Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của lá cây me rừng Phyllanthus emblica

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực hiện : Nguyễn Ngọc Tín Mã số sinh viên : K38.201.124 Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực hiện : Nguyễn Ngọc Tín Mã số sinh viên : K38.201.124 Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn cũng như giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cô không chỉ hỗ trợ cho em về mặt kiến thức khoa học cũng như kỹ năng mà còn truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Đó là hành trang quý báu cho em trên bước đường tương lai sau này. Em xin hết lòng cảm ơn quý Thầy Cô trong phòng hợp chất thiên nhiên nói riêng và các Thầy Cô khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh nói chung. Các Thầy Cô đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt thời gian em học tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên Trường đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình trao đổi những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY ME RỪNG .................................................. 2 1.1.1. Mô tả chung ...................................................................................................... 2 1.1.2. Vùng phân bố .................................................................................................... 2 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ................................................................. 2 1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền ......................................................................... 2 1.2.2. Nghiên cứu về dược tính ................................................................................... 3 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC .......................................... 4 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 14 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .................................. 14 2.1.1. Hóa chất .......................................................................................................... 14 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................ 14 2.1.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................... 14 2.2. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................... 15 2.2.1. Thu hái nguyên liệu ........................................................................................ 15 2.2.2. Xử lí mẫu nguyên liệu ..................................................................................... 15 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ............................................................................... 15 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO HEXANE ........................ 16 2.4.1. Sắc ký cột silica gel trên cao hexane .............................................................. 16 2.4.2. Sắc ký cột trên phân đoạn H2 của bảng 2.1 .................................................... 17 2.4.3. Sắc ký cột trên phân đoạn H2.4 của bảng 2.2 ................................................. 17 2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE ....... 18 2.5.1. Sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate ...................................................... 18 2.5.2. Sắc ký cột trên phân đoạn EA4 của bảng 2.4 ................................................. 19 2.5.3. Sắc ký cột trên phân đoạn EA4.1 của bảng 2.5 .............................................. 19 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 21 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEATC1 ................................................ 21 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PHTC2 .................................................. 22 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 24 4.1. KẾT LUẬN........................................................................................................... 24 4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................. 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1) 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi t Triplet Mũi ba dd Double of doublet Mũi đôi đôi m Multiplet Mũi đa δ Chemical shift Độ chuyển dịch hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin ppm Part per million Một phần một triệu RP-18 Reversed Phase-18 Pha đảo C-18 UV Ultra Violet Tia cực tím Rf Retention factor EA Ethyl Acetate Etyl acetat C Chloroform Cloroform DCM Dichloromethane Diclorometan Me Methanol Metanol H n-Hexane Hexan AcOH Acetic acid Axit axetic Ac Acetone Aceton Glu Glucopyranosyl Glucopyranosyl SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng g gam mg miligam MHz Mega Hertz Hz Hertz Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây me rừng Phyllanthus Emblica Linn. ........ 4 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao hexane .................................................................... 15 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2 ................................................................ 16 Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2.4 ............................................................. 16 Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ............................................................ 18 Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 ............................................................. 18 Bảng 2.6. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.1 .......................................................... 19 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEATC1 ........................................................... 21 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PHTC2 ............................................................. 24 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao hexane và ethyl acetate ............................................ 15 Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất PHTC2 ................................................................ 17 Sơ đồ 2.3. Quy trình cô lập hợp chất PEATC1 ............................................................. 19 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Lá cây me rừng ............................................................................................... 2 Hình 1.2. Quả me rừng ................................................................................................... 2 Hình 3.1. Một số tương quan HMBC của hợp chất PHTC2 ........................................ 23 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR (Acetone-d6) của hợp chất PEATC1 ........................................ Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR (Acetone-d6) của hợp chất PEATC1 ....................................... Phụ lục 3. Phổ 1H-NMR (CDCl3) của hợp chất PHTC2 .................................................. Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất PHTC2 ................................................. Phụ lục 5. Phổ HSQC (CDCl3) của hợp chất PHTC2 ...................................................... Phụ lục 5a. Phổ HSQC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PHTC2 ..................................... Phụ lục 6. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PHTC2 ..................................................... Phụ lục 6a. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PHTC2 .................................... Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín LỜI MỞ ĐẦU Chi Phyllanthus là một chi lớn, có khoảng 500 – 700 loài được chia thành 10 – 11 chi nhỏ, bao gồm Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Conani, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus, Ericocus và Phyllanthus [5]. Trong những năm gần đây, các loại cây thuộc chi Phyllanthus đang rất được quan tâm bởi những ứng dụng của nó trong y học cổ truyền. Trong số đó, Phyllanthus amarus Schum et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng), Phyllanthus urinaria L. (cây Diệp hạ châu ngọt) và Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) được dùng nhiều trong các bài thuốc chữa bệnh gan, sỏi thận, Cây me rừng (Phyllanthus emblica Linn) là cây thuộc chi Phyllanthus. Cây này đã và đang được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Ở nước ta, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa. Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn. Quả có thể dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát. Rễ được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp. Còn lá nấu nước rửa bên ngoài có thể trị lở loét, mẫn ngứa [1]. Bên cạnh việc được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, các hợp chất được cô lập từ cây me rừng đã được chứng minh có tác dụng hạ men gan, chống oxi hóa, kháng khuẩn, Mặc dù, thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây me rừng, nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này rất ít. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn cây me rừng để nghiên cứu trong đề tài này với mong muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học Việt Nam. 1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY ME RỪNG: Tên thông thường: Me rừng Tên gọi khác: du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn. Hình 1.1. Lá cây me rừng Hình 1.2. Quả me rừng 1.1.1 Mô tả chung: Cây có chiều cao trung bình 3m, phân nhiều nhánh. Cành nhỏ, mềm, dài 20cm, bên ngoài có phủ một lớp lông. Lá xếp thành hai hàng trên các cành nhỏ trông giống như lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ, hình ba cạnh. Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 10 hàng năm. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa mọc ở nách lá phía dưới của cành, với rất nhiều hoa đực, vài hoa cái. Quả tươi hình cầu, mọng nước, sau khi khô thành quả nang. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt [1]. 1.1.2 Vùng phân bố: Me rừng được phân bố rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc và Ấn Độ [10]. Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa. Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn [1]. 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân, thường dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát (dùng 10 – 30 quả sắc uống mỗi ngày). Còn rễ có vị đắng, chát, tính mát được dùng để trị viêm ruột, đau 2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín bụng đi ngoài, cao huyết áp (dùng 15 – 20g sắc uống mỗi ngày). Bên cạnh đó, lá nấu nước rửa bên ngoài để trị lở loét, mẩn ngứa. Tại Ấn Độ, quả me rừng được dùng như một nguồn vitamin C với tên “myrobalan emblic”. Quả tươi là một vị thuốc mát, lợi tiểu, nhuận tràng, dùng dưới hình thức mứt (thêm đường mật), còn quả khô có thể dùng chữa lỵ, ỉa chảy [1]. 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính • Tác dụng bảo vệ gan Chiết xuất ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng gan với liều lượng 75mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [8]. • Tác dụng kháng virus Hợp chất 1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75) được Yang Xiang và các cộng sự cô lập được từ cây me rừng vào năm 2011 có khả năng ức chế Herpes Simplex virus type 1 (HSV-1), từ đó ngăn chặn sự lây nhiễm virus trong giai đoạn đầu với nồng độ 31.70 μM [17]. • Tác dụng kháng khuẩn Chiết xuất từ cây me rừng được Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu vào năm 2007 cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus và B. subtilis), Gram âm (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi) và nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) [14]. • Tác dụng gây độc tế bào ung thư Vào năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất được cô lập từ quả me rừng. Kết quả cho thấy một số hợp chất có tác dụng gây độc tế bào ung thư vú như geraniin (50) (IC50 13.2 μg/ml), quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside (70) (IC50 15.5 μg/ml), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (71) (IC50 31.2 μg/ml), isocorilagin (39) (IC50 80.9 μg/ml), quercetin (69), kaempferol (68) (IC50 125 μg/ml) [15]. Một nghiên cứu khác được Xinxian Zhu cùng các cộng sự công bố vào năm 2013 cho thấy dịch chiết polyphenol từ cây me rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) ở nồng độ là 150 mg/ml [6]. • Tác dụng chống oxi hóa 3 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Năm 2007, Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn và chống oxi hóa của dịch chiết từ cây me rừng. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của cây có khả năng chống oxi hóa cao với IC50 11.1 μg/ml [6]. Bên cạnh đó, các hợp chất phenol từ quả me rừng như isocorilagin (39), geraniin (50), kaempferol (68), quercetin (69), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (70), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (71) cũng có hoạt tính chống oxi hóa[13]. Các hợp chất khác như chebulagic acid (41), mallotusinin (42), chebulanin (40), gallic acid (7), ellagic acid (21) và 3-O-galloyl 1,4-latone mucic acid (14) được cô lập từ quả me rừng cũng được thử nghiệm và cho thấy có khả năng chống oxi hóa [10]. • Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng của thuốc động kinh Theo nghiên cứu vào năm 2015 của Sitthichai Iamsaard và các cộng sự, dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid (một loại thuốc trị bệnh động kinh nhưng có tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới) [9]. 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Bảng 1: Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn) S T T Nhóm hợp chất Hợp chất Bộ phận cây Tài liệu tham khảo 1 Alkaloid Zeatin [5] 2 Zeatin nucleotide [5] 3 Zeatin riboside [5] 4 Benzenoid Chebulic acid [5] 5 3-6-di-O-galloyl-β-O-D-glucopyranose [5] 6 Gluco-gallin [5] 7 Gallic acid Quả [5], [4] 8 Ethyl Gallate [5], [4] 9 Cinnamic acid [4] 10 2-O-galloyl L-malic acid Quả [18] 11 2-O-galloyl mucic acid [18] 12 2-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid [18] 13 5-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid [18] 14 3-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid [18] 15 3,5-di-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid [18] 4 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín 16 2-O-galloyl methyl ester mucic acid [18] 17 2-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid methyl ester [18] 18 5-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid methyl ester [18] 19 3-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid methyl ester [18] 20 3,5-di-O-galloyl 1,4-lactone mucic acid methyl ester [18] 21 Coumarin Ellagic acid Quả [5], [4] 22 Diterpene Giberellin A-1 [5] 23 Giberellin A-3 [5] 24 Giberellin A-4 [5] 25 Giberellin A-7 [5] 26 Giberellin A-9 [5] 27 Sesqui- terpenoid Phyllaemblic acid [20] 28 Phyllaemblic acid methyl ester Rễ [19] 29 Phyllaemblic acid B Rễ [22] 30 Phyllaemblic acid C [22] 31 Phyllaemblicin D [22] 32 Norsesqui- terpenoid Phyllaemblicin A Rễ [19] 33 Phyllaemblicin B [19] 34 Phyllaemblicin C [19] 35 Phenolic Glycoside 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D- glucopyranoside Rễ [22] 36 2,6-dimethoxy-4-(2- hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D- glucopyranoside [22] 37 Tannin Chebulanic acid Quả [11] 38 Corilagin [5] 39 Isocorilagin [14], [13] 40 Chebulanin Quả [11] 41 Chebulagic acid [11] 42 Mallotusinin [10] 43 Phyllaembinin A Quả [21] 44 Phyllaembinin B Lá, cành [21] 45 Phyllaembinin C [21] 46 Phyllaembinin D [21] 47 Phyllaembinin E [21] 48 Phyllaembinin F [21] 5 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín 49 Phyllanthunin Quả [4] 50 Geraniin [14] 51 Lipid Stearic acid Quả [4] 52 Acid Lauric acid Quả [4] 53 Steroid β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside [6] 54 Stigmasta-7,22-diene-3-O-β-D- glucoside [6] 55 5α,6β-dihydroxylsitosterol [12] 56 5α,6β,7α-dihydroxylsitosterol [12] 57 7α-acetoxysitosterol [12] 58 β-sitosterol [12] 59 7α-dihydroxylsitosterol [12] 60 7β-ethoxysitosterol [12] 61 7-ketositosterol [12] 62 Stigmast-4-ene-3-one [12] 63 Stigmast-4-ene-3,6-dione [12] 64 Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one [12] 64 Stigmast-4-ene-3β,6α-diol [12] 66 6’-(stigmast-5-ene-3-O-β-D- glucopyranosidyl) hexadecaneoate [12] 67 6’-(stigmast-5-ene-7-one-3-O-β-D- glucopyranosyl) hexadecaneoate [12] 68 Flavonoid Kaempferol Lá [14], [13] 69 Quercetin [5],[13] 70 Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside Quả [13] 71 Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside [14], [13] 72 Leucodelphinidin [5] 73 Rutin [5] 74 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose Lá [7] 75 1,2,4,6-tetra-O-galloy-β-D-glucose Lá,cành [17] 76 Apidenin-7-O-(6”-butyryl-β- glucopyranoside Lá [7] 6 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Các công thức cấu tạo của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn HO NH N NH NN NH N NN N O OHOH OP O HO OH OH OH N H NN N N O OH OHOH (1) (2) (3) O O HO HO OH COOH COOH HOOC O OHHORO OH RO R=Galloyl O OR OH OH HO HO R=Galloyl (4) (5) (6) O OR HO OH OH OH O COOH HOOC HRO R=Galloyl (7) R = H; (8) R = C2H5 (9) (10) R1OOC COOR2 H OR OH H OH H H OH R=Galloyl OO R1O OR2 H H OR3 OR4 O (16) R1=R2=CH3; (18) R1=CH3, R2=H (12) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (17) R1=H, R2=CH3;(11) R1=R2=H (19) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (14) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl (15 )R1=R4=H, R2=R3=Galloyl R=Galloyl O O OHHO H RO H R1O O O O O O OHHO HO OH R2 H H R1 O OHOO (13) R1=H (21) (22) R1=R2=OH (20)R1=CH3 (24) R1=H, R2=OH (26) R1=R2=H 7 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín HO H H R O OHO O OO O O O HO OH OH O OO O O O HO OH OCH3 O (23) R=OH (27) (28) (25) R=H O O OH OR2 OH OH HH R1 HOOC O O O OO OH OH HOHO HO O O O OH (29) R1=OH, R2=H (32) (30) R1=R2=H (31) R1=H, R2=Glu O O O OO O OH HOHO HO O O O OH O OH HOHO HO O O O OO O OH HOHO HO O O O OH O O HOHO HO O OH HO OH (33) (34) COOH OR R=Glu R=Glu OO OR HO OR O O O OR O OO HO OHOOC OH OH R=Galloyl RO R=Galloyl O OH OR HO O O HO HO OH O OH OH HO (35) (36) (37) (38) 8 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín R=Galloyl HO HO HO O O HO HO HO O ORO HO O OH R=Galloyl OH O O O OR O OO HO OHOOC OH OH HO R=Galloyl OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR O OO HO OHOOC OH OH (39) (40) (41) OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O OH OHHO HO R=Galloyl OHO HO OH OH O O O O O OH OR HO R=Galloyl OO O O HO HO O H HO OH OH O HO HO OG R=Galloyl (42) (43) (44) R=Galloyl OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O HOOC HO H COOH OH OH O R2O R3O OH OR4 OR1 (45) (46) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (47) R1=Galloyl, R3=neoche, R2=R4=H (48) R1=Galloyl, R4=neoche, R2=R3=H 9 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín O OG OH OH OO O OH OHO O O OH OO HO HO HO OH R=Galloyl OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O H OH OH O HO OHOH R COOH (49) (50) (51) R=n-C17H35 (52) R=n-C11H23 O OH OH HO HO OHO HO OH OH O (53) (54) H R OH OH HO H R2HO R1 (55) R=H (57) R1=H, R2=CH3COO; (58) R1=H, R2=H (56) R=OH (59) R1=H, R2=OH; (60) R1=CH3CH2O, R2=H H HO O H O R2R1 (61) (62) R1=R2=H (63) R1=H, R2=OH 10 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín H O O H HO OH (64) (65) H O R1 O OH HO HO R2 O OH O OH HO OH R (66) R1=H, R2=OOC(CH2)14CH3 (68) R=H (67) R1=OH, R2=OOC(CH2)14CH3 (69) R=OH O O OH OH OH HO O O HO OH HO OH O O O HO OH O OH HO OHHO OH O OH HO OH OH OH OH OH (70) (71) (72) O OH HO O O OH OH O HO OH OH O OH3C HO HO OH O OR OR OR RO RO R=Galloyl (73) (74) 11 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín O OR ORHO RO RO R=Galloyl O OH OOH OO OH O O HO HO (75) (76) Chú thích: OH OH HO O O HOOC OH OH HO HOOC H H H O O OH OHHO HO Galloyl neoche Glu = Glucopyranosyl 12 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 2.1.1. Hoá chất  Silica gel: silica gel 40 – 63 μm, Merck và silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột.  Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc kí cột.  Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F 254 , Merck.  Sắc kí lớp mỏng loại DC, RP-18, Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ethanol, hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H2SO4 20%. 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử. 2.1.3. Phương pháp tiến hành Phương pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và sắc kí lớp mỏng. Được hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 13 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh. 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá cây me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được thu hái tại Bình Thuận vào tháng 5/2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica Linn”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Lá me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (7.2kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (285.5 g). Cao ethanol thô được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane (22.1 g), cao ethyl acetate (143.1 g) và cao còn lại (77.1g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. 14 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO HEXANE 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao hexane Cao hexane (22.1 g) được sắc kí cột (SKC) silica gel, giải ly với hệ dung H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 6 phân đoạn (H1 – 6), được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao hexane STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 H1 H 7.70 Vệt dài Chưa khảo sát 2 H2 H:EA 9:1 2.69 Nhiều vết Khảo sát 3 H3 H:EA 8:2 1.76 Nhiều vết Đã khảo sát 4 H4 H:EA 7:3 0.54 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 H5 H:EA 6:4 0.94 Nhiều vết Chưa khảo sát 6 H6 EA 1.83 Vệt dài Chưa khảo sát Ghi chú: H: hexane, EA: ethyl acetate. 15 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2 của bảng 2.1 Phân đoạn H2 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn H2 được thực hiện SKC sillica gel, giải ly với hệ dung môi H:DCM 15:35. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 9 phân đoạn (H2.1 – H2.9), được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 H2.1 H:DCM 15:35 20.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 H2.2 H:DCM 15:35 23.3 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 H2.3 H:DCM 15:35 60.0 Vệt dài Chưa khảo sát 4 H2.4 H:DCM 15:35 571.6 Nhiều vết Khảo sát 5 H2.5 H:DCM 15:35 411.1 Nhiều vết Chưa khảo sát 6 H2.6 H:DCM 15:35 50.5 Nhiều vết Chưa khảo sát 7 H2.7 H:DCM 15:35 217.1 Nhiều vết Chưa khảo sát 8 H2.8 H:DCM 15:35 407.2 Vệt dài Chưa khảo sát 9 H2.9 H:DCM 15:35 138.8 Vệt dài Chưa khảo sát Ghi chú: DCM: dichloromethane 2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2.4 của bảng 2.2 Phân đoạn H2.4 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn H2.4 được SKC sillica gel với hệ dung môi H:DCM 35:15. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (H2.4.1-H2.4.5), được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H2.4 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 H2.4.1 H:DCM 35:15 1.2 Vệt dài Chưa khảo sát 2 H2.4.2 H:DCM 35:15 52.2 2 vết tách rõ Khảo sát 3 H2.4.3 H:DCM 35:15 33.3 Nhiều vết Chưa khảo sát 4 H2.4.4 H:DCM 35:15 153.8 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 H2.4.5 H:DCM 35:15 159.7 Nhiều vết Chưa khảo sát Phân đoạn H2.4.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ, màu tím cùng vết dơ kéo thành đuôi dài. Từ phân đoạn H2.4.2 (52.2 mg) của bảng 4, tiếp tục SKC nhiều lần thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được ký hiệu là PHTC2 (23.0 mg). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.2. 16 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín 2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Cao ethyl acetate (143.1 g) được SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 80% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA1 – 6) được trình bày ở bảng 2.4. 17 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA1 H:EA 2:8 16.50 Vệt dài Đã khảo sát 2 EA2 EA 13.28 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 EA3 EA:Me 95:5 22.25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát 4 EA4 EA:Me 8:2 33.40 Nhiều vết Khảo sát 5 EA5 EA:Me 7:3 14.70 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: Me: methanol 2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.4 Phân đoạn EA4 (33.4 g) SKLM cho nhiều vết, hiện hình màu tím dưới đèn UV nên được chọn đem SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 8 phân đoạn (EA4.1 – EA4.8) được ghi lại ở bảng 2.5. Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.1 H:EA 1:3 4.67 Vệt dài Khảo sát 2 EA4.2 H:EA 1:3 3.78 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 3 EA4.3 H:EA 1:9 2.52 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 4 EA4.4 H:EA 1:9 2.75 Vệt dài Chưa khảo sát 5 EA4.5 EA 1.59 Vệt dài Chưa khảo sát 6 EA4.6 EA:Me 95:5 1.86 Kéo vệt Chưa khảo sát 7 EA4.7 EA:Me 85:15 3.40 Kéo vệt dài Chưa khảo sát 8 EA4.8 EA:Me 6:4 2.80 Kéo vệt Chưa khảo sát 2.5.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.1 của bảng 2.5 Phân đoạn EA4.1 (4.67 g) bằng hệ dung môi DCM:Me có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 7 phân đoạn (EA4.1.1 – EA4.1.7). Kết quả được trình bày ở bảng 2.6. 18 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Bảng 2.6. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.1 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA4.1.1 DCM 352.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 EA4.1.2 DCM:Me 95:5 308.0 Nhiều vết, kéo vệt Đã khảo sát 3 EA4.1.3 DCM:Me 9:1 923.6 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 4 EA4.1.4 DCM:Me 9:1 181.4 Kéo vệt Chưa khảo sát 5 EA4.1.5 DCM:Me 9:1 536.1 Kéo vệt Chưa khảo sát 6 EA4.1.6 DCM:Me 8:2 553.0 Nhiều vết Khảo sát 7 EA4.1.7 DCM:Me 7:3 412.1 Kéo vết Chưa khảo sát Phân đoạn EA4.1.6 (553.0 mg) của bảng 2.6 khi SKLM cho vết màu tím và vết dơ kéo dài, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi H:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng, được kí hiệu là PEATC1 (34.0 mg). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.3. 19 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEATC1 Hợp chất PEATC1 (34.0 mg) thu được từ phân đoạn EA4.1.6 có những đặc điểm như sau: - Dạng tinh thể hình kim, màu trắng, kết tinh trong dung môi acetone. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ nóng bảng mỏng cho vết có màu hồng nhạt. (dung môi giải ly hexane:acetone 3:1, Rf = 0.36). - Phổ 1H-NMR (Aceton-d6, phụ lục 1, bảng 3.1) δH ppm 7.16 (1H, s) - Phổ 13C-NMR (Aceton-d6, phụ lục 2, bảng 3.1) δC ppm 167.5 (>C=O), 121.3 (>C=, C–1), 109.5 (=C–, C–2), 145.3 (>C=, C–3), 138.1 (>C=, C–4).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PEATC1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 proton vòng thơm (δH 7.16) cho thấy hợp chất có vòng thơm. Phổ 13C-NMR cho thấy có 1 tín hiệu cộng hưởng của carbon >C=O (δC 169.5) và 4 tín hiệu cộng hưởng của các carbon vòng benzen trong vùng δC 145.3 – 109.5, cho phép dự đoán hợp chất PEATC1 có một vòng thơm và có cấu trúc đối xứng. Từ các dữ liệu phổ NMR trên, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của acid gallic [3] cho thấy có sự tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất PEATC1 là acid gallic. O OH OHHO OH 1 2 3 4 5 6 Acid gallic (PEATC1) 20 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEATC1 Vị trí carbon PEATC1 (acetone-d6) Acid gallic [3] (acetone-d6) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 121.3 120.8 2 7.16 (s) 109.4 7.15 (s) 109.1 3 145.3 144.9 4 138.1 137.8 5 145.3 144.9 6 7.16 (s) 109.4 7.15 (s) 109.1 >C=O 167.5 167.4 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PHTC2 Hợp chất PHTC2 (23.0 mg) thu được từ phân đoạn H2.4.2 có những đặc điểm như sau: - Dạng bột màu trắng. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ nóng bảng mỏng xuất hiện vết có màu tím nhưng không hiện hình dưới đèn tử ngoại. (dung môi giải ly hexan:ethyl acetate 45:5, Rf = 0.45) - Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 3, bảng 3.2) δH 4.68 (1H, d, J = 2 Hz) , 4.56 (1H, dd, J = 1.5, 2.5 Hz), 3.18 (1H, dd, J = 5, 11.5 Hz), các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ 13C-NMR (CDCl3, phụ lục 4, bảng 3.2) δC 151.1 (>C=, C–20), 109.5 (=CH2, C–29), 79.2 (C–O, C–3), 55.5 (>CH–, C–5), 39.0 (>C<, C–4), 19.5 (CH3, C–30), độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 5, 5a, 6 và 6a).  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất PHTC2 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 2 proton olefin ở δH 4.68 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 4.56 (1H, dd, J=1.5, 2.5 Hz). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn thể hiện tính hiệu cộng hưởng của proton –CH–OR ở δH 3.18 (1H, dd, J = 5.0, 11.5 Hz) và tín hiệu cộng hưởng của 7 nhóm methyl trong vùng δH (0.76 – 1.68). Ngoài ra, một số tín hiệu cộng hưởng của các proton –CH2– (1.95, 1.18) và >CH– (0.68, 1.18, 2.37) cũng xuất hiện trên phổ. 21 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Phổ 13C-NMR của hợp chất PHTC2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon. Trong đó, có tín hiệu cộng hưởng của carbon gắn nhóm hydroxyl tại δC 79.2 (C–OH, C– 3) và tín hiệu cộng hưởng của 2 carbon olefin tại δC 151.1 (>C=, C–20) và 109.5 (=CH2, C–29). Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PHTC2 được dự đoán là triterpene có khung sườn lupane với một liên kết đôi và 1 nhóm OH. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của 2 proton olefin ở δH 4.68 và 4.56 đến carbon cộng hưởng ở δC 19.5 ( –CH3, C–30) và δC 48.14 (=C<, C–19) và proton ở δH 2.37 (H– 19) tương quan với carbon cộng hưởng tại δC 109.5 (=CH2, C–29) chứng minh hợp chất có khung sườn lupane với nối đôi đầu mạch. Ngoài ra, một proton tại carbon có gắn nhóm hydroxyl (δH 3.18, H–3) tương quan đến các carbon cộng hưởng tại δC 38.9 (– CH2–, C–1) 55.5 (>CH–, C–5) và 28.1 (–CH3, C–23) chứng minh nhóm OH gắn trên carbon số 3. Các tương quan HMBC khác được thể hiện trong hình 3.1. Qua các dữ kiện của phổ NMR trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất lupeol [2] cho thấy có sự tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất PHTC2 là lupeol. Lupeol (PHTC2) HO 1 2 3 4 5 6 7 9 810 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 22 23 24 25 26 28 27 29 30 22 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PHTC2 Vị trí carbon PHTC2 (CDCl3) Lupeol (CDCl3) [2] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) 1 38.9 38.2 2 25.3 25.3 3 3.18 (dd, 5.0, 11.5) 79.2 3.16 (dd, 5.4, 10.6) 79.1 4 39.0 38.9 5 0.68 (dd, 1.5, 9.5) 55.5 55.5 6 18.2 18.5 7 34.5 34.5 8 41.0 41.0 9 50.6 50.6 10 37.3 37.3 11 21.1 21.1 12 27.6 27.5 13 38.2 39.0 14 43.0 43.0 15 27.6 27.6 16 35.7 36.8 17 43.2 43.2 18 1.39 (m) 48.5 48.5 19 2.37 (m) 48.1 48.1 20 151.1 151.1 21 1.95 (m) 30.0 30.0 22 1.18 (m) 40.2 40.2 23 0.97 (s) 28.1 0.95 (s) 28.2 24 0.76 (s) 15.5 0.75 (s) 15.6 25 0.83 (s) 16.3 0.82 (s) 16.3 26 1.03 (s) 16.1 1.02 (s) 16.2 27 0.94 (s) 14.7 0.93 (s) 14.7 28 0.79 (s) 18.5 0.78 (s) 18.2 29 4.68 (d, 2.0) và 48.56 (dd, 1.5, 2.5) 109.5 4.68 (s) và 4.56 (s) 109.5 30 1.68 (s) 19.5 1.25 (s) 19.5 HO 1 2 3 4 5 10 25 24 6 7 8 9 11 12 26 14 27 13 18 15 16 28 17 22 21 19 2030 29 23 Hình 3.1. Một số tương quan HMBC của hợp chất PHTC2 23 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Ngọc Tín CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN Từ dịch chiết ethyl acetate, một hợp chất đã được cô lập. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm, so sánh với tài liệu tham khảo và được đề nghị là acid gallic. O OH OHHO OH 1 2 3 4 5 6 Acid gallic (PEATC1) Ngoài ra, một chất khác được cô lập từ dịch chiết hexane, được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm và so sánh tài liệu tham khảo. Cấu trúc của hợp chất được đề nghị là lupeol. Lupeol (PHTC2) 4.2. ĐỀ XUẤT Trong phạm vi khóa luận, em chỉ mới khảo sát trên lá cây me rừng. Trong thời gian tới nếu có điều kiện em sẽ tiếp tục khảo sát trên các phân đoạn khác của cây với nhiều hy vọng cô lập thêm được những hợp chất có cấu trúc mới và sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập được, mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu Y học cổ truyền dân tộc. HO 1 2 3 4 5 6 7 9 810 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 22 23 24 25 26 28 27 29 30 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu tiếng Việt [1]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 695-696. • Tài liệu tiếng Anh [2]. A. K. Jamal, W.A. Yaacob, Laily B.Din (2008), A chemical study on Phyllanthus reticulates, Journal of Physical science, 19(2), 45 – 50. [3]. Anchara Chanwithcesuk, Aphiwat Teerawutgulrag, Jeremy D. Killburn, Nuansri Rakariyatham (2007), Antimicrobial gallic acid from Caesalpinia minosoides Lamk, Food Chemistry, 100(3), 1044-1048. [4]. Chun-Bin Yang, Fan Zang, Mei-Cai Deng, Guang-Yun He, Jian-Min Yue, Run-Hua Lu (2007), A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L, Journal of the Chineses Chemical Society, 54, 1615-1618. [5]. João B. Calixto, Adair R. S. Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A. Yunes (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential, Med Res Rev, 18(4), 225-258. [6]. Mahbuba Khatun, Mirajum Billah, Md. Abdul Quader (2012), Sterols and sterol glucoside from Phyllanthus species, Dhaka Univ. J. Sci, 60(1), 5-10. [7]. S.K. El-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), A new cytotoxic acelated apigenin glucoside form Phyllanthus emblica L, Natural Product Research, 22(1), 91-95. [8]. Sharma Bhawna , Sharma Upendra Kumar (2010), Hepatoprotective activity of some indigenous plants, Institute of pharmacy, 2(1), 568-572. [9]. Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uanindut, Somsak Nualkaew và Bungorn Sripanidkulchai (2015), Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular damage in valproic acid – included rats, Int. J. Morphol, 33(3), 1016 – 1022. [10]. Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2011), Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from Phyllanthus emblica L. fruit, Food Chemistry, 126, 277-282. [11]. Wei Lou, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Gouhua Rao (2012), Structural indentification of isomallotusisnin and other phenolics in Phyllanthus emblica L. fruit hull, Food Chemistry, 132, 1527-1533. [12].Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), Cytotoxicity and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica, Fitoterapia, 84, 252-256. [13]. Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008), Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities, Food Chemistry, 109, 909-915. [14]. Xiaoli Liu, Mouming zhao, JinshuiWang và Weilou (2007), Antimicrobial and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical carbon dioxide extraction và methanol extraction, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330. [15]. Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua Tao, Jinshui Wang (2012), Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.), Food Chemistry, 131, 685-690. [16]. Xinxian Zhu, Jianjun Wang, Yang Ou, Weiwei Han và Huaifang Li (2013), Polyphenol extract of Phyllanthus emblica (PEEP) induces inhibition of cell proliferation and triggers apoptosis in cervical cancer cells, European Journal of medical research, 18, 2-5. [17]. Yangfei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong, Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato and Yifei Wang (2011), In vitro anti-Herpes simplex virus activity of 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose from Phyllanthus emblica L. (Euphorbiaceae), Phytotherapy research, 25, 978-979. [18]. Yin-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), New phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica, Chem. Pharm. Bull, 49(5), 537-540. [19]. Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2000), Novel norsesquiterpenoids from the roof of Phyllanthus emblica, American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy, 63, 1507-1510. [20]. Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2000), Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated norbisabolane form the roof of Phyllanthus emblica, Tetrahedron Letters, 41, 1781-1784. [21]. Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), Phyllanemblinins A-F, new ellagitannins from Phyllanthus emblica, American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy, 64, 1527-1532. [22].Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2007), Novel sesquiterpenoids from the roof of Phyllanthus emblica, American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy, 64, 870-873. PHỤ LỤC