Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến sự ra hoa in vitro của một vài cây trong họ rau dền (Amaranthaceae)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1. Những biến đổi ở SAM của cây ex vitro trong quá trình ra hoa 3.1.1. Đặc điểm hình thái Ảnh 3.1: Các giai đoạn phát triển của mô phân sinh hoa trong điều kiện ex vitro a: SAM cây ex vitro ở tuần thứ 4; (b): tuần thứ 5; (c): tuần thứ 6 Không giống như cây thân gỗ, khi cây thân thảo chuyển từ trạng thái sinh dưỡng sang trạng thái sinh sản không có những thay đổi rõ về mặt hình thái để có thể quan sát được bằng mắt thường (Beverley, 2007) [12]. Các cây thuộc chi Mào gà đều là cây thân thảo, do đó không sự khác biệt về hình dạng, cách sắp xếp của lá, độ dài của lóng thân giữa những cây đang ở trạng thái sinh dưỡng và những cây đã có sự thay đổi ở vùng mô phân sinh ngọn để chuyển sang trạng thái sinh sản. Chính vì thế, chỉ có thể quan sát sự thay đổi trạng thái sinh trưởng của cây Mào gà thông qua quan sát hình thái của vùng mô phân sinh ngọn chồi dưới kính hiển vi bằng phương pháp giải phẫu. Ở ảnh 3.1a, mô phân sinh ngọn chồi của cây ex vitro 4 tuần tuổi đang trong giai đoạn sinh dưỡng có hình dạng khá bằng phẳng. Sau một tuần, vùng đỉnh bắt đầu nhô cao, các tế bào tại vùng đỉnh của chồi bắt màu đậm chứng tỏ đây là khu vực đang xảy ra sự phân chia tế bào mạnh (ảnh 3.1b). Theo Bùi Trang Việt (2000) [7], sự tượng hoa thường xảy ra sau sự chuyển tiếp ra hoa 2-3 ngày, khiến các tế bào ngoại vi phân hóa thành các sơ khởi bầu noãn, bao phấn và các tế bào sâu hơn với 40 tốc độ rất nhanh, làm chồi phồng lên thành nụ hoa, dễ dàng quan sát được dưới kính hiển vi qua lát cắt dọc. Như vậy, chồi ngọn 5 tuần tuổi đã bước sang giai đoạn tượng hoa. Mô phân sinh ngọn chồi của cây ở giai đoạn 6 tuần tuổi đã biệt hóa, tạo thành phát hoa và hình thành các cơ quan hoa (ảnh 3.1c). Các hình ảnh trên cho thấy không có sự thay đổi lớn về mặt kích thước của mô phân sinh khi chuyển từ trạng thái sinh dưỡng sang trạng thái sinh sản trong điều kiện tự nhiên. Kết quả quan sát hình thái chồi ex vitro ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình ra hoa nêu trên là cơ sở để xác định các giai đoạn của quá trình ra hoa in vitro. 3.1.2. Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp Bảng 3.1: Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp của chồi ngọn cây ex vitro Giai đoạn (tuần tuổi) CĐQH (µmol O2/cm 2/phút) CĐHH (µmol O2/g/phút) 4 2,56 ± 0,18a 34,42 ± 0,32a 5 3,50 ± 0,12b 43,49 ± 0,74b 6 4,47 ± 0,24c 42,10 ± 0,15b Kết quả đo cường độ quang hợp của chồi ngọn ở cây ex vitro cho thấy có sự gia tăng cường độ quang hợp trong suốt quá trình ra hoa (bảng 3.1). Cường độ quang hợp của chồi ngọn cây ở giai đoạn tượng hoa (cây 5 tuần tuổi) tăng lên (3,50 µmol O2/cm2/phút) so với cường độ quang hợp của cây 4 tuần tuổi (2,56 µmol O2/cm2/phút) và tiếp tục tăng ở tuần thứ 6, khi đã hình thành phát hoa và phát sinh cơ quan hoa (4,47 µmol O2/cm2/phút). Tương tự như sự thay đổi của cường độ quang hợp ở chồi ngọn trong các giai đoạn khác nhau của quá trình ra hoa, cường độ hô hấp cũng có sự biến đổi lớn. Cường độ hô hấp ở chồi ngọn ở tuần thứ 5 (43,49 µmol O2/cm2/phút), tuần thứ 6 (42,10 µmol O2/cm2/phút) tăng so với tuần thứ 4 (34,42 µmol O2/cm2/phút). Điều 41 này cho thấy cường độ hô hấp ở chồi ngọn cũng tăng khi có sự chuyển đổi từ mô phân sinh sinh dưỡng sang mô phân sinh hoa. Ở vùng mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình chuyển từ mô phân sinh sinh dưỡng sang mô phân sinh hoa, tốc độ phân chia của tế bào tăng nhanh và chu kỳ tế bào được rút ngắn lại (Taiz và Zeiger, 2002) [58]. Chính vì vậy, các tế bào của vùng này cần nhiều năng lượng và dinh dưỡng cho việc tổng hợp DNA, RNA, protein. Do vậy, cường độ hô hấp tăng cao đáp ứng cho nhu cầu năng lượng ở vùng mô phân sinh ngọn chồi. Để đáp ứng nhu cầu về năng lượng và dinh dưỡng đó, cường độ quang hợp ở chồi tăng cao, đảm bảo cung cấp đủ lượng carbohydrate cho các phản ứng sinh tổng hợp của các tế bào ở vùng mô phân sinh. 3.1.3. Hàm lượng đường và tinh bột Bảng 3.2: Hàm lượng đường và tinh bột ở chồi ngọn của cây ex vitro Giai đoạn (tuần tuổi) Hàm lượng đường (mg/g VLT) Hàm lượng tinh bột (mg/g VLT) 4 20,61 ± 0,51a 1,46 ± 0,10b 5 25,75 ± 0,49b 1,40 ± 0,01b 6 24,24 ± 0,46b 1,25 ± 0,03a Ở chồi ngọn của cây đang trong giai đoạn sinh dưỡng (4 tuần tuổi) có hàm lượng đường là 20,61 mg/g VLT. Hàm lượng đường của chồi ngọn tăng khi cây chuyển sang trạng thái sinh sản (25,75 mg/g VLT ở tuần thứ 5 và 24,24 mg/g VLT ở tuần thứ 6). Hàm lượng tinh bột thay đổi tỷ lệ nghịch với sự gia tăng của hàm lượng đường. Ở tuần thứ 4, hàm lượng tinh bột của chồi ngọn là 1,46 mg/l VLT. Khi cây bước vào giai đoạn tượng hoa hàm lượng tinh bột bắt đầu giảm cho đến khi hình thành phát hoa (1,25 mg/g VLT). Điều này chứng tỏ bên cạnh nguồn đường do quang hợp cung cấp thì hàm lượng đường gia tăng còn do quá trình thủy phân tinh 42 bột được tăng cường nhằm cung cấp thêm đường cho sự tăng trưởng của các cơ quan hoa. Trong quá trình ra hoa của thực vật bậc cao, hàm lượng sucrose ở ngọn nhánh ra hoa tăng nhằm cung cấp năng lượng cho sự phân bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Theo Lincoin và Eduardo (2002) [38], khi mô phân sinh sinh dưỡng chuyển sang mô phân sinh hoa, cường độ quang hợp tăng cao nên sản phNm từ quang hợp cũng tăng. Điều này khiến hàm lượng đường ở vùng mô phân sinh ngọn chồi tăng nhưng đây không phải là nguồn carbohydrate duy nhất mà chồi được cung cấp. Hàm lượng đường của chồi trong giai đoạn ra hoa tăng cao còn do kết quả của sự thủy phân tinh bột dự trữ (Helgi và Stephen, 2005) [32]. Chính vì thế, thông thường hàm lượng tinh bột sẽ giảm trong quá trình ra hoa. 3.1.4. Hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật Bảng 3.3: Hàm lượng CĐTTTV ở chồi ngọn cây ex vitro Giai đoạn (tuần tuổi) CĐHTTTV (mg/g VLT) Auxin Cytokinin Gibberellin Acid abscisic 4 0,40 ± 0,01a 0,39 ± 0,02b 2,43 ± 0,08a 0,43 ± 0,01a 5 0,65 ± 0,04b 0,49 ± 0,01c 2,48 ± 0,02a 0,60 ± 0,02b 6 0,59 ± 0,04b 0,32 ± 0,03a 2,41 ± 0,03a 0,66 ± 0,01c Ở chồi ngọn cây ex vitro trong giai đoạn sinh dưỡng (4 tuần tuổi), hàm lượng gibberellin là 2,43 mg/g VLT. Kết quả đo hoạt tính gibberellin của chồi ngọn cây đã chuyển sang giai đoạn sinh sản cho thấy hàm lượng gibberellin không thay đổi trong quá trình ra hoa (2,48 mg/g VLT ở tuần thứ 5 và 2,41 mg/g VLT ở tuần thứ 6). Tuy nhiên, kết quả này vẫn chưa đủ để kết luận về vai trò của gibberellin trong sự ra hoa ở Mào gà bởi trên Lolium temulentum và Spathiphyllum một số loại gibberellin kích thích ra hoa nhưng lại không có tác dụng kéo dài lóng thân (King và cộng sự, 2000) [36]. 43 Ngoài gibberellin, hàm lượng của auxin, cytokinin và acid abscisic đều có sự biến động. Ở chồi ngọn cây 5 tuần tuổi, hàm lượng auxin là 0,65 mg/g VLT và 6 tuần tuổi là 0,59 mg/g VLT, cao hơn so với hàm lượng auxin trong chồi ngọn cây 4 tuần tuổi (0,40 mg/g VLT). Kết quả này cho thấy auxin giữ vai trò nhất định trong sự ra hoa ở cây Mào gà. Trong quá trình trình ra hoa, hàm lượng cytokinin thay đổi không theo một xu hướng nhất định. Hàm lượng cytokinin ở chồi ngọn tăng khi cây chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn tượng hoa (0,49 mg/g VLT ở cây 5 tuần tuổi so với 0,39 mg/g VLT ở cây 4 tuần tuổi) nhưng lại giảm khi cây đạt 6 tuần tuổi (0,32 mg/g VLT). Sự gia tăng hàm lượng cytokinin (2-iP và zeatin) ở mô phân sinh ngọn chồi cũng xảy ra trong giai đoạn đầu của sự ra hoa trên Arabidopsis (Hasan và Nobumasa, 1996) [31]. Như vậy, cytokinin có thể là hormone cần cho giai đoạn đầu của quá trình khởi tạo và phát triển mô phân sinh hoa. Ngoài ra, hàm lượng acid abscisic ở chồi ngọn cũng tăng trong quá trình ra hoa. Ở chồi ngọn của cây 4 tuần tuổi, hàm lượng acid abscisic chỉ ở mức 0,43 mg/g VLT. Khi cây chuyển sang giai đoạn tượng hoa hàm lượng acid abscisic tăng (0,60 mg/g VLT) và tiếp tục tăng lên khi xảy ra sự tăng trưởng các cơ quan hoa (0,66 mg/g VLT). Thông thường, ở những cây bị stress nước, hàm lượng acid abscisic tăng cao. Sau thời gian stress, nếu được tưới nước theo một chế dộ nhất định, cây sẽ bắt đầu ra hoa. từ đây có thể nói acid abscisic có ảnh hưởng đến sự ra hoa nhưng vai trò của nó trong ra hoa đến nay vẫn chưa được biết rõ (Helgi và Stephen, 2005) [32]. 44 3.2. Sự ra hoa in vitro ở cây Mào gà 3.2.1. Vai trò của sucrose trong sự ra hoa in vitro của cây CCL1 Bảng 3.4: Vai trò của sucrose trong sự ra hoa in vitro của cây CCL1 Môi trường Hàm lượng sucrose (g/l) Tỷ lệ ra hoa (%) 40 ngày 50 ngày 60 ngày MS 20 0 0 0 MS 30 0 0 0 MS 40 0 0 0 MS 50 0 0 0 MS 60 0 0 0 MS ½ 20 0 0 22,22 ± 2,22 a MS ½ 30 0 0 37,70 ± 2,22 b MS ½ 40 0 11,11 ± 2,22 a 68,89 ± 2,22 d MS ½ 50 0 8,89 ± 2,22 a 62,22 ± 2,22 c MS ½ 60 0 0 0 Trong môi trường khoáng MS nguyên bổ sung 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l 50 g/l và 60 g/l, tất cả các chồi đều không ra hoa (bảng 3.4). Khi hàm lượng khoáng đa lượng giảm một nửa, ở nồng độ 20 g/l sucrose tỷ lệ chồi hình thành hoa đạt 22,22% sau 60 ngày trong môi trường cảm ứng (ảnh 3.2). Tỷ lệ chồi ra hoa sau 60 ngày tăng khi tăng nồng độ sucrose trong môi trường, đạt cao nhất ở nồng độ 40 g/l (68,89%). Nồng độ sucrose tăng cũng thúc đNy chồi ra hoa sớm hơn. Sau 40 ngày chuyển vào môi trường MS ½ có chứa 40 g/l và 50 g/l sucrose, hoa bắt đầu xuất hiện và tỷ lệ đạt 11,11% - 8,89%. Tuy nhiên, khi nồng độ sucrose vượt quá 50 g/l, tỷ lệ ra hoa giảm và tất cả các chồi không ra hoa khi nồng độ sucrose trong môi trường chiếm 6%. 45 Ảnh 3.2: Hoa Mào gà in vitro ở ngày thứ 60 a: trong môi trường MS ½ bổ sung 30 g/l, b: 40 g/l, c: 50 g/l sucrose Kết quả nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng trong quá trình ra hoa cho thấy trên thực vật bậc cao tồn tại hai giới hạn về dinh dưỡng: giới hạn dưới (nguồn dinh dưỡng thấp không đủ cung cấp cho cây tăng trưởng, phát triển và ra hoa), giới hạn trên (nguồn dinh dưỡng quá cao, sự phát triển sinh dưỡng chiếm ưu thế) (Bùi Trang Việt, 2000) [7]. Ở cùng lượng sucrose nhưng các chồi trong môi trường khoáng MS nguyên không ra hoa trong khi những chồi được nuôi cấy trong môi trường MS ½ có khả năng ra hoa. Từ đó, có thể nói hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường khoáng nguyên MS ở các nồng độ sucrose khác nhau (20 g/l - 60 g/l) là giới hạn trên về dinh dưỡng đối với cây Mào gà CCL1. Mặt khác, ở điều kiện tự nhiên, thực vật đáp ứng với sự biến động dinh dưỡng từ môi trường (các stress) bằng cách khởi động chương trình ra hoa sớm hơn nhằm đảm bảo kịp ra hoa, kết quả và tạo hạt trước khi chết (Beverley, 2007) [12]. Việc giảm hàm lượng khoáng đa lượng trong môi trường MS ½ có thể gây stress cho các chồi đã có thời gian 3 tuần tăng trưởng 46 trong môi trường MS nguyên. Vì thế, việc giảm hàm lượng khoáng đa lượng kích thích sự ra hoa. Kết quả phân tích cường độ quang hợp, cường độ hô hấp và hàm lượng đường của chồi ngọn cây Mào gà CCL1 ở điều kiện tự nhiên cho thấy các tế bào vùng mô phân sinh ngọn chồi cần được cung cấp nhiều đường trong giai đoạn ra hoa. Carbohydrate không chỉ cần do nhu cầu năng lượng mà còn là dấu hiệu cần thiết cho sự ra hoa (Bùi Trang Việt, 2000) [7]. Tuy nhiên, sản phNm quang hợp của cây trong điều kiện in vitro thường không đủ cho nhu cầu này. Việc tăng hàm lượng sucrose trong môi trường MS ½ đáp ứng nhu cầu carbohydrate của các chồi nên tăng khả năng ra hoa và số hoa trên mỗi chồi. Sự gia tăng hàm lượng sucrose cũng làm tăng tỷ lệ hoa in vitro trên Phyllanthus niruri (Ong và cộng sự, 2006) [47], Fagopyrum esculentum L. (Yongsak và cộng sự, 2001) [67]. Trong điều kiện in vitro, đường là nguồn cung cấp carbohydrate quan trọng cho cây và cũng là tác nhân gây nên áp suất thNm thấu. Tăng hàm lượng sucrose trong môi trường nuôi cấy đồng nghĩa với làm tăng áp suất thNm thấu. Trong môi trường có áp suất thNm thấu cao vượt quá ngưỡng sẽ khiến tế bào bị mất nước, gia tăng hàm lượng acid abscisic, giảm hô hấp. Do đó, nó làm giảm khả năng tăng trưởng và giảm tốc độ phân chia của tế bào (Edwin và cộng sự, 2008) [25]. Chính vì thế, các chồi trong môi trường MS và MS ½ có bổ sung 60 g/l sucrose tăng trưởng kém, không ra hoa. 47 3.2.2. Ảnh hưởng của nitơ, phosphor và kali đến sự ra hoa ở cây CCL1 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nitơ trong sự ra hoa in vitro của cây CCL1 Hàm lượng NH4NO3 (mg/l) Tỷ lệ ra hoa (%) 40 ngày 50 ngày 60 ngày 825* 0 8,89 ± 3,85 a 75,55 ± 2,22 b 550 0 0 26,67 ± 3,85 a 412,5 0 0 0 0 0 0 0 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nitơ (bảng 3.5) cho thấy tất cả chồi trong các nghiệm thức ở thí nghiệm này đều không ra hoa sau 40 ngày trong môi trường cảm ứng. Hoa bắt đầu xuất hiện sau 50 ngày ở nghiệm thức đối chứng (môi trường có 825 mg/l NH4NO3, tương đương với hàm lượng trong môi trường khoáng MS ½). Ở ngày thứ 60, tỷ lệ hoa in vitro đạt cao nhất môi trường có 825 mg/l NH4NO3 (75,55%, ảnh 3.3) và tỷ lệ hoa giảm dần khi giảm lượng NH4NO3. Ảnh 3.3: Hoa in vitro trong môi trường khoáng MS ½ 48 Theo Sachs (1977), tỷ lệ C/N ở chồi ngọn tăng cao trong quá trình ra hoa và hàm lượng nitơ cao ức chế sự ra hoa. Việc sử dụng môi trường MS ½ hoặc giảm hàm lượng nitơ khiến khả năng hình thành hoa in vitro tăng đáng kể trên tre (Bambusa vulgaris), Dendrocalamus giganteus, D. strictus, Doritis, Orichophragmus violaceus (Meira và Vered, 2006) [42], đậu Hà Lan (P. sativum) (Franklin và cộng sự 2000) [29]. Tuy nhiên, kết quả từ bảng 3.5 chứng tỏ việc giảm nitơ đơn lẻ không cảm ứng ra hoa và tỷ lệ C/N không phải yếu tố tác động chính đến sự ra hoa in vitro của cây Mào gà CCL1. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phosphor và kali đến sự ra hoa in vitro ở cây CCL1 Hàm lượng KH2PO4 (mg/l) Tỷ lệ ra hoa (%) 40 ngày 50 ngày 60 ngày 85* 0 4,45 ± 2,22 a 75,55 ± 2,22 c 170 0 0 35,55 ±2,22 b 255 0 0 15,55 ± 2,22 a 340 0 0 15,55 ± 2,22 a Ở nghiệm thức đối chứng (môi trường MS ½ chứa 85 mg/l KH2PO4, hàm lượng trong môi trường khoáng MS ½), hoa xuất hiện sau 50 ngày và tỷ lệ chồi ra hoa đạt 75,55% sau 60 ngày. Khi tăng lượng KH2PO4 tỷ lệ chồi ra hoa giảm dần (bảng 3.6, ảnh 3.3). Các nghiên cứu trên địa lan (Cymbidium) (Kostenyuk và cộng sự, 1999) [37], nhân sâm (Chang và Hsing, 1980) [16], cà chua (Dielen và cộng sự, 2001) [23] chứng minh rằng việc giảm hàm lượng nitơ đơn lẻ không cảm ứng ra hoa nhưng khi kết hợp giảm nitơ với bổ sung BA, cắt rễ và tăng hàm lượng phosphor, kali trong môi trường nuôi cấy thúc đNy sự ra hoa in vitro xảy ra nhanh hơn. Tuy nhiên đối với cây Mào gà CCL1, việc gia tăng hàm lượng kali, phosphor không làm tăng tỷ lệ hoa in vitro. Kết quả từ bảng 3.5 và 3.6 chứng tỏ hàm lượng nitơ, kali và phosphor trong môi trường khoáng MS ½ là hàm lượng tối ưu cho sự ra hoa của cây Mào gà CCL1. 49 3.2.3. Ảnh hưởng của BA và auxin đến sự ra hoa in vitro của cây CCL1 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của BA và các loại auxin đến sự ra hoa in vitro của cây CCL1 Nồng độ CĐHTTTV (mg/l) Tỷ lệ ra hoa (%) BA NAA IBA 2,4-D 40 ngày 50 ngày 60 ngày - - - - 0 8,89 ± 3,85 a 75,55 ± 2,22 a 0,05 - - - 0 0 0 0,05 0,1 - - 0 0 0 0,1 - - - 0 0 0 0,1 0,1 - - 0 46,67 ± 3,85 d 100 b 0,2 - - - 0 0 0 0,2 0,1 - - 0 0 0 0,1 0,2 - - 0 66,22 ± 2,22 g 100 b 0,1 0,4 - - 0 75,55 ± 2,22 g 100 b 0,1 0,6 - - 0 88,89 ± 2,22 i 100 b - - 0,1 - 0 0 0 0,1 - 0,1 - 0 77,78 ± 2,22 g 100 b 0,1 - 0,2 - 0 53,33 ± 2,22 e 100 b 0,1 - 0,4 - 0 22,22 ± 2,22 bc 100 b 0,1 - 0,6 - 0 15,55 ± 2,22 b 100 b - - - 0,1 0 0 0 0,1 - - 0,1 0 71,11 ± 2,22 g 100 b 0,1 - - 0,2 0 75,55 ± 2,22 g 100 b 0,1 - - 0,4 0 95,55 ± 2,22 h 100 b 0,1 - - 0,6 0 64,45 ± 2,22 f 100 b 50 Bảng 3.7 cho thấy tất cả các chồi đều không ra hoa trên môi trường bổ sung BA đơn lẻ ở các nồng độ khác nhau (0,05 mg/l - 0,2 mg/l), các loại auxin (NAA, IBA, 2,4-D) đơn lẻ ở 0,1 mg/l và kết hợp BA ở các nồng độ 0,05 mg/l; 0,2 mg/l với NAA 0,1 mg/l. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng hoa xuất hiện sau 50 ngày nuôi cấy (8,89%). Kết hợp BA 0,1 mg/l lần lượt với NAA (0,1 mg/l), IBA (0,1 mg/l), 2,4-D (0,1 mg/l), hoa xuất hiện sau 50 ngày nuôi cấy và tỷ lệ hoa tăng khi tăng nồng độ NAA (0,1 mg/l - 0,6 mg/l), IBA (0,1 mg/l - 0,2 mg/l), 2,4-D (0,1 mg/l - 0,4 mg/l). Tỷ lệ hoa in vitro cao nhất trong môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,4 mg/l 2,4-D (95,55%) sau 50 ngày. Tuy nhiên, các chồi trong môi trường chứa 0,1 mg/l BA và 0,4 mg/l 2,4-D tăng trưởng kém, cây thấp, lá vàng úa và tạo nhiều mô sẹo ở gốc, hoa nhỏ và bất thường (ảnh 3.4a). Môi trường chứa 0,1 mg/l BA và 0,6 mg/l NAA có tỷ lệ chồi ra hoa thấp hơn (88,89%) nhưng các chồi trong nghiệm thức này đều tăng trưởng tốt, cây to khỏe, lá xanh, ít tạo mô sẹo ở gốc, hoa to (ảnh 3.4b). Tất cả các nghiệm thức phối hợp 0,1 mg/l BA với các loại auxin ở những nồng độ khác nhau đều đạt tỷ lệ ra hoa 100% sau 60 ngày nuôi cấy, cao hơn so với đối chứng. Nồng độ IBA và 2,4-D cao (0,4 mg/l - 0,6 mg/l) làm giảm tỷ lệ hoa in vitro. Kết quả khảo sát ở thí nghiệm này chứng minh BA và các loại auxin (NAA, IBA, 2,4-D) tác động đến khả năng ra hoa in vitro của cây Mào gà CCL1. Cytokinin hay auxin đơn lẻ không có khả năng kích thích sự ra hoa in viro mà cần có sự kết hợp của cả hai nhóm CĐHTTTV này theo một tỷ lệ thích hợp. Hơn nữa, trong môi trường không bổ sung CĐHTTTV, cây vẫn có khả năng ra hoa dù tỷ lệ thấp và cần nhiều thời gian. Sự kết hợp của BA và NAA cũng kích thích sự ra hoa in vitro từ mô sẹo của Saintpaulia ionantha H. Wendl. (Daud và Taha, 2008) [20]. Theo Bùi Trang Việt (2000) [7], mức độ cân bằng giữa cytokinin và auxin là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Trong trường hợp cây Mào gà CCL1, đây chính một trong những là yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa in vitro. 51 Ảnh 3.4: Hoa Mào gà in vitro ở ngày thứ 50 trong môi trường MS ½ bổ sung BA và các loại auxin a: 0,1 mg/l BA và 0,4 mg/l 2,4-D, b: 0,1 mg/l BA và 0,6 mg/l NAA, c: 0,1 mg/l BA và 0,1 mg/l IBA, d: 0,1 mg/l BA và 0,4 mg/l NAA Cho đến nay, vai trò của auxin trong ra hoa vẫn chưa được hiểu rõ. Khi dùng chất ức chế sự vận chuyển auxin ở Arabidopsis, hoa phát triển một cách bất thường nên có thể auxin cần cho sự phát triển của các cơ quan hoa (Taiz và Zeiger, 2002) [58]. Ngược lại, vai trò của cytokinin trong sự ra hoa rõ ràng hơn. Cytokinin làm tăng tốc độ và tăng tính đồng bộ của sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000) [7]. Theo McCartan và Van Standen (2003), việc bổ sung BA tăng khả năng ra hoa in vitro do các CĐHTTTV thuộc nhóm cytokinin có thể loại bỏ tác nhân ức chế ra hoa ở rễ bằng cách kiềm hãm sự tăng trưởng của rễ. Ngoài ra, cytokinin còn có khả năng kích hoạt cơ chế cảm ứng ra hoa, cần cho giai đoạn đầu của quá trình khởi tạo 52 và phát triển của mô phân sinh hoa (Kostenyuk và cộng sự, 1999; Hasan Basri và Nobumasa Nito, 1996) [37, 31]. 3.2.4. Ảnh hưởng của PBZ đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của PBZ đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Nồng độ paclobutrazol (mg/l) Tỷ lệ ra hoa (%) 30 ngày 40 ngày 50 ngày 0* 0 0 88,89 ± 2,22 b 0,5 24,45 ± 2,22 b 57,77 ± 2,22 b 100 a 1 31,11 ± 2,22 c 68,89 ± 2,22 c 100 a 2 62,22 ± 2,22 d 84,45 ± 2,22 d 100 a 3 8,89 ± 2,22 a 26,67 ± 3,85 a 100 a Theo bảng 3.8, trong môi trường không bổ sung PBZ cây ra hoa sau 50 ngày nuôi cấy. Khi thêm PBZ vào môi trường, thời gian ra hoa của chồi in vitro được rút ngắn hơn so với môi trường không có PBZ. Tỷ lệ chồi ra hoa tăng khi tăng nồng độ PBZ (0,5 mg/l - 2 mg/l) và đạt cao nhất ở nồng độ 2 mg/l (62,22% sau 30 ngày và 84,45% sau 40 ngày) (ảnh 3.5). Ở nồng độ 3 mg/l, tỷ lệ ra hoa giảm, lá vàng. Tất cả nghiệm thức có bổ sung PBZ đều đạt tỷ lệ ra hoa sau 100% 50 ngày nuôi cấy. PBZ có tác dụng chặn con đường sinh tổng hợp gibberellin do nó ức chế sự oxi hóa kaurene thành acid kaurenoic, ức chế gibberellin, tác động đến cytochrome P450 (một trong những thành phần của phức hợp chuyển điện tử nằm trên màng tế bào) và cản quá trình thoái hóa acid abscisic. Chính vì vậy nó làm giảm tốc độ phân chia của tế bào, làm giảm chiều cao cây, khiến cây bị lão hóa nhanh hơn (Christo và cộng sự, 1995) [19]. PBZ còn tăng cường quá trình quang hợp, làm tăng lượng carbohydrate; tăng lượng N, P, Ca, Mg của lá từ đó thúc đNy sự tăng trưởng của hoa và tăng số lượng, chất lượng hoa (Fatma và cộng sự, 2007) [28]. Ngoài ra, PBZ 53 cũng làm tăng tỷ lệ hoa in vitro ở Euphorbia millii (Dewir và cộng sự, 2006) [22], Saposhnikovia divaricata (Qi và cộng sự, 2009) [49]. Ảnh 3.5: Hoa Mào gà in vitro trong môi trường bổ sung PBZ a: 0,5 mg/l paclobutrazol, b: 1 mg/l paclobutrazol, l: c: mg/l paclobutrazol, d: 3 mg/l paclobutrazol PBZ làm giảm nồng độ gibberellin nội sinh ở mô phân sinh ngọn. Tuy nhiên, khi xử lý gibberellin ngoại sinh cho những chồi bạch đàn (Eucalyptus nitens) đã được xử lý với PBZ, tác dụng tăng khả năng ra hoa và tỷ lệ, chất lượng hoa lại giảm. Như vậy, có thể cơ chế kích thích ra hoa của paclobutrazol là do gibberellin bị ức chế (Moncur và Hasan, 1994) [45]. Từ kết quả phân tích hàm lượng hormone nội sinh của chồi ngọn cây Mào gà CCL1 ngoài tự nhiên và kết quả thí nghiệm này 54 chứng tỏ gibberellin không phải là yếu tố tác động đến sự ra hoa của cây Mào gà CCL1. 3.2.5. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Thời gian chiếu sáng (giờ) Cường độ ánh sáng (lux) 1800 ± 100 2700 ± 100 Tỷ lệ hoa (%) 8/24 51,11 ± 2,22 b 62,22 ± 2,22 b 12/24 64,44 ± 5,88 c 64,45 ± 2,22 b 16/24 64,45 ± 2,22 c * 66,67 ± 3,85 b 24/24 11,11 ± 2,22 a 8,89 ± 2,22 a Bảng 3.9 cho thấy ở cùng thời gian chiếu sáng, tỷ lệ chồi ra hoa trong điều kiện in vitro giữa hai cường độ 1800 lux và 2700 lux không có sự khác biệt đáng kể. Ngay cả khi thay đổi độ dài của thời gian chiếu sáng (8/24 giờ - 16/24 giờ), tỷ lệ ra hoa giữa các nghiệm thức cũng không khác biệt lớn. Nhưng khi tăng thời gian chiếu sáng lên đến 24/24 giờ liên tục, tỷ lệ chồi hoa giảm (11,11% ở cường độ 1800 lux và 8,89% ở 2700 lux). Ở cường độ ánh sáng thấp (1800 lux) hoa có màu nhạt hơn so với hoa được chiếu sáng ở cường độ 2700 lux (ảnh 3.6). 55 Ảnh 3.6: Hoa Mào gà CCL1 khi chiếu sáng 1800 lux (a) và 2700 lux (b) Mào gà là cây ra cây ngày ngắn nhưng không phụ thuộc chặt chẽ vào quang kỳ. Cây ra hoa tốt nhất khi thời gian chiếu sáng dưới 14 giờ nhưng vẫn có thể ra hoa khi thời gian chiếu sáng ngắn hoặc dài hơn. Tuy nhiên, khi được chiếu sáng liên tục 24/24 giờ, tỷ lệ ra hoa giảm mạnh. Điều này có thể lý giải dựa vào hoạt động của các thụ quan ánh sáng. Chúng là tác nhân truyền tín hiệu ánh sáng, tham gia điều hòa quá trình ra hoa thông qua việc tác động đến sự biểu hiện của gen CO và độ ổn định của protein CO. Trong điều kiện quang kỳ dài, phytochrome B hoạt động mạnh, làm giảm khả năng biểu hiện của CO, làm giảm lượng CO. Do đó làm giảm biểu hiện của các gen xác định mô phân sinh hoa, giảm khả năng ra hoa của chồi (Brian, 2006) [14]. Sự sinh tổng hợp màu sắc ở cánh hoa chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Ở hoa Eustoma grandiflorum Crise., việc gia tăng hàm lượng sucrose và cường độ ánh sáng làm tăng lượng sắc tố của cánh hoa, khiến hoa có màu đậm hơn (Uddin và cộng sự, 2000) [61]. Hơn nữa, ánh sáng có liên quan chặt chẽ đến 56 quá trình sinh tổng hợp anthocyanin, carotenoid và chlorophyll. Khi tăng cường độ ánh sáng, khả năng sinh tổng hợp anthocyanin cũng tăng, chính vì thế làm cho màu sắc của hoa đậm hơn (Phuong và Valeriano, 2009) [48]. 3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ra hoa in vitro cây CCL1 Nhiệt độ (0C) Tỷ lệ ra hoa sau 30 ngày (%) 20 4,45 ± 2.22 b 25* 68,89 ± 2.22 a 30 66.67 ± 2.22 a Ảnh 3.7: Mô phân sinh hoa sau 30 ngày ở 200C Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hình thành hoa in vitro cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa những cây được nuôi cấy ở 250-C với cây được nuôi cấy ở 300C. Tuy nhiên, ở 200C, tỷ lệ ra hoa giảm rõ rệt (bảng 3.10). Kết quả giải phẫu cho thấy hầu hết chồi có sự tượng hoa (ảnh 3.7) nhưng tỷ lệ chồi tạo cơ quan hoa và tăng trưởng rất thấp (bảng 3.10). Điều này chứng tỏ nhiệt độ giữ vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của các cơ quan hoa ở cây Mào gà CCL1. 57 3.2.7. Sự ra hoa in vitro của các loài CCL1, CCL2 và CPL Bảng 3.11: Sự ra hoa in vitro của các loài Mào gà Loài Tỷ lệ ra hoa sau 30 ngày (%) CCL1 64,45 ± 2,22 a CCL2 60,00 ± 3,85 a CPL 24,45 ± 2,22 b Trong cùng điều kiện nuôi cấy, khả năng ra hoa in vitro của các cây Mào gà thuộc 2 loài khác nhau có sự khác biệt khá rõ (bảng 3.11, ảnh 3.9). Ở hai giống thuộc loài Celosia cristata L. (CCL1 và CCL2), sau 30 ngày trong môi trường cảm ứng, tỷ lệ chồi ra hoa không có sự khác biệt (64,45% và 60%). Trong khi đó, ở loài Celosia plumosa L. (CPL) tỷ lệ chồi ra hoa chỉ ở mức 24,45%. Kết quả khảo sát này cho thấy đặc tính di truyền của cây ảnh hưởng rất lớn đến quá trình ra hoa ở cây Mào gà. Ảnh 3.8: Hoa Mào gà in vitro của loài Celosia cristata L. CCL1 (a), CCL2 (b) 58 Ảnh 3.9: Hoa in vitro của loài Celosia plumosa L. 59 3.3. So sánh những biến đổi của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình ra hoa của cây CCL1 ở môi trường tối ưu (OP) và môi trường không cảm ứng ra hoa 3.3.1. Hình thái của SAM Ảnh 3.10: Các giai đoạn phát triển của mô phân sinh hoa trong điều kiện in vitro a, b, c: mô phân sinh ngọn chồi trong môi trường MS ở giai đoạn 0, 2, 3 tuần d, e: mô phân sinh ngọn chồi trong môi trường OP ở giai đoạn 2, 3 tuần Mô phân sinh sinh dưỡng của cây Mào gà CCL1 có kích thước khoảng 70 - 80 µm, khá bằng phẳng và không có sự khác biệt lớn về mặt kích thước giữa cây in vitro và cây ex vitro (ảnh 3.1, 3.10). Ảnh 3.10a cho thấy ở thời điểm được chuyển vào môi trường cảm ứng, các chồi đều đang ở trong giai đoạn sinh dưỡng. Sau 2 tuần trong môi trường MS và OP, sự tượng hoa xảy ra, mô phân sinh của các chồi bắt đầu nhô cao (ảnh 3.10b, 3.10d) do sự phát triển nhanh của các sơ khởi hoa (Bùi Trang Việt, 2000). Tuy nhiên, sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS, có sự hình thành cơ quan hoa ở những chồi đã tượng hoa nhưng phát hoa không kéo dài và không có sự tăng trưởng của các cơ quan hoa. Do đó không thể thấy được sự hình 60 thành hoa khi quan sát bằng mắt thường (tỷ lệ hoa in vitro của cây trong môi trường MS là 0%). Trong khi đó, các chồi được nuôi cấy trong môi trường OP có sự kéo dài phát hoa và hình thành các cơ quan hoa. Tiến trình ra hoa của các chồi Mào gà trong môi trường OP tương tự như cây ở điều kiện ex vitro (ảnh 3.1). 3.3.2. Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp Bảng 3.12: Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp của chồi ngọn cây in vitro Giai đoạn (tuần tuổi) Môi trường CĐQH (µmol O2/cm2/phút) CĐHH (µmol O2/g/phút) 0 MS 0,64 ± 0,01a 7,96 ± 0,32a 2 0,78 ± 0,04b 31,71 ± 0,57b 3 1,45 ± 0,03c 12,47 ± 0,27c 0 OP 0,64 ± 0,01a 7,96 ± 0,32a 2 0,99 ± 0,03c 28,67 ± 0,49c 3 0,91 ± 0,02b 22,89 ± 0,56b Trong suốt quá trình ra hoa của các chồi trong điều kiện in vitro ở cả hai môi trường (MS và OP), cường độ quang hợp và cường độ hô hấp của chồi đều tăng tương tự như xu hướng của chồi cây ngoài tự nhiên. Cường độ quang hợp của chồi ngọn ở cây tại thời điểm bắt đầu chuyển vào môi trường cảm ứng ở mức 0,64 µmol O2/cm2/phút. Ở chồi đã chuyển sang giai đoạn tượng hoa (tuần thứ 2), cường độ quang hợp tăng lên (0,78 µmol O2/cm2/phút trong môi trường MS và 0,99 µmol O2/cm2/phút trong môi trường OP) và tiếp tục giữ mức cao ở sau khi sự tượng hoa xảy ra (tuần thứ 3) (1,45 µmol O2/cm2/phút trong môi trường MS và 0,91 µmol O2/cm2/phút trong môi trường OP). Tương tự như chồi ngọn của cây ngoài tự nhiên, chồi ngọn của cây trong điều kiện in vitro khi chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng (0 tuần tuổi) sang giai đoạn sinh sản (2 tuần tuổi) có sự gia tăng cường độ hô hấp (từ 7,96 µmol O2/cm2/phút ở 0 tuần tuổi tăng lên 31,71 µmol O2/cm2/phút trong môi trường MS và 28,67 µmol 61 O2/cm2/phút trong môi trường OP). Sau giai đoạn tượng hoa, cường độ hô hấp giảm xuống (12,47 µmol O2/cm2/phút trong môi trường MS và 22,89 µmol O2/cm2/phút trong môi trường OP) nhưng vẫn cao so với giai đoạn sinh dưỡng. Khả năng quang hợp của cây in vitro ở mức thấp so với cây ex vitro do đó đây không là nguồn cung cấp carbohydrate chính cho cây. Mặc dù vậy, kết quả khảo sát trên chứng tỏ sự gia tăng hoạt tính biến dưỡng ở mô phân sinh ngọn chồi thúc đNy hoạt động của bộ máy sinh dưỡng, khiến cường độ quang hợp tăng lên nhằm kết hợp với nguồn sucrose được bổ sung vào môi trường để đáp ứng cho nhu cầu dinh dưỡng và năng lượng ở vùng đỉnh trong quá trình ra hoa. Bên cạnh đó, cường độ hô hấp của chồi ngọn ở điều kiện in vitro cũng tăng cao trong suốt quá trình ra hoa, giống xu hướng của cây ở điều kiện ex vitro nhằm đảm bảo cung cấp đủ lượng ATP cho các phản ứng sinh tổng hợp DNA, RNA, ribosome, protein,… (Bùi Trang Việt, 2000; Helgi và Stephen, 2005) [7, 32]. 3.3.3. Hàm lượng đường và tinh bột Bảng 3.13: Hàm lượng đường và tinh bột của chồi ngọn cây in vitro Giai đoạn (tuần tuổi) Môi trường Hàm lượng đường (mg/g VLT) Hàm lượng tinh bột (mg/g VLT) 0 MS 11,31 ± 0,45a 0,45 ± 0,05a 2 11,44 ± 0,38a 0,49 ± 0,02a 3 11,28 ± 0,15a 0,49 ± 0,05a 0 OP 11,31 ± 0,45a 0,45 ± 0,05a 2 29,19 ± 0,24c 2,14 ± 0,09b 3 13,03 ± 0,50b 3,46 ± 0,05c Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy không có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng đường và tinh bột của các chồi trong hai môi trường MS ở ba giai đoạn khác nhau. Trong khi đó, hàm lượng đường của chồi trong môi trường OP tăng ở tuần thứ 2 (sự tượng hoa đã xảy ra, 29,19 mg/g VLT), tuần thứ 3 (phát hoa kéo dài, hình thành cơ quan hoa, 13,03 mg/g VLT). Sự gia tăng hàm lượng đường ở chồi ngọn của cây 62 trong môi trường OP tương ứng với sự gia tăng cường độ quang hợp và cường độ hô hấp (bảng 3.12). Mặt khác, việc tăng cường thủy giải tinh bột ở chồi ngọn cũng góp phần quan trọng làm tăng hàm lượng sucrose, đáp ứng cho nhu cầu carbohydrate ở mô phân sinh trong quá trình ra hoa (Helgi và Stephen, 2005) [32]. Chồi ngọn cây ở giai đoạn bắt đầu chuyển vào môi trường cảm ứng (giai đoạn sinh dưỡng) có hàm lượng tinh bột là 0,45 mg/g VLT. Không giống như chồi cây ngoài tự nhiên, hàm lượng tinh bột của chồi ngọn trong môi trường OP không giảm trong quá trình ra hoa. Khi cây chuyển sang giai đoạn sinh sản, hàm lượng tinh bột vẫn tiếp tục tăng (2,14 mg/g VLT ở tuần thứ 2 và 3,46 mg/g VLT ở tuần thứ 3). Sự khác biệt này do môi trường tối ưu (OP) có chứa PBZ, chính sự hiện diện của PBZ làm tăng quang hợp và tăng tích lũy tinh bột trong suốt thời gian nuôi cấy (Fatma và cộng sự, 2007) [28]. 3.3.4. Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Bảng 3.14: Hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở chồi ngọn cây in vitro Giai đoạn (tuần tuổi) Môi trường CĐHTTTV (mg/g VLT) Auxin Cytokinin Gibberellin Acid abscisic 0 MS 0,65 ± 0,55a 0,46 ± 0,02a 2,43 ± 0,06a 0,68 ± 0,02a 2 0,80 ± 0,02b 0,39 ± 0,02a 2,46 ± 0,11a 0,72 ± 0,03a, b 3 0,64 ± 0,02a 0,44 ± 0,04a 2,39 ± 0,15a 0,79 ± 0,02b 0 OP 0,65 ± 0,55a 0,46 ± 0,02a 2,43 ± 0,06a 0,68 ± 0,02a 2 0,82 ± 0,02a 0,78 ± 0,04b 2,61 ± 0,01a 0,67 ± 0,03a 3 0,70 ± 0,03b 0,61 ± 0,03c 2,49 ± 0,06a 0,70 ± 0,03a 63 Bảng 3.14 cho thấy: − Không có sự thay đổi về hàm lượng gibberellin ở các chồi trong cả hai môi trường. − Hàm lượng auxin của chồi trong hai môi trường đều tăng trong quá trình chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản (có sự tượng hoa xảy ra). Hàm lượng auxin trong chồi ngọn cây tại thời điểm bắt đầu chuyển vào môi trường cảm ứng ở mức 0,65 mg/g VLT. Khi sự tượng hoa xảy ra (tuần thứ 2 trong môi trường cảm ứng), hàm lượng auxin trong chồi ngọn thay đổi rõ rệt (0,80 mg/g VLT trong môi trường MS và 0,82 mg/g VLT trong môi trường OP). Hàm lượng auxin giảm thấp sau khi chồi đã qua giai đoạn tượng hoa. Ở tuần thứ 3 trong môi trường cảm ứng, hàm lượng auxin của chồi trong môi trường MS chỉ ở mức 0,64 mg/g VLT (gần bằng với hàm lượng của giai đoạn ban đầu) trong khi hàm lượng của chồi trong môi trường OP vẫn còn ở mức cao (0,70 mg/g VLT). − Hàm lượng cytokinin của chồi môi trường MS không có thay đổi trong suốt quá trình ra hoa. Các chồi trong môi trường OP ở thời điểm 2 tuần có hàm lượng cytokinin tăng cao so với hàm lượng trong chồi tại thời điểm chuyển vào (0,78 mg/g VLT so với 0,46 mg/g VLT). Sau khi sự tượng hoa xảy ra, cây chuyển sang giai đoạn kéo dài phát hoa và hình thành các cơ quan hoa, hàm lượng cytokinin vẫn được duy trì ở mức cao (0,61 mg/g VT). − Hàm lượng acid abscisic ở các chồi trong môi trường OP không thay đổi trong suốt quá trình ra hoa. Trong môi trường MS, hàm lượng acid abscisic của các chồi đã có sự hình thành của các cơ quan hoa tăng cao hơn so với hàm lượng của chồi tại thời điểm bắt đầu chuyển vào môi trường cảm ứng. 64 Các kết quả phân tích trên (bảng 3.12, 3.13, 3.14, ảnh 3.10) cho thấy các tác nhân tham gia vào quá trình ra hoa ở cây Mào gà CCL1 trong điều kiện in vitro là: − Hàm lượng carbohydrate: các kết quả khảo sát chứng tỏ có sự thay đổi hoạt tính biến dưỡng ở mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình chuyển từ chồi sinh dưỡng sang chồi sinh dục (có sự gia tăng cường độ quang hợp và hô hấp) và kết quả giải phẫu cũng cho thấy có sự tượng hoa, hình thành cơ quan hoa của chồi trong môi trường MS. Các chồi này chủ yếu sử dụng nguồn carbohydrate từ môi trường và một phần nhỏ từ quang hợp. Nguồn năng lượng này chỉ đủ dùng cho việc phát triển dinh dưỡng và tượng hoa, hình thành các cơ quan hoa, không đủ cho sự phát triển cùa các cơ quan hoa. Trong khi đó, dưới tác dụng của PBZ, các chồi trong môi trường OP không tăng kích thước tế bào mà tập trung tích lũy carbohydrate. Do đó, ngoài nguồn đường do môi trường cung cấp, chồi còn sử dụng nguồn đường từ quá trình thủy phân tinh bột dự trữ để đáp ứng cho nhu cầu chuyển từ mô phân sinh sinh dưỡng sang mô phân sinh hoa một cách tối đa. − Tỷ lệ auxin/cytokin: trong môi trường MS (không bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh), hàm lượng auxin và cytokinin ở chồi ngọn không thay đổi kể từ sau khi được chuyển từ môi trường tăng trưởng sang môi trường nuôi cấy mới. Trong môi trường OP (có bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh), hàm lượng của các chất này tăng sau khi chồi được chuyển vào môi trường cảm ứng. Từ đây, có thể thấy cytokinin (BA) và auxin (NAA) tác động đến cân bằng auxin/cytokinin ở vùng mô phân sinh ngọn chồi, ảnh hưởng đến sự hình thành và tăng trưởng của các cơ quan hoa. Hơn nữa, sự có mặt của PBZ cũng làm gia tăng lượng cytokinin nội sinh, góp phần thay đổi tỷ lệ auxin/cytokinin (Christo và cộng sự, 1995) [19].