Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ sinh thành, đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người. Em xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban chủ nhiệm, Thầy và Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Em xin trân trọng biết ơn: - TS. Phan Phước Hiền. - ThS. Mai Đình Trị. đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quí báu cho luận văn. - Cô Nguyễn Thị Huyên, phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Khoa Công Nghệ Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. - Ths. Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh Trần Kim Hùng Nguyên iv TÓM TẮT TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)". Đề tài được tiến hành tại - Phòng Hóa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và Phòng Hóa Lý-Phân Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. - Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường - Khoa Công Nghệ Môi Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN PHƯỚC HIỀN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Nhằm khẳng định một phần những công dụng dân gian trên một cách có khoa học và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Những kết quả đạt được: - Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin… - Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung môi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol. Sau khi chiết tách tiến hành loại dung môi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung môi. - Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Kết quả thu cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là MICSalmonella = 340 μg/ml MICE. coli = 330 μg/ml - Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol. v MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tóm tắt ...................................................................................................................... iv Mục lục ...................................................................................................................... v Danh sách các từ viết tắt ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .................................................................................................... x Danh sách các hình .................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Phần I. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) ................................................ 3 2.1.1.Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 3 2.1.3.Thành phần hoá học ................................................................................... 4 2.1.4.Tính chất dược lý ....................................................................................... 4 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian ........................................................... 4 2.1.4.2. Tác dụng sinh học ......................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn đường ruột ............................................................................................ 9 2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột ....................................................... 9 2.2.1.1. Định nghĩa ..................................................................................... 9 2.2.1.2. Hình thể ......................................................................................... 9 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy .......................................................................... 9 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học ............................................................. 9 2.2.1.5. Sức đề kháng ............................................................................... 10 vi 2.2.1.6. Độc tố .......................................................................................... 10 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ............................................................... 11 2.2.1.8. Phân loại...................................................................................... 12 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 13 2.3. Salmonella ......................................................................................................... 13 2.3.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 14 2.3.1.1. Hình thái...................................................................................... 14 2.3.1.2. Tính chất nuối cấy ....................................................................... 14 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học .......................................................... 15 2.3.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 15 2.3.1.5. Độc tố .......................................................................................... 15 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 15 2.3.1.7. Phân loại...................................................................................... 16 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 16 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 16 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thương hàn ...................................................... 17 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn ........................................... 18 2.3.3. Miễn dịch ................................................................................................ 18 2.3.4. Chuẩn đoán vi sinh vật bệnh thương hàn ................................................ 18 2.3.4.1 Cấy máu ....................................................................................... 18 2.3.4.2. Cấy phân ..................................................................................... 19 2.3.4.3. Chuẩn đoán gián tiếp .................................................................. 19 2.3.5. Phòng bệnh .............................................................................................. 20 2.3.5.1. Phương pháp phòng bệnh chung không đặc hiệu ....................... 20 2.3.5.2. Phương pháp phòng bệnh đặc hiệu ............................................. 20 2.3.6. Điều trị .................................................................................................... 20 2.4. Escherichia coli ................................................................................................ 21 2.4.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 21 2.4.1.1. Hình thái...................................................................................... 21 2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy ....................................................................... 21 2.4.1.3. Tính chất hoá sinh ....................................................................... 22 vii 2.4.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 22 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 22 2.4.1.6. Phân loại...................................................................................... 23 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 23 2.4.3. Chuẩn đoán vi sinh vật ............................................................................ 24 2.4.3.1. Chuẩn đoán trực tiếp ................................................................... 24 2.4.3.2. Chuẩn đoán gián tiếp .................................................................. 24 2.4.4. Phòng bệnh .............................................................................................. 24 2.4.5. Chữa bệnh ............................................................................................... 24 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 26 3.1. Vật liệu .............................................................................................................. 26 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................... 26 3.1.1.1. Nguyên liệu ................................................................................. 26 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................... 26 3.1.1.3. Hóa chất cần thiết ....................................................................... 26 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm ........................................ 27 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 28 3.2.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................... 28 3.2.2. Xác định độ ẩm ...................................................................................... 28 3.2.3. Xác định tro toàn phần ............................................................................ 28 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật .................................................... 28 3.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 28 3.3.2. Cách tiến hành ......................................................................................... 28 3.4. Phương pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa ........................ 34 3.4.1. Điều chế các loại cao ............................................................................. 34 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa ........................................................... 34 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 34 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol ............................................................... 34 3.4.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 34 3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa ........................................ 36 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập được ...................................... 36 viii 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ................................................................... 36 3.5.1. Chuẩn bị môi trường .............................................................................. 36 3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa ......................................................................... 36 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục ........................................................... 38 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy ................................................................................... 38 3.5.5. Thử nghiệm ............................................................................................ 39 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 4.1. Nguyên liệu........................................................................................................ 41 4.1.1. Xác định độ ẩm ....................................................................................... 41 4.1.2. Xác định độ tro ........................................................................................ 41 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ........................................................... 41 4.3. Cô lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa .......................................................... 43 4.3.1. Điều chế các loại cao............................................................................... 43 4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa ............................................................. 43 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 43 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol ............................................................... 43 4.3.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 43 4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa ............................................. 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S ............................................... 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh ............................................................................................ 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................... 51 I. Kết luận ................................................................................................................ 51 5.1. Khảo sát thành phần hóa học ............................................................................. 51 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn .................................................................. 51 II. Đề nghị ......................................................................................................................... 51 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S ...................................................................... 52 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S........................................................................ 53 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S ............................................................. 54 Phụ lục 4: Phổ 13C của hợp chất S ...................................................................... 55 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol .......... 56 ix CÁC TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer. IR : Infrared, hồng ngoại. MS : Mass Spectrometry, khối phổ. J : Hằng số ghép cặp. s : Singlet, mũi đơn. d : Doublet, mũi đôi. t : Triplet, mũi ba. q : Quartet, mũi bốn. m : Multiplet, mũi đa. SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase. SGPT : Glutamic pyruvic transaminase. LD50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể. x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa ....................... 4 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa ........................................................................ 6 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng .................................................................................. 7 Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng .............................................................................. 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng ................................................................................ 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol .................................... 8 Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa ........................................................................................... 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi .................................................. 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) ................................. 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml .............................................................................................. 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl3 trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml ............................................................................................. 50 Bảng 4.6: Kết luận ........................................................................................................ 50 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Cây Xuân Hoa ................................................................................................ 3 Hình 2.2: Salmonella typhimurium............................................................................... 14 Hình 2.3: Escherichia coli ............................................................................................ 21 Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn .................................................................................. 38 Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào ........................................ 40 Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S ................................................ 47 Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol ...................................... 48 Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ ............................................................................................ 49 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli ................................................................... 50 Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella ............................................................ 50 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ và biểu đồ Trang Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột ......................................................... 13 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ............... 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thô từ lá Xuân Hoa ................................... 35 Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa .................................. 46 Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi ........................................ 44 1 Phần I. MỞ ĐẦU 1.1 . Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thông dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa… Ở Trung Quốc người ta sử dụng rễ của cây này để chữa vết thương. Nguyễn Thị Lan Oanh và công sự đã thử nghiệm dịch chiết lá Xuân Hoa cho thấy lá Xuân Hoa không độc với cá chọi. Trần Công Khánh và cộng sự đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50. Hiện nay nhiễm khuẩn đường tiêu hóa diễn ra rất phổ biến. Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh dẫn đến nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây ra. Do đó tìm ra một nguồn vật liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và nhiễm khuẩn đường tiêu hoá nói riêng an toàn và hiệu quả hơn. Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: "Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đƣờng ruột của cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)". 1.2 . Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích - Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật các cấu tử hữu cơ có trong lá Xuân Hoa. - Chiết tách hợp chất hữu cơ từ lá Xuân Hoa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. - Khảo sát khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa. 2 1.2.1. Yêu cầu - Định tính sơ bộ một số cấu tử hữu cơ có trong lá cây Xuân Hoa theo phương pháp phân tích của trường Đại Học Dược Khoa Rumani. - Cô lập các loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol và cao nước. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory concentration) của các loại cao đã cô lập đối với hai chủng vi sinh vật đường ruột E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. - Chiết tách và tinh sạch được các hợp chất từ lá xuân Hoa và xác định cấu trúc hóa học của chúng. 3 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 2.1.1.Đặc điểm thực vật học [2],[7] -Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum. - Họ: Ô rô (Acanthaceae). - Tên thông thường: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Nhật Nguyệt, Tù Linh, Trạc Mã. - Phân bố: Việt Nam, Lào. 2.1.2 Đặc điểm hình thái [8],[11] Đây là một loài cây bụi, sống đa niên, thân non màu xanh lục, phần già hóa gỗ màu nâu, phân nhiều cành mảnh. Lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình lưỡi mác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm, rộng 3,5 - 5 cm, gốc lá hơi men xuống. Cụm hoa dài 10 - 16 cm, ở kẽ lá hoặc đàu cành, gồm các xim ngắn ở các mấu. Hoa lưỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nữa chiều dài của thuỳ, môi dướigồm 3 thùy to, thùy giữa của môi dưới có các chấm màu tím. Hai nhị sinh sản với chỉ nghị ngắn đính trên họng tràng, bao phấn đính gốc, mầu tím, hai nhị lép. Hai chỉ nhị bầu trên nhẵn dài khoảng 1,5 cm, hai lá noãn liền nhau tạo thành bầu hai ô; vòi nhị dài khoảng 2,5 – 2,7 cm, nửa dưới của vòi có lông, 2/3 của vòi trên có màu tím nhạt. Quả nang, hai ô, mỗi ô chứa hai hạt. Cây ra hoa từ tháng 4 – 5. Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm. Cây được trồng nhiêu nơi như một cây thuốc gia đình. Hình 2.1: Cây Xuân Hoa 4 2.1.3.Thành phần hoá học [1],[9],[13],[17],[19] Bằng các phản ứng định tính hoá học, đã sơ bộ xác định trong lá cây Xuân Hoa có chứa: acid hữu cơ, carotenoid, coumarin, đường tự do, phytosterol, flavonoid, saponin. Ngoài ra lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%). Đặc biệt hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25 – 150 mg% và 46 – 85 mg%). Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa còn giàu valin (29 – 1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin còn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hóa quan trọng. Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lượng vanađi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi) Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa Chất khoáng đa lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Chất khoáng vi lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Ca 875,5 Fe 38,75 Mg 837,6 Al 37,5 K 587,5 V 3,75 Na 162,7 Cu 0,43 Mn 0,34 Ni 0,19 Những nghiên cứu gần đây của Trần Công Khánh và cộng sự về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa đã phân lập được nhiều chất hữu cơ như: Phytol, poriferasterol, beta-D-glucoperanosyl-3-O-sitosterol… 2.1.4.Tính chất dƣợc lý 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian [8],[10] Ở Trung Quốc người ta dùng rễ của cây Xuân Hoa để chữa vết thương, đau loét dạ dày, suy nhược thần kinh. Ở Việt Nam cây Xuân Hoa đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo tài liệu truyền tay thì cây Xuân Hoa có một số tác dụng sau: - Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức. 5 - Chữa rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, lỵ, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân. - Chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não. - Chữa đau dạ dày, loét thành tá tràng, chảy máu đường ruột, viêm loét đại tràng, trĩ nội. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trướng, làm giảm đau khi bị ung thư gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp cho người bị huyết áp cao hoặc thấp. Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Người ta thường dùng lá tươi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nước, giã nát lấy nước uống hoặc nấu ăn. Liều lượng phụ thuộc vào từng bệnh, từng người; thông thường ăn từ 3 – 7 lá một ngày chia làm hai lần. Thời gian điều trị tùy thuộc vào bệnh, như khi bị rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, lỵ chỉ ăn 7 – 14 lá là khỏi; đái rắt, đái buốt, đái ra máu thì ăn 14 – 20 lá; viêm đại tràng co thắt thì ăn kết hợp với lá mơ lông trong bữa ăn, từ 1 – 2 tháng. Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn được dùng để chữa bệnh cho gia súc như chữa bệnh cho gà rù, chó cảnh sau khi đẻ cho ăn 1 – 2 lá, gà chọi sau khi chọi cho ăn 1 – 3 lá là hồi phục ngay. 2.1.4.2. Tác dụng sinh học [3],[4],[18] Năm 1999, Trần Công Khánh và cộng sự ở ĐH Dược Hà Nội thử nghiệm độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa trên chuột.  Thử độc tính cấp Cho chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa với các nồng độ khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột. Đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày chuột bằng bơm tiêm 1 ml có kim đầu tù. Quan sát đại thể các phủ tạng sau khi mổ chuột và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc: tim, gan, thận, dạ dày, ruột. + Kết quả: Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg trọng lượng chuột, sau khi uống thuốc và suốt qua trình thí nghiệm chuột thuốc không thay đổi trạng thái hoạt động. Chuột vẫn bò tới, bò lui, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi, rữa mặt… 6 Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng, chuột sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhưng sau 1 giờ trở lại bình thường, chuột nằm rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. Qua đêm, rải rác chuột có đi phân nát. Tất cả chuột ở các liều trên đều không chết. Chuột sống hoàn toàn khỏe mạnh sau 24 giờ. Sau 24 giờ giết ngẫu nhiên 3 chuột ở các liều: 0,83 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột, quan sát đại thể cho thấy các phủ tạng hoàn toàn bình thường. Quan sát vi thể cho kết quả trình bày ở bảng II.2 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa Cơ quan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 0,83 g/kg Cơ tim bình thường Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Quản cầu và các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Không có tổn thương thực thể ở các tạng. 9,19 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ. Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Có thoái hoá nhẹ ở gan. 11,5 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Có tổn thương nhẹ ở gan và thận + Kết luận: Cao toàn phần lá Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Chuột sống hoàn toàn qua 48 giờ. Như vậy trên độc tính cấp, cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan Tiến hành gây ngộ độc gan chuột nhắc bằng carbon tetrachloride (CCl4) với liều: 1 ml CCl4/kg thể trọng và 0,5 ml CCl4/kg thể trọng. Sau đó tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA), một sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; J.Robak và cộng sự. 7 Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA tính theo công thức: X = E x 30,8 Trong đó: X = hàm lượng MDA; E = độ hấp thu ở 532 nm; 30,8 = hệ số tắt phân tử. Kết quả: Kết quả đo MDA trong gan chuột được trình bày ở bảng II.3 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng Lô Thí nghiệm n (số chuột) ETB MDATB 1 Đối chứng 8 0,163 5,0296 2 Gây mô hình viêm gan, không dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,458 14,1156 3 Gây mô hình viêm gan, có dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,348 10,7091 Như vậy ở lô uống cao toàn phần Xuân Hoa hàm lượng MDA có giảm so với mô gây mô hình (giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091) + Hàm lượng men gan quá cao (AST, ALT), không đo được trên máy. + Xét nghiệm vi thể: chưa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do tác dụng điều trị của thuốc. Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng Lô Thí nghiệm n (số chuột) ETB MDATB 1 Đối chứng 8 0,1915 5,8982 2 Gây mô hình viêm gan, không dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,385 11,547 3 Gây mô hình viêm gan, có dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,203 6,2463 Kết quả cho thấy lô có uống cao toàn phần lá Xuân Hoa hàm lượng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 11,547 xuống còn 6,2463). Xác định hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng: 8 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhóm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng: Lô n (số chuột) AST (U/I) ALT (U/I) 1 8 270 432 2 12 9668 10878 3 8 8740 10533 Hàm lượng men gan có giảm nhưng chưa đáng kể. Xét nghiệm vi thể: lô chuột được uống cao toàn phần lá Xuân Hoa và gây mô hình, nhận thấy vùng hoại tử xung quanh tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ vẫn tồn tại, các tế bào ở các vùng thoái hóa đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hướng hồi phục. Kết luận: ở liều gây ngộ độc gan 1 ml CCl4/kg thể trọng, gan chuột bị hoại tử nặng, các giá trị AST, ALT tăng lên quá cao, không đọc được trên máy, nhưng hàm lượng MDA có giảm rõ rệt từ 14,1156 xuống còn 10,7091 và chưa thấy có dấu hiệu bình phục của tế bào gan. Với liều gây độc 0,5 ml/kg thể trọng, hàm lượng MDA cũng giảm rất rõ rệt, từ 11,574 xuống còn 6,2463, hàm lượng men gan cũng giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục của gan. Như vậy có thể sơ bộ kết luận: cao đặc toàn phần lá cây Xuân Hoa có tác dung ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hướng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm. Năm 2004, Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hòa đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang được sử dụng trị bệnh tiêu chảy heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lượt: Bột Xuân Hoa 92,86 %; Coli- norgen 90,48 %; Cotrimxazol 83,33 %. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14 %; 9,52 %; 14,29 %. Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với 2 loại kháng sinh Coli-nogen và Cotrimxazol Loại thuốc Số heo thử nghiệm Số luợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Số con % Số con % Số con % Bột Xuân Hoa 42 10 23,81 29 69,05 39 92,86 Coli- norgen 42 10 23,81 25 59,52 38 90,48 Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33 9 Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân heo bệnh sau khi điều trị cho thấy tác nhân gây bệnh là E. coli, không tìm thấy tác nhân gây bệnh khác như: Salmonella, Proteus và Pseudomonas. Ngoài ra Huỳnh Kim Diệu và cộng sự còn tiến hành thử nghiệm độc tính của cây Xuân Hoa trên chuột cho thấy: Không xác định được LD50: kết luận lá Xuân Hoa không có độc tính cấp diễn. Thử độc tính bán trường diễn: Sau 60 ngày tác động thuốc các chỉ tiêu sinh lý máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu bình thường. Và các chỉ số sinh hoá của gan và thận: SGOT, SGPT, Bilirubin toàn phần, Creatinin không khác biệt so với lô đối chứng. Tiến hành giải phẩu bệnh lý chức năng gan và thận: khảo sát vi thể nhận thấy mô gan và thận bình thường, không có hiện tượng hủy hoại tế bào gan và thận. Như vậy lá Xuân Hoa không gây độc tính bán cấp. 2.2. Vi khuẩn đƣờng ruột [3],[12] 2.2.1.Đại cƣơng về họ vi khuẩn đƣờng ruột 2.2.1.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi; không có men oxidase; len men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không; khử nitrat thành nitrit; có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân; không sinh nha bào. 2.2.1.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thước trung bình 2 - 4 μm x 0,4 - 0,6 μm. Một số loài hình thể không ổn định,có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 2.2.1.3.Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trong môi trường lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường; có thể phát triển thành váng trên bề mặt; nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy ống. 10 Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. - Dạng R: mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng. - Dạng M: hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lac dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau. 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hoá học Những tính chất sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: - Di động hoặc không di động. - Lên men hoặc không lên men một số loại đường. Hai loại thường được xác đinh nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. - Có hay không có một số enzym. Hai enzym thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hoá protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. - Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp, ví dụ khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons. Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta có thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đó vào họ này. Ngoài các tính chất đó, nhiều tính chất sinh vật hóa học khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae 2.2.1.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng sinh nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hoá lý đặc biệt của môi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 1000C và bởi các hóa chất sát khuẩn thông thường. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 11 2.2.1.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là lipopolysaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100.000 đến 500.000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, dể chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 1000C trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốt. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngọai độc tố như S.shiga, E.coli loại ETEC (enterotoxigenic E.coli). Ngoại độc tố của S.shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều; ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Kháng nguyên O là kháng nguyên thân của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên; poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc. Kháng nguyên O không bị phá hủy ở 1000C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẻ xãy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để 12 phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Kháng nguyên H có bản chất là protein, dể bị phá huỷ ở 1000C hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xãy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thàng không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt. kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.typhy). Kháng nguyên K, nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được khang nguyên này. 2.2.1.8. Phân loại Vấn đề phân loại của Enterobacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều. ngoài cách phân loại của Bergey có ba cách phân loại khác: Cách phân loại của tiểu ban về Enterobacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc tế, năm 1958, chia họ này thành 12 giống. 13 Cách phân loại của Kauffmann, năm 1966, chia Enterobateriaceae thành 3 tộc và 12 giống. Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14 giống.Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nó giúp ích nhiều trong chuẩn đoán vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học. Dưới đây là sơ đồ phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing. Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột Tộc I: Escherichieae Giống I: Escherichia. Giống II: Shigella. Tộc IV: Citrobactereae Giống I: Citrobacter Tộc VII: Yersinieae Giống I: Yersinia Tộc II: Edwardsielleae Giống I: Edwardsiella Tộc V: klebsielleae Giống I: Klebsiella Giống II: Enterobacter Giống III: Hafnia Giống IV: Serratia Tộc VIII: Erwinieae Giống I: Erwinia Tộc III: Salmonelleae Giống I: Samonella Tộc VI: Proteeae Giống I: Proteus Giống II: Morganella Giống III: Providencia 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiểu cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp… Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Bệnh lý ở các mô, các cơ quan khác nhau có thể là hậu quả của bệnh lý đường tiêu hoá, có thể song hành với bệnh lý ở đường tiêu hóa, nhưng cũng có thể chỉ biểu 14 hiện bệnh lý ở một cơ quan nào đó trong khi đường tiêu hóa vẫn hoàn toàn bình thường. 2.3. Salmonella [3],[12],[27] Mặc dù hiện nay người ta đã biết đến mấy chục loài đến hàng nghìn typ huyết thanh khác nhau thuộc giống Salmonella, S.typhi vẫn là loài được quan tâm nhiều nhất không những bởi vai trò gây bệnh của nó mà vì nó gắn liền với những mốc lịch sử quan trọng trong quá trình nghiên cứu về Salmonella nói chung và bệnh thương hàn nói riêng. Bệnh thương hàn đã được biết đến từ rất lâu. Y văn thế giới ghi nhận sự mô tả về bệnh này lần đầu tiên vào năm 1820 của Bretoneau. Năm 1880, Grafky đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản làm từ hạch của bệnh nhân bị chết vì bệnh thương hàn và ông cũng là người đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884. Năm 1896, Widal chứng minh rằng huyết thanh của bệnh nhân thương hàn có khả năng ngưng kết S.typi. Đây là cơ sở cho phương pháp chuẩn đoán huyết thanh học. Năm 1917, Felix đã mô tả kháng nguyên thân và kháng nguyên lông của Salmonella, đặt cơ sở cho phương pháp phân tích kháng nguyên của vi khuẩn. Năm 1935, Reilly đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của bệnh thương hàn. Ông chứng minh rằng hệ thần kinh thực vật có vai trò trong việc gây ra những tổn thương ở ruột. 2.3.1. Đặc điểm sinh học 2.3.1.1. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 μm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), rất di động, không có vỏ, không sinh bào tử. 15 Hình 2.2: Salmonella typhimurium 2.3.1.2. Tính chất nuôi cấy Có khả năng phát triển trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Rất dễ nuôi cấy, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ 60C – 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9. Trên môi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ môi trường đục đều. Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường không màu hoăc màu trắng sáng. Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng; trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh. 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hoá học Không lên men lactose (loài S.arizona lên men lactose chậm). Lên men đường glucose thường sinh hơi (trừ S. typhi). Sử dụng được citrat ở môi trường Simmons (trừ S. typhi và S. paratyphiA). Catalase (+), oxidase (-), urease (-). Lysin decarboboxylase (+) (trừ S. paratyphi A). ONPG (-), RM (+), VP (-). H2S (-) (một số chủng trong loài S. paratyphi A có khả năng sinh H2S). 2.3.1.4. Sức đề kháng Có thể tồn tại trong nước 2 – 3 tuần, trong phân 2 – 3 tháng. Trong nước đá có thể sống được 2 – 3 tháng. 16 Bị chết ở nhiệt độ 500C trong vòng 1 giờ hoặc 1000C trong vòng 5 phút. Với các thuốc sát khuẩn thông thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu diệt. 2.3.1.5. Độc tố - Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoăc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Peyer bị phù nề, đôi khi hoại tử. Nội độc tố có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella. - Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện nuôi cấy invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố. 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên Kháng nguyên O: Hiện nay đã tìm thấy gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Dựa trên kháng nguyên O người ta chia Salmonella thành các nhóm A.B,C,D… Mỗi nhóm mang một yếu tố kháng nguyên đặc hiệu nhóm. Mỗi loài mang một yếu tố khác nhau, những yếu tố đó cấu tạo thành công thức O của từng loài. Kháng nguyên H: Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. gallinarum và S. pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những loài Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Những loài có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép khi nuôi cấy chúng trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với kháng nguyên H thì chúng vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Dựa vào kháng nguyên H người ta chia Salmonella thành các serotyp (typ huyết thanh). Kháng nguyên H lai được chia thành hai phase: phase 1 đặc hiệu và phase 2 không đặc hiệu. Thường các chủng Salmonella đều có cả hai phase này (trừ S. typhi và S. paratyphi). Kháng nguyên K: Kháng nguyên K chỉ có ở S. typhy và S. paratyphi C và còn được gọi là kháng nguyên Vi (Virulence). Kháng nguyên Vi dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường. Tuy nhiên kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, trong trường hợp này vi khuẩn sẽ không ngưng kết mặc 17 dù trộn với kháng huyết thanh O đặc hiệu. Muốn cho hiện tượng ngưng kết O xuất hiện, cần phải làm nóng huyền dịch vi khuẩn (1000C trong 20 phút) để tách kháng nguyên K ra khỏi tế bào. Kháng nguyên Vi không tham gia trong việc gây bệnh. 2.3.1.7. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài và các typ huyết thanh. Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. typhy và các S. paratyphi A,B,C (typhoid = bệnh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột). Về sau, người ta thấy rằng, một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập ở nhiều loài động vật khác nhau. Vì những lý do đó, cuối cùng người ta gọi các loài mới phát hiện đuợc theo tên địa phương ở đó nó được phân lập như S. teheran, S. congo, S. london. Đến nay người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella. 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh Tùy theo từng loài, Salmonella có th