Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cây me rừng Phyllanthus emblica Linn. Họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Long Hải Mã số sinh viên : K38.201.027 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5/ 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Long Hải Mã số sinh viên : K38.201.027 Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5/ 2016 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Các thầy/ cô khoa Hóa, đặc biệt là thầy/ cô bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy/ cô bộ môn Hóa Hữu cơ trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, đã nhận lời phản biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp tôi hiểu rõ thêm về nội dung bài luận này. Các bạn sinh viên K38, Khoa Hóa ĐHSP TP.HCM đã cộng tác và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 2 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT .............................................................................................. 2 1.1.1 Mô tả chung ............................................................................................................ 2 1.1.2 Vùng phân bố ......................................................................................................... 3 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ....................................................................... 3 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền ............................................................................... 3 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính ......................................................................................... 3 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................ 4 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ......................................................................................... 13 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP ............................................................ 13 2.1.1 Hoá chất ................................................................................................................ 13 2.1.2 Thiết bị .................................................................................................................. 13 2.1.3 Phương pháp tiến hành .......................................................................................... 13 2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................... 13 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất .................................... 14 2.2 NGUYÊN LIỆU ...................................................................................................... 14 2.2.1 Thu hái nguyên liệu ............................................................................................... 14 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu .......................................................................................... 14 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ................................................................................. 14 2.3.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá ......................................................... 14 2.3.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ .................................................. 16 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ ........... 16 2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá .................................................. 17 2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3 ............................................................. 17 2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3 ......................................................... 18 2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ ........ 18 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane ..................................................................... 18 2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ ......................... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 20 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1 ............................................................ 20 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAC1 .......................................................... 23 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................... 27 4.1 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 27 4.2 ĐỀ XUẤT ................................................................................................................ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 29 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU NMR Nuclear magnetic reasonance spectroscopy COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy HSQC Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy HR-ESI-MS High resolution electrospray ionization mass spectrum J Coupling constant ppm Parts per million H Hexane EA Ethyl acetate Me Methanol DCM Dichloromethane Ac Acetone HSV Herpes simplex virus s Singlet d Doublet dd Doublet of doublets t Triplet m Multiplet DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá 17 Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate của lá 17 Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3 18 Bảng 2.4 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ 19 Bảng 2.5 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ 19 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEH1 23 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEAC1 26 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của lá 15 Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ 16 Hình 1.1 Cây me rừng 2 Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22 Hình 3.2 Một số tương quan COSY của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22 Hình 3.3 Một số tương quan COSY và HMBC của hợp chất PEAC1 25 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất PEH1 Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất PEH1 Phụ lục 3 Phổ COSY của hợp chất PEH1 Phụ lục 4 Phổ HSQC của hợp chất PEH1 Phụ lục 5 Phổ HMBC của hợp chất PEH1 Phụ lục 6a Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 6b Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 7a Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 7b Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 8a Phổ DEPT của hợp chất PEAC1 Phụ lục 8b Phổ DEPT của hợp chất PEAC1 Phụ lục 9 Phổ COSY của hợp chất PEAC1 Phụ lục 10 Phổ HSQC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 11a Phổ HMBC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 11b Phổ HMBC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 12 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PEAC1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa đã tạo điều kiện cho sự phát triển thảm thực vật vô cùng phong phú. Con người đã khai thác nhiều tính năng của các loài cây phục vụ cho đời sống, sản xuất và sinh hoạt, nhất là dùng để chữa bệnh. Từ lâu, dân gian đã xuất hiện nhiều loại cây chữa bệnh gan, tiểu đường, thận, Chi Phyllanthus là một chi lớn với khoảng 550 đến 750 loài [2], gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ như: Phyllanthus emblica L. (me rừng), Phyllanthus urinaria (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus urinaria L. (cây diệp hạ châu ngọt), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây phèn đen), Phyllanthus flexuosus (diệp hạ châu), Phyllanthus amarus (diệp hạ châu đắng),...những cây này được biết đến với tính năng chữa bệnh. Trong những năm gần đây, sự quan tâm đến chi này tăng lên đáng kể. Với nhịp điệu phát triển của hóa học và y học, các nhà khoa học không những nghiên cứu về đặc điểm thực vật mà còn về dược tính. Cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thuộc chi Phyllanthus được dùng nhiều trong y học cổ truyền để điều trị bệnh thận, nhiễm trùng đường ruột, tiểu đường, viêm gan B. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này trên thế giới đã được thực hiện, nhưng ở Việt Nam còn rất ít. Với mong muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hóa học trên cây me rừng được thu hái ở Bình Thuận. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Tên thường: cây me rừng Tên gọi khác: chùm ruột núi, dư cam tử, ngưu cam tử, du cam tử. Tên khoa học: Phyllanthus emblica L. Thuộc họ dầu (Euphorbiaceae) 1.1.1 Mô tả chung [1] Cây cao 3m, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm. Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phái dưới của cành, với rất nhiều hoa đực và hoa cái. Hoa nở từ tháng 3 đến tháng 11 hằng năm. Quả hình cầu. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt. Hình 1.1 Cây me rừng 2 1.1.2 Vùng phân bố Cây me rừng phân bố rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Á như ở Trung Quốc, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, bán đảo Mã Lai [17]. Ở nước ta, cây me rừng được trồng là loại cây mọc hoang trên các đồi trọc, xuất hiện nhiều tại các vùng rừng núi Việt Bắc và Tây Bắc [1]. 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Hầu hết các bộ phận đều được dùng làm thuốc như quả, lá, thân, rễ. 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân.Rễ vị đắng, chát, tính mát, có tác dụng hạ áp. Tại Ấn Độ, cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến. Cây me rừng giàu vitamin C, có tác dụng bảo vệ, tăng hấp thụ thức ăn, tăng cường phổi, nhuận tràng, tốt cho da và tóc, chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư da và gan. Một số bài thuốc cổ truyền Chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát: mỗi ngày dùng 10-30 quả sắc uống. Chữa viêm ruột, đau bụng, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống. Chữa lở loét, mẩn ngứa: dùng lá nấu nước rửa bên ngoài. Trị tiểu đường: quả me rừng 15-20g ướp muối và uống mỗi ngày. 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính Quả có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn, sát trùng, kháng vi rút, kháng viêm [10]. 3 Hợp chất geraniin (52) có tác dụng chống oxi hóa rất tốt với IC50 là 4,7 μM cho DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và 65,7 μM cho quá trình oxi hóa chất béo. Các hợp chất khác như quercetin (48), kaempferol (49), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (50), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (51), isocorilagin (53) cũng có tác dụng chống oxi hóa [13]. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất được cô lập từ quả me rừng cho thấy một số hợp chất có tác dụng gây độc tế bào ung thu vú như geraniin (52) và isocorilagin (53) với IC50 lần lượt là 13,2 và 80,9 μg/ml, cùng với các hợp chất quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (50) (IC50 15.5 μg/ml), kaempferol 3-O-β-D- glucopyranoside (51) (IC50 31.2 μg/ml), quercetin (48) (IC50 125 μg/ml), kaempferol (49) (IC50 125 μg/ml). Ngoài ra, isocorilagin có khả năng gây độc tế bào ung thư phổi với IC50 là 51,4 μg/ml [15]. Chiết xuất từ cây me rừng được Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu vào năm 2009 cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus và B. subtilis), Gram âm (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi) và nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) [14]. Tác dụng kháng virus HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D- glucose (54) được cô lập từ cây me rừng cũng được thử nghiệm. Kết quả cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của HSV với IC50 là 31,7 μM [16]. Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan và phục hồi gan bị tổn thương do ethanol khi thử nghiệm trên chuột với liều lượng 75 mg/kg/ngày [9]. Dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid (một loại thuốc trị bệnh động kinh nhưng có tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới) [6]. 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Phyllanthus emblica L. được trình bày như sau. 4 Các nghiên cứu trước 1998 cho thấy cây me rừng có chứa các hợp chất như zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl-β-D-glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9), glucose- gallin (10), ellagic acid (11), giberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16), leucodelphinidin (17), rutin (18) và β-sitosterol (19) [2]. HO NH N NH NN (1) NH N NN N O OHOH (2) OP O HO OH OH OH N H NN N N O OH HO OH (3) O O HO HO OH COOH COOH HOOC (4) OR O O O OR O OO HO OHOOC OH OH R=Galloyl (5) RO R=Galloyl (6) O OH OR HO O O HO HO OH O OH OH HO 5 O OHHORO OH R=Galloyl (7) OR O OR HO OH OH (8) R=H (9) R=C2H5 O OR OH OH HO HO R=Galloyl (10) O O O O OHHO HO OH (11) R2 H H R1 O OHO (12) R1=R2=OH (14) R1=H, R2=OH (16) R1=R2=H HO H H R O OHO (13) R=OH (15) R=H O O O OH HO OH OH OH OH OH (17) O OH HO O OR OH R=Rha-glu (18) OH HO H H H H H (19) Năm 2000, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã cô lập được các hợp chất phyllaemblic acid (20) và dẫn xuất (21-23) từ rễ của cây me rừng [17]. OO O O O R3O OR2 OR1 O (20) R1=R2=R3=H (21) R1=CH3, R2=R3=H (22) R1=CH3, R2=CH3CO, R3=H (23) R1=CH3, R2=R3=CH3CO Năm 2001, Ying-Jun Zhang cùng các cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất phenolic mới là L-malic acid 2-O-gallate (24), mucic acid 2-O-gallate (28), 2-O-galloyl mucic acid 6 1,4-lactone (29), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31), 3-O-galloyl mucic acid 1,4- lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34) cùng với các dẫn xuất methyl ester của những hợp chất này (25-27, 30, 32) [18] và các hợp chất phyllanemblinin A-F (35-40) từ cây me rừng [19]. COOH HOOC HRO R1OOC COOR2 H OR OH H OH H H OH R=Galloyl (24) R=Galloyl (25) R1=R2=CH3 (26) R1=H, R2=CH3 (27) R1=CH3, R2=H (28) R1=R2=H OO R1O OR2 H H OR3 OR4 O (29) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (30) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (33) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl (34) R1=R4=H, R2=R3=Galloyl O O OHHO H RO H R1O O R=Galloyl (31) R1=H (32) R1=CH3 OHO HO OH OH O O O O O OH OR HO R=Galloyl (35) OO O O HO HO O H HO OH OH O HO HO R=Galloyl (36) OR OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O HOOC HO H COOH OH OH R=Galloyl (37) 7 O R2O R3O OH OR4 OR1 (38) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (39) R1=Galloyl, R2=H, R3=neoche, R4=H (40) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=neoche Năm 2007, Chun-Bin Yang cùng các cộng sự đã cô lập được hợp chất ellagitanin mới là phyllanthunin (41), cùng 8 hợp chất khác đã biết như: gallic acid (8), ethyl gallate (9), ellagic acid (11), β-sitosterol (19), daucosterol (42), stearic acid (43), lauric acid (44), cinnamic acid (45) [3]. O OR OH OH OO O OH OHO O O OH OO HO HO HO OH R=Galloyl (41) O H H H (42) O OH OH HO HO OH O (45) R COOH (43) R=n-C17H35 (44) R=n-C11H23 Năm 2008, S. K. El-Desouky và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là apigenin-7- O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside) (46) và các hợp chất khác như gallic acid (8), 1,2,3,4,6-penta-O-galloylglucose (47) [8]. Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô lập thêm 6 hợp chất từ quả me rừng: quercetin (48), kaempferol (49), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (50), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (51), geraniin (52), isocorilagin (53) [13]. 8 OOH OOH OO OH O O HO HO (46) O OR OR OR RO RO R=Galloyl (47) O O O HO OH O OH HO OHOH O OH O OH HO OH (50) R=OH (51) R=H OH OH R (48) OH OOH HO O OH (49) R=Galloyl (52) OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O H OH OH O HO HO OH R=Galloyl (53) HO HO HO O O HO HO HO O ORO HO O OH Năm 2011, Yangfei Xiang cùng các cộng sự đã cô lập được 1,2,4,6-tetra-O- galloyl- β-D-glucose (54) từ lá và cành của cây me rừng [16]. 9 O OR ORHO RO RO R=Galloyl (54) Năm 2012, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được từ vỏ của trái me rừng các hợp chất chebulagic acid (55), chebulanin (56), isomallotusinin (57), và isocorilagin (53) [11]. Mahbuba Khatun và các cộng sự đã cô lập được β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside (58) từ cây me rừng [5]. OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR O OO HO OHOOC OH OH R=Galloyl (55) R=Galloyl (56) OH O O O OR O OO HO OHOOC OH OH HO OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O OH OHHO HO R=Galloyl (57) O H OH OH HO HO (58) Năm 2013, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được các hợp chất sterol (59-70), từ cành và lá của cây me rừng, trong đó có 2 hợp chất sterol mới là trihydroxysitosterol (60) và 5α,6β,7α-acetoxysitosterol (61) [12]. 10 H R OH OH HO (59) R=H (60) R=OH R2HO (61) R1=H, R2=CH3COO (62) R1=H, R2=OH (63) R1=CH3CH2O, R2=H (64) R1=R2=O R1 H (65) R1=R2=H (66) R1=R2=O (67) R1=H, R2=OH O R2R1 H HO OH (68) H O R1 O OH HO HO R2 (69) R1=H, R2=CH3-(CH2)14COO (70) R1=OH, R2=CH3-(CH2)14COO 11 Ghi chú: Galloyl OH HO HO O Neoche O O OH OHHO HHOOC H HOOC H CO O OH HO HO HO O HO OH OH O HO OH HO O Glu= Glucopyranosy Rha-glu= α-L-rhamnopyranosyl (1→6) –O-β-D- glucopyranosyl 12 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 2.1.1 Hoá chất  Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Ấn và Merck dùng cho cột sắc kí.  Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc kí cột.  Sắc kí bảng mỏng loại 25DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60F 254 , Merck.  Sắc kí bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethanol, acetone, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng H2SO4 20%. 2.1.2 Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử. 2.1.3 Phương pháp tiến hành 2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất Dùng phương pháp sắc kí để cô lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ bao gồm các kĩ thuật SKC silica gel pha thường và pha đảo RP-18 kết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%. 13 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR được đo tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, TP.Hồ Chí Minh. Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS tại Phòng thí nghiệm Viện Kiểm Nghiệm Thuốc, 200 Cô Bắc, Cô Giang, Quận 1, TP.Hồ Chí Minh. 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.2.1 Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu đề tài là lá, thân và rễ cây me rừng (Phyllanthus emblica L. ) được thu hái tỉnh Bình Thuận, vào tháng 5/2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica L.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 2.3.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá Các bộ phận cây me rừng (Phyllanthus emblica L. ) như rễ, thân, lá được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi. Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô. Cao ethanol thô của lá được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate. Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.1. 14 Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của lá Bột lá khô (7.2 kg) - Ngâm trong ethanol 96 o Bã khô Dịch ethanol - Cô quay thu hồi dung Ethanol thu hồi Cao ethanol (285.5 g) - Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung Cao hexane (22.1 g) Cao ethyl acetate (143.1 g) Cao còn lại (77.1 g) 15 2.3.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ Cao ethanol thô rễ được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate. Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.2. Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ Phương pháp SKC (sắc kí cột): Các cao (hoặc phân đoạn) được sắc kí cột với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, dịch giải ly qua cột được hứngg vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM (sắc kí lớp mỏng). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau gom chung thành một phân đoạn. Bột rễ khô (9.4 kg) - Ngâm trong ethanol 96 o Bã khô Dịch ethanol - Cô quay thu hồi dung Ethanol thu hồi Cao ethanol (252.4 g) - Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung Cao hexane (6.1 g) Cao ethyl acetate (75.1 g) Cao còn lại (152.3 g) 16 2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá Cao ethyl acetate của lá me (143.1g) được SKC silica gel lần lượt với các hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần (80-100% EA), tiếp sau là hệ dung môi EA:Me (5- 100% Me). Kết quả thu được 5 phân đoạn kí hiệu từ EA1 – EẠ5. Kết quả được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA1 H:EA 2:8 16.50 Vệt dài Đã khảo sát 2 EA2 EA 13.28 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 EA3 EA:Me 95:5 22.25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát 4 EA4 EA:Me 8:2 33.40 Nhiều vết Đã khảo sát 5 EA5 EA:Me 7:3 14.70 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol) 2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3 Phân đoạn EA3 (22.25g) cho SKLM nhiều vết, có vết tách rõ nên phân đoạn EA3 được thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me (0-30% Me). Kết quả thu được 7 phân đoạn EA3.1-EA3.7, được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA3.1 C 1.82 Vệt dài Khảo sát 2 EA3.2 C:Me 95:5 1.23 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 3 EA3.3 C:Me 9:1 0.85 Nhiều vết, tách rõ Thu được PEH1 4 EA3.4 C:Me 85:15 1.88 Vệt dài Chưa khảo sát 5 EA3.5 C:Me 8:2 2.55 Vệt dài Chưa khảo sát 6 EA3.6 C:Me 8:2 4.86 Kéo vệt Chưa khảo sát 7 EA3.7 C:Me 7:3 3.40 Kéo vệt dài Chưa khảo sát 17 Ghi chú: C(Chloroform), Me (Methanol) 2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3 Phân đoạn EA3.3 (0.85 g) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn EA3.3 được SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me 9:1. Kết quả thu được 5 phân đoạn EA3.3.1-EA3.3.5, được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA3.3.1 C 132.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 EA3.3.2 C:Me 9:1 72.0 Nhiều vết, kéo vệt Khảo sát 3 EA3.3.3 C:Me 87:13 54.3 Tách vết rõ Thu được PEH1 4 EA3.3.4 C:Me 8:2 143.4 Kéo vệt Chưa khảo sát 5 EA3.3.5 C:Me 8:2 186.1 Kéo vệt Chưa khảo sát Ghi chú: C (chloroform), Me (methanol) Phân đoạn EA3.3.3 (54.3 mg) được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi C:Me (87:13) thu được 15.0 mg hợp chất dạng dầu, màu vàng, đặt kí hiệu là PEH1. 2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ Trích 1.1g từ 6.1g cao hexane của rễ, SKC với hệ dung môi giải ly H:DCM có độ phân cực tăng dần (0-100% DCM), tiếp theo giải ly với hệ dung môi DCM:Me có độ phân cực tăng dần (0-30% Me). Kết quả thu được 9 phân đoạn, kí hiệu từ RH1 – RH9. Kết quả được trình bày ở bảng 2.4. 18 Bảng 2.4 Sắc kí cột trên cao hexane của rễ STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 RH1 H:DCM 4:1 18.2 Vệt dài Chưa khảo sát 2 RH2 H:DCM 2:3 378.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 RH3 H:DCM 1:4 15.5 Nhiều vết Chưa khảo sát 4 RH4 H:DCM 1:4 20.3 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 RH5 DCM 45.4 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 6 RH6 DCM:Me 97:3 158.7 Tách vết rõ Đã khảo sát 7 RH7 DCM:Me 9 :1 72.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 8 RH8 DCM:Me 9:1 35.2 Vệt dài Chưa khảo sát 9 RH9 DCM:Me 9: 1 101.2 Vệt dài Chưa khảo sát Ghi chú: H (hexane), DCM (dichloromethane), Me (Methanol) 2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ Phân đoạn RH6 (158.7 mg) được SKC silica gel bằng hệ dung môi H:DCM với độ phân cực tăng dần (0-100% DCM). Kết quả thu được 5 phân đoạn, kí hiệu từ RH6.1 – RH6.5. Kết quả được trình bày ở bảng 2.5. Bảng 2.5 Sắc kí cột trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 RH6.1 DCM 22.3 Vệt dài Chưa khảo sát 2 RH6.2 DCM 24.4 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát 3 RH6.3 DCM: Me 97:3 26.1 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát 4 RH6.4 DCM:Me 95:5 38.8 Tách vết rõ Thu được PEAC1 5 RH6.5 DCM: 95:5 23.1 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: DCM (dichloromethane), Me (methanol) 19 Phân đoạn RH6.4 được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi DCM :Me 95:5 và SKC silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi Ac: Me (2:1) thu được 8.0 mg chất rắn, màu trắng, được kí hiệu là PEAC1. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1 Hợp chất PEH1 (15.0 mg) thu được từ phân đoạn EA3.3.3 của bảng 3 có những đặc điểm sau: - Dạng dầu màu vàng. - SKLM với hệ giải ly C:Me 87:13 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu đen. - Phổ 1H-NMR (MeOD, phụ lục 1), δH (ppm): 4.71, 4.20, 3.90, 3.84, 3.31, 3.20 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.1. - Phổ 13C-NMR (MeOD, phụ lục 2), δC (ppm): 105.4, 101.2, 78.0, 77.9, 75.1, 75.0, 73.5, 71.8, 71.6, 62.7, 57.3, 55.5 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.1. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (MeOD, phụ lục 3, 4 và 5 ). Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR của hợp chất PEH1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen trong vùng δH 4.80-3.10. Trong đó, hai cặp tín hiệu cộng hưởng tại δH 4.71 (1H, d, J=3.5 Hz) và δH 4.20 (1H, d, J= 8.0 Hz) là những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton anomer. Phổ 13C-NMR cho thấy hai tín hiệu cộng hưởng của carbon anomer ở δC 101.2 và 105.3. Ngoài ra, phổ đồ còn thể hiện những tín hiệu cộng hưởng của carbon mang oxygen 20 của đường trong vùng δC 105.3-62.7. Từ đó, cho phép dự đoán hợp chất PEH1 có hai phân tử đường. Phổ HSQC cho thấy proton anomer cộng hưởng tại δH 4.71 (H-1a) tương quan với carbon anomer cộng hưởng tại δC 101.2 (C-1a). Tương tự, proton cộng hưởng tại δH 4.20 (H-1b) cho tương quan với carbon anomer cộng hưởng tại δC 105.3 (C-1b). Phổ COSY của hợp chất PEH1 thể hiện sự tương quan giữa proton anomer δH 4.71 (H-1a) và proton cộng hưởng tại δH 3.42 ( H-2a), còn proton anomer δH 4.20 (H-1b) lại cho tương quan với proton cộng hưởng tại δH 3.20 (H-2b). Ngoài ra, phổ HMBC còn giúp xác định thêm cấu trúc của hai phân tử đường. Theo đó, proton anomer của phân tử đường thứ nhất δH 4.71 cho tương quan HMBC với các carbon cộng hưởng tại δC 75.1 ( C-3a), δC 55.5 (-OCH3). Proton cộng hưởng tại δH 3.44 (-OCH3) cho tương quan với carbon δC 101.2 (C-1a). Như vậy tại vị trí C-1 của phân tử đường thứ nhất gắn -OCH3. Các tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.1. Tương tự, phổ HMBC cũng thể hiện sự tương quan giữa proton anomer của phân tử đường thứ hai δH 4.20 với carbon của nhóm methoxy (δC 57.3) và ngược lại. Từ đó cho thấy nhóm -OH vị trí C-1b của phân tử đường thứ hai tại đã bị methyl hóa. Tuy nhiên, phổ HMBC không xuất hiện sự tương quan nào giữa hai phân tử đường. Qua các dữ liệu phổ NMR trên, có thể dự đoán hợp chất PEH1 là hỗn hợp 2 phân tử đường. Phân tử đường thứ nhất có các nguyên tử carbon cộng hưởng tại δC 101.2, 77.9, 75.1, 73.5, 71.8, 62.7 và phân tử đường thứ hai có các nguyên tử carbon cộng hưởng tại δC 105.4, 78.0, 75.0, 73.5, 71.6, 62.7. Proton anomer H-1a của phân tử đường thứ nhất có hằng số ghép J= 3.5 Hz nên phân tử đường thứ nhất có cấu hình α. Proton H-1b phân tử đường thứ hai có hằng số ghép J= 8.0 Hz nên phân tử đường thứ hai có cấu hình β. Proton H-3a (δH 3.65) xuất hiện dưới dạng mũi dd giống mũi ba có hằng số ghép J= 9.0 và 8.5 Hz, nên có thể dự đoán H-4a ở vị trí trục. Tương tự, proton H-3b (δH 3.30) có hằng số ghép J= 10.0 và 9.0 Hz nên H-4b cũng ở vị trí trục. 21 Từ những dữ liệu NMR, hợp chất PEH1 được đề nghị là hỗn hợp hai phân tử đường. Phân tử đường thứ nhất là 1-O- methyl-α-D-glucopyranoside (PEH1-a) và phân tử đường thứ hai là 1-O- methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-b). O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-a) (PEH1-b) Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chất PEH1-a và PEH1- b O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH 1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-a) (PEH1-b) Hình 3.2 Một số tương quan COSY của hợp chất PEH1-a và PEH1- b 22 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEH1 Vị trí PEH1-a (CD3OD) PEH1-b (CD3OD) δH (ppm), J(Hz) δC (ppm) δH (ppm), J(Hz) δC (ppm) 1 4.71 (d, 3.5) 101.2 4.20 (d,8.0) 105.3 2 3.42 (dd, 9.5/4.0) 73.5 3.20 (dd, 9.0/8.5) 75.0 3 3.65 (dd, 9.0/8.5) 75.1 3.30 (dd, 10.0/9.0) 78.0 4 3.31 (m) 71.8 3.32 (m) 71.6 5 3.33 (m) 77.9 3.55 (m) 73.5 6 3.84, 3.70 (m) 62.7 3.84, 3.70 (m) 62.7 1 -OCH3 3.44 (s) 55.5 3.57 (s) 57.3 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAC1 Hợp chất PEAC1 (8.0 mg) thu được từ phân đoạn RH6.4 có những đặc điểm sau: - Dạng tinh thể màu trắng. - SKLM với hệ giải ly DCM:Me 95:5 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu nâu. - Phổ 1H-NMR (CDCl3 + MeOD, phụ lục 6a và 6b), δH (ppm) : 5.58, 4.87, 4.84, 1.2, 1.00, 0.96, 0.93, 0.91 và 0.82 và các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ 13C-NMR (CDCl3 + MeOD, phụ lục 7a và 7b), δC (ppm): 182.5, 175.3, 151.3, 111.0 và các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC (CDCl3 + MeOD, phụ lục 8a,8b,9,10,11a và 11b). - Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 12). Biện luận phổ Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton olefin ở δH 5.58 (1H, dd, J= 17.0 /10.5Hz), 4.86 (1H, dd, J= 10.5/1.5Hz) và 4.84 (1H, dd, J= 17.5/1.0Hz), proton của sáu nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp ở δH 1.20, 1.00, 0.96, 0.93, 0.91 và 0.82. 23 Phổ 13C-NMR kết hợp với kĩ thuật DEPT cho thấy có ba mươi carbon, nên dự đoán hợp chất cô lập được là triterpene. Trong đó có hai carbon olefin loại –CH2=CH– cộng hưởng ở δC 151.3 và 111.0, sáu carbon tứ cấp loại >CCH–, mười một carbon >CH2 , sáu carbon methyl. Ngoài ra, phổ đồ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai carbon >C=O ở δC 182.5 và 175.3. Cấu trúc của các triterpene năm vòng thường có nhóm –OH gắn tại C-3 hoặc tại C-3 là >C=O [7]. Trong cấu trúc của hợp chất PEAC1 không có tín hiệu cộng hưởng 1H- NMR và 13C-NMR cho thấy C-3 gắn –OH hoặc C-3 trở thành >C=O. Kết hợp dữ kiện nối đôi olefin dạng –CH=CH2 và sáu nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp, các tín hiệu >CH– tại δC 58.6, 53.4 và 42.8 dự đoán hợp chất là triterpene có khung sườn friedelan với vòng A bị phá vỡ. Phổ COSY cho thấy proton cộng hưởng tại δH 2.23 (H-2) tương quan với proton cộng hưởng tại δH 1.38, 1.50 (H-1), proton cộng hưởng tại δH 1.54 (H-18) cho tương quan với proton cộng hưởng tại δH 1.90, 1.25 (H-19). Phổ HMBC cho thấy proton >CH– cộng hưởng ở δH 0.84 (t, J= 4.0) tương quan với carbon olefin cộng hưởng tại δC 151.3, methyl δC 18.0 (–CH3), proton olefin ở δC 5.58 cho tương quan với các carbon ở δC 58.6 (>CH–, C-10), 42.38 (>C<, C-5) và 18.0 (–CH3 , C-24). Hai proton olefin còn lại cho tương quan HMBC với carbon cộng hưởng ở δC 42.4 (C-5), 151.3 (=CH, C-4). Do đó, hợp chất PEAC1 được dự đoán nối đôi –CH=CH2 nằm ở vị trí C-4 – C-23. Proton của hai nhóm methylen khác ở δH 2.40 (H-21) và 1.90 (H-19) cũng cho tương quan HMBC với carbon nhóm –COOH ( δC 182.5), proton của nhóm methyl cộng hưởng ở δH 1.20 (H-30) cũng cho tương quan HMBC với carbon – COOH ở δC 182.5, nên cho phép dự đoán C-29 của khung friedelan đã trở thành –COOH. Các tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.3. Khối phổ phân giải cao cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z = 471.3472, phù hợp với công thức phân tử C30H48O4 [M-H]- = 471.3474. 24 Từ tất cả dữ liệu NMR, kết hợp so sánh dữ liệu NMR của hai hợp chất 3,4- secofriedelan-3,28-dioic acid [4] và hợp chất 3-oxofriedelan-29-oic acid [7] có những điểm tương đồng nên cấu trúc của hợp chất được đề nghị là 3,4-secofriedel-4(23)-en- 3,29-dioic acid. Đây là hợp chất mới trong tự nhiên đã được xác định bằng phần mềm Scifinder vào ngày 16/5/2016 tại Đại học Jhong-Li, Taiwan. HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (PEAC1) HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30HOOC Hình 3.3 Một số tương quan COSY và HMBC của hợp chất PEAC1 25 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEAC1 Vị trí PEAC1 (CDCl3+CD3OD) 3,4-secofriedelan- 3,28-dioic [4] 3-oxofriedelan-29- oic acid [7] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm) δC (ppm) 1 1.50 (m), 1.38 (m) 21.8 22.55 22.2 2 2.23 (m) 37.6 38.93 41.3 3 175.3 177.88 213.3 4 5.58 (dd,17.0/10.5) 151.3 37.17 58.2 5 42.4 38.84 42.1 6 41.8 39.96 41.3 7 18.2 19.06 18.2 8 53.4 54.32 50.7 9 38.4 40.38 37.4 10 0.84 (t, 3.5) 58.6 60.83 59.8 11 35.5 36.21 35.3 12 30.2 32.01 30.2 13 40.5 38.84 39.1 14 39.0 39.96 39.2 15 33.0 33.83 29.7 16 35.8 30.82 36.1 17 29.8 45.84 30.1 18 1.54 (m) 42.8 39.09 44.2 19 1.90 (dd), 1.25 (m) 31.7 35.97 29.5 20 40.0 29.40 40.4 21 28.7 33.66 29.5 22 38.7 37.10 36.6 23 4.86 (dd, 10.5/1.5), 4.84 (dd, 17.5/1.0) 111.0 7.94 6.2 24 0.93 (s) 18.0 19.89 14.6 25 0.82 (s) 17.9 18.11 18.0 26 0.91 (s) 21.0 21.27 18.4 27 0.96 (s) 18.3 19.14 16.3 28 1.00 (s) 32.1 182.69 31.8 29 182.5 30.31 184.5 26 30 1.20 (s) 32.1 35.03 31.6 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ dịch chiết cao ethyl acetate của lá thu được hợp chất PEH1. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm, đó là hỗn hợp 1-O-methyl-α- D-glucopyranoside và 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside. O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-a) (PEH1-b) Từ dịch chiết cao hexane của rễ thu được hợp chất PEAC1. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm và so sánh tài liệu tham khảo nên được đề nghị là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid. Đây là hợp chất mới trong tự nhiên. HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC 27 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (PEAC1) 4.2 ĐỀ XUẤT Trong phạm vi khóa luận, tôi chỉ mới khảo sát trên cao ethyl acetate của lá và cao hexane của rễ, nên trong thời gian tới nếu có điều kiện tôi sẽ khảo sát trên cao butanol và các bộ phận còn lại của cây me rừng với nhiều hi vọng cô lập thêm được những hợp chất có cấu trúc mới và sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập được, mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu Y học cổ truyền dân tộc. 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 29 [1] Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 695- 696. Tài liệu Tiếng Anh [2] Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus: Their Chemistry, Pharmacology, and Therapeutic Potential”, Pharmacology, Medicinal Research Reviews, 18(4), 225-258. [3] Chun-Bin Yang, Fan Zhang, Mei-Cai Deng, Guang-Yun He, Jian-Min Yue and Run-Hua Lu (2007), “A New Ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L.”, Journal of the Chinese Chemical Society, 54, 1615-1618. [4] F. Laure, G. Herbette, R. Faure, J.P. Bianchini, P. Raharivelomanana and B. Fogliani (2005), “Structures of new secofriedelane and friedelane acids from Calophyllum inophyllum of French Polynesia”, Magnetic Resonance In Chemistry, 43, 65-68. [5] Mahbuba Khatun, MiraJum Billah and Md. Abdul Quader’ (2012), “Sterols and Sterol Glucoside from Phyllanthus Species”, Dhaka University Journal of Science, 60(1), 5-10. [6] Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uanindut, Somsak Nualkaew and Bungorn Sripanidkulchai (2015), “Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular damage in valproic acid – included rats”, Int. J. Morphol, 33(3), 1016 – 1022. [7] Shashi B. Mahato, Asish P. Kundu (1994), “13C-NMR spectra of pentacylic triterpenoids- a complication and some salient features”, Phytochemistry, 37(6), 1517-1575. [8] S. K. El-Desouky, Shi Young Ryu and Young-Kyoon Kim (2008), “A new cytotoxic acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L.”, Natural Product Research, 22(1), 91-95. 30 [9] Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), “Hepatoprotective activity of some indigenous plants”, International Journal of PharmTech Research, 2(1), 568-572. [10] Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2011), “Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from Phyllanthus emblica L. fruit”, Food Chemistry, 126, 277-282. [11] Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2012), “Structural identification of isomallotusinin and other phenolics in Phyllanthus emblica L. fruit hull”, Food Chemistry, 132, 1527-1533. [12] Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), “Cytotoxicity and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica”, Fitoterapia, 84, 252-256. [13] Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008), “Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities”, Food Chemistry, 109, 909-915. [14] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, JinshuiWang and Weilou (2009), “Antimicrobial and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical carbon dioxide extraction and methanol extraction”, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330. [15] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wu, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua Tao, Jinshui Wang (2012), “Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.)”, Food Chemistry, 131, 685-690. [16] Yangfei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong, YingJun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato and Yifei Wang (2011), “In vitro Anti‐Herpes simplex virus activity of 1,2,4,6‐tetra‐O‐ galloyl‐β‐D‐glucose from Phyllanthus emblica L. (Euphorbiaceae)”, Phytotherapy Research, 25, 975-982. 31 [17] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang and Isao Kouno (2000), “Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthus emblica ”, Tetrahedron Letters, 41, 1781-1784. [18] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, and Isao Kouno (2001), “New phenolic constituents from the Fruit Juice of Phyllanthus emblica”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 49(5), 537-540. [19] Ying-Jun Zhang, Tomomi Abe, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, and Isao Kouno (2001), “Phyllanemblinins A-F, New ellagitannins from Phyllanthus emblica”, Journal of Natural Products, 64, 1527-1532. 32 PHỤ LỤC Ph ụ lụ c 1 . P hổ 1 H -N M R củ a hợ p ch ất P EH 1 Ph ụ lụ c 2 . P hổ 13 C- N M R củ a hợ p ch ất P EH 1 Ph ụ lụ c 3 . P hổ C O SY c ủa h ợp c hấ t P EH 1 Ph ụ lụ c 4 . P hổ H SQ C củ a hợ p ch ất P EH 1 Ph ụ lụ c 5 . P hổ H M BC c ủa h ợp c hấ t P EH 1 Ph ụ lụ c 6 a. P hổ 1 H -N M R củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 6 b. P hổ 1 H -N M R củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 7 a. P hổ 13 C- N M R củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 7 b. P hổ 13 C- N M R củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 8 a. P hổ D EP T củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 8 b. P hổ D EP T củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 9 . P hổ C O SY c ủa h ợp c hấ t P EA C 1 Ph ụ lụ c 1 0. P hổ H SQ C củ a hợ p ch ất P EA C 1 Ph ụ lụ c 1 1a . P hổ H M BC c ủa h ợp c hấ t P EA C 1 Ph ụ lụ c 1 1b . P hổ H M BC c ủa h ợp c hấ t P EA C 1 Phụ lục 12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PEAC1 Ý KIẾN CỦA HỘI ĐỒNG TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Chủ tịch hội đồng Lê Tín Thanh