Khóa luận Định danh nhóm nấm trichoderma spp phân lập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM ------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHÓM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHÓM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii “Không gì có thể so sánh đƣợc tình yêu tôi dành cho mẹ, ba, chị và em tôi, những ngƣời nắm giữ trái tim tôi trọn đời. Tôi luôn cảm thấy ấm áp bởi sự quan tâm và tình thƣơng chân thành của những ngƣời thân tộc dành cho tôi. Không bao giờ quên sự quan tâm, chia sẻ và những lời dạy dỗ của Thầy TS. Lê Đình Đôn, một ngƣời thầy lớn. Tôi luôn tự hào vì đã đƣợc học tập và rèn luyện ở trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và bộ môn Công nghệ sinh học nói riêng. Gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Văn Lẫm, chị Trần Thị Vân, Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, Phạm Thị Minh Kiều, Trịnh Thị Phƣơng Vy và các Anh, Chị ở viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Luôn nhớ đến các bạn cùng lớp DH03SH với tôi và các bạn khoa Nông học cùng làm chung ở phòng 105, bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, những ngƣời thật đáng mến. Có những giai đoạn thật khó khăn trong cuộc sống và tôi thật may mắn có đƣợc ngƣời bạn đã chịu đựng và luôn làm tôi cảm thấy ấm áp. Cảm ơn mày nhiều lắm Tuyền”. Nguyễn Thị Khả Tú iv TÓM TẮT Đề tài: “Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam” do Nguyễn Thị Khả Tú thực hiện từ 19/3/2007 đến ngày 19/8/2007 tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng Công nghệ sinh học thực vật, viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Mục đích Định danh tên loài 11 dòng nấm Trichoderma spp. phân lập ở Việt Nam. Phân nhóm và xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma spp.. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma spp. (Trichoderma) với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. Phƣơng pháp thực hiện Kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) với dữ liệu của chúng trên NCBI bằng phần mềm ClustalX 1.83. So sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Kết quả đạt đƣợc Khẳng định tên loài chính xác 10 dòng Trichoderma. Thiết lập và thể hiện rõ đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma. 11 dòng Trichoderma Việt Nam thuộc 5 loài T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens (trừ dòng T. asperellum (T6)) có quan hệ di truyền khá xa so với các dòng trên thế giới. 10 dòng có nguồn gốc bản địa và dòng v T. asperellum (T6) là dòng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Mối quan hệ di truyền giữa 5 loài này là bền vững và phù hợp với mối quan hệ về hình thái. Kết luận Với kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 có thể định danh chính xác tên loài và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các loài cũng nhƣ các dòng trong cùng loài của Trichoderma. Sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA và nhất là trình tự một phần vùng tef1 có thể phân biệt giữa dòng Trichoderma bản địa với các dòng ngoại lai. Mở ra triển vọng cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo của phƣơng pháp định danh trong đề tài. vi ABSTRACT “Identifying and grouping of Trichoderma spp. collected in Viet Nam”, thesis is carried out by Nguyen Thi Kha Tu, from 19 Mar, 2007 to 19 Aug, 2007 at Plant Protection Pepartment, Argonomy Faculty, Nong Lam University and Phytobiotechnology Laboratory, Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University. This thesis was based on molds identified results then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) stable and apart of tef1 (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) funtional regions with their data on NCBI to identifying species and grouping of 11 Trichoderma genus. Finally, ITS – rDNA and apart of tef1 regions of 11 Trichoderma genus were compared with their data at different ecological, geographic areas on over the world to clear the genetic relationship. The results show that confirming exactly the species of 10 Trichoderma genus, T68 genus was identified T. atroviride. Establishing and clearing the genetic relationship among 11 Trichoderma genus. In which, 11 Trichoderma genus in Viet Nam of 5 species T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum , T. virens (except T. asperellum genus (T6)) have a rather far genetic relationship from others in the world. 10 genus orginated from locality and T. asperellum (T6) is the one migrated in our country. Genetic relationship among 5 species is stable and suitable with morphological characteristics. vii MỤC LỤC TÓM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC HÌNH ...................................................................................... xii Chƣơng 1 ..................................................................................................................... 0 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 0 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 0 1.2. Mục đích ........................................................................................................ 0 1.3. Yêu cầu .......................................................................................................... 0 Chƣơng 2 ..................................................................................................................... 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 2 2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma ..................................................................... 2 2.1.1. Phân loại................................................................................................... 2 2.1.2. Nguồn gốc ................................................................................................ 2 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 3 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học ....................................................... 4 2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng ....................................... 4 2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma ........................................................................... 6 2.3. Các phƣơng pháp định danh tên loài nấm Trichoderma ................................ 7 2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA ........................................... 9 2.5. Giới thiệu về vùng tef1 ................................................................................. 10 2.6. Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass ....................... 10 2.7. Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA .................. 11 2.8. Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma ... 13 Chƣơng 3 ................................................................................................................... 15 viii VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................ 15 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu .................................................. 15 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 15 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 15 3.2. Hoá chất ....................................................................................................... 16 3.3. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 17 3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma. ................................................................. 17 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma ............................................................ 17 3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma ............................................................. 18 3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA ............................................... 18 3.8. Phản ứng PCR .............................................................................................. 19 3.9. Đánh giá kết quả PCR ................................................................................. 21 3.10. Định danh tên loài các dòng Trichoderma ................................................... 22 3.11. Phân nhóm tạo phổ hệ di truyền .................................................................. 24 3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới ............................ 24 Chƣơng 4 ................................................................................................................... 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 25 4.1. Kết quả ly trích DNA ................................................................................... 25 4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ........... 26 4.3. Kết quả định danh tên loài ........................................................................... 27 4.4. Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền ..................................................... 35 4.4.1. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ................................................................................................................ 35 4.4.2. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA ........ 37 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI...... 39 4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới................................................................. 41 Chƣơng 5 ................................................................................................................... 44 ix KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 44 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 44 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate. DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylene diamin tetracetic acid. PCR: Polymerase chain reaction. RAPD: Random amplified polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid. SDS: sodium dodecyl sulfate. Taq: Thermus aquaticus. TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid. TE: Tris ethylene diamine tetra acetate. Tm: Melting Tempereture (nhiệt độ nóng chảy). U: Đơn vị hoạt tính. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài ........... 15 Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng ............................... 20 Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng ....... 21 Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ................................................................... 21 Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI ....... 22 Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI ..................... 23 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 5 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T33 với các loài trên NCBI ............ 30 Bảng 4. 6 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T2 với các loài trên NCBI .............. 30 Bảng 4. 7 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T14 với các loài trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 8 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T85 với các loài trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 9 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T88 với các loài trên NCBI ............ 32 Bảng 4. 10 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T6 với các loài trên NCBI ............. 32 Bảng 4. 11 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T68 với các loài trên NCBI ........... 33 Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên loài các dòng Trichoderma của đề tài ............... 33 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trƣờng PDA sau 2 – 3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) ................... 3 Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI ............................................................................... 9 Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 . 20 Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F .............................. 20 Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút .............................................................. 26 Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút ............ 26 Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thƣớc 600 bp ...................................................................................... 27 Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F, có kích thƣớc 320bp ............................................................. 27 Hình 4. 5 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một phần vùng tef1 (B). ...................................................................................................... 36 Hình 4. 6 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B) ................................................................................................................... 38 Hình 4. 7 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với dữ liệu của chúng trên thế giới. ............................................................................. 40 Hình 4. 8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma ....... Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 43 Hình 4. 9 Kết quả so sánh trình tự một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 42 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm Trichoderma là một loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh hại cây trồng và có khả năng kích thích sự phát triển của bộ rễ cây. Việc khai thác tiềm năng của Trichoderma dƣới dạng chế phẩm sinh học nhƣ một tác nhân sinh học phòng trừ nhiều bệnh hại cây trồng, giúp cho cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn đã và đang đƣợc các nƣớc trên thế giới trong đó có nƣớc ta rất quan tâm nhằm tạo sản phẩm nông nghiệp không có dƣ lƣợng thuốc hóa học là một yêu cầu bắt buộc vì sức khỏe cộng đồng, xuất khẩu và cân bằng môi trƣờng sinh thái, hƣớng đến một nền nông nghiệp bền vững. Vì thế, việc định danh chính xác tên loài và xác định mối quan hệ di truyền của chúng trở nên thật cần thiết. Nhƣng do hệ thống định danh và phân loại của Trichoderma vẫn chƣa hoàn chỉnh nên việc chỉ dựa đơn lẻ vào hình thái , trình tự vùng bảo tồn hoặc trình tự các vùng chức năng thì không thể định danh chính xác tên loài của chúng (Gary J. Samuels, 2004). Khóa luận tốt nghiệp này nhằm mục đích định danh tên loài với độ chính xác cao, bằng cách kết hợp kết quả định danh dựa vào hình thái với trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) mà phƣơng pháp định danh chỉ bằng hình thái không hoàn toàn chính xác. Đồng thời, phân nhóm tạo phổ hệ di truyền để thành lập dữ liệu chi tiết về quần thể nấm Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên lãnh thổ nƣớc ta. 1.2. Mục đích Định danh tên loài và phân nhóm xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam. . Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. 1.3. Yêu cầu Phục hồi 11 dòng Trichoderma từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn nấm. 1 Nuôi cấy và nhân sinh khối Trichoderma. Ly trích DNA từ sinh khối Trichoderma với độ tinh khiết cao. Thiết lập đƣợc quy trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Xác định đƣợc tên loài 11 dòng Trichoderma trên cơ sở kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng của trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) bằng phần mềm ClustalX 1.83. Phân nhóm và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dòng Trichoderma thông qua việc so sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Đánh giá đƣợc mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và phần mềm TreeView 1.6.6. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma 2.1.1. Phân loại Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chƣa đƣợc biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thƣờng dựa vào sự khác biệt về đặc trƣơng hình thái; đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích dẫn của Clipson, N. và cs, 2001). Đã có hơn 50 loài Trichoderma khác nhau đã đƣợc tìm thấy. Trichoderma đƣợc phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Trong đó, nhóm Saturnisporum không tìm thấy giai đoạn teleomorph (giai đoạn sinh sản hữu tính, đây là một dạng biến dị từ sự tái tổ hợp do lai chéo ngoại huyết nhƣ trong chu kì cận giới tính) và nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp có giai đoạn này độc lập, chỉ có 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph nên đƣợc gọi là Hypocrea, thƣờng không đƣợc dùng với mục đích kiểm soát sinh học (Gary J. Samuels, 2004). 2.1.2. Nguồn gốc Trichoderma đƣợc tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderme khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trƣờng PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trƣờng PGA hóa vàng. Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trƣờng PDA sau 2 – 3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thƣớc từ 1-7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động nhƣ chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trƣng, một số ít có màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1.4 µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thƣớc không quá 5 m. Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà 4 T. harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trƣờng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên chlamydospores có thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.5 đến 9.5. Phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 30 0C. Một vài dòng phát triển tốt ở 35 0C. Một số ít phát triển đƣợc ở 40 0C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 37 0C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng (Gary J. Samuels, 2004) Nấm Trichoderma đƣợc sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp., Fusarium spp. và Crinipellis spp. gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng nhƣ tiêu, bông, nho, bắp, đậu nành, 5 mận, táo, cà rốt, hành, rau diếp do có tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng, kí sinh với nấm hại hoặc tiết kháng sinh, enzyme (chitinase, β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng. Tiết kháng sinh: T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một vài loài T. atroviride và T. viride tiết 6-pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) có hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, koningii, viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridin) là một độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens. Ký sinh: Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hoá chất, nó ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật kí sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết các enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi kí sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nó. Khi kí sinh vào cây T. asperellum tiết cellulase, cho phép nó tấn công những nấm nhƣ Phytophthora 6 spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng. Cạnh tranh: Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khoẻ). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đƣờng xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp.. Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thƣơng, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu cho đất vì thế làm tăng năng suất cây trồng nhờ khả năng phân giải phospho khó tan có rất nhiều trong đất mà cây không hấp thụ đƣợc và khả năng tiết các enzyme phân hủy chất hữu cơ nhƣ cellulase, glucanase thành các dạng dễ hấp thu. Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ nhƣ loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trƣởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzyme bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh. 2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma Nấm mốc nói chung (trong đó có Trichoderma) có thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl hóa) và các thành phần khác gồm β – glucan, α – glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8 – 33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) . Màng 7 tế bào dầy khoảng 7 µm thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa, thƣờng hình tròn, đôi khi kéo dài, đƣờng kính khoảng 2 – 3 µm. Ty thể hình elip, luôn di động để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999). Những hiểu biết cơ bản về cấu tạo tế bào Trichoderma chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn và cải tiến các phƣơng pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp với nghiên cứu của đề tài. 2.3. Các phƣơng pháp định danh tên loài của Trichoderma Đến thập niên 1990, việc định danh và phân nhóm Trichoderma chỉ dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý (đánh giá các isoenzyme). Năm 1969, Rifai đƣa ra các đặc điểm hình thái của tất cả các loài Trichoderma. Sau đó, Bisett (1984, 1991a, 1991b, 1991c, 1992, 1998 (Gams và Bissett)) bổ sung các đặc điểm hình thái của Hypocrea và Gliocladium, là teleomorphs của Trichoderma. Phƣơng pháp định danh chỉ dựa vào hình thái không hoàn toàn chính xác do một vài loài Trichoderma có đặc điểm hình thái rất giống nhau, chỉ khác nhau ở một vài đặc điểm rất khó nhận thấy và xác định nhƣ T. asperellum T. viride Chlamydospore nhìn thấy rõ trên đám bào tử non ở mặt sau đĩa petri. Chlamydospore ít thấy hoặc thấy không rõ ràng. Bào tử (conidia) có dạng hình cầu hoặc hình oval. Không có mùi dừa Bào tử có hình tròn hoặc bán cầu. Có mùi dừa T. longibrachiatum T. sinensis Trên môi trƣờng PGA khuẩn lạc vẫn tăng trƣởng mạnh ở 40 0C. Không phát triển ở 40 0C trên môi trƣờng PGA. Cành bào tử mọc vuông góc. Cành bào tử mọc không vuông góc (nhỏ hơn 900). T. atroviride T. koningii Không có pustule (cụm bào tử). Có pustule. 8 Bào tử hình oval. Không làm môi trƣờng PGA có màu Bào tử hình chữ nhật hoặc hình ellip. Làm môi trƣờng PGA có màu vàng Có nhiều chlamydospore. Không có chlamydospore. Cành bào tử mọc không vuông góc (nhỏ hơn 900). Cành bào tử mọc vuông góc với trục chính. T. atroviride T. viride Không có hoặc ít thấy pustule Pustule xuất hiện nhiều Chlamydospore có nhƣng chỉ nhìn thấy qua kính hiển vi Chlamydospore có và nhìn thấy ở mặt sau của đĩa. Phƣơng pháp định danh và phân loại Trichoderma sau này đƣợc tăng cƣờng bằng phƣơng pháp phân tử . Kết hợp các maker phân tử (ITS1, ITS2, RAPD) với phân tích đăc̣ điểm sinh lý và kết quả phân nhóm dựa vào hình thái để phân tích các teleomorphs của Trichoderma (Kuhls và cs (1996, 1997), Samuels (1996), Samuels và cs (1998), Turner và cs (1997)). Năm 2004, Druzhinina Irina và cs đã bổ sung hệ thống phân loại và phổ hệ di truyền của Trichoderma/ Hypocrea bằng cách kết hợp hình thái với phân tích sinh lý và phân tử. Hiện nay, vùng ITS – rDNA đƣợc xem là cơ sở đáng tin cậy để phân nhóm và định danh Trichoderma. Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA và đặc điểm hình thái thì rất khó phân biệt đƣợc T. viride với T. koningii và T. atroviride nhƣng nếu phân tích thêm vùng tef1 (large intron) thì hoàn toàn có thể phân biệt giữa chúng. Phƣơng pháp định danh GCPSR (Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition) là phƣơng pháp dựa vào mức độ tƣơng đồng và vị trí phù hợp của dòng Trichoderma phân tích với các dòng trong phổ hệ di truyền. Phƣơng pháp này cho kết quả định danh đáng tin cậy và tiết kiệm đƣợc chi phí, thời gian hơn phƣơng pháp định danh chỉ dựa vào hình thái. Năm 2002, Kullnig-Gradinger và cs sử dụng 4 vùng ITS– rDNA, mitssuDNA, tef1 (short intron thứ 5) và ech42 (large exon) để đánh giá phổ hệ di truyền của các loài Trichoderma và cho kết quả rất đáng tin cậy. Tuy nhiên, trong định danh bằng phân tử đòi hỏi dữ liệu Trichoderma trên GenBank phải nhiều và đầy đủ các loài. 9 Nhƣng ngay cả khi đòi hỏi này đƣợc đáp ứng thì vẫn xảy ra trƣờng hợp trình tự vùng ITS – rDNA của dòng cần định danh khi sƣ̉ duṇg công cu ̣Blast trên NCBI thì có độ tƣơng đồng cao với quá nhiều loài. Do đó, hình thái vẫn luôn là nền tảng để định danh, phân nhóm Trichoderma và phƣơng pháp phân tử chỉ để xác nhận hoặc phân biệt những loài mới (Kubicek C.P. và cs, 2003). Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI 2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hoá, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật cũng nhƣ các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế 10 trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thƣờng không chính xác và cần khoảng thời gian dài (Guarro và cs, 1999). rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer, là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA). Vùng 5.8S – rDNA có kích thƣớc rất nhỏ và ít có sự biến đổi (Szymanski và cộng sự, 2001). Vùng ITS – rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thƣờng để xác định các biệt hoá trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền (Guarro và cs, 1999). Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật cùng giới nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh, tạo phổ hệ di truyền. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và ctv, 1996). Các primer chúng tôi sử dụng trong đề tài này cũng đƣợc thiết kế theo hai dạng trên. Vùng ITS, các primer đƣợc thiết kế dựa trên vùng bảo tồn 18S, 5.8S và 28S. Primer ITS2 và ITS3 đƣợc thiết kế, sàng lọc dựa trên vùng 5.8S – rDNA của N. crassa, Schizosaccharomyces pombe và S. cerevisiae, Vicia faba chuột. Vùng 28S – rDNA của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) đƣợc so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự dựa vào vùng 18S – rDNA của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và cs, 1989). 2.5. Giới thiệu về vùng tef1 Là vùng gen có chức năng mã hóa tạo protein elongation factor – 1α, protein này là nhân tố tham gia vào việc kéo dài chuỗi peptide. Đây là vùng mang tính bảo thủ cao với số bản sao thấp, có chức năng chuyên biệt và đặc trƣng cho từng loài Trichoderma. Do đó, nó đƣợc dùng để định danh chính xác tên loài và phân biệt giữa các nhóm với nhau hay giữa các loài cùng nhóm Trichoderma (Gary J. Samuels, 2005). 2.6. Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass Phƣơng pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lƣợng so với band của 11 phân tử Mass. Mẫu định lƣợng cần phải đƣợc pha loãng một , hai , ba , …, n lần. Sau đó, các mẫu pha loãng đƣợc kiểm tra bằng điện di và đƣợc so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt đƣợc sự tƣơng đƣơng về kích thƣớc và độ sáng giữa band của mẫu pha loãng với band của Mass. Từ đó, xác định đƣợc nồng độ của mẫu pha loãng và tính đƣợc nồng độ của mẫu gốc do có hệ số pha loãng. Bảng 2.1 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng) 10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp 7 µg 700 bp 70 ng 700 bp 5 µg 500 bp 50 ng 500 bp 2 µg 200 bp 20 ng 200 bp 1 µg 100 bp 10 ng 100 bp Những hiểu biết về phƣơng pháp này là cơ sở để chúng tôi ƣớc lƣợng đƣợc nồng độ DNA ly trích và pha loãng khi không sử dụng phân tử Mass. 2.7. Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA Palmer và cs (1990) đã so sánh trình tự SSU – rDNA (Small Subunit – rDNA) của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín. Kết quả cho thấy trình tự 18S – rDNA của nhân là có nhiều biến đổi nhất. Đến năm 1991 và 1992, Bruns và cs đƣa ra liên tiếp các nghiên cứu trên vùng rDNA để phân nhóm, nhận biết tính đa Hình 2. 3 Thang chuẩn về nồng độ của phân tử Mass (Bio- Rad) 2,5 µl mẫu chuẩn đƣợc pha loãng với 10 µl loading buffer và TE đƣợc bơm vào gel agarose 1,8 %. Gel này đƣợc đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X. Gel đƣợc ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg/ ml EtBr) trong 15 phút và đƣợc giữ trong nƣớc 30 phút. 12 dạng và mối quan hệ di truyền của những loài nấm sợi khi so sánh sự thay đổi trình tự của vùng SSU – rDNA (18S). Dựa trên trình tự vùng 18S, 5.8S và ITS – rDNA, Berbee và cs (1995) đã chứng minh Penicillium spp., Aspergillus spp. và Paecilomyces spp. thuộc lớp Trichocomaceae. Năm 1991, Bruns và cs phân tích trên vùng SSU – rDNA và chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota, Oomycota, và Fungi. Cũng dựa vào phân tích trên vùng này, ngƣời ta cũng đã chứng minh Schizosaccharomycetales có nguồn gốc từ lớp Myxomycota (Guarro và cs, 1999). Khi phân tích trên vùng LSU – rDNA (Large Subunit – rDNA, 24S), Wakefield và cs (1992) cho rằng P. carinii thuộc lớp nấm men Basidiomycete trong khi trƣớc đó ngƣời ta thƣờng lầm tƣởng loài này thuộc nhóm động vật nguyên sinh. Năm 1994, Leclerc M.C. và cs kết hợp so sánh trình tự vùng LSU – rDNA và SSU – rDNA đã chứng minh S. apiospermum and S. prolificans có quan hệ về di truyền. Muthumeenakshi và cs (1994) đã chứng minh có sự đa hình trên các dòng T. harzianum khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS – rDNA. Dùng nấm Trichoderma chống bệnh cho cây bông, khoai tây và một số cây trồng khác, do Trichoderma có sự cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh: thối rễ cây hoà thảo, thối đen rễ cây bắp cải, dƣa leo, cà chua, bầu bí, bệnh chết ẻo trên cây họ đậu, bệnh chết rạp trên cây thuốc lá, bệnh héo cây ở cây bông, dƣa hấu, cây ăn trái và hàng loạt các bệnh do nấm gây ra (Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang 1997). Năm 1998, Nguyễn Thị Thuần đã chứng minh nấm Trichoderma có hiệu quả trong phòng trừ bệnh cây trồng do các nấm hại cây trồng. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997) và Nguyễn Thị Thuần (1999) đã đề xuất những loại môi trƣờng và điều kiện nhân sinh khối nấm Trichoderma với giá thành thấp từ những vật liệu rẻ tiền để tạo chế phẩm sinh học. Gary E. Harman (2000), nghiên cứu cơ chế tạo các enzyme phân huỷ lớp cellulose hay chitin nhƣ cellulase, chitinase, β – 1,3 glucanase của Trichoderma để xác định gene mã hóa cho các enzyme này, đáp ứng cho nghiên cứu tạo dòng, loại bỏ hoặc gia tăng số lƣợng bản sao của gene vì thế tăng lƣợng enzyme sản sinh ra hoặc biến nạp vào trong cây làm gia tăng khả năng kháng bệnh cho cây. Đồng thời, 13 khi cây đƣợc bón vào rễ T. harzianum (T-22) thì giảm 40% lƣợng phân đạm cần bón cho một vụ bắp. Ngoài ra, Trichoderma còn làm tăng sự nảy mầm và phát triển của cây, giúp cho bộ rễ phát triển mạnh hơn và giúp bắp, cải trở nên kháng tốt với khô hạn và có hiệu lực cao trong sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào trong đó cellulase dùng trong xử lý phân cắt polysaccharide (là chất đƣợc sử dụng nhiều trong chế biến lƣơng thực, thực phẩm và trong công nghiệp sợi) để làm tăng độ mềm và độ trắng của vải bông trong công nghiệp sợi. Enzyme này cũng đƣợc sử dụng trong thức ăn gia cầm để tăng sự tiêu hoá hemicellulose của lúa mạch hay từ những loại tinh bột khác. Trichoderma còn đƣợc sử dụng để phân giải rác sinh hoạt và các phế thải nông nghiệp nhờ khả năng tiết ra cellulase, enzyme này bền nhiệt hơn vi khuẩn (Nguyễn Xuân Thành, 2003). Ở viện Năng lƣợng Nguyên tử Việt Nam, Hoàng Hƣng Tiến (2005) [49], đang tiến hành nghiên cứu “gây tạo và chọn lọc đột biến Trichoderma chống chịu thuốc trừ nấm hóa học tồn lƣu trong đất canh tác bằng tia cực tím” [38]. Lê Đình Đôn và cs (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T. virens, T. harzianum và T. asperellum (có nguồn gốc trong nƣớc). Thiết lập hoàn chỉnh quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của ba loại nấm này và đã đăng ký thƣơng mại ba chế phẩm “Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh” và “BIO – TRI” với bản quyền thuộc trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, góp phần tạo sản phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng. 2.8. Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma Năm 2002, Christian P. Kubicek và cs giải mã trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron, khuếch đại bằng cặp primer tef1fw và tef1rev) trên 96 dòng nấm đƣợc phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Đài Loan, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Burma, Malaysia và Singapore. Kết luận 37 dòng là T. harzianum, 16 dòng T. virens, 8 dòng là T. spirale, T. asperellum có 4 dòng, T. koningii có 3 dòng, T. atroviride có 3 dòng, 1 dòng là T. hamatum, 1 dòng là T. ghanense và 2 dòng là Hypocrea jecorina (anamorph là T. reesei). Và xác định sự 14 tƣơng quan, mối quan hệ di truyền của chúng, trong 4 loài T. harzianum, T. virens, T. asperellum và T. atroviride thì T. harzianum có quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với T. atroviride có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất. Đồng thời, xác nhận phổ hệ di truyền từ đặc điểm hình thái tƣơng đồng với phổ hệ di truyền phân tử vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron). Cũng vào năm này, Christopher R. Thornton và cs cũng sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA để xác định mối quan hệ di truyền của các loài phân lập đƣợc. Trong 5 loài T. longibrachiatum, T. harzianum, T. virens, T. asperellum và T. atroviride thì T. harzianum cũng có quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với T. atroviride cũng có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất, đồng thời T. longibrachianum có mối quan hệ di truyền khá xa với các loài còn lại. Khi nghiên cứu trên 83 dòng nấm, Gary J. Samuels (2005) dựa vào hình thái nhận diện 72 dòng là Trichoderma và 19 dòng chƣa xác định chính xác có phải đó là Hypocrea hay không. Khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2, đọc trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định tên loài. Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA sẽ ko hoàn toàn chính xác vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng lớn về trình tự vùng này do đây là vùng bảo tồn. Do đó, việc xác định vùng gen chuyên biệt hơn nhƣ vùng gene mã hoá actin (act1), calmodulin (cal1), endochitinase 42 (ech42) và vùng tef1 sẽ giúp việc định danh chính xác hơn, phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Lại Hà Tố Hoa (2006), khuyếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với 2 cặp primer ITS4 – ITS5 và ElongR – ElongF của dòng Trichoderma T4 (đƣợc TS. Lê Đình Đôn và cs phân lập và định danh bằng hình thái tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ mẫu đất tại huyện Củ Chi, Tp. HCM), giải trình tự và so sánh với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và khẳng định tên loài của dòng T4 là Trichoderma asperellum. Có mức độ tƣơng đồng của vùng ITS – rDNA và vùng tef1fw – tef2rev cùng là 98%. 15 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc thực hiện từ 19/3/2007 đến 8/2007 tại phòng Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng – phòng Công nghệ sinh học thực vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu Là 11 dòng Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau ở Việt Nam, đã đƣợc định danh bằng hình thái và xác định tính đối kháng với các nấm gây bệnh hại cây trồng bởi TS. Lê Đình Đôn và cs, tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dựa theo khóa phân loại Trichoderma của Gary J. Samuels (2004) và tiêu bản chuẩn. Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài Ký hiệu Tên loài định danh dựa vào hình thái Địa điểm phân lập (Quận-Huyện, Tỉnh- Thành phố (đối tƣợng lấy mẫu)) Tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng T38 T. virens Quận Thủ Đức, Tp.HCM (đất) Sclerotium rolfsii (+++) * Pythium spp. (+++) Phytophthora spp. (+) * T14 T. harzianum Huyện Đa Oai, Lâm Đồng (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Pythium spp. (+++) Pythium spp. (+) Phytophthora spp. (++) * T6 Chƣa xác định Tiền Giang (dứa) Pythium spp. (++) Phytophthora spp. (++) Sclerotium rolfsii (++) 16 T37 T. sinensis Đồng Nai (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T33 T. asperellum Kiên Giang (dứa) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T19 T. asperellum Tây Ninh (đậu phụng) Chƣa xác định T2 T. asperellum hoặc T. harzianum Lâm Đồng (trà) Chƣa xác định T42 T. viride Bình Phƣớc (dứa) Chƣa xác định T88 T. asperellum Đồng Nai (đất) Fusarium spp. (+++) Phytophthora spp. (+++) Sclerotium rolfsii (+++) T85 T. harzianum Nghệ An (đất rừng) Fusarium spp. (+) T68 T. atroviride Bình Phƣớc (đất rừng) Sclerotium rolfsii (+++) Rhizoctonia solani (+++) Fusarium spp. (+) (*): (+++) đối kháng mạnh, (++) đối kháng trung bình, (+) đối kháng yếu. 3.2. Hoá chất Môi trƣờng CAM để lƣu trữ nguồn Trichoderma: thành phần gồm bột bắp (30 g), đƣờng dextrose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Môi trƣờng PGA (Potato Glusose Agar) để phục hồi Trichoderma: thành phần gồm khoai tây (200 g), glucose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Môi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma: thành phần gồm yeast extract (5 g), KH2PO4 (0.5 g), K2HPO4 (0.5 g), MgSO4 (0.5 g), glucose (20 g), CaCl2 (rất ít) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Ly trích DNA tổng số Trichoderma: nitơ lỏng, lysis buffer, phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1), chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch TE 1X Hoá chất cho điện di: gel agarose (gồm glucose và agar), đệm TAE 0.5X (dùng 17 để pha gel và làm buffer chạy điện di), ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) và blue loading dye 6X (Promega) Hoá chất cho phản ứng PCR (Promega): Taq DNA polymerase, 10X PCR buffer, dNTP, MgCl2, forward primer và reverse primer. 3.3. Dụng cụ và thiết bị Bình tam giác (250 ml, 500 ml (Đức)), giấy nhôm, nồi nấp khử trùng Tommy (Mỹ), máy lắc định ôn, máy vortex (IKA Works), ống nghiệm dung tích 15 ml (Đức), bộ cối chày nghiền mẫu (Đức), micropipette (10 l, 100 l, 1000 l (Đức)), tủ lạnh (-70 0C, -20 0C, - 4 0C (Sanyo – Nhật)), máy cất nƣớc 2 lần, máy chụp gel (Biorad – Mỹ), cối sứ và chày giã (Đức), eppendorf (0.2 ml, 05 ml, 1.5 ml (Mỹ), cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ), máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc), pipet các loại (Nichiryo – Nhật), máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức), bồn ủ nhiệt (Memmert), máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật) và lò viba (Electrolux – Thụy Điển) 3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma: từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn. Cách pha 1 lít môi trƣờng PGA: 200 g khoai tây đƣợc gọt vỏ cắt nhỏ và đun sôi, lọc qua vải để chỉ lấy phần dịch nƣớc. Thêm vào đó lƣợng glucose, agarose nhƣ trên và lƣợng nƣớc cho vừa đủ 1 lít. Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra đều. Môi trƣờng PGA đƣợc cho vào bình tam giác và hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút bằng autoclave. Để môi trƣờng nguội bớt rồi đổ khoảng 15 ml môi trƣờng vào đĩa petri sạch (90 mm), để nguội môi trƣờng sẽ đông cứng lại. Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lƣu trữ nguồn Trichoderma, đặt lên giữa mặt thạch PGA trong đĩa petri. Sau 2 – 3 ngày các khuẩn ty Trichoderma sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa. 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma Nhân sinh khối Tri