Khảo sát tinh dầu tần dày lá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA SƯ PHẠM
KHẢO SÁT TINH DẦU TẦN DÀY LÁ Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành: Sư phạm hóa học GV hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S Ngô Quốc Luân Mai Thị Anh Tú Lớp: Sư phạm Hóa học K31 Mã số SV: 2051766 Cần Thơ, 2009 LỜI CÁM ƠN: Sau 8 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được nhiều điều bổ ích và tích lũy được nhiều kiến thức quý báu về lĩnh vực mà em nghiên cứu. Do đó trong trang đầu luận văn này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Thầy Ngô Quốc Luân, người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tất cả quý thầy cô Bộ môn Hóa Học – Khoa Sư Phạm, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho đề tài của em được hoàn thành tốt hơn. Cha mẹ, gia đình đã ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em về tinh thần và vật chất giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tập thể lớp Sư Phạm Hóa K31 đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC:  Trang LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................................i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN MỤC LỤC .....................................................................................................................................ii TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI ...............................................................................................iv DANH SÁCH PHỤ LỤC ............................................................................................................v PHẦN I: MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 I. Lý do chọn đề tài: ................................................................................................................ 7 II. Một số nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu:.................................................... 7 III. Giới hạn của đề tài: .......................................................................................................... 8 IV. Những giả thuyết của đề tài: ........................................................................................... 8 V. Phương pháp và phương tiện nghiên cứu: ..................................................................... 8 VI. Các bước thực hiện đề tài: .............................................................................................. 8 PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 10 A – LÝ THUYẾT: ..................................................................................................................... 10 I. Tìm hiểu về cây tần dày lá: .................................................................................................. 10 I.1. Mô tả cây ......................................................................................................................... 4 I.2. Nơi sống và thu hái:...................................................................................................... 11 I.3. Công dụng của cây tần dày lá: ..................................................................................... 11 II. Tìm hiểu về tinh dầu: .......................................................................................................... 13 II.1. Trạng thái tự nhiên: ..................................................................................................... 13 II.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên: ........................................................................... 13 II.3. Quá trình tích lũy tinh dầu: ......................................................................................... 13 II.4. Tính chất lý – hóa của tinh dầu: ................................................................................. 14 II.4.1. Tính chất vật lý:........................................................................................................ 14 II.4.2. Tính chất hóa học ..................................................................................................... 14 II.4.3. Công dụng của tinh dầu ........................................................................................... 14 II.4.4. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên:..................................... 15 II.4.5. Các phương pháp sản xuất tinh dầu ........................................................................ 15 II.4.5.1. Phương pháp cơ hoc ...................................................................................... 15 II.4.5.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ................................................... 15 II.4.5.3. Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi ............................................. 16 II.4.5.4. Trích ly bằng dung môi không bay hơi : ...................................................... 16 II.4.5.5. Phương pháp trích ly bằng CO2 .................................................................... 16 II.4.5.6. Phương pháp sinh học ................................................................................... 17 III. Tìm hiểu về tinh dầu của cây tần dày lá:........................................................................ 17 B – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ: ................................................................................... 18 I. Dụng cụ và hóa chất:......................................................................................................... 18 I.1. Dụng cụ: ........................................................................................................................ 18 I.2. Hóa chất:........................................................................................................................ 18 II. Ly trích tinh dầu tần dày lá và xác định các chỉ số vật lí, chỉ số hóa học của tinh dầu: .......................................................................................................................................... 18 II.1 Ly trích tinh dầu tần dày lá .......................................................................................... 18 II.2. Xác định chỉ số vật lí, chỉ số hóa học của tinh dầu ................................................... 19 II.2.1. Đánh giá cảm quan ................................................................................................... 19 II.2.2. Xác định chỉ số vật lí................................................................................................ 19 II.2.3. Xác định chỉ số hóa học ........................................................................................... 20 III. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trong quá trình chưng cất: ........................................................................................................................................... 22 III.1. Khảo sát nguyên liệu xay và không xay ................................................................... 22 III.2. Khảo sát thời gian để héo nguyên liệu...................................................................... 22 III.3. Khảo sát thời gian chưng cất ..................................................................................... 23 III.4. Khảo sát lượng nước chưng cất................................................................................. 24 IV. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu................................................................ 25 V. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá............................. 26 V.1. Chuẩn bị....................................................................................................................... 26 V.2. Thí nghiệm................................................................................................................... 27 VI. Định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong cây tần dày lá........................... 29 V.1. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất sterol............................................................. 29 V.1.1. Đại cương về sterol .................................................................................................. 29 V.1.2. Một số thuốc thử dùng để nhận biết sterol ............................................................. 29 V.1.2. Định tính sterol......................................................................................................... 30 V.2 Khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavon............................................................. 31 V.2.1. Đại cương về flavon................................................................................................. 31 V.2.2. Thuốc thử flavon ...................................................................................................... 31 V.2.3. Thí nghiệm định tính flavon .................................................................................... 31 V.3. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất glucosid ........................................................ 32 V.3.1. Đại cương về glucosid ............................................................................................. 32 V.3.2. Thuốc thử định tính glucosid................................................................................... 32 V.3.3. Thí nghiệm định tính glucosid ................................................................................ 32 V.4. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất saponin: ....................................................... 33 V.4.1. Đại cương về saponin .............................................................................................. 33 V.4.2. Thí nghiệm định tính saponin.................................................................................. 33 V.5. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất tanin ............................................................. 34 V.5.1. Đại cương về tanin ................................................................................................... 34 V.5.2. Thuốc thử dùng để nhận biết tanin.......................................................................... 34 V.5.3. Thí nghiệm định tính tanin ...................................................................................... 35 V.6. Khảo sát sự hiện diện của hợp chất alkaloid ........................................................ 35 V.6.1. Đại cương về alkaloid .............................................................................................. 35 V.6.2. Một vài thuốc thử dùng để nhận biết alkaloid........................................................ 36 V.6.3. Thí nghiệm định tính alkaloid ................................................................................. 36 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 37 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................vi DANH SÁCH PHỤ LỤC: Phụ lục 1: Một số hình ảnh ghi lại trong thời gian thực hiện đề tài. Phụ lục 2: Bảng công thức cấu tạo các cấu phần trong tinh dầu tần dày lá. TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI: Tinh dầu xuất hiện và phát triển theo nền văn minh của nhân loại. Từ thời xa xưa, con người đã biết sử dụng trực tiếp các loại cây cỏ, hoa lá có mùi thơm trong các nghi lễ tôn giáo. Đến thời kì trung cổ đại tại châu Âu, những hợp chất thiên nhiên mới được sử dụng rộng rãi. Hiện nay, tinh dầu đang là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp trên thế giới và ngày càng được ứng dụng trong nhiều sản phẩm, từ những sản phẩm đắt tiền như các loại nước hoa cao cấp đến những mặt hàng rẻ tiền như một nồi xông trị cảm ta đều bắt gặp sự hiện diện của tinh dầu. Người ta xem tinh dầu như là “vàng lỏng” và nó sẽ trở thành nguồn tài nguyên vô hạn nếu con người biết khai thác, sử dụng một cách hợp lí. Một đặc điểm quan trọng không thể thay thế của tinh dầu so với các hợp chất hữu cơ tổng hợp khác là nó không gây hại môi trường và dễ phân hủy. Do có những công dụng thực tiễn như vậy nên ngày càng có nhiều những nghiên cứu cũng như khai thác tinh dầu trên toàn thế giới. Trong những nguồn tinh dầu được ly trích đó, không thể không kể đến tinh dầu cây tần dày lá thuộc họ Hoa môi. Tần dày lá còn có tên gọi khác như: rau tần, rau thơm lông, húng chanh, dương tử tô…là một trong những loại rau thơm quý ở nước ta, được dùng chế biến hương vị trong các món ăn và làm thuốc trị bệnh rất hiệu quả. Chính vì vậy đề tài “Khảo sát tinh dầu tần dày lá” được thực hiện nhằm bước đầu tìm hiểu, khảo sát thành phần hóa học, những ứng dụng của cây tần dày lá với mong ước góp một phần nhỏ trong nghiên cứu khoa học về loại cây này.  Phương pháp để ly trích tinh dầu trong đề tài là phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp, sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger.  Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trong quá trình chưng cất, từ đó đưa ra các thông số tối ưu để thực hiện việc ly trích tinh dầu đạt hiệu quả cao.  Xác định chỉ số vật lý, chỉ số hóa học của tinh dầu.  Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS).  Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.  Bước đầu thực hiện một số thí nghiệm nhỏ để định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong cây tần dày lá. PHẦN I: MỞ ĐẦU I. Lý do chọn đề tài: Từ thời xa xưa con người đã biết khai thác và sử dụng tinh dầu để làm thuốc, gia vị, chất thơm phục vụ nhu cầu cuộc sống. Ngày nay, tinh dầu lại càng khẳng định vị thế quan trọng của nó trong các phương pháp hương trị liệu do tinh dầu có mùi thơm ngát làm tinh thần chúng ta thoải mái, dễ chịu hơn rất nhiều. Phần lớn tinh dầu được chiết xuất từ lá, thân, hoa, củ hoặc vỏ cây từ thực vật, vì vậy chúng rất tinh khiết và có công dụng tốt đối với sức khỏe. Hằng năm, trên thế giới sản xuất ra khoảng 20.000 tấn tinh dầu thiên nhiên chủ yếu từ thực vật. Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc hình thành và phát triển các loài thực vật, đặc biệt là các loại cây chứa tinh dầu có giá trị cao. Ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, cây chứa tinh dầu phân bố khá đa dạng và phong phú, trong đó có cây tần dày lá – một trong những loại rau thơm quý ở Việt Nam, là loại gia vị đặc sắc và làm thuốc trị bệnh rất hiệu quả. Tần có vị the cay, mùi thơm, tính ấm, không độc, có tác dụng lợi phế, trừ đờm, giải cảm, làm ra mồ hôi, làm thông hơi, giải độc. Bộ phận dùng là lá và ngọn non – thường được dùng trị cảm cúm, ho hen, sốt, đau bụng, đau đầu, côn trùng cắn đốt, đổ máu cam, nôn ra máu, viêm họng, viêm phế quản, khản tiếng và nhiều bệnh khác. Lá rau tần chứa ít tinh dầu (0.05 – 0.12 %). Tinh dầu tần dày lá là một chất lỏng màu vàng nhạt, độ nhớt thấp, có vị cay, nóng, mùi thơm như chanh rất dễ chịu. Tác dụng chữa bệnh của rau tần là nhờ tinh dầu này. Tinh dầu được sản xuất từ lá cây tươi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Theo những nghiên cứu gần đây tinh dầu tần dày lá có tính chất kháng sinh mạnh, chữa được nhiều bệnh, phù hợp với kinh nghiệm chữa bệnh cổ truyền của nhân dân ta. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã chiết xuất tinh dầu tần dày lá để dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm, làm chất tạo hương trong các loại thức uống, kem, kẹo, các loại gia vị ướp thịt… Xuất phát từ thực tế chung đó, đề tài “Khảo sát tinh dầu tần dày lá” được thực hiện nhằm bước đầu tìm hiểu, khảo sát thành phần hóa học và những ứng dụng của cây tần dày lá từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng của loại cây này. II. Một số nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu:  Năm 2003, Dilexa Valera, Roimar Rivas, Jorge Luis Avila và các nhà khoa học thuộc khoa dược, đại học Los Andes (Venezuela) cũng tiến hành nghiên cứu tinh dầu tần dày lá sau khi ly trích tinh dầu từ lá cây tần bằng bộ chưng cất tinh dầu Clevenger. Nhóm các nhà khoa học này đã tiến hành nghiên cứu trên cây tần dày lá được trồng ở hai nơi khác nhau là: Mérida (độ cao 1.400 m so với mực nước biển) và Rancherías (độ cao 1.100 m so với mực nước biển)  Năm 2004, các nhà khoa học: Raimundo N. Silva – Filho; Igara O. Lima, Evandro L. de Souza (Brazil) cũng tiến hành ly trích tinh dầu từ lá cây tần bằng bộ chưng cất tinh dầu Clevenger. Sau đó thử hoạt tính kháng vi sinh của tinh dầu trên chủng nấm Candida bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch; kiểm tra ảnh hưởng của tinh dầu tần dày lá đến hoạt tính kháng nấm Candida của một số chất kháng sinh.  Năm 2005, K Magathayaru (Ấn Độ) và nhóm cộng sự cũng tiến hành ly trích tinh dầu từ lá cây tần bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và phân tích thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS). III. Giới hạn của đề tài: - Đề tài khảo sát tinh dầu tần dày lá chỉ giới hạn nghiên cứu ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp. - Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh của tinh dầu bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. - Định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong dịch etanol và dịch cloroform của tần dày lá. IV. Những giả thuyết của đề tài: - Tinh dầu tần dày lá là một chất lỏng màu vàng sáng, nhẹ hơn nước, dễ bay hơi, có mùi thơm đặc trưng. Không tan trong nước nhưng tan nhiều trong các dung môi hữu cơ: diethyl ether, chất béo, cloroform… - Thành phần hóa học của tinh dầu chủ yếu là các hợp chất phenolic: thymol, carvacrol, eugenol, charvicol; còn có một chất màu đỏ là colein. - Tinh dầu tần dày lá có tính chất kháng sinh mạnh, có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn: Staphylococcus, Shighella flexneri, Sonnei, Shiga, B. Shubtilis, Streptococcus, D. Pneumoniae…. V. Phương pháp và phương tiện nghiên cứu: V.1. Phương pháp: - Thu thập và xử lý nguyên liệu. - Ly trích tinh dầu tần dày lá bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu - Xác định chỉ tiêu lý hóa của tinh dầu - Định danh và định lượng thành phần hóa học có trong tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS). - Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế. - Thực hiện một số thí nghiệm để định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong cây tần dày lá. V.2. Phương tiện: - Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger - Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS: HP 6890 - Cân đồng hồ - Cân phân tích - Bình đo tỷ trọng - Tủ sấy - Bếp điện… VI. Các bước thực hiện đề tài: - Từ tháng 10/2008 đến tháng 11/2008: tìm tài liệu - Tháng 12/2008: nghiên cứu, tổng hợp tài liệu, tìm phương pháp thực hiên. - Từ tháng 01/2009 đến tháng 02/2009: Mua nguyên liệu và tiến hành ly trích trong phòng thí nghiệm. - Từ tháng 03/2009 đến tháng 04/2009: Tổng hợp tài liệu lý thuyết và thực nghiệm viết bài báo cáo. PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU A – LÝ THUYẾT: I. Tìm hiểu về cây tần dày lá: I.1. Mô tả cây tần dày lá: Cây cỏ, sống lâu năm, cao 20-50 cm. Phần thân sát gốc hóa gỗ. Lá mọc đối, dày cứng, giòn, mọng nước, mép khía răng tròn.Thân và lá dòn, mập, lá dày có lông mịn, thơm và cay . Hai mặt lá màu xanh lục nhạt. Hoa nhỏ, 4 tiểu nhị, màu tím đỏ, mọc thành bông ở đầu cành. Quả nhỏ, tròn, màu nâu. Toàn cây có lông rất nhỏ và thơm như mùi chanh.
Hình 1: Cây tần dày lá Tên gọi khác: Húng chanh, rau thơm lông, rau thơm lùn, rau tần, dương tử tô, sak đam ray. Thuộc họ: Hoa môi- Lamiaceae. Tên khoa học: Plectranthus amboinicus, đồng nghĩa: Coleus amboinicus Tên gọi ở một số nước khác trên thế giới: QUỐC GIA TÊN GỌI CuBa Cuban Oregano Ấn Độ Indian Borage Spanish Spanish thyme Mexico Mexican mint Pháp French thyme Anh Lemon balm Phân loại khoa học: Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Lamiales Họ (familia): Lamiaceae Chi (genus): Plectranthus Loài (species): P. amboinicus I.2. Nơi sống và thu hái: Cây có gốc ở quần đảo Môluýc (miền Mã Lai) được trồng làm gia vị và làm thuốc. Có thể thu hái lá quanh năm, thường dùng tươi, dùng đến đâu hái đến đó. Lúc trời khô ráo, hái lá bánh tẻ, loại bỏ các lá sâu hay lá già úa vàng, đem phơi nắng nhẹ hay sấy ở 40-45 0C đến khô I.3. Công dụng của cây tần dày lá: Ngoài ứng dụng làm gia vị cho các món ăn, tần dày lá còn có nhiều công dụng đối với y học. Cụ thể là: I.3.1. Đối với Tây y: - Tần dày lá là một dược liệu chữa ho hen, cảm cúm. Tinh dầu tần có tác dụng kháng sinh mạnh đối với vi khuẩn gây ho như tụ cầu, liên cầu, phế cầu… Hiện nay, ở các quốc gia kỹ nghệ phát triển, dược thảo đang được công chúng sử dụng rộng rãi. Trong ngành công nghệ dược phẩm nước ta cũng vậy, ngày nay để trị ho, người ta thường ưa chuộng những loại dược phẩm có nguồn gốc từ tinh dầu của các cây thuốc hơn. Tác dụng của chúng đã được chứng minh qua hàng trăm năm nay như bạc hà, tần dày lá, gừng, tràm… Dưới đây là một số chế phẩm từ tinh dầu tần dày lá:
Hình 2:Thuốc trị ho EUGICA Hình 3: Thuốc trị ho EUGICA FORT
Hình 4:Siro EUGICA SYRUP Hình 5: Kẹo ngậm EUGICA CANDY - Ngoài ra, một muỗng súp tần dầy lá có tác dụng chống ôxy hóa tương đương một quả táo. Loại rau thường dùng cho món canh chua này còn chứa axít phenolic có thể giúp phòng ngừa một số bệnh ung thư. - Nghiên cứu vừa được các nhà khoa học Mỹ công bố ngày 9/4/2009: Một chất chiết xuất từ cây húng chanh Ấn Độ có tên Forskolin có thể cải thiện việc điều trị nhiễm trùng bàng quang, chất này có thể tìm thấy phổ biến trong các cửa hàng thực phẩm sức khỏe và được bán như một mặt hàng giúp giảm dị ứng và giảm béo. - Tần dầy lá có khả năng diệt khuẩn E. coli và Giardia lamblia, một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy, đau bụng. I.3.2. Đối với Đông y: Sau đây là một số bài thuốc chữa bệnh từ tần dày lá: 1. Chữa cảm cúm, cảm sốt, nhức đầu, ngẹt mũi, ho đờm: + Lấy 15-20 gr tần dày lá giã vắt lấy nước cốt để uống, hoặc có thể cho thêm gừng, hành (mỗi loại 12gr) đem nấu uống và xông cho ra mồ hôi. 2. Chữa sốt cao không ra mồ hôi + Lấy 20gr lá tần dày lá, 15gr lá tía tô, 5gr gừng tươi (cắt lát mỏng), 15gr cam thảo đất. Tất cả đem nấu lấy nước dùng lúc nóng ấm để cho ra mồ hôi. 3. Trị ho, viêm họng + Hái vài lá tần dày lá nhai, ngậm, rồi nuốt nước. 4. Chữa viêm họng, viêm thanh quản + Dùng 20gr tần dày lá, 15gr kim ngân hoa, 15g sài đất, 12gr xạ can, 12gr cam thảo đất, đem tất cả nấu lấy nước dùng. 5. Trị chảy máu cam + Lấy 20gr tần dày lá, 15gr trắc bá (sao đen), 10gr hoa hòe (sao đen) và 15gr cam thảo đất. Đem nấu lấy nước dùng một ngày với lượng như trên; hoặc lấy lá tần vò nát rồi nhét vào bên mũi chảy máu. 6. Trị ho + 15gr tần dày lá, 5gr lá chanh, 5gr vỏ quýt, 3gr gừng tươi, 10gr đường phèn. Đem nấu uống mỗi ngày một thang. 7. Chữa đau nhức do ong đốt + Dùng 20gr tần dày lá, một tí muối ăn (loại muối hạt) đem giã nhỏ hoặc nhai kỹ, nuốt nước, còn bã thì đắp vào chỗ ong đốt. 8. Trị nổi mề đay + Dùng lá tần nhai nuốt nước, bã thì đắp hay xoa xát lên những vùng da nổi mề đay. 9. Trị hôi miệng: + Lấy một nắm tần dày lá khô, sắc lấy nước đặc, dùng ngậm và súc miệng, sau vài ngày miệng sẽ hết hôi. II. Tìm hiểu về tinh dầu: II.1. Trạng thái tự nhiên: Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu. Cần phân biệt rõ tinh dầu với dầu béo (hỗn hợp các triglicerid) và dầu mỏ (hỗn hợp các hydrocarbon). Rất khó khăn khi có một định nghĩa tuyệt đối chính xác cho tinh dầu. Về mặt thực hành, tinh dầu có thể như “ một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật”, chỉ có một số ít tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật. Tinh dầu thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không bị phân hủy. Trong thiên nhiên, rất nhiều tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít ở trạng thái tiềm tàng. Ở trạng thái tiềm tàng, tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện gia công nhất định trước khi tiến hành ly trích. Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu hiện sẵn trong nguyên liệu có thể thu trực tiếp dưới những điều kiện ly trích bình thường. II.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên: Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên. Kết quả thống kê cho thấy có khoảng 2500 loài cây có chứa tinh dầu. Trữ lượng tinh dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Cây mọc ở vùng nhiệt đói có trữ lượng tinh dầu cao hơn cây ở vùng ôn đới. Ngay trong một cây, thành phần và lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau. Ngoài ra lượng tinh dầu thu được còn phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách chiết…Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng rất khác nhau: hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25%; bạc hà hàm lượng khoảng 1%; quả hồi và nụ đinh hương thì hàm lượng tinh dầu tương ứng có thể đạt giá trị 5% và 15%. II.3. Quá trình tích lũy tinh dầu: Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô. Hình dạng các mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây. Những mô này có thể hiện ở tất cả mọi nơi trong cây như rễ, thân, lá, hoa và trái…dưới những tên gọi khác nhau như: Tế bào tiết: tế bào tiết ra tinh dầu rồi giữ luôn trong tế bào (mô tiết) như trong cánh hoa hồng, củ gừng… Lông tiết: cũng là tế bào tiết nhưng nằm nhô ra ngoài bề mặt thực vật, thường bắt gặp ở lá các họ Hoa môi, Cúc, Cà…. Túi tiết: tế bào tiết ra tinh dầu nhưng không chứa lại bên trong mà dồn chung chứa vào một xoang trống, tạo ra bởi cơ chế ly bào hay tiêu bào. Túi tiết thường nằm bên dưới biểu bì. Thường có ở vỏ trái các giống Citrus, Eucalyptus… Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong phần gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các giống Dipterocarpi, Artemisia… Về phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ Hoa môi, họ Cam, họ Sim, họ Hoa tán. Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây: như ở hoa (hồng, nhài, cam, chanh…); ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu, tần dày lá…); ở vỏ cây (quế); ở thân cây (hương đàn, peru…); ở rễ (hương bài, gừng, nghệ, xuyên khung…). II.4. Tính chất lý – hóa của tinh dầu: II.4.1. Tính chất vật lý: Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như menthol, camphor… là ở thể rắn. Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm…. Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu như: tinh dầu quế có màu nâu sẫm, tinh dầu thymus màu đỏ. Tinh dầu thường có vị cay và hắc. Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu nặng hơn nước như tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế. Tỷ trọng thay đổi theo thành phần hóa học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon terpenic thì tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn. Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56. Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc có nhân thơm. Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao. Vì tinh dầu là một hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định. Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất. Ví dụ, hợp chất terpen có điểm sôi là 150 – 1600C, hợp chất sesquiterpen có điểm sôi cao hơn, khoảng 250 – 2800C, còn các hợp chất polyterpen có điểm sôi trên 3000C. Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn. Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc hà, tinh dầu xá xị…. II.4.2. Tính chất hóa học: Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước tinh dầu dễ bị oxy hóa và có thể bị nhựa hóa một phần. Alcol trong tinh dầu bị oxy hóa thành aldehyd, aldehyd biến thành acid. Các hợp chất có nối đôi dễ bị oxy hóa hoặc tham gia vào phản ứng cộng hợp. Các hợp chất ceton và aldehyd dễ bị aldol hóa tạo nhựa khi có sự hiện diện của kiềm. Nhiều thành phần có các nhóm chức khác nhau có thể tham gia các phản ứng hóa học, làm thay đổi tính chất của tinh dầu. II.4.3. Công dụng của tinh dầu: Khoa học ngày càng tiến bộ thì ứng dụng của tinh dầu ngày càng rộng rãi và chiếm một vị trí quan trọng:  Trong thực phẩm: tinh dầu giúp cho thức ăn được bảo quản lâu, khử trùng, chống nấm mốc… làm tăng hương vị của thức ăn.  Mỹ phẩm: Tinh dầu đóng vai trò quan trọng vì nó có khả năng giữ mùi, chống oxi hóa, bảo vệ da, tạo hương thơm dịu tự nhiên. Nên tinh dầu được ứng dụng nhiều trong: dầu thơm, nước hoa, kem, dầu gội…  Trong y học: giúp dễ tiêu hóa, bài tiết của dạ dày, tăng khả năng tuần hoàn máu, giảm đau, tăng quá trình trao đổi chất, chống vi khuẩn, vi rút. Nên tinh dầu được tinh dầu được sử dụng nhiều dưới dạng thuốc viên, cao, dung dịch lỏng… II.4.4. Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên:  Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu.  Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu.  Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất  Đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng II.4.5. Các phương pháp sản xuất tinh dầu: Do những yêu cầu về nguyên tắc sản xuất nên khi khai thác hợp chất thơm từ thực vật, động vật, người ta thường dùng một trong các phương pháp sau đây: II.4.5.1. Phương pháp cơ hoc: Đây là phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự do bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu (thường là ép). Phương pháp này được dùng phổ biến đối với các loại vỏ quả họ Citrus như cam, chanh, quýt, bưởi… Vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp tế bào mỏng trong biểu bì. Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, các tế bào có chứa tinh dầu bị vỡ ra giải phóng tinh dầu. Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu, các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi. Nhược điểm của phương pháp ép là tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu là các hợp chất hữu cơ hòa tan từ vật liệu đem ép. II.4.5.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước: Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước được dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, cả hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước. Phương pháp này có ưu điểm là nhiệt độ sôi của hỗn hợp thấp hơn nhiệt độ sôi của nước (1000C) trong khi nhiệt độ sôi của tinh dầu > 1000C ở áp suất khí quyển. Chưng cất lôi cuốn hơi nước không đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp, nhưng có khả năng tách gần như triệt để tinh dầu có trong nguyên liệu. Ngoài ra, phương pháp này còn cho phép phân ly các cấu tử trong tinh dầu thành những phần riêng biệt có độ tinh khiết cao hơn dựa vào sự khác biệt về tính chất bay hơi.  Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp: Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước ra. Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ ở địa phương, nhất là ở những nơi mới bắt đầu khai thác tinh dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm:  Chất lượng tinh dầu sản phẩm không cao.  Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị.  Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài.  Tiêu tốn nhiều năng lượng.  Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp: Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau. Do bộ phân chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của tinh dầu thu được tốt hơn. Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng tinh dầu thu được. II.4.5.3. Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong với dung môi bên ngoài do chênh lệch nồng độ. Sau khi trích ly phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu. II.4.5.4. Trích ly bằng dung môi không bay hơi : Dựa vào tính chất có thể hòa tan trong chất béo động vật và thực vật của tinh dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật hoặc thực vật, tinh dầu sẽ khuếch tán qua màng tế bào, hòa tan vào dầu, sau đó tách riêng dầu để thu tinh dầu. Phương pháp ngâm bằng dung môi không bay hơi có nhiều ưu điểm hơn phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi ở chỗ thu được dầu ít tạp chất hơn. Tuy nhiên, phương pháp này rất thủ công, khó cơ giới hóa và có nhược điểm lớn là chất béo dùng làm dung môi rất khó bảo quản và chế biến, giá thành cao. Chính vì vậy hiện nay phương pháp này rất ít được sử dụng. II.4.5.5. Phương pháp trích ly bằng CO2: Lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 lỏng chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp trích ly dùng CO2 lỏng được sử dụng nhiều trong công nghiệp trong thời gian gần đây do có nhiều ưu điểm như: - Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt. - CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi khác. - Dễ loại và không để lại vết dung môi. - Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phân hủy. - Quá trình kín ít bị hao tốn. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí cho CO2 còn đắt, nên chưa được phổ biến. II.4.5.6. Phương pháp vi sóng: Phương pháp dùng kỹ thuật sóng tăng động năng cho các phân tử tinh dầu, làm tăng quá trình khuếch tán của tinh dầu ra bề mặt mà không sử dụng nhiệt độ. Nhiệt tạo ra trong quá trình phá vỡ các túi tinh dầu nhỏ, thời gian thực hiện ngắn nên không gây ra phân hủy tinh dầu. Phương pháp trích sử dụng vi sóng có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay vẫn đang ở quy mô phòng thí nghiệm. II.4.5.7. Phương pháp sinh học: Phương pháp này được ứng dụng cho các nguồn nguyên liệu có tinh dầu ở trạng thái kết hợp (glucosid). Để phân lập tinh dầu, người ta phải sử lí bằng cách lên men hoặc dùng enzym, sau đó kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu giống như các loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác. III. Tìm hiểu về tinh dầu của cây tần dày lá:  Theo K. magathayaru, những thành phần nổi bật nhất trong tinh dầu tần dày lá ở Brazil là: Carvacrol  50.7%   Gamma Caryophyllene  13.1%   Patchoulane  8.7%    Theo Dilexa Valera, Roimar Rivas, Jorge Luis Avila và các nhà khoa học thuộc khoa dược, đại học Los Andes (Venezuela): Tinh dầu tần dày lá được trồng ở hai nơi khác nhau có các chỉ số vật lý khác nhau, thành phần hóa học trong tinh dầu cũng khác nhau. Cụ thể là:  Về chỉ số vật lý: Chỉ số vật lý  Tinh dầu ở Rancherías  Tinh dầu ở Mérida   Tỷ trọng  0.9241  0.8894   Độ quay cực  -2.40  -1.80   Chỉ số khúc xạ  1.5075  1.4903    Về thành phần hóa học: Số thứ tự  Tên chất  Hàm lượng % ở Mérida  Hàm lượng % ở Rancherrías   1  α-thujene  0.4  -   2  Α-thinene  0.2  -   3  camphene  1.0  -   4  1-octen-3-ol  1.0  0.8   5  β-myrcene  1.1  0.3   6  α-felandrene  0.1  -   7   3-carenene  0.1  -   8  α-terpinene  1.3  0.6   9  p-cymene  19.8  9.8   10  β-felandrene  0.6  -   11   -terpinene  7.2  4.7   12  c-sabinene hydrate  0.2  -   13  borneol  0.1  -   14  Terpin-4-ol  0.9  1.0   15  thymol  0.5  0.5   16  carvacrol  55.3  64.7   17  t-caryophyllene  5.4  9.1   18  α-bergamotene  3.3  4.6   19  α-humulene  1.3  2.6   20  Caryophyllene oxide  0.4  1.1   21  di-elapiol  0.1  -    Theo Raimundo N. Silva – Filho; Igara O. Lima, Evandro L. de Souza (Brazil) tinh dầu tần dày lá có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của một số nấm men thuộc chủng Candida: C. albicans; C. tropicalis; C. quilliermondii; C. krusei; C. parapsilosis. Ngoài ra, tinh dầu tần dày lá còn làm tăng hoạt tính kháng nấm Candida của các chất kháng sinh: amphotericin B, ketoconazole, itraconazole.  Kết luận: Từ những nghiên cứu trên cho thấy tinh dầu tần dày lá là chất lỏng nhẹ hơn nước, có thành phần hóa học chính là: carvacrol (luôn chiếm hàm lượng cao nhất trong tinh dầu) và có hoạt tính kháng sinh mạnh. B – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ: I. Dụng cụ và hóa chất: I.1. Dụng cụ: Bộ dụng cụ cất tinh dầu Clevenger Tủ sấy Cối xay sinh tố Bếp điện Lưới amiang Giấy lọc Phễu lọc I.2. Hóa chất: Diethyl ether Na2SO4 khan  Đũa thủy tinh Becher 500, 100, 50 ml Ống nghiệm Ống đong Pipet Ống nhỏ giọt Các thuốc thử dùng cho định tính được trình bày trong phần V. (Định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong cây tần dày lá) II. Ly trích tinh dầu tần dày lá và xác định các chỉ số vật lí, chỉ số hóa học của tinh dầu: II.1 Ly trích tinh dầu tần dày lá: Nguyên liệu là lá cây tần được thu hái vào lúc sáng sớm tại chợ An Nghiệp (Cần Thơ). Lá cây sau khi xử lý sơ bộ (rửa sạch, loại bỏ những lá sâu, dập, úng) được cắt nhỏ 1- 2 mm (đối với nguyên liệu không xay) hoặc xay nhuyễn với nước cho vào bình cầu. Ráp hệ thống chưng cất và tiến hành chưng cất tinh dầu. Để nguội, dùng bình chiết lấy phần tinh dầu phía trên, làm khan bằng Na2SO4 thu được tinh dầu sản phẩm, đem cân xác định lượng tinh dầu ly trích được. Từ đó ta xác định được hàm lượng tinh dầu của quá trình ly trích. Dưới đây là sơ đồ ly trích tinh dầu tần dày lá: NGUYÊN LIỆU XỬ LÝ SƠ BỘ BÌNH CẦU HỆ THỐNG CHƯNG CẤT BÌNH HỨNG LỚP TINH DẦU TRÊN Na2SO4 khan  LÀM KHAN  Hình 6: Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger TINH DẦU SẢN PHẨM Sơ đồ ly trích tinh dầu tần dày lá: II.2. Xác định chỉ số vật lí, chỉ số hóa học của tinh dầu: II.2.1. Đánh giá cảm quan: Tinh dầu tần dày lá là chất lỏng màu vàng sáng, trong, nhẹ hơn nước, có mùi thơm dịu. II.2.2. Xác định chỉ số vật lí:  Tỷ trọng: Tỷ trọng của tinh dầu tại 200C là tỉ số khối lượng tinh dầu ở 200C trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 200C. Cách xác định: Trước tiên ta rửa sạch bình đo tỷ trọng (tỷ trọng kế) tráng lại bằng etanol rồi sấy thật khô. Cân tỷ trọng kế rỗng (m0) Cho nước cất vào đầy tới cổ bình, đậy nút, lau khô phần nước trào. Cân khối lượng của bình và nước cất (m1) Thay nước cất bằng tinh dầu, làm tương tự, cân khối lượng cả bình và tinh dầu (m2). Tỷ trọng:  20  m2  m1 d 20  m1  m0 Với m0 : khối lượng tỷ trọng kế rỗng (g). m1 : khối lượng tỷ trọng kế và nước (g). m2 : khối lượng tỷ trọng kế và tinh dầu (g) Kết quả: Tính được tỷ trọng của tinh dầu là: dTD = 0.9057 II.2.3. Xác định chỉ số hóa học:  Chỉ số acid (Index Acid): Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1g tinh dầu. KOH trung hòa các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng RCOOH + KOH RCOOK + H2O Cách xác định: Cho vào erlen 100ml: 10ml etanol, thêm vào 5 giọt dung dịch phenolphthalein. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. Cho tiếp vào 1 ml tinh dầu, lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình. Chỉ số acid được tính theo công thức IA  5,61. f .VKOH dTD Trong đó: VKOH: số ml dung dịch KOH 0.1N dùng chuẩn độ kể từ khi thêm tinh dầu. f: hệ số điều chỉnh nồng độ KOH 0.1N 5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0.1 N d: tỷ trọng của tinh dầu Kết quả:  Lần 1  Lần 2  Lần 3  Trung bình   VKOH (ml)  0.6  0.7  0.6  0.6333   Chỉ số acid  3.7098  4.3881  3.7098  3.9157   Bảng 1:Kết quả xác định chỉ số acid của tinh dầu tần dày lá Kết luận: Chỉ số acid của tinh dầu tần dày lá là: IA = 3.9157  Chỉ số savon hóa (Index Savon): Chỉ số savon hóa là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1g tinh dầu. Quá trình savon hóa tinh dầu bao gồm: KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH RCOOK + H2O và KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R1COOR2 R1COOK + R2OH Cách xác định Lấy một erlen 100 ml khô và sạch: cho vào 1 ml tinh dầu và 15 ml KOH 0.1N. Đun hoàn lưu trong 1 giờ để savon hóa ester và trung hòa các acid tự do có trong tinh dầu. Để nguội, cho thêm vào erlen 15 ml nước cất, 5 giọt phenolphthalein, lắc đều, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N để trung hòa lượng KOH còn dư đến khi dung dịch vừa mất màu hồng. Thực hiện phép đo 3 lần, ghi nhận thể tích dung dịch HCl 0.1N (V1) đã dùng chuẩn độ. Ta thực hiện tương tự với mẫu trắng, ghi thể tích HCl 0,1N (V0) đã chuẩn độ. Chỉ số savon được tính theo công thức:  IS  5,61.F .(V0  V1 ) dTD Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml). V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml). dTD: tỷ trọng của mẫu tinh dầu (g) Kết quả:  Lần 1  Lần 2  Lần 3  Trung bình   V0(ml)  15  15  15  15   V1 (ml)  8.5  8.3  8.4  8.4   IS  40.1899  41.4265  40.8082  40.8082   Bảng 2:Kết quả xác định chỉ số savon hóa của tinh dầu tần dày lá Kết luận: Chỉ số savon hóa của tinh dầu tần dày lá là: IS = 40.8082  Chỉ số ester hóa (Index Ester) Chỉ số ester hóa của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1g tinh dầu Chỉ số ester hóa của tinh dầu bằng hiệu số giữa chỉ số savon và chỉ số acid: IE = IS – IA = 40.8082 - 3.9157 = 36.8925 III. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trong quá trình chưng cất: Chúng tôi tiến hành khảo sát 4 yếu tố: thời gian để héo nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu xay và không xay. Nguyên tắc: cố định 3 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó cố định yếu tố này và tiếp tục thay đổi một yếu tố khác, cứ tiến hành như vậy cho đến khi chọn được 4 mức tối ưu của 4 yếu tố cho quá trình ly trích. III.1. Khảo sát nguyên liệu xay và không xay: Cố định 3 yếu tố: thời gian để héo nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất. Bảng 3: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo nguyên liệu xay và không xay: Nguyên liệu  Thời gian để héo (giờ)  Khối lượng mẫu (gam)  Thời gian chưng cất (giờ)  Thể tích nước (ml)  Khối lượng tinh dầu (gam)  Hàm lương tinh dầu (%)   Xay  0  300  2.5  500  0.3060  0.1020   Không xay  0  300  2.5  500  0.2658  0.0886   0.105 0.1 0.095 0.09 0.085 0.08  1 2 Nguyên liệu Hình 7: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo nguyên liệu xay và không xay (1): Nguyên liệu xay (2): Nguyên liệu không xay Nhận xét: Nguyên liệu được xay nhuyễn cho lượng tinh dầu nhiều hơn so với nguyên liệu không xay do khi xay nhuyễn đã làm tăng bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với nước làm tăng hiệu suất quá trình ly trích. III.2. Khảo sát thời gian để héo nguyên liệu: Ta cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được xay nhuyễn và thay đổi thời gian để héo nguyên liệu như sau: 0h, 3h, 6h, 9h. Sau khi ly trích, cân và so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn mức thời gian để héo tối ưu. Bảng 4: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo thời gian để héo: Thời gian để héo (giờ)  Khối lượng mẫu (gam)  Thể tích nước (ml)  Thời gian chưng cất  Khối lượng tinh dầu (gam)  Hàm lương tinh dầu (%)   0  300  500  4  0.3300  0.110   3  300  500  4  0.2718  0.101   6  300  500  4  0.2340  0.085   9  300  500  4  0.1800  0.060   0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 2 4 6 8 10 Thời gia n để hé o (h) Hình 8: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo thời gian để héo Nhận xét:Hàm lượng tinh dầu giảm dần theo thời gian để héo nguyên liệu. Quan sát đồ thị cho thấy trong vòng 3 giờ độ giảm lượng tinh dầu tương đối ít, càng để lâu lượng tinh dầu càng giảm. Vì vậy, để thu được lượng tinh dầu cao nhất nên chưng cất ngay sau khi thu hái. III.3. Khảo sát thời gian chưng cất: Với thời gian để héo tối ưu đã chọn, ta tiếp tục cố định các yếu tố còn lại và thay đổi các mức thời gian chưng cất như sau: 1h, 1h30, 2h, 2h30, 3h, 3h30, 4h. Ta cũng cân và so sánh lượng tinh dầu thu được để tìm ra thời gian chưng cất tối ưu. Bảng 5: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo thời gian chưng cất: Thời gian chưng cất (giờ)  Khối lượng mẫu (gam)  Thể tích nước (ml)  Thời gian để héo (giờ)  Khối lượng tinh dầu (gam)  Hàm lương tinh dầu (%)   1  300  500  0  0.150  0.05   1.5  300  500  0  0.225  0.075   2  300  500  0  0.294  0.098   2.5  300  500  0  0.321  0.107   3  300  500  0  0.318  0.106   3.5  300  500  0  0.321  0.107   4  300  500  0  0.327  0.109   0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 1 2 3 4 5 Thời gian chưng cất (h) Hình 9: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất Nhận xét: Qua khảo sát, ta thấy hàm lượng tinh dầu có thay đổi theo thời gian chưng cất. Hàm lượng tinh dầu tăng lên khi ta tăng thời gian chưng cất. Nhưng từ mức 2.5 giờ khi ta tiếp tục tăng thời gian thì lượng tinh dầu tăng không đáng kể, nên chọn mức thời gian chưng cất tới ưu là 2.5 giờ để tiếp tục khảo sát các yếu tố khác. III.4. Khảo sát lượng nước chưng cất: Với 3 mức tối ưu của 3 yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất như sau: 300ml, 400ml, 500ml, 600ml, 700ml. Cân và ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi trường hợp, từ đó xác định được lượng nước chưng cất tối ưu. Bảng 6: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo lượng nước chưng cất: Lượng nước chưng cất (ml)  Khối lượng mẫu (gam)  Thời gian chưng cất (giờ)  Thời gian để héo (giờ)  Khối lượng tinh dầu (gam)  Hàm lương tinh dầu (%)   300  300  2.5  0  0.2607  0.0869   400  300  2.5  0  0.2964  0.0988   500  300  2.5  0  0.3030  0.1010   600  300  2.5  0  0.2904  0.0968   700  300  2.5  0  0.2640  0.0880   0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 200 400 600 800 Lượng nước chưng cất (ml) Hình 10: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo lượng nước chưng cất Nhận xét: Qua quá trình khảo sát, ta thấy cùng khối lượng mẫu là 300 gam, ứng với lượng nước chưng cất là 500 ml sẽ cho lượng tinh dầu cao nhất. IV. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu: Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:  Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS: HP 6890  Cột mao quản: dài 30 m, đường kính trong 250 µm, lớp phim dày 250 µm.  Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 2500C  Tỷ lệ dòng (splitless)  Đầu dò khối phổ tứ cực (MSD)  Tốc độ dòng khí mang (He) 0.9 ml/phút, áp suất 6.9 psi  Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 600C, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng lên 1000C, với tốc độ tăng 100C/phút. Tiếp tục tăng đến 2800C với tốc độ tăng 300C/phút và giữ trong 15 phút. Kết quả: Bảng 7: Thành phần hóa học của tinh dầu tần dày lá: STT  Thời gian lưu  Tên cấu phần  Hàm lượng (%)   1  4,385  (2E)-2-Hexenal  0,279   2  5,734  3-Thujene  0,416   3  5,860  1R-alpha-Pinene  0,345   4  7,470  1-octen-3-ol  0,315   5  7,659  Beta Myrcene  0,797   6  8,485  Alpha Terpinolene  0,852   7  8,788  Beta Cymene  23,363   8  10,116  Gamma Terpinene  5,332   9  15,627