Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) và cây bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ NGỌC TÖ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC TÖ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 ii LỜI CẢM TẠ Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô tại trƣờng đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi. - TS. Trần Thị Dung đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - KS. Trần Ngọc Hùng, KS. Nguyễn Thị Thu Hằng, KS. Lê Hồng Thủy Tiên thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện và hƣớng dẫn tôi hoàn thành tốt đề tài. - Toàn thể các bạn trong lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Thị Ngọc Tú iii TÓM TẮT NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007 “KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÒ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl)” Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Dung Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 tại Bộ môn Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Cây lan sò và cây bắt ruồi in vitro đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cảm ứng ra hoa với các yếu tố cảm ứng đƣợc sử dụng là GA3, BA, cƣờng độ ánh sáng và sự gia tăng nồng độ KH2PO4, giảm nồng độ NH4NO3. Những kết quả thu đƣợc:  Đối với cây lan sò - Môi trƣờng thích hợp nhất để cây lan sò ra hoa trong ống nghiệm (đạt tỉ lệ 44,4%) là môi trƣờng MS có bổ sung GA3 1,5mg/l. Cây ra nụ sau 78 ngày nuôi cấy và ra hoa sau 95,5 ngày, trung bình đạt 7 hoa/cây. - Môi trƣờng có bổ sung BA hoặc thay đổi cƣờng độ ánh sáng không có ảnh hƣởng nhiều trên sự ra hoa của cây lan sò in vitro.  Đối với cây bắt ruồi - Việc thay đổi nồng độ KH2PO4 và NH4NO3 không có ảnh hƣởng tốt trên sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro. Cây chỉ ra nụ nhƣng tỉ lệ không cao hơn so với đối chứng. Tất cả các nụ đều không nở thành hoa. iv ABSTRACT NGUYEN THI NGOC TU, Nong Lam University, HCM city, August, 2007. “The study of flowering in vitro in Dischidia pectinoides Pearson and Drosera burmannii Vahl.” Supervisor: Tran Thi Dung, Ph.D The subject was studied from 3/2007 to 8/2007 at the Department of Biotechnology at Nong Lam University. Dischidia pectinoides and Drosera burmannii in vitro were cultured in basic medium Murashige and Skoog (MS) and the supplement with different plant growth regulator such as: GA3, BA; the change of the intensity of light, KH2PO4, NH4NO3. Results:  In Dischidia pectinoides The best medium for flower induction is MS medium supplemented with 1.5mg/l GA3. The plants has formed flower buds after 78 days and bloomed after 95.5 days. There are 7 flowers in plant. The effect of MS medium supplemented with BA or changed the intensity of light isn’t clearly.  In Drosera burmannii The change of KH2PO4 and NH4NO3 concentrations didn’t effect in fowering in vitro in Drosera burmannii. The plants was formed flower buds, but ratio isn’t higher when compared with control treatment. All of flower buds didn’t bloom. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ......................................................................................................... i Lời cảm tạ ........................................................................................................ ii Tóm tắt ............................................................................................................ iii Mục lục ............................................................................................................ v Danh sách các bảng ......................................................................................... viii Danh sách các hình .......................................................................................... x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục đích yêu cầu ...................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................ 2 Chƣơng 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. Giới thiệu về đối tƣợng nghiên cứu .......................................................... 3 2.2.1. Giới thiệu khái quát về cây lan sò ....................................................... 3 2.1.2. Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi ................................................... 5 2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng lên sự ra hoa ngoài tự nhiên .................................. 6 2.2.1. Độ tuổi cây ......................................................................................... 7 2.2.2. Môi trƣờng ........................................................................................... 7 2.2.2.1. Tình trạng dinh dƣỡng ................................................................... 7 2.2.2.2. Nhiệt độ ......................................................................................... 8 2.2.2.3. Quang kỳ ........................................................................................ 8 2.2.2.4. Hiện tƣợng xuân hóa (hay sự thọ hàn) ......................................... 13 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng lên sự ra hoa in vitro ............................................. 15 2.3.1. Độ tuổi cây ......................................................................................... 16 vi 2.3.2. Dinh dƣỡng .......................................................................................... 16 2.3.2.1. Nồng độ đƣờng .............................................................................. 16 2.3.2.2. Hàm lƣợng photpho và nitơ .......................................................... 17 2.3.3. Các chất điều hòa sinh trƣởng ............................................................. 18 2.3.3.1. Cytokinins ...................................................................................... 18 2.3.3.2. Auxins ........................................................................................... 19 2.3.3.3. Gibberellins ................................................................................... 19 2.3.4. Các yếu tố khác ................................................................................... 20 2.4. Sự phát triển hoa in vitro ........................................................................... 22 2.5. Các nghiên cứu ra hoa in vitro .................................................................. 23 2.5.1. Trên thế giới ........................................................................................ 23 2.5.2. Trong nƣớc .......................................................................................... 24 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26 3.2 Nội dung .................................................................................................... 26 3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 26 3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sò ........................ 27 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò. ............................................................. 26 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa ................. 27 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò. .................................................................................................. 28 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi ............ 28 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. .............................................................................................. 28 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi ................................................................................................ 29 3.4. Chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................ 29 vii 3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trƣởng ......................................... 29 3.4.2 Theo dõi sự ra hoa ................................................................................ 29 3.5 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 30 3.5.1 Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................. 30 3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy ................................................................................. 30 3.5.3 Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 30 3.5.4 Xử lý số liệu ......................................................................................... 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................. 31 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 51 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 51 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 52 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa trên cây lan sò trong ống nghiệm .................................... 26 Bảng 3.2: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa ................................................................................................ 27 Bảng 3.3: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò .................................................... 28 Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi ................................................................. 28 Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. ................................................................. 29 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi của cây lan sò in vitro ........................................................................................... 31 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng lá của cây lan sò in vitro .......................................................................................... 32 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến số chồi của cây lan sò in vitro trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa. ............................................. 34 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự sinh trƣởng lá của cây lan sò in vitro trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa . ....... 36 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa ...................... 37 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số chồi của cây lan sò in vitro ........................................................................................... 42 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số lá của cây lan sò in vitro ........................................................................................... 42 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trƣởng chiều cao ix của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 45 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi .................................................................................................... 46 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự sinh trƣởng chiều cao của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 47 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 48 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1: Các giai đoạn phát triển của hoa lan sò in vitro ................................... 39 Hình 4.2: Hoa lan sò in vitro ................................................................................ 40 Hình 4.3: Những biểu hiện bất thƣờng của hoa lan sò in vitro ............................ 41 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA trên sự tạo chồi và gia tăng số lá của cây lan sò in vitro ........................................................................................... 44 Hình 4.5: Các giai đoạn phát triển của hoa bắt ruồi in vitro ................................ 49 Hình 4.6: Cấu tạo hoa và các cơ quan bên trong của nụ hoa bắt ruồi in vitro ..... 50 B2 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vòng đời của một thực vật bắt đầu từ hạt. Hạt nẩy mầm hình thành chồi và rễ. Cây phát triển sinh dƣỡng đến một giai đoạn nhất định thì ra hoa, thụ phấn và tạo hạt. Giai đoạn tạo hạt cũng chính là giai đoạn kết thúc một vòng sinh trƣởng và phát triển của thực vật và khi hạt nẩy mầm sẽ mở ra một vòng đời mới. Thế giới thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, có những cây hoàn thành vòng đời trên chỉ trong ba tháng đến một năm nhƣng cũng có những cây phải mất đến vài năm. Do vậy, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, con ngƣời đã dần dần chuyển sang nhân giống cây trong ống nghiệm để rút ngắn vòng đời của thực vật, từ đó có thể kiểm soát hầu hết cơ chế của các quá trình diễn ra trong cuộc sống của thực vật. Việc nghiên cứu điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm cũng là một phần của mục đích trên. Nếu con ngƣời hiểu rõ cơ chế và có thể điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm dễ dàng thì đây sẽ là một công cụ rất hữu ích trong việc nghiên cứu sinh lý thực vật; rút ngắn giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng ở các thực vật có giai đoạn sinh trƣởng dài, làm cây ra hoa sớm; và một đóng góp to lớn cho nông nghiệp đó là xây dựng một hệ thống có ý nghĩa trong vi nhân giống, cải thiện giống cây trồng, phục hồi các tính trạng quý, tạo cây có năng suất cao, chất lƣợng tốt,… Hơn nữa, trong cuộc sống hiện đại mà hoa kiểng là một phần không thể thiếu của con ngƣời thì việc thƣơng mại hóa hoa trong ống nghiệm rất có tiềm năng phát triển trong tƣơng lai do hoa trong ống nghiệm có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ là nhỏ, gọn, không tốn diện tích, không tốn công chăm sóc,…rất thích hợp để trang trí trong những văn phòng làm việc hiện đại cũng nhƣ làm quà tặng. 2 Cùng mục đích trên và đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm, dƣới sự hƣớng dẫn của TS.TRẦN THỊ DUNG, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) VÀ CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) 1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để cây lan sò và cây bắt ruồi ra hoa trong ống nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của cây lan sò và cây bắt ruồi in vitro: - Trong môi trƣờng nuôi cấy có sự thay đổi nồng độ chất dinh dƣỡng và nồng độ chất kích thích sinh trƣởng. - Trong các điều kiện ánh sáng khác nhau. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Giới thiệu khái quát về cây lan sò  Nguồn gốc phân loại [15] Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Spermatophyta Ngành phụ : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Asclepiadaceae Giống : Dischidia Tên khoa học : Dischidia pectinoides Pearson / Tên tiếng Việt : Lan sò Lan sò có nguồn gốc từ Philippines, là một loại hoa kiểng mới tại Việt Nam.  Đặc điểm hình thái và sinh học [25] Lan sò là một loại dây leo nhỏ, sống hàng năm, có khả năng phát triển đến chiều dài khoảng 250 cm. Lá đơn, mọc đối hoặc xen kẽ. Cây phân nhánh từ gốc và nách lá. Một số lá của lan sò phồng to lên trông giống nhƣ một con sò. Hoa nhỏ màu đỏ hồng xuất hiện ở nách lá vào mùa xuân. Lan sò đƣợc trồng từ cây con in vitro hoặc từ các nhánh con có rễ. Lan sò phát triển tốt trên các loại giá thể là dƣơng xỉ, vỏ cây bần, xơ dừa hoặc những nhánh cây gỗ trôi dạt,…không phát triển hoặc phát triển chậm trên giá thể là đất. Lan sò là cây ƣa bóng râm, dƣới ánh nắng trực tiếp có thể dẫn tới hiện tƣợng cháy sém lá, phát 4 triển tốt trong điều kiện ít ánh nắng mặt trời tốt nhất là ánh nắng nhẹ lúc sớm mai và lúc cuối buổi trƣa. Ngoài ra đây cũng là một loại cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh. Nhu cầu nƣớc của cây không cao, chỉ cần tƣới phun sƣơng cho cây 1-2 lần trong một tuần. Nguồn thức ăn của cây đƣợc tổng hợp từ không khí do vậy chỉ cần bổ sung thêm cho cây một lƣợng ít phân bón mỗi tháng một lần.  Một số loại lan sò [18, 33] Dischidia ovata: có nguồn gốc từ Úc, đƣợc phát triển nhƣ là một loại thực vật trồng trong nhà, là một loại dây leo có rễ bám có khả năng phát triển đến chiều dài 2m. Lá hình oval, mọng nƣớc, màu nâu đỏ khi phát triển dƣới ánh nắng mặt trời. Khi lớn, cây có những cụm hoa nhỏ màu đỏ hồng. Đây là loại cây ƣa bóng râm, phát triển trong điều kiện khí hậu ẩm ƣớt. Cây đƣợc nhân giống bằng hạt tƣơi hoặc giâm cành. Cây giâm cành ở giai đoạn vƣờn ƣơm cần độ ẩm rất cao. Dischidia platyphylla: xuất xứ từ vùng đảo Philippine, dài khoảng 2m. Lá mọc đối; một vài lá nhỏ, màu xanh xám; hình oval. Hoa màu vàng sẫm có thể lớn đến khoảng 4mm đƣờng kính, phát triển từ nách lá có hình dạng nhƣ là bình chứa nƣớc. Nhân giống bằng hạt hoặc cành. Điều kiện thích hợp cho loại thực vật này phát triển là nhà kính có độ ẩm và nhiệt độ cao, khí hậu mát mẻ. Dischidia nummularia: dài khoảng 3m, dạng dây leo bện chặt vào thân cây chủ. Lá màu xám bạc. Hoa nhỏ màu trắng dạng ống mọc thành cụm tròn đồng tâm có một vòng lông thƣa phía trong. Nhân giống sử dụng hạt hoặc nhánh trƣởng thành trong điều kiện ẩm ƣớt và khí hậu ấm áp. Dischidia imbricata: có nguồn gốc từ vùng rừng mƣa của Malaysia cũng là một dạng dây leo, bám và phát triển rễ từ các nách lá bất cứ nơi nào tiếp xúc với giá thể để củng cố độ bám và bao phủ hầu nhƣ toàn bộ giá thể. Hoa của loại cây này có dạng nhƣ là một cái bình trà nhỏ. Đây cũng là loại cây ƣa bóng râm, phát triển tốt trong nhà kính có nhiệt độ ấm áp và có độ ẩm thích hợp. 5 2.1.2 Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi  Nguồn gốc phân loại [10] Giới : Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Rosidae Bộ : Caryophyllales Họ : Droseraceae Giống : Drosera Tên khoa học : Drosera burmanni Vahl (1794) Tên tiếng Việt : Cây bắt ruồi, Trƣờng lệ Burman, Bèo đất, Trói gà Trong tự nhiên, họ bắt ruồi Droseraceae gồm có 4 chi và khoảng 200 loài, phân bố khắp thế giới. Phổ biến nhất là ở Mỹ. Ở Việt Nam, cây bắt ruồi đƣợc tìm thấy ở khu bảo tồn Bình Châu- Phƣớc Bửu, Đà Lạt và một vài nơi ở Miền Trung. Chúng chủ yếu mọc hoang dại, dọc đƣờng đi, ít đƣợc con ngƣời quan tâm.[3]  Đặc điểm hình thái và sinh học [1, 16, 19] Cây bắt ruồi (Drosera burmanni) là dạng cây cỏ nhỏ, sống nhất niên, bò sát đất. Thân ngắn, rễ giả. Lá hình hoa thị, mọc chụm ở mặt đất, có cuống bụng, dạng trứng ngƣợc (đầu nhỏ ở phía cuống lá) hoặc dạng nêm, cuống nhỏ dài 10-15 mm, có nhiều lông tuyến ở phía trên. Lá có thể sập lại đƣợc để bắt sâu bọ đậu vào lá. Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nẩy chồi con từ gốc thân hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt. Cây có hoa quanh năm. Hoa nhỏ màu trắng, vàng hoặc tím nằm trên một cuống chung dài mọc thẳng từ giữa đám lá thấp mang hoa lƣỡng tính gọi là phát hoa. Phát hoa cao khoảng 10 cm có từ 3-10 hoa; hoa mẫu 5; 5 nhị hoa, ngắn hơn đài hoa; bầu nhị đơn, 5 vòi nhụy. Quả mỡ, chứa nhiều hạt nhỏ. Hệ thống lông tuyến trên lá tiết ra nhiều chất keo rất nhầy. Khi những con côn trùng nhỏ nhƣ ruồi, muỗi đậu vào lá, chúng sẽ bị dính chặt vào, lá từ từ cuộn mép 6 lại, đƣa con mồi vào giữa lá, sau đó dịch tiêu hóa sẽ đƣợc tiết ra và con mồi dần dần bị tiêu hóa. Cây bắt ruồi đƣợc nhân giống bằng hạt, tách chồi hoặc bằng cây con nuôi cấy in vitro. Môi trƣờng phát triển cây bắt ruồi ngoài vƣờn ƣơm thích hợp là: ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn với bột than gỗ, độ ẩm khoảng 50-70%, nhiệt độ 18-240C, là loại cây ƣa ánh sáng nên cần nhiều ánh sáng trực tiếp và cây phải đƣợc chiếu sáng tối thiểu từ 6-8 h ngày. Ở nơi có cƣờng độ ánh sáng cao cây phát triển tốt và có màu đỏ.  Các loại cây bắt ruồi Drosera indica L. (gọng vó): lá hẹp và dài, mọc toả ra nhƣ gọng vó, cũng có nhiều lông nhày. Phân bố những vùng đất lầy, ruộng nghèo. [1] Drosera spatulata: còn gọi là bắt ruồi lá hình thìa, là một loài cây thân thảo với các lá hình thìa đƣờng kính 12-25 mm. Rễ chùm, đƣờng kính mỗi sợi rễ tới 0,2 mm. Hoa mọc thành chùm khoảng 2-30 hoa nhỏ, cuống hoa dài khoảng 2-30 cm, phủ đầy lông. Các cánh hoa màu tím hồng. Hạt hình elip- trụ hoặc elip- trứng, màu từ nâu sẫm đến đen, dài 0,4 mm, đƣờng kính 0,06- 0,12 mm. Loài bắt ruồi này phân bố chủ yếu ở châu Á, từ miền bắc Nhật Bản, tới Australia và New Zealand. [11] 2.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ RA HOA NGOÀI TỰ NHIÊN [8] Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi chất lƣợng đặc trƣng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời. Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là bƣớc chuyển quan trọng đánh dấu bƣớc phát triển mới của thực vật và có ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật. Hoa đƣợc thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; tƣợng hoa; tăng trƣởng và nở hoa. Sự chuyển tiếp ra hoa Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh tiền hoa. Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chỉ biết đƣợc bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dƣỡng (tổng hợp RNA, ribosom, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh. Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra 7 đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dƣỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dƣới ngọn của mô phân sinh tiền hoa. Sự tƣợng hoa Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày để dẫn tới sự tƣợng hoa, tức sự sinh cơ quan hoa (quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi). Sự phát triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dƣới kính lúp, qua lát cắt dọc). Sự tăng trƣởng và nở hoa Khi sự tƣợng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể tiếp tục tăng trƣởng và nở (trƣờng hợp các cây nhất niên). Tuy nhiên nụ hoa có thể vào trạng thái ngủ (ví dụ: nụ hoa Lilas đƣợc tạo vào cuối mùa hè, nhƣng hoa chỉ nở vào mùa xuân nhờ nhiệt độ lạnh mùa đông gỡ trạng thái ngủ).[8] 2.2.1 Độ tuổi cây [8] Sự ra hoa (phát triển hoa) là bƣớc chuyển quan trọng trong đời sống thực vật. Để một chồi dinh dƣỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trƣởng thành ra hoa. Trạng thái này có thể rất sớm ở Arachis (phát thể hoa thành lập ở nách tử điệp), khoảng 13 lóng ở cà chua, 5-7 năm ở các cây ăn trái, và khoảng 50 năm ở cây sồi. Hơn nữa, vài thực vật cần mùa đông hay quang kỳ thích hợp mới đạt tới trạng thái này. Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau, từ hột tới hột, trong vòng vài tháng tới vài năm, thậm chí ở một số cây chỉ khoảng 15 ngày nhƣ vài cây vùng sa mạc. 2.2.2 Môi trƣờng 2.2.2.1 Tình trạng dinh dƣỡng [8] Mỗi thời kỳ sinh trƣởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau. Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dƣỡng không nhiều nhƣng phải cân đối. Lƣợng dinh dƣỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép: Giới hạn trên: là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dƣỡng chiếm ƣu thế. Giới hạn dƣới: là giới hạn mà dƣới đó, dinh dƣỡng không đủ cho sự ra hoa. 8 Vì vậy, trong thực tế sự tỉa cành thích hợp sẽ kích thích mạnh sự phát triển hoa. Thông thƣờng, sự dinh dƣỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dƣỡng và ngƣợc lại, sự dinh dƣỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa. Do đó, việc lựa chọn tỉ lệ C/N cao thích hợp sẽ kích thích sự ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dƣỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trƣởng của thực vật. Tóm lại, có nhiều yếu tố dinh dƣỡng ảnh hƣởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dƣỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dƣỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N. 2.2.2.2 Nhiệt độ [1] Nhiệt độ môi trƣờng cũng ảnh hƣởng đến sự ra hoa trong đó có nhiệt độ thực tại và tổng tích ôn. Nhiệt độ thực tại: mỗi thực vật thƣờng có một nhiệt độ thích hợp để ra hoa. Tổng tích hàn: một số thực vật không phụ thuộc vào nhiệt độ thực tại mà phụ thuộc vào tổng nhiệt độ tích luỹ đƣợc trong suốt giai đoạn sinh trƣởng. Khi đạt đƣợc một tổng nhiệt độ thích hợp thì trổ hoa. 2.2.2.3 Quang kỳ [8] Quang kỳ là sự xen kẽ giữa sáng và tối trong giai đoạn 24 giờ (trong thực nghiệm, giai đoạn này có thể dài hoặc ngắn hơn), và quang kỳ tính (quang chu kỳ) là phản ứng của thực vật đối với quang kỳ tức là đối với sự biến thiên theo mùa của độ dài ngày. Độ dài ngày là một yếu tố quan trọng để điều khiển thời gian ra hoa. Đã có nhiều thí nghiệm chứng minh rằng độ dài ngày có ảnh hƣởng sâu sắc đối với sự ra hoa của thực vật. Thí nghiệm của Tournois (1912, Pháp) lần đầu tiên chứng minh cây gai dầu có khả năng ra hoa, trong nhà kính, nếu giai đoạn chiếu sáng đƣợc rút ngắn. Năm 1913, Klebs trên ví dụ của cây cỏ trƣờng sinh (Sempervivum) đã chỉ ra rằng có thể làm cây ra hoa vào mùa đông bằng cách chiếu ánh sáng bổ sung. 9 Garner và Allard (1920, Mỹ) thực hiện một hệ thống các thí nghiệm trên loại thuốc lá ra hoa vào mùa thu: Maryland mammoth. Bằng cách thay đổi nhiệt độ và quang kỳ (thay đổi chiều dài ngày và đêm), họ kết luận, ở thứ thuốc lá này, không phải nhiệt độ mà chính là quang kỳ ảnh hƣởng tới sự ra hoa: cây chỉ ra hoa nếu chiều dài ngày dƣới 13-14 giờ. Đây là cây ngày ngắn (CNN), giống nhƣ cây gai dầu. Nhƣ vậy, khi đạt tới tuổi trƣởng thành, nhiều thực vật phải chờ một dấu hiệu nào đó để tƣợng hoa, mà quan trọng nhất là quang kỳ. Dựa theo những quan sát và phân tích cách đáp ứng của thực vật đối với quang kỳ, ngƣời ta phân biệt cây theo quang kỳ nhƣ sau:  Cây bất định (CBĐ): có thể ra hoa bất chấp quang kỳ, miễn là giai đoạn sáng cho phép quang hợp đủ. Đặc trƣng cho các loại thực vật thuộc nhóm này là: cà chua, đậu Hà lan, phần lớn các thứ thuốc lá, bắp, Lilas, anh đào,…  Cây ngày ngắn (CNN): chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng ngắn hơn một giai đoạn sáng tới hạn C và giai đoạn tối dài hơn giai đoạn tối tối thiểu; giai đoạn tối không đƣợc gián đoạn (sự chiếu sáng trong giai đoạn tối, dù chỉ vài phút, sẽ cản sự ra hoa). Các cây tiêu biểu cho nhóm này là: gai dầu, đậu nành, tía tô, thƣợc dƣợc,…  Cây ngày dài (CND): chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng dài hơn giai đoạn sáng tới hạn C. Ví dụ: rau bi na có C = 13-14 giờ, thì là: 11-14 giờ. Trong nhóm này còn có: hành, cà rốt, cải đƣờng, sà lách, thuốc phiện, lúa mạch… Ngoài các nhóm cây nêu trên, còn một số cây không lệ thuộc quá chặt chẽ vào quang kỳ: trong quang kỳ thích hợp, chúng ra hoa nhanh chóng; trong quang kỳ không thích hợp, chúng vẫn ra hoa nhƣng chậm hơn. Đó là các cây thích ngày ngắn (vài thứ cúc, Cosmos, Euphorbia), hay các cây thích ngày dài (lúa mì, lúa mạch đen mùa xuân). Hiếm hơn, một vài loài có thể ra hoa trong đêm tối liên tục nhƣ huệ dạ hƣơng từ giò, khoai tây từ chồi trên củ. Một số cây có đồng thời hai giá trị tới hạn: một trên và một dƣới. Đây là các cây ngày dài- ngày ngắn hay cây ngày ngắn- ngày dài. 10 Vậy quang kỳ tác động lên cây nhƣ thế nào? Theo quan điểm của Allard và Garnar (1920) thì cây đáp ứng với các chiều dài tƣơng đối của ngày và đêm. Hanner và Bonner (1938) đã chứng minh rằng ở một số cây ngày ngắn Xanthium (C=15,5 giờ): cây không đáp ứng với chiều dài ngày cũng nhƣ chiều dài tƣơng đối của ngày và đêm, mà đáp ứng với chiều dài của giai đoạn tối, chính giai đoạn tối mới quan trọng. Các nhà nghiên cứu trong những năm 40 của thế kỷ XX đã phát hiện rằng sự ra hoa và các phản ứng khác đối với quang kỳ thực chất là do độ dài đêm chứ không phải do độ dài ngày kiểm soát. Thực nghiệm cho thấy thực vật đƣợc gọi là ngày ngắn cần có đêm tối liên tục. Nếu giai đoạn tối bị ngắt quãng bởi những cƣờng độ chiếu sáng thấp chỉ khoảng 3-5 lux trong thời gian 3-5 phút ở 7-9 giờ sau khi bắt đầu giai đoạn tối có thể đảo ngƣợc phản ứng ra hoa của cây. Ngƣợc lại, nếu giai đoạn sáng của cây ngày dài bị ngắt quãng bởi sự che tối thì điều này hoàn toàn không gây ảnh hƣởng tới khả năng ra hoa của cây ngày dài [2,8] Năm 1936, B.S. Moskov và M.K. Tsailakhian chứng minh rằng cơ quan tiếp nhận cảm ứng quang kỳ là lá. Những cành không có lá không ra hoa mặc dầu có tác động của quang kỳ thích hợp. Sự tác động của quang kỳ dù chỉ trên một lá cũng đủ để hình thành mầm hoa. Các lá non đã nở ra hoàn toàn mẫn cảm nhất. Tác nhân kích thích đƣợc hình thành trong lá dƣới ảnh hƣởng của quang kỳ thích hợp di chuyển vào điểm sinh trƣởng. Sau một số lƣợng chu kỳ cảm ứng nhất định cây mới ra hoa trong mọi chu kỳ quang. Tùy thuộc vào kiểu thực vật mà số lƣợng các chu kỳ cảm ứng khác nhau. Có những loài chỉ đòi hỏi một chu kỳ quang, song cũng có những loài cần đến 25 chu kỳ quang (đậu tƣơng). [8] Vào năm 1865, Sachs phát hiện ra rằng những lá cây để ngoài sáng sản xuất ra những chất hình thành hoa, chúng hiện diện ở hàm lƣợng rất nhỏ nhƣng đóng vai trò tiên phong trong sự ra hoa. Đến năm 1936, Chailakhyan đã nhận thấy ở cây Xanthium chỉ cần đặt một lá trong ngày ngắn (che tối), phần cây còn lại trong ngày dài, cây có thể ra hoa ở những vị trí khác nhau. Lá là nơi nhận cảm ứng và chồi là nơi phản ứng ra hoa, do đó phải có sự vận chuyển kích thích từ lá tới chồi [7] . Kích thích ấy có dấu hiệu hormon và đƣợc ông gọi là florigen – hormon ra hoa. 11 Giả thuyết về florigen đã đƣợc làm sáng tỏ qua việc tiến hành các thí nghiệm ghép: có sự truyền kích thích quang kỳ qua chỗ ghép, để kích thích sự ra hoa của cành không đƣợc cảm ứng. Hơn nữa, chất trích từ cây ngày ngắn Xanthium hay cây bất định hƣớng dƣơng, đang ra hoa, nếu đƣợc chích vào cây Xanthium chƣa đƣợc cảm ứng quang kỳ, có thể kích thích cây Xanthium này ra hoa. Từ các kết quả nhƣ vậy, ngƣời ta cho rằng: florigen là hormon chuyên biệt cho sự ra hoa, có tính phổ biến ở thực vật và không có tính hữu cực. Nhƣ vậy, cây chỉ ra hoa khi nào tích lũy đủ lƣợng florigen cần thiết cho sự ra hoa dƣới tác dụng của quang kỳ.[8] Các thí nghiệm trên đã dẫn tới kết luận về sự tồn tại của hormon đặc hiệu chuyên biệt gây ra sự chuyển cây sang trạng thái ra hoa. Vì sự chuyển sang trạng thái ra hoa có thể do sự ghép lá lấy từ cây đang ra hoa gây nên tùy thuộc vào phản ứng chu kỳ quang của nó, ngƣời ta giả định hormon đó giống nhau đối với tất cả các loài cây. Tuy nhiên, quan điểm đó đã bị lung lay một ít vì đã có thí nghiệm trong đó xử lí hormon GA làm cho thực vật ngày dài ra hoa ở điều kiện ngày ngắn và không gây ảnh hƣởng gì đối với cây ngày ngắn [8]. Chailakhyan (1936- 1977) đã đƣa ra giả thuyết chất tạo hoa có chứa hai thành phần gồm: gibberellin và anthesin để hóa giải mâu thuẫn này. Theo ông tùy loài thực vật mà một trong hai thành phần của florigen luôn luôn hiện diện đầy đủ trong mọi cơ quan thực vật, thành phần thứ hai chỉ đƣợc tạo ra trong điều kiện quang kỳ cảm ứng. Một thực vật trƣởng thành ra hoa khi hội đủ hai thành phần này. Quang kỳ và số chu kỳ cảm ứng thay đổi theo loài là để điều chỉnh tỉ lệ giữa hai thành phần này (gibberellin/ anthesin) ở mức độ thích hợp từ đó kích thích cây ra hoa. [8] Những thí nghiệm trên đây đã khẳng định sự hiện diện của florigen nhƣng bản chất và cơ chế tác động thực sự của florigen đối với sự hình thành ra hoa của cây vẫn còn là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học. Gần đây, với tiến bộ về phƣơng pháp phân tích với độ nhạy cao có thể phát hiện sự hiện diện của những hợp chất ở những nồng độ rất nhỏ đã mở ra hy vọng tìm ra florigen. Kết quả phân tích cho thấy, ngoại trừ đƣờng, trong libe còn chứa những phân tử nhỏ, peptide, protein (Fisher và ctv, 1992; Sakuth và ctv, 1993; Marentes và Grusak, 1998; Xoconostle- 12 Cazares và ctv, 1999; Kehr và ctv, 1999), và acid nucleic (Kühn và ctv, 1997; Ruiz- Medrano và ctv, 1999). Vì vậy florigen cũng có thể đƣợc dự đoán là một peptide, 1 protein, 1 nucleic acid, hay 1 phân tử nhỏ. Vì vậy chỉ có những phân tích về thành phần của nhựa libe một cách tỉ mỉ hơn mới có thể trả lời chính xác thành phần tự nhiên của florigen là gì và đây cũng là nhiệm vụ của công nghệ sinh học thực vật trong tƣơng lai. [14,24] Năm 1935, Flint và Mcalister thấy rằng sự nẩy mầm của hạt cải xà lách đƣợc kích thích bởi ánh sáng đỏ nhƣng bị cản bởi ánh sáng đỏ xa (Fr). Năm 1946, Borthwick và Hendricks chứng minh hiệu ứng đối nghịch của R (660nm) và Fr (730nm) trên sự ra hoa Xanthium pennsylvanicu. Năm 1952, Borthwick và Hendricks lặp lại thí nghiệm của Flint và Mcalister và nhận thấy rằng hiệu ứng ánh sáng có những đặc tính giống nhau trên hai hiện tƣợng nẩy mầm và ra hoa và hai ông nhận định rằng: do yêu cầu thấp về năng lƣợng nên không thể có hai sắc tố mà đơn giản hơn chỉ có hai dạng dễ biến đổi qua lại của cùng một sắc tố họ gọi là phytochrom gồm có dạng Pfr (hoạt động) đƣợc sinh ra dƣới hiệu ứng của R qua con đƣờng quang hóa có tác dụng kích thích nẩy mầm hay cản ra hoa, và dạng Pr (không hoạt động) đƣợc sinh ra dƣới hiệu ứng của Fr. Từ đây xuất hiện hai thuyết về hoạt động của phytochrom đối với quá trình ra hoa của thực vật là thuyết “đồng hồ cát” và thuyết “đồng hồ sinh học”. Tuy nhiên, hai thuyết này chƣa thuyết phục bởi chƣa giải thích đƣợc một số trƣờng hợp đối với các loài thực vật khác. Gần đây, ngƣời ta hƣớng sang xem xét đến nhiều yếu tố môi trƣờng sung quanh. Các yếu tố môi trƣờng có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp trên sự ra hoa: quang kỳ đƣợc nhận bởi lá trƣởng thành, nhiệt độ bởi cả thực vật (riêng sự thọ hàn đƣợc nhận chủ yếu bởi ngọn chồi), nƣớc bởi hệ thống rễ,…Các yếu tố này tƣơng tác mạnh trong sự ra hoa, và mỗi yếu tố có thể làm thay đổi giá trị ngƣỡng của những yếu tố khác. Sự điều hòa chuyển tiếp ra hoa bằng tín hiệu môi trƣờng có ảnh hƣởng quan trọng đảm bảo cho sự ra hoa đồng loạt và giao phối cùng loài của hầu hết các loài thực vật, hoàn tất sự sinh sản hữu tính dƣới các điều kiện bên ngoài thích hợp. 13 Cho đến nay cơ chế của sự ra hoa trên thực tế vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ và vẫn còn gây nhiều thắc mắc tranh cãi đối với những ngƣời làm nghiên cứu khoa học. Tuy nhiên, những thí nghiệm trên đây đã phần nào hé mở và đƣa ra những hƣớng đi mới để chúng ta có thể đi sâu nghiên cứu một cách rõ ràng hơn nữa cơ chế và các yếu tố ảnh hƣởng trên sự ra hoa ở thực vật. 2.2.2.4 Hiện tƣợng xuân hóa (hay sự thọ hàn) [8] Hiện tƣợng xuân hóa ở thực vật là hiện tƣợng cảm ứng thực vật nẩy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất định) đặc biệt là thực vật ôn đới. Điều này đã đƣợc chứng minh qua thí nghiệm của Lyssenko (1928) trên giống lúa mì Triticum sativum. Đây là giống lúa mì gồm hai thứ: thứ mùa đông hạt gieo vào mùa thu, cây mầm trải qua mùa đông và tăng trƣởng trong mùa xuân, sau đó cây ra hoa vào mùa hè năm sau; thứ mùa xuân hạt đƣợc gieo vào mùa xuân, cây tăng trƣởng và ra hoa trong mùa hè (cây mầm không chịu đƣợc mùa đông). Nhƣ vậy, thứ mùa đông phải trải qua nhiệt độ lạnh mùa đông mới có thể cho hoa, nếu gieo vào mùa xuân, cây vẫn ở trạng thái dinh dƣỡng và không cho hoa trong mùa hè. Trên cơ sở đó, Lyssenko đã tiến hành thí nghiệm nhƣ sau: ông đã cho làm ẩm hạt thứ mùa đông (tới 50% trọng lƣợng khô), sau đó đặt hạt trong phòng lạnh (1-200C), trong một tháng, thì các hạt này có thể gieo trong mùa xuân, và cây ra hoa nhƣ thứ mùa xuân với năng suất cao. Với kỹ thuật này, cây không cần qua mùa đông và ngƣời nông dân không phải làm việc vất vả. Đó là kỹ thuật thọ hàn hay xuân hóa do Lyssenko đề ra và đặt tên, và đã đƣợc áp dụng trên hàng triệu hecta, từ năm 1935, ở Liên Xô. Nhƣ vậy, dựa vào yêu cầu của sự thọ hàn có thể phân thực vật ra làm 3 loại: Cây cần thọ hàn tuyệt đối (thƣờng có dạng hoa hồng): phải trải qua một thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thƣờng là cây hai năm ( cải đƣờng, cà rốt,…); cây nhiều năm (Lolium, Dactylis glomerata,…);… Cây cần thọ hàn không bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu đƣợc thọ hàn): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi có 7 lá nếu hạt đƣợc thọ hàn, nhƣng cần 16-25 lá nếu không đƣợc thọ hàn. 14 Cây không cần thọ hàn: cây một năm không qua mùa đông, cây đa niên tƣợng hoa trƣớc mùa đông. Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt độ thấp là phôi hay chồi. Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh của phôi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đó cũng đƣợc xuân hóa. Ngoài ra cũng có một số thí nghiệm cho thấy rằng đỉnh sinh trƣởng cũng là nơi tiếp nhận xử lý lạnh. Nếu ghép đỉnh sinh trƣởng của cây đã xuân hóa vào cây chƣa xuân hóa thì sẽ xảy ra phản ứng ra hoa y nhƣ chúng đã đƣợc xuân hóa. Tuy nhiên cho đến lúc này thì cơ chế của quá trình xuân hóa vẫn chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. [2] Tùy theo loại cây mà độ tuổi mẫn cảm với xuân hóa của thực vật có khác nhau. Ở ngũ cốc giai đoạn hiệu quả nhất là lúc nẩy mầm, thậm chí ở giai đoạn bảo quản hạt giống. Ở các thực vật khác thì giai đoạn mẫn cảm nhiệt độ sảy ra ở một thời kỳ sinh trƣởng của cây: giai đoạn cây con, giai đoạn trải lá bàng (bắp cải). Chính vì vậy mà những cây hai năm thì cần một mùa đông cây sinh trƣởng trong điều kiện nhiệt độ thấp. Năm 1948, Melchers và Lang đã tiến hành thí nghiệm ghép giữa cây hai năm không thọ hàn và cây hai năm đã thọ hàn, cho thấy kích thích ra hoa. Từ đây đã xuất hiện quan niệm về hormon xuân hóa đặc hiệu gọi là “vernalin” đƣợc truyền qua chỗ ghép và không đặc hiệu cho loài. Vậy bản chất của “vernalin” là gì? Sự thọ hàn thƣờng đi cặp với sự gia tăng gibberellin, nhóm chất làm dễ sự ra hoa ở vài loài hoa hồng. Các chất cản sinh tổng hợp gibberellin đàn áp hiệu ứng thọ hàn. Tuy nhiên, giả thuyết vernalin là gibberellin là khó chấp nhận vì gibberellin chỉ giúp sự kéo dài lóng ở các thực vật mà các lóng ngắn là sự cản trở duy nhất của sự ra hoa và gibberellin vẫn kích thích ra hoa ở một số cây hai năm khi không trải qua xử lý lạnh. Vậy cũng giống florigen, gibberellin không thể là vernalin - hormon xuân hóa mà chỉ có thể là hormon hoạt tính của vernalin. Trong cây tồn tại chất mà biến đổi thành tiền chất của vernalin trong điều kiện lạnh, sau đó tiền chất này biến đổi thành vernalin và ở nhiệt độ ấm áp, nó quay trở lại chất ban đầu. Do đó trong một số 15 trƣờng hợp điều kiện môi trƣờng không thuận lợi đặc biệt là nhiệt độ cao sẽ xảy ra hiện tƣợng phản xuân hóa. [2,8] Việc hiểu biết ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp hay hiện tƣợng xuân hóa đến sự phát triển của cây có ý nghĩa trong sản xuất. Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ thấp thích hợp, ngƣời ta có thể biến lúa mì đông thành lúa mì xuân, biến cây hai năm thành cây một năm. Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trƣởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch. [2] 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ RA HOA IN VITRO Ngay từ khi ra đời ngành công nghệ sinh học nhất là công nghệ sinh học thực vật đã có những đóng góp to lớn trong lĩnh vực nông nghiệp, góp phần cải thiện đáng kể sản lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời bảo tồn và góp phần làm phong phú thêm hệ thực vật trên trái đất. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật có vai trò đáng kể trong những thành quả đã đạt đƣợc ở trên thông qua việc nghiên cứu sinh lý các quá trình sinh trƣởng và sinh sản của thực vật. Hiện nay, việc nghiên cứu sinh lý thực vật đƣợc tập trung ở thời kỳ cuối trong vòng đời của thực vật đó là giai đoạn ra hoa. Khả năng hình thành hoa in vitro của mẫu cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và bên ngoài, hoá học và vật lý nhƣng thật sự thì các yếu tố trên đều có ảnh hƣởng qua những con đƣờng rất phức tạp và không thể xác định đƣợc (Trần Thanh Vân ,1973; Trần Thanh Vân và ctv, 1974; Scorza và Janick, 1980; Croes và ctv, 1985; Lang, 1987; Compton và Vielleux, 1992). Sự ra hoa đƣợc xem là một quá trình điều hoà phức tạp bởi sự phối hợp của các yếu tố môi trƣờng và di truyền (Tisserat và Galletta, 1995). Những yếu tố đặc biệt quan trọng là độ tuổi, dinh dƣỡng, chất điều hoà sinh trƣởng, ánh sáng và pH của môi trƣờng nuôi cấy (Heylen và Vendrig, 1988). [38] 16 2.3.1 Độ tuổi cây Trong điều kiện in vitro, cây có thể ở trạng thái phát triển sinh dƣỡng mãi mãi mà không cần hoàn thành vòng đời nhƣ trong điều kiện in vivo. Tuy nhiên, đối với giai đoạn ra hoa, cả cây in vitro lẫn cây in vivo đều phải hội đủ các yếu tố cần thiết mới hình thành hoa hay nói cách khác thực vật phải trải qua giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng, đạt đến một giai đoạn trƣởng thành nhất định thì mới ra hoa. Thực vật còn non không ra hoa vì chúng chƣa có khả năng ra hoa hoặc đỉnh sinh trƣởng không đáp ứng với nhân tố tạo hoa (Lang, 1965; Hackett, 1985). Ở đây, độ tuổi của mẫu cấy ban đầu có thể có hoặc không ảnh hƣởng nhƣ là một yếu tố cần thiết cho sự ra hoa của cây in vitro. Demeulemeester và Deproft (1999) báo cáo rằng độ tuổi của cây mẹ có khả năng ảnh hƣởng lên sự ra hoa in vitro ở cây rau diếp xoăn. Tƣơng tự, ở cây hoa hồng, G. Y. Wang+ và cộng sự cũng nhận thấy cây mẹ hoa hồng còn trẻ và khỏe mạnh sẽ làm tăng sức sống và sự đồng đều của mẫu cấy trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng cảm ứng tạo hoa. Hơn nữa, thời gian của giai đoạn tiền nuôi cấy cũng ảnh hƣởng mạnh tới khả năng tạo hoa của cây hoa hồng sau khi đƣợc đƣa vào môi trƣờng cảm ứng. Ví dụ: nếu mẫu cấy hoa hồng đƣợc nuôi cấy 45 ngày trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng cảm ứng thì tỉ lệ hình thành hoa rất cao (49,2%), trong khi mẫu đƣợc nuôi cấy khoảng 25 hoặc 60 ngày trƣớc khi cảm ứng cho tỉ lệ hoa thấp hơn nhiều (5,9% và 9,2%). Đối với cây đậu xanh (Pisum sativum), tỉ lệ hoa tăng sau khi cấy chuyền lần hai, tỉ lệ hoa giảm và mất khả năng ra hoa sau lần cấy chuyền thứ ba trở đi. Trái lại, đối với cây cẩm chƣớng, các mẫu cấy dù đã trải qua trên bốn lần cấy chuyền mẫu cấy vẫn cho tỉ lệ hình thành hoa cao (Daksha et al, 1994). Cho đến nay vẫn chƣa có báo cáo rõ ràng nào về sự ảnh hƣởng của độ tuổi mẫu cấy đối với sự ra hoa của cây trong điều kiện in vitro. [21,22] 2.3.2 Dinh dƣỡng 2.3.2.1 Nồng độ đƣờng Đƣờng cần thiết cung cấp nguồn cacbon trong môi trƣờng nuôi cấy để cảm ứng sự ra hoa và phát triển hoa (Steinberg 1950; Takimoto 1960; Kimura 1963; Loo 1964b; Paulet 1965; Margara và Touraud 1968; Nitsch 1972; Dien và Tran Thanh 17 Van 1974; Handro 1977). Các loại đƣờng sucrose, glucose, maltose, lactose và raffinose đã đƣợc sử dụng thành công (Margara và Rancillac 1966; Nitsch và Nitsch 1967) trong đó sucrose là loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro nhất. Nồng độ đƣờng tối ƣu cho sự ra hoa khác nhau giữa các loài. Hiệu quả tác động của đƣờng hòa tan thể hiện thông qua việc tăng cƣờng hoạt động của con đƣờng trao đổi chất pentose phosphate (Nitsch và Nitsch 1967). Ngoài ra, hiệu quả của việc sử dụng đƣờng cũng chịu ảnh hƣởng của ánh sáng và sự xuân hóa trong tác động riêng biệt của chúng (Liverman và Bonner 1953; Baldev 1959; Pierik 1967b). [9] 2.3.2.2 Hàm lƣợng photpho và nitơ [1,22] Nhƣ chúng ta đã biết, nitơ là thành phần cơ bản của chất nguyên sinh trong tế bào, quyết định sự sinh trƣởng của cây. Ngoài ra, nitơ còn là thành phần cấu tạo của enzyme và diệp lục tố. Sự dinh dƣỡng giàu nitơ giúp cây phát triển sinh dƣỡng mạnh, cây cao lớn, lá xanh tốt; thiếu nitơ, lá nhỏ, vàng úa, cây cằn cỗi, phát triển chậm và ra hoa sớm. Trong nuôi cấy mô, nitơ đƣợc cung cấp thống qua các các muối nitrat (NO3 - )và muối amon (NH4 + ). Ngoài nitơ, phospho cũng là yếu tố không thể thiếu cho cây, có vai trò quan trọng trong tổng hợp nucleoprotein của nhân tế bào, vận chuyển năng lƣợng, tham gia vào cấu trúc màng, thúc đẩy sự phát triển rễ và làm cây phát dục nhanh. Do vậy, trong nghiên cứu ra hoa in vitro, môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là môi trƣờng ½ MS hoặc kết hợp giảm lƣợng nitơ và tăng lƣợng phospho. Điều này đã đem lại những kết quả đáng kể trong các nghiên cứu ra hoa in vitro. Ví dụ: ở cây Torenia, nếu loại bỏ NH4NO3 trong môi trƣờng sẽ làm tăng cƣờng sự biệt hóa nụ hoa của mẫu cấy trên môi trƣờng MS (Tanimoto và Harada, 1981); ở cây đậu xanh, khi giảm nồng độ NH4NO3 trong môi trƣờng MS còn 8,25g/ml thì tỉ lệ ra hoa cao nhất là 4,2 hoa/ chồi; ở Cymbidium và Ornithogalum nồng độ phospho cao kích thích sự ra hoa của cây; sự gia tăng lƣợng phospho gấp 2 lần trong môi trƣờng ½ MS (giảm N) làm cải thiện đáng kể tỉ lệ ra hoa của cây Brassica [30] 18 2.3.3 Các chất điều hòa sinh trƣởng Khi thực vật đạt đƣợc độ tuổi nở hoa, các yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ánh sáng và chất dinh dƣỡng có ảnh hƣởng đáng kể đến sự hình thành và biệt hóa chồi hoa (Lang, 1952; Salisbury, 1961; Evans, 1971). Những ảnh hƣởng này đƣợc thực vật cảm nhận gián tiếp thông qua các chất có tác dụng kích thích hay ức chế sự nở hoa tồn tại trong cơ thể chúng. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy sự nở hoa dƣờng nhƣ là kết quả của sự tƣơng tác giữa các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật nhƣ cytokinin, auxin, gibberellin, ethylene, acid abscisic (ABA) và những chất khác đã biết hoặc chƣa biết (Raghavan và Jacobs, 1961; Bernier và ctv, 1977; Wellensiek, 1977). Điều này càng thể hiện rõ hơn trong các nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm và các chất điều hòa sinh trƣởng thể hiện rõ vai trò quan trọng của mình. [9] 2.3.3.1 Cytokinins Cytokinin là một trong các chất điều hòa sinh trƣởng bắt buộc đƣợc sử dụng trong điều khiển ra hoa in vitro do có vai trò kích thích sự phân chia tế bào và hình thành cơ quan, tạo chồi và tăng trƣởng nụ nách thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trƣởng [2,20]. Ngoài ra, cytokinin còn thúc đẩy một số thực vật bậc cao chuyển sang giai đoạn sinh sản trong điều kiện in vitro (Dickens và Staden, 1988; Paek và ctv, 1989; Wang và ctv, 1993, 1997; Jumin và Nito, 1996; Jumin và Ahmad 1999). Cytokinin cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nụ hoa đƣợc báo cáo ở cả cây một lá mầm (Mohanram và Batra, 1970; Zhong và ctv, 1992) và hai lá mầm (Rastogi và Sawhney, 1987; Narasimhulu và Reddy, 1984). Cytokinin có thể cảm ứng tạo hoa khi sử dụng đơn lẻ (Duan và Yazawa, 1995; Jumin và Nito, 1996; Nadgauda và ctv, 1997; Jumin và Ahmad, 1999). Ở một số thực vật, để hoa đƣợc hình thành thì cần kết hợp cytokinin với auxin (Peeter và ctv, 1994), hay gibberellin (Rastogi và Sawhney, 1987) hoặc kết hợp cùng kinetin, GA3 và IAA (Luo và ctv (2000); Tepfer và ctv, 1966) [30]. Tuy cytokinin có vai trò quan trọng trong việc hình thành hoa in vitro nhƣng nó vẫn không thể cảm ứng sự nở hoa ở các mô thực vật còn non. Điều này cho thấy rằng ngoài cytokinin còn có yếu tố 19 khác liên quan đến hƣớng biệt hóa hoa của thực vật (Wardell và Skoog, 1969b; Scorza và Janick, 1980) [9] Trong các loại cytokinin thì 6_Benzyladenine (BA) và thidiazuron (TDZ) thƣờng đƣợc sử dụng nhất. TDZ là một chất điều hoà sinh trƣởng tổng hợp, không là dẫn xuất của cytokinin nhƣng có tác dụng nhƣ 1 cytokinin. Các sinh trắc nghiệm đƣợc thực hiện nhận thấy rằng TDZ có tác dụng gấp 4 lần hơn cytokinin. Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp từ mô. Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và những cấu trúc bất thƣờng. Ở nồng độ quá cao, TDZ cảm ứng hình th