. Nuôi cấy ḍch huyền ph̀ 19 2.2.3.1. Kh́i niệm huyền ph̀ tế bào . 19 2.2.3.2. Nguyên tắc ṭo huyền ph̀ 19 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự ṭo huyền ph̀ tế bào . 20 2.2.3.4. Ćc phương ph́p nuôi cấy huyền ph̀ hiện nay . 20 2.2.3.5. Ćc điều kiện nuôi cấy ḍch tế bào ảnh hưởng đến việc sản xuất ćc hợp chất thứ cấp 22 2.2.4. Ćc phương ph́p gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền ph̀ . 22 2.2.4.1. Tối ưu h́a điều kiện nuôi cấy . 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào ć khả năng sản xuất cao . 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất . 22 2.2.4.4. Cố đ̣nh tế bào . 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân h́a mô 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) 23 2.3. Ćc kỹ thuật sử ḍng trong bài luận văn 24 2.3.1. Phương ph́p ly trích – thu nhận hợp chất 24 2.3.1.1. Sắc ký cột 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) . 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế . 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao ́p HPLC trong đ̣nh lượng hợp chất thứ cấp . 28 Chương 3: VẬT LIỆU – PHưƠNG PHÁP 31 Thời gian và đ̣a điểm thực hiện 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, ṭo ḍch huyền ph̀ . 31 3.1.1. Vật liệu 31 3.1.2. Phương ph́p 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo śt ảnh hưởng c̉a thành phần khóng và nồng độ đường lên sự ph́t triển c̉a mẫu cấy lớp mỏng 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo śt sự kết hợp 2 lọi hormone thích hợp cho việc kích ứng ṭo mô sẹo . 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo śt nồng độ thích hơp c̉a 2,4-D khi kết hợp ̣ với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng ṭo mô sẹo . 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćc kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và ṭo ḍch huyền ph̀ . 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo śt sự ảnh hưởng c̉a ́nh śng lên sự hình thành sắc tố đỏ c̉a mô sẹo 37 3.2. Ly trich va cô lâp hơp chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni 38́ ̀ ̣ ̣ 3.2.1. Vật liệu 38 3.2.2. Phương ph́p 39 3.3. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone trong ćc nguyên liệu nuôi cấy in vitro kh́c nhau bằng phương ph́p sắc ký lỏng cao ́p HPLC 40 3.3.1. Vật liệu 40 3.3.2. Phương ph́p . 40 3.3.2.1. X́c đ̣nh điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp . 40 3.3.2.2. Xây dựng đường chuẩn . 41 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćch xử lý mẫu trong đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone . 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong ćc bộ phận kh́c nhau c̉a cây in vitro 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong ćc mẫu cây ć sắc tố đỏ và mẫu không ć sắc tố đỏ . 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. X́c đ̣nh hàm lượng anthraquinone trong mẫu ḍch huyền ph̀ đã ṭo được từ thí nghiệm 4 45 3.4. Xử lý thống kê . 45 Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo ṭo ḍch huyền ph̀ . 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo śt ảnh hưởng c̉a thành phần khóng và nồng độ đường lên sự ph́t triển c̉a mẫu cấy lớp mỏng 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo śt sự kết hợp 2 lọi hormone thích hợp cho việc kích ứng ṭo mô sẹo . 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo śt nồng độ thích hơp c̉a 2,4-D khi kết hợp ̣ với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng ṭo mô sẹo . 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćc kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và ṭo ḍch huyền ph̀ . 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo śt sự ảnh hưởng c̉a ́nh śng lên sự hình thành sắc tố đỏ c̉a mô sẹo 56 4.2. Ly trich va cô lâp hơp chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni 58́ ̀ ̣ ̣ 4.3. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinne trong ćc nguyên liệu nuôi cấy in vitro kh́c nhau bằng phương ph́p sắc ký lỏng cao ́p HPLC . 59 4.3.1. Xây dựng đường chuẩn . 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo śt ảnh hưởng c̉a ćch xử lý mẫu trong đ̣nh lương hợp chất anthraquinone . 61̣ 4.3.3. Thí nghiệm 7: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong ćc bộ phận kh́c nhau c̉a cây in vitro 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So śnh hàm lượng hợp chất anthraquinone trong ćc mẫu ć sắc tố đỏ và mẫu không ć sắc tố đỏ 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. X́c đ̣nh hàm lượng anthraquinnone trong mẫu ḍch huyền ph̀ đã ṭo được từ thí nghiệm 4 . 66 Chương 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 68 5.1. Kết luận . 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo ṭo ḍch huyền ph̀ 68 5.1.2. Đ̣nh lượng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao ́p HPLC . 68 5.2. Đề ngḥ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 70 PHỤ LỤC DANH SACH CÁC H̀NH́ TRANG Hình 2.1. Khu vực phân bố c̉a Drosera burmanni Vahl trên thế giới 4 Hình 2.2. Hình th́i c̉a Drosera burmanni Vahl 4 Hình 2.3. Ĺ D. burmanni 5 Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. . 7 Hình 2.5. Cấu tŕc h́a học c̉a một số flavonoid và flavonoid glucoside 10 Hình 2.6. Môt số loai Drosera ć gí tṛ kinh tế cao trên thế giới . 15̣ ̣ Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gín đọn qui mô nhỏ trên ćc ḿy lắc . 21 Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm . 21 Hình 2.9. Sắ c ky côt . 24́ ̣ Hình 2.10. Mô hinh sắ c ky nhanh côt khô . 26̀ ́ ̣ Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng . 27 Hình 2.12. Sơ đồ hoat đông cac bô phân cua may HPLC 29̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ ́ Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro 31 ̃ Hình 4.1. Mô seo đươc hinh thanh tư mâu lơp mong cây D.burmanni trên ̣ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ̉ môi trương Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vơi ̀ ́ nồ ng đô thay đôi . 52̉ ̣ ̃ Hình 4.2. Mô seo đươc hinh thanh tư mâu lơp mong long thân cây ̣ ̣ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ̉ D. burmanni trên môi trương Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D̀ vơi nồ ng đô thay đôi . 53̉ ̣ ́ Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trường lỏng lắc 55 Hình 4.3.B. C̣m tế bào quan dưới kính hiển vi 40X. . 55 Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dưới kính hiển vi 40X 55 Hình 4.4. ̉nh hưởng c̉a ́nh śng lên sự hình thành sắc tố đỏ c̉a mô seo cây D. burmanni 57̣ Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm . 60 Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm . 60 Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm . 60 Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm . 60 Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC c̉a anthraquinone tham chiếu ở ơ 70 ppm 60̉ Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni được xử lý theo quy trình A. 61 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni được xử lý theo quy trình B 61 Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu rễ cây D. burmanni Vahl . 63 Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu thân la cây D. burmanni Vahl 63́ Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni Vahl ć sắc tố đỏ. 65 Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu cây D. burmanni Vahl không ć sắc tố đỏ . 65 Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC c̉a mẫu ḍch môi trường sau khi lọc sinh khối tế bào 66 Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC c̉a sinh khối tế bào từ ḍch huyền ph̀ 66

pdf108 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 3216 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn . Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , ngƣời đa ̃tâṇ tình hƣớng dâñ và taọ moị điều kiêṇ để em thƣc̣ hiêṇ khóa luâṇ này. Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả. Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam, ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ ích. Em cảm ơn anh Điền , anh Hoàng , anh Cƣờng và các anh chi ̣ phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sin h hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , ĐH Nông Lâm TP . HCM. Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em thƣc̣ tâp̣. Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đôṇg viên tôi nhƣ̃ng lúc găp̣ khó khăn trong đề tài. Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các baṇ thân đa ̃cùng tôi chia sẻ tất cả nhƣ̃ng nỗi buồn vui suốt bốn năm đaị hoc̣. Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tƣởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuôc̣ sống. Tháng 9/2007 Hoàng Thị Thu iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cƣ́u “Khảo sát khả năng ƣ́ng duṇg ky ̃thuâṭ nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâṇ hơp̣ chất anthraquinone” đƣơc̣ tiến hành taị trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên , Đaị hoc̣ Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sinh hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Kết quả thu đƣơc̣: - Mô seọ tƣ̀ mâũ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơc̣ hình thành trên môi trƣờng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đƣờng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điều kiêṇ ủ tối. - Các kỹ thuật sắc ký cột , sắc ký bản mỏng đƣơc̣ sƣ̉ duṇg nhằm cô lâp̣ và ly trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơp̣ chất này đ ƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác nhau của cây Drosera burmanni Vahl. - Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinone bằng kỹ thuâṭ HPLC cho thấy : hàm lƣơṇg anthraquinone trong rê ̃là 3,03% so với troṇg lƣơṇg khô, nhiều hơn trong thân lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắc tố đỏ là 0,78%; trong sinh khối huyền phù tế bào là 0,02% ( so với troṇg lƣơṇg tƣơi ), trong khi không thấy có sƣ ̣hiêṇ diêṇ của anthraquinone trong dic̣h môi trƣờng . v SUMMARY The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology, University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007. Results: - Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l), 2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to 5,8 before autoclaving. - Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was used as authentic sample for HPLC technique. - Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone, larger than 2,78% in leaves. - Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW, compared with 2,78% DW in green-leaf trees. - Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been found in spent medium. Ho Chi Minh city, September, 2007. Hoang Thi Thu vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tƣạ ..................................................................................................................... .i Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục luc̣ ..................................................................................................................... vi Danh sách các chƣ̃ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ..................................................................................................... x Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3 2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3 2.1.3. Mô tả hình thái ............................................................................................... 4 2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6 2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7 2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11 2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12 2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp ........................................................................ 14 2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................ 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19 2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù .............................................................................. 19 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào ......................................................................... 19 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19 vii 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù ........................................................................................................... 22 2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy ..................................................................... 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22 2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24 2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28 Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................ 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31 3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31 3.1.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37 3.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38 3.2.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 39 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40 3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp......................................... 40 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41 viii 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone ........................................................................... 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45 3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................. 45 Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù ........................................................... 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56 4.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơṇg hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ...................................................... 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-benzylaminopurine CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên) ctv : cộng tác viên HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ao áp) IAA : 3-indolyl-acetic acid IBA : 3-indolebutyric acid MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : naphthalene acetic acid PVP : poly vinyl pyrrolidone TCL : Thin Cell Layer (Lớp mỏng tế bào) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) x DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4 Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4 Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5 Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. ........................................................... 7 Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10 Hình 2.6. Môṭ số loaị Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15 Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc ................... 21 Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21 Hình 2.9. Sắc ký côṭ ............................................................................................... 24 Hình 2.10. Mô hình sắc ký nhanh côṭ khô ............................................................. 26 Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................... 27 Hình 2.12. Sơ đồ hoaṭ đôṇg các bô ̣phâṇ của máy HPLC ...................................... 29 Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31 Hình 4.1. Mô seọ đƣơc̣ hình thành tƣ̀ mâũ lớp mỏng cây D.burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣thay đổi ..................................................................................................... 52 Hình 4.2. Mô seọ đƣơc̣ hình thành tƣ̀ mâũ lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣thay đổi ............................................................................................... 53 Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc .............................................. 55 Hình 4.3.B. Cụm tế bào quan dƣới kính hiển vi 40X. ........................................... 55 Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣới kính hiển vi 40X .............................................. 55 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô seọ cây D. burmanni ........................................................................................ 57 Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60 Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60 xi Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60 Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60 Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm ................ 60 Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A. ............................................................................................................ 61 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B .............................................................................................................. 61 Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63 Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl .................... 63 Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. .......... 65 Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không có sắc tố đỏ. ............................................................................................................ 65 Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66 Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. ................... 66 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ TRANG SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Con đƣờng tổng hơp̣ các hơp̣ chất thƣ́ cấp ở thƣc̣ vâṭ ........................ 18 Sơ đồ 3.1. Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone .......................... 39 Sơ đồ 3.2. Quy trình xƣ̉ lý mâũ ............................................................................ 42 Sơ đồ 3.3. Quy trình xƣ̉ lý dic̣h huyền phù .......................................................... 45 Sơ đồ 3.4. Quy trình ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone (kết quả) ........... 58 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46 Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak ..................................................................... 59 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone ..................................................................................................... 8 Bảng 2.2. Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera ................... 9 Bảng 2.3. Dƣợc tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera ............................................................................................... .13 Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng ....................................... 33 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ............................................................... 34 Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ..................................... 35 Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo ................................................................................ 36 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo ................................................................... 37 Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................... 43 Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ ................................................................ 44 Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ................................................................................................ 47 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ............................................................................................................. 48 Bảng 4.4. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trƣờng sử dụng kết hợp 2 loại hormone khác nhau ....................................................................................... 48 xiv Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49 Bảng 4.6. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau ......................................................... 54 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo .... 56 Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59 Bảng 4.9. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................................................ 62 Bảng 4.10. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mâũ có và không có sắc tố đỏ ................................................................................................ 64 Bảng 4.11. Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù ....... 66 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sử dụng thực vật không chỉ làm nguồn thực phẩm mà còn cho nhiều mục đích khác, đặc biệt là trong y học. Ngƣời ta sử dụng một số loại thực vật tƣơi để đắp lên vết thƣơng hoặc thực vật khô để sắc thuốc trị bệnh. Cách đây hơn một thế kỷ, dựa vào y học cổ truyền các nhà khoa học đã phát triển các quy trình cho phép tạo ra nhiều loại thuốc từ các hợp chất thứ cấp chiết xuất từ cây trồng. Với tiến bộ khoa học, các phân tử hoá học trong cây đã đƣợc tổng hợp nhân tạo để sản xuất dƣợc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo còn gặp nhiều khó khăn do con đƣờng tổng hợp các chất này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của nhiều loài thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vậy việc áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các phƣơng pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo đƣợc một cách chủ động số lƣợng các hợp chất có giá trị trị liệu. Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thập đƣợc 3 loài Drosera trong đó Drosera burmanni Vahl gần đây đã đƣợc nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng nhƣ nhân giống thành công bằng tạo chồi trực tiếp. 2 Do đó để hƣớng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lƣợng chất quinone đã đƣợc nghiên cứu thành công, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ” đã ra đời. 1.2. Mục tiêu  Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát hàm lƣợng hợp chất quinone thu đƣợc từ nuôi cấy dịch huyền phù. 1.3. Yêu cầu  Tạo đƣợc mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl.  Phân tích định tính và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng anthraquinone trong từng thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D. burmanni bằng máy HPLC. 1.4. Ý nghĩa của đề tài:  Ý nghĩa khoa học: đây là một bƣớc tiến quan trọng và cần thiết trong qui trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone.  Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D. burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ 2. 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 2.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [14]: Giới: Plantae (Thực vật). Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan). Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan). Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng). Bộ: Nepenthales. Họ: Droseraceae. Giống: Drosera. Loài: Drosera burmanni Vahl. Tên tiếng Anh: burmese sundew. Tên thông thƣờng: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trƣờng lệ burman. 2.1.2. Phân bố Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở đông bắc nƣớc Úc, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34]. Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận. 4 h Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30]. 2.1.3. Mô tả hình thái Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lông tuyến màu đỏ hay toàn cây màu đỏ [6], [15], [33], [35]. Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35].  Thân (Hình 2.2 A, B, C) Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong bóng râm, không hình thành thân củ dƣới đất. Thân mang nhiều phát hoa [31]. Ghi chú Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl Khu vực không có sự hiện diện của Drosera burmanni Vahl A F E D C B 5  Lá (Hình 2.3) Lá hình muỗng, xếp thành hình hoa thị quanh thân, phiến lá dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt lá phủ đầy lông tuyến. Lá có tua cuốn với những giọt keo ở đầu gọi là dịch nhầy, côn trùng dính vào và bị bẫy trong dịch này. Sau đó chất này sẽ tiêu hóa côn trùng mắc bẫy. Tua cuốn trên lá uốn cong về phía con mồi bằng tính hƣớng tiếp xúc của nó. Drosera burmanii Vahl là một trong những loài có chuyển động tua cuốn nhanh nhất [37]. Hình 2.3: Lá D. burmanni [42]. A: Lá; B: Các tua cuốn. C, D: Cấu trúc một tua cuốn. Tua cuốn là lông tiết đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các tuyến xuyên qua lớp biểu bì gián đoạn.  Rễ Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chùm nhƣng chỉ có một vài nhánh. Chúng đƣợc gọi là rễ giả vì chỉ có cơ quan hút nƣớc, cung cấp nƣớc cho cây.  Hoa (Hình 2.2 D, E) Cây ra hoa tháng 3 - 4. Hoa đều, lƣỡng tính, nhỏ, có nhiều màu sắc từ tím nhạt tới vàng nhạt, màu đỏ, hồng và trắng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, mọc A D C B 6 thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa. Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bò cạp. Hoa đối xứng tròn, lá đài 5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trắc mô, bầu 5 lá noãn hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14]. Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sáng. Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp nhất (nụ đƣợc hình thành sớm nhất). Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng. Nếu sự thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh.  Hạt (Hình 2.2 F) Hạt thu đƣợc sau một tuần từ khi hoa nở. Hạt nằm trong nang hạt. Nang hạt tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiều hạt. Nang hạt còn non có màu xanh, nang hạt chín có màu đen. Hạt màu đen, đƣờng kính 0,1 mm. 2.1.4. Đặc tính sinh học  Hình thức sinh sản Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt.  Phƣơng thức bắt mồi Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps). Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trò nhƣ một cái bẫy nhỏ. Các keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giọt sƣơng và không bị khô đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà loài cây này còn đƣợc gọi là “sundew”). Giọt keo dính này tác động nhƣ những giấy bắt mồi (flypaper). Các giọt keo thƣờng không độc và có hƣơng thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính chúng. Khi đó những lông tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con mồi lại và đẩy nó vào giữa lá. Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi. Lá sẽ hấp thu chất dinh dƣỡng mà cây không thể lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng [25], [34], [35]. 7 2.1.5. Đặc điểm sinh thái Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên [3], [40].  Đất đai Cây có thể sống đƣợc ở hầu hết các điều kiện: đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid [37]. Đất trồng Drosera: hỗn hợp ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn bột than gỗ.  Độ ẩm Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt keo dính đầu lông tiết.  Nhiệt độ Cây sống đƣợc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hợp nhất 18 - 25OC. Dƣới 5 OC cây ngừng phát triển.  Ánh sáng Cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một ngày. Khi cây sống ở nơi có cƣờng độ ánh sáng cao thì toàn bộ cây sẽ chuyển sang màu đỏ. Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh. 8 2.1.6. Thành phần hóa học Nhiều hợp chất naphthoquinone và các flavonoid đã đƣợc cô lập, xác định cấu trúc và định lƣợng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.  Naphthoquinone Các loại Drosera thƣờng sản sinh 2 loại naphthoquinone chính là plumbagin và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngoài ra còn có các naphthoquinone vi lƣợng khác nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (Bảng 2.2) mà không thể tìm thấy trong các loài cây khác [29]. Bảng 2.1: Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21] Plumbagin 7 Methyljuglone D. andersoniana D. auriculata D. binata D. bulbosa D. capensis D. capillaris D. cistiflora D. dichotoma D. erythrorhiza D. intermedia D. longifolia D. lunata D. macrophylla D. madagascariensis D. microphylla D. modesta D. natalensis D. peltata D. adelae D. aliciae D. aliciae x capensis D. anglica D. auriculata D. burkeana D. burmanii D. capensis D. cistiflora D. cuneifolia D. dielsiana D. filiformis D. hamiltonii D. hilaris D. indica D. intermedia D. longifolia D. longifolia x rotundifolia 9 D. platypoda D. prolifera D. pygmaea D. regia D. rotundifolia D. slackii D. stolonifera, spp. Rupicola D. venusta D. villosa D. madagascariensis D. ramentacea D. regia D. rotundifolia D. spathulata D. stolonifera, spp. Stolonifera D. tracii D. trinervia D. villosa Bảng 2.2: Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera [21] Naphthoquinone Loài Kiểu nuôi cấy Droserone Hydroxydroserone Biramentaceone a Droserone-5-glucoside Rossoliside Hydroxydroserone-5-glucoside 2-Methylnaphtazarin-5-O- glucoside b D. whittakeri D. rotundifolia D. whittakeri D. rotundifolia D. ramentaceae D. rotundifolia D. rotundifolia D.spatulata D.rotundifolia D.rotundifolia D.spatulata In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vitro In vitro In vivo In vitro In vitro a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ. b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi methanol. 10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách chiết từ các loài Drosera [21]. R1 R2 R3 R4 R5 [1] CH3 H H H OH 7-Methyljuglone [2] H H CH3 H OH Plumbagin [3] H H CH3 OH OH Droserone [4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone [5] H H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside [6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside R6 R7 [7] CH3 H Rossoliside [8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside  Flavonoid Drosera chứa phổ rất rộng các flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin, isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20]. Quercetin Kaempferol Myricetin Hyperin Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside [29]. R4 O O R2 R3 R5 R1 OH OGlc R7 OH R6 11 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống  Nhân giống tự nhiên [3] Nhân giống bằng cách gieo hạt Thời gian gieo hạt tốt nhất là cuối mùa đông. Hạt đƣợc gieo trên hỗn hợp đất trồng thích hợp. Tốt nhất nên giữ hạt trong điều kiện mát và ẩm khoảng 6 tuần. Sau đó cho hạt vào chậu đất có bọc túi nhựa và để trong điều kiện sáng. Đến khi hạt nảy mầm thì bỏ túi nhựa ra và trồng các cây con vào chậu lớn. Nhân giống bằng cách cắt rễ Cây bắt ruồi có thể đƣợc nhân giống từ các rễ dày. Lấy những rễ khỏe từ cây mẹ, cắt thành đoạn dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hỗn hợp đất dày 6 cm, phủ chúng với l lớp đất dày 1 cm. Bọc những chậu đất này lại và đặt trong điều kiện sáng. Khi cây mới bắt đầu mọc lên thì không bọc nữa. Nhân giống bằng phƣơng pháp cắt rễ tốt nhất vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Nhân giống bằng cách cắt lá Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Lá đƣợc cắt ở cuống lá rồi đặt lên trên hỗn hợp đất và cát sao cho lông tuyến hƣớng lên. Giữ cuống lá ngập trong đất nhƣng không phủ lên các lông tuyến. Bọc chậu đất lại và giữ trong điều kiện sáng. Sự phát triển của cây xảy ra trong vài tuần. Nhân giống bằng cây mầm Vào mùa thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thập những cây mầm này và trồng thành những cây mới. Một cách để thu thập cây mầm là giữ những chậu chứa cây trút ngƣợc xuống 1 tờ giấy và dùng tăm gạt cây mầm ra khỏi cây mẹ. Gieo chúng trên hỗn hợp đất. Cây sẽ mọc rễ và phát triển thành cây trƣởng thành.  Nhân giống in vitro Hầu hết những nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô Drosera đều cho thấy nhiều loài Drosera có tiềm năng nhân giống rất cao khi đƣợc nuôi cấy trong điều kiện in vitro thích hợp. Cho đến nay, rất nhiều loài Drosera đã đƣợc nuôi cấy 12 in vitro thành công. Hầu hết hạt, lá kết cụm nhƣ hoa, lá tách biệt, đôi khi cả rễ, hoa và mầm cũng đƣợc sử dụng làm mẫu cấy để thiết lập quy trình nuôi cấy mô. Trong nƣớc và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D. burmanni Vahl. Cây sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng MS 1/2 (Murashige Skoog, với lƣợng khoáng cơ bản giảm một nửa), bổ sung than hoạt tính và casein hydrosylate 100 mg/l [3]. 2.1.8. Tầm quan trọng 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái Drosera burmanni Vahl thƣờng mọc ở đất chua, vùng bạc màu nên là loài chỉ thị cho vùng đất chua, bạc màu [14], [37]. 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật Họ Droseraceae là một đối tƣợng điển hình cho các nghiên cứu về quá trình tiến hóa ở thực vật, bao gồm những thí nghiệm về phát triển và sinh lý học nhằm nghiên cứu vai trò chuyên biệt của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong tiến hóa hình thái ở mức vĩ mô. Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài thích nghi với từng điều kiện môi trƣờng khác nhau nên rất thích hợp cho những nghiên cứu về sự thích nghi cấu trúc và chức năng (bao gồm dinh dƣỡng từ côn trùng và sự sản sinh mầm) trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Ngoài ra, hạt phấn của giống cây này đƣợc tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp từ hình thức giao phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ phấn ở thực vật. 2.1.8.3. Giá trị dƣợc tính Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tiềm năng về giá trị dƣợc tính của Drosera (Bảng 2.3). Trong đó quan trọng nhất là các quinone, đặc biệt là plumbagin, 7-methyljuglone và các flavonoid. Các hợp chất quinone đƣợc tìm thấy có khả năng chữa các căn bệnh hô hấp ở ngƣời nhƣ: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao. Chúng cũng có khả năng chống lại các virus, nấm, khuẩn và chống ung thƣ. Tiêu biểu trong nhóm này là plumbagin và 7-methyljuglone [29]. 13 Ngoài quinone, các flavonoid ly trích từ Drosera cũng có giá trị dƣợc tính cao nhƣ khả năng ức chế enzyme và chống oxi hóa. Một số flavonoid có ảnh hƣởng lớn đến chức năng của hệ miễn dịch. Tiêu biểu nhóm này có thể kể đến quercetin và myricetin. Chúng là những chất ức chế hiệu quả các enzyme glyoxylase mà những enzyme này giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách giải độc -ketoaldehyde. Trong y dƣợc, quercetin đƣợc sử dụng để ngăn ngừa và điều trị ung thƣ, nó cũng có khả năng ức chế hoạt tính gây đột biến gen của benzopyrene, một hydrocacbon nhiều nhân thơm gây ung thƣ tiêu biểu. Bảng 2.3: Dƣợc tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [29] HOẠT TÍNH TÀI LIỆU THAM KHẢO Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959) Ức chế độc tố Harborne (1982) Chống hen suyễn Frenzer (1980) Chống ung thƣ Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992) Ngừa thai, phá thai Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985) Chống nhiễm nấm Békésiová (1997) Ngừa hủi, phong Bokemo (1984) Chống vi khuẩn Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992) Chống đột biến Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992) Ngừa giun lãi Fetterer và ctv (1991) Chống co thắt Juniper và ctv (1989) Chống virut Walt (1972) Tim mạch Itoigawa và ctv (1991) Dùng làm mỹ phẩm Slack (1980) Miễn nhiễm Kreher và ctv (1990) Diệt côn trùng Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989) Chống vi trùng lao Gundidza và ctv (1990) Chống ho gà Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993) 14 Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thƣờng là cẩm địa la) đƣợc dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sƣng, đau họng, ho do phổi nóng, khạc ra máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích. Ở Quảng Tây, cây dùng để trị đòn ngã, tổn thƣơng và bệnh mề đay [15]. Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dùng D. burmanni Vahl dƣới nhiều dạng khác nhau (rƣợu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) để chữa bệnh ho gà [2]. Drosera burmanni Vahl cũng đƣợc công nhận là có giá trị trong việc chữa các bệnh kiết lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dƣỡng nhƣng bụng chƣớng to ở trẻ em) [9], [10]. 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera đƣợc dùng làm đông tụ sữa do giàu hàm lƣợng acid hữu cơ và enzyme. Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera còn đƣợc dùng để nhuộm vải [39]. 15 2.1.8.5. Giá trị kinh tế Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị kinh tế rất cao trong thị trƣờng hoa cảnh thế giới (Hình 2.6) [42]. Hình 2.6: Môṭ số loaị Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới [42]. D. brevicornis D. aliciae D. capensis D. capensis D. paleacea D. sewelliae D. pulchella D. pulchella D. villosa D. villosa D. fimbriata D. fimbriata D. binata D. binata D. falconeri D. erythrorhiza 16 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc  Trong nƣớc Đỗ Đăng Giá p (2003) đã khảo sát, thu thập, thuần dƣỡng và thử nghiệm in vitro những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu [1]. Trần Thị Bích Chiêu (2004) khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây Drosera burmanni Vahl [13]. Quách Ngô Diễm Phƣơng (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây Drosera indica L và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất naphthoquinone có hoạt tính sinh học đƣợc tách chiết từ cây [12]. Hồ Thụy Bích Tuyền (2006) ly trích và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3]. Nguyêñ Đaị Hải (2006) đa ̃n uôi cấy mô cây bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl) và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô plumbagin [5].  Thế giới K. Javaram và M. N .V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây Drosera burmanni Vahl trong môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA. Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ phát hoa cũng đƣợc quan sát trên môi trƣờng với nồng độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l). Sự ra rễ cũng đƣợc thực hiện thành công trên môi trƣờng MS cơ bản [24]. Mejia Hersikorpi và các cộng sự (2002) đã nhân giống thành công cây Drosera rotundifolia từ lá của nó và tạo ra đƣợc cụm chồi đạt 20 - 30 chồi trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5]. Kawiak A., Królika A. và Lojokowska E. tái sinh D. anglica, D. binata đạt số chồi lớn nhất trên môi trƣờng Vacin và Went không có chất điều hòa sinh trƣởng, đối với D. anglica là môi trƣờng Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine (BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trƣờng nhân chồi tối ƣu cho D. cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA. Môi trƣờng lỏng làm gia tăng đáng kể khả năng nhân chồi của mẫu cấy D. anglica và D. binata [25]. 17 Ingrid L. I. Hook (2001) đã nuôi cấy D. binata, D. rotundifolia, D. capensis trong cả môi trƣờng MS lỏng và có agar; nuôi cấy dịch huyền phù D. rotundifolia trên môi trƣờng Gamborg’s B5; nuôi dịch huyền phù D. capensis trong môi trƣờng MS và McCowns Woody Plant (McC) [23]. Jozep Nahálka và cộng sự đã tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền phù để thu nhận plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28]. 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp hay sản phẩm trao đổi bậc hai là những sản phẩm đƣợc tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trƣờng ngoài. Phần lớn các sản phẩm bậc hai thƣờng không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế bào . Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tƣợng sinh tổng hợp thừa [7]. Các loại hợp chất thứ cấp bao gồm những nhóm chính sau: Các hợp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, các độc chất chứa nitơ đã đƣợc glycosyl hóa, các amino acid không phải protein,… Các chất trao đổi có phenol, isoprenoid, các polyketide. Con đƣờng tổng hợp ra chúng đƣợc trình bày trong sơ đồ 2.1 [43]. 18 Hình các nhóm hợp chất thứ cấp chính trong thực vật Sơ đồ 2.1: Con đƣờng tổng hợp các nhóm hợp chất thứ cấp chính ở thực vật [43]. 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới điều kiện đặc biệt (vết thƣơng, xử lý với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật…). Mô sẹo có thể đƣợc kích thích tạo ra trong ống nghiệm bằng cách đƣa một mẫu nhỏ của cây lên môi trƣờng vô trùng có bổ sung hormone. Dƣới tác dụng của các hormone kích thích nội sinh hoặc các hormone nhân tạo, quá trình trao đổi chất 19 của tế bào sẽ thay đổi và bắt đầu hoạt động phân bào. Vì vậy khi có sự mất cân bằng về các nồng độ hormone sinh trƣởng trong thực vật thì mô sẹo hình thành. Khối mô

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfHOANG THI THU.pdf