Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Parmotrema Sp. thu hái ở Bình Thuận

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA sp. THU HÁI Ở BÌNH THUẬN GVHD : Th.s HỒ XUÂN ĐẬU SVTH : PHẠM THỊ NGỌC OANH MSSV : 35106037 TP. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013 MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................... 5 LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................. 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................... 6 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y ................................................................................. 6 1.2. MÔ TẢ LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp. ................. 6 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA ............................................................................................. 9 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................. 16 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ........................................................................... 16 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ....................................................................... 16 CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ........................................ 19 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1 .............. 19 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2 ................ 21 3.3. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H1 ............. 23 3.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H2 ............. 24 KẾT LUẬN ............................................................................................... 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 27 LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não[1], Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian. Người da đỏ ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[1]. Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi. Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm các cơn đau gan[1]. Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa. Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng và nước hoa. Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môi trường. Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây,... trong những điều kiện khác nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng. Vậy mà từ trước đến nay ở Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu về hóa học cũng như ứng dụng của địa y. Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y thuộc chi Parmotrema thu hái ở huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận Trang 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium). Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết. Địa y thường được chia làm ba dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose). Hình 1: Ba dạng chính của địa y Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, ), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh. 1.2. MÔ TẢ LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp. • Địa y mọc trên đá ở núi Tà Cú, ở độ cao 1.000 mét so với mực nước biển, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận.(Hình 1) Xanthoria sp., địa y khảm trên đá núi lửa tại miệng núi lửa ở Idaho, USA. Xanthoparmelia cf. lavicola, một địa y phiến, trên đá bazan Địa y sợi Hypogymnia cf. tubulosa với Bryoria sp. và Tuckermannopsis sp. ở miền núi Canada. Trang 7 Hình 2:Tản địa y Parmotrema sp. • Tên khoa học của địa y được xác định thuộc chi Parmotrema nhưng chưa xác định được loài. Mẫu hiện đang gửi thạc sĩ Võ Thị Phi Giao và tiến sĩ Harrie J. M. Sipman để giúp xác định tên khoa học. • Mẫu ký hiệu US-B026, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. 1.3. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y 1.3.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5] Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Barbatic acid, 4-O- demethylbarbatic acid, diffractaic acid, evernic acid, lecanoric acid, β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp Ergochrome AA (secalonic acid A) Gây độc cho thực vật Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine sp. Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Usnic acid Ức chế sự nẫy mầm và phát triển của Lepidium sativum 1.3.2. Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: virensic acid và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV. Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Sao chép ngược HIV Trang 8 (+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-Cloroemodin, 7- Chloro-1-O-methylemodin, 5,7- Dichloroemodin, Hypericin HIV, cytomegalovirus và các virus khác 1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Vi khuẩn Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Protolichesterinic acid Helicobacter pylori Methyl orsellinate, Ethyl orsellinate, Methyl β-orsellinate, Methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, Pannarin Leishmania spp Emodin, Physcion Bacillus brevis Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 1.3.4. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5] Hợp chất của địa y Enzyme bị ức chế Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Baeomycesis acid 5-Lipoxygenase Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- propylphenyl)methane, Divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Trang 9 Confluentic acid, 2β-O- Methylperlatolic acid Monoaminoxidase B 4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglandinsynthetase (+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV) Vulpinic acid Phosphorylase Norsolorinic acid Monoamino oxidase Physodic acid Arginine decarboxylase Usnic acid Ornithine decarboxylase 1.3.5. Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5] Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin, Sphaerophorin Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất, Euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột Psoromic acid, Chrysophanol, Emodin và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp polyketid Các acid béo Năm 2001, Sassaki GL[6] đã cô lập được acid béo trong một số loài địa y thuộc chi Parmotrema như 9-oxodecanoic acid (1), 9-metyltetradecanoic acid (2), 6- Trang 10 metyltetradecanoic acid (3), 3-hydroxydecanoic acid (4), nonanedioic acid (5) và decanedioic acid (6). Các acid béo vòng Năm 1990, F. David[7] và cộng sự đã cô lập được praesoredioic acid (7) và protopraesorediosic acid (8) từ Parmotrema praesorediosum. Ngoài ra, cũng từ chi Parmotrema còn phân lập được lichesterinic acid (9) và protolichesterinic acid (10). Các hợp chất phenol đơn vòng Cũng trong năm này, Irma S. Rojas[8] công bố sự có mặt của orcinol (11), metyl-β- orsellinate (12) và metyl haematommate (13) trong Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale. Năm 2000, từ địa y Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale, Javaprakasha G. K.[9] đã cô lập orsenillic acid (14) và metyl orsenillate (15). Depside Năm 1999, Laily B. Din[10] đã công bố trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có chứa một hàm lượng lớn các hợp chất bậc hai bao gồm các depside là một loại ester tạo thành bằng sự liên kết của hai hay nhiều phân tử phenolcarboxylic acid như atranorin (16) và cloroatranorin (17). Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes và cộng sự[12] đã cô lập lecanoric acid (18) từ Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale Depsidone Trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có mặt các depsidone[6,10,12,13] sau malonprotocetraric acid (19), protocetraric acid (20), furmaprotocetraric acid (21), succinprotocetraric acid (22), salazinic acid (23), consalazinic acid (24), α-collatolic acid (25), dehydrocollatolic acid (26), alectoronic acid (27), norstictic acid (28), và hypostitic acid (29) Xanthone Theo N. K Honda và cộng sự đã cô lập được 2 xanthone là lichenxanthone (30) và secalonic acid (31) trong Parmotrema dilatatum, Parmotrema lichnxanthonium và Parmotrema sphaerospora[14]. Trang 11 Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp mevalonic acid Năm 1993, Bazyli Czeczuga[16] đã nhận danh được 17 carotenoid có mặt trong Parmotrema tinctorum dựa vào kỉ thuật HPLC và so sánh với phổ IR là α-carotene (33), β- carotene (34), β-eryptoxanthin (35), lutein (36), 3’-epilutein (38), zeaxanthin (39), luteinepoxide (40), antheraxanthin (41), violaxanthin (42), mutatoxanthin (43), flavoxanthin (44), echinenone (45), canthaxanthin (46), astaxanthin (47), neoxanthin (48), capsochrome (49), β-citraurin (50). Các hợp chất tạo nên bằng quá trình sinh tổng hợp của tảo Năm 2005, Elaine R.Carbonero[16], nhà hóa học Brazil, đã định danh được hai glucan với tên là nigeran [(1 → 3), (1 → 4) - α - glucan] và lichenan [(1 → 3), (1 → 4) - β - glucan] trong Parmotrema austrosinense, Parmotrema delicatulum, Parmotrema mantiqueirense, Parmotrema schindleri và Parmotrema tinctorum. Trang 12 Công thức hóa học của các hợp chất 113 11 9 7 5 3 13 11 9 7 5 3 114 COOH CH3 9 - Metyltetradecanoic acid 14 CH3 COOH 6 - Metyltetradecanoic acid (3) (1) 1 1 9 7 5 3 9 7 5 3 3 - Hydroxydecanoic acid (4 ) 10 COOH OH O COOH 9 - Oxodecanoic acid (2) 10 HO OC COOH COOH HOOC 9 7 5 3 1 9 7 5 3 1 Decanedioic acid (6)Nonanedioic acid (5) O (CH2)14 COOH O H3C COOH Praesorediosic acid (7) O (CH2)14 COOH O COOH H2C Protopraesorediosic acid (8) O (CH2)12 COOH O H3C CH3 O (CH2)12 COOH O CH3 H2C Lichesterinic acid (9) Protolichesterinic acid (10) Metyl Metyl haematommate- orcinol carboxylat ( 12) OH CH3 HO COOCH3 CH3 COOCH3 OH CHO HO CH3 (13) Orcinol (11) CH3 OHHO COOCH3 OH CH3 HO CH3 Metyl orsellinate (15) Orsellinic acid (14) OHHO CH3 COOH β Trang 13 CH3 HO CHO OH C O O CH3 OH C CH3 O OCH3 Atranorin (16) CH3 HO CHO OH C O Cl O CH3 OH C CH3 O OCH3 Cloroatranorin (17) CH3 HO OH C O O CH3 OH C CH3 O OH Lecanoric acid (18) O OH C CH3 O O O COOH OH O CH3 HO CHO C O O OH C CH3 O CH2OH OH O CH3 HO CHO C O Malonprotocetraric acid (19 ) Protocetraric acid (20 ) O OH C CH3 O O O OH O CH3 HO CHO C O HOOC Fumarprotocetraric acid (21) Succinprotocetraric acid (22) O OH C CH3 O O O OH O CH3 HO CHO C O HOOC O OH C CH2OH O OCHHO O CH3 HO CHO C O O OH C CH2OH O OCHHO O CH3 HO C O OH Salazinic acid (23) Consalazinic acid (24 ) O OH C O OCHHO CH3 O CH3 C O CH3O CH3 Hypostictic acid (29) Trang 14 O OH O O HO O C O CH3O O O OH O O O CH3 O C O CH3O O (CH2 )4 CH3 (CH2 )4 CH3 Dehydrocollatolic acid (26) O OH O O HO O C O HO O O OH CH O O HO CH3 O C O HO CH3 CHO Alectoronic acid (27) Norstictic acid (28) CH3 CH3O O O OH OCH3 Lichenxanthone (30 ) OH CH3 OH O COOCH3 O OH CHO O O OH CH3 OHSecalonic acid (31 ) α - Carotene (33 ) - Carotene)( β,ε β - Carotene (34 ) - Carotene)( β,β - Carotene-3,3'-diol)( β,ε OH HO Lutein (36 ) OH HO 3' - Epilutein (38 ) OH β - Eryptoxanthin (35) Carotene-3-ol)( β,β− α - Collatolic acid (25) Trang 15 - Carotene-3,3'-diol) Zeaxanthin (39) OH HO Luteinepoxide (40) HO O OH (5,6 - Epoxy - 5,6 - dihydro - b, b - carotene-3,3'-diol) HO O Antheraxanthin (41) O OH HO Flavoxanthin (44) O OH O HO Astaxanthin (47) O Carotene- 4-on)( β,β Echinenone (45) O O ( β,β Carotene - 4,4' - dion) Canthaxanthin (46) Neoxanthin (48) ( 5,6 - Epoxy - 6,7 - -didehydro - 5,5,5',6' - tetrahydro - β, β - carotene-3,5,3'-triol) Capsochrome (49) ( 5,8 - Epoxy - 3,3'- - dihydroxy - 5,8 - dihydro - β, χ - carotene - 6'- on) O HO O OH HO β - Citraurin (50) HO β,β ( (5,8 –Epoxy-5,8-dihdro-β,ε-carotene-3,3’-diol) 3,3’-Dihydroxy- β,β-carotene-4,4’-dion , (5,6 –Epoxy-5,6-dihdro-β,ε-carotene-3,3’-diol) 3-Hydroxy-8-apo-β-carotene-8’-al Trang 16 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ Hóa Chất Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa, ethyl acetat, acid acetic, cloroform, aceton, metanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại và nước cất. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H2SO4, đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04- 0.06 mm, Ấn Độ. Thiết Bị Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng). Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath. Cột sắc ký: cột cổ điển. Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck. Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne. Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Tất cả phổ được ghi tại: - Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Từ 1kg mẫu địa y tươi được tiến hành bằng phương pháp ngâm dầm trong dung môi metanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao metanol thô. Sau đó, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dần : eter dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, và metanol thu được các loại cao: cao eter dầu hỏa, cao chloroform, cao ethyl acetat và cao metanol. Dịch của những loại cao này được làm bay hơi dung môi bằng máy cô quay với nhiệt độ xấp xỉ 40oC. Trang 17 Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa y Sắc kí cột trên cao methanol Cao methanol (100g) chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly thu được 2 phân đoạn: phần tủa (10g) và phần dịch. Từ phân đoạn tủa (10g) sắc kí cột và giải ly với hệ dung môi ete dầu : etyl axetat (9:1- 0:10) thu được ba phân đoạn( T1-T2-T3). Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica trên phân đoạn T1, thu được hai chất kí hiệu là Par-H1 và Par-H2. Với phân đoạn T3 sắc ký lớp mỏng điều chế và giải ly với hệ dung môi etyl axetat: axit axetic (10:1) thu được hai chất kí hiệu là Par 1 và Par 2. - Ngâm dầm bằng methanol. - Thu hồi dung môi - Giải li bằng các dung môi khác nhau. - Thu hồi dung môi Cao eter dầu hỏa Cao chloroform Cao methanol Cao ethyl acetate Địa y tươi(1kg) Cao methanol Trang 18 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao methanol. Sắc kí lớp mỏng điều chế EA:Me 9 : 1 : 5giọt/10ml Cao Me1 Cao Me2 (5:5-0:10) EA:AcOH(10:1) ED:EA:AcOH Par 2 Par 1 Par-H2 Par-H1 H:EA (9:1 – 0:10) Cao EA1 Phân đoạn T1 Phân đoạn T2 Phân đoạn T3 ED:EA (9:1 – 0:10) Parmotrema sp Cao Me 100g Tủa 10g Dịch Cao EA2 Phần còn lại Trang 19 CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1 Hợp chất par 1 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp là chất bột, màu trắng đục. Phổ 1H-NMR (phụ lục 1). Phổ 13C-NMR (phụ lục 2). Phổ HSQC (phụ lục 3). Phổ HMBC (phụ lục 4). Biện luận cấu trúc phổ: Trên phổ 1H–NMR, ở vùng từ trường thấp, thấy có tín hiệu của một proton vòng thơm mũi đơn tại δH 6.83 (1H, s, H-5) và một proton của nhóm aldehyde mũi đơn tại δH 10.58 (1H, s, H-8). Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của proton nhóm methylen –CH2–O– mũi đơn ở δH 4.60 (2H, s, H-8’) và hai tín hiệu của hai nhóm methyl gắn với vòng thơm tại δH 2.42 (3H, s, H-9) và δH 2.40 (3H, s, H-9’). Phổ 13C–NMR cho thấy hợp chất Par 1 có 18 carbon trong đó có: 1 nhóm aldehyde (δC 191.67), 2 nhóm carboxyl (δC 170.1, 163.8), 1 carbon methin (δC 118.6), 1 nhóm –CH2OH (δC 52.9), 2 nhóm methyl (δC 21.3, 14.3) và các carbon vòng thơm (δC 116.6, 161.2, 112.4, 163.8, 152.0, 111.8, 155.0, 117.0, 151.9, 141.7, 129.4). Phổ HSQC giúp tái khẳng định điều đó. Trên nhân thơm A, nhóm 6-CH3 tương quan với carbon tại δC 116.6 (C-1), δC 118.6 (C- 5), δC 152.0 (C-6). Nhóm 5-H tương quan với carbon tại δC 21.3 (C-9), δC 163.8 (C-4), δC 112.4 (C-3). Nhóm 3-CHO tương quan với carbon tại δC 163.8 (C-4), δC 112.4 (C-3). Từ đó xác định được cấu trúc của vòng A. Trên nhân thơm B, nhóm 6’-CH3 có δ=14 dịch về từ trường cao, chứng tỏ 6’-CH3 phải ở lân cận một nguyên tử oxy[18]. Thêm nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của 6’-CH3 với carbon tại δC 111.8 (C-1’), δC 141.7 (C-5’), δC 129.5 (C-6’). Từ đó khẳng định vị trí nhóm -CH3 trên nhân B. Trang 20 Nhóm methylen có δ=4.60 chứng tỏ nhóm methylen phải vừa liên kết với oxy vừa liên kết với vòng thơm. Nhóm methylen liên kết với oxy và nhân thơm thông thường phải có δ=60-70ppm. Độ dịch chuyển hóa học của nhóm hydroxymethylen dịch về vùng từ trường cao ở 52.0ppm chứng tỏ nhóm này phải ở lân cận 2 nguyên tử oxy. Thêm nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của 3’-CH2OH với carbon tại δC 155.0 (C-2’), δC 117.0 (C- 3’), δC 151.9 (C-4’). Từ đó khẳng định vị trí nhóm -CH2OH trên nhân B. Từ đó xác định được cấu trúc của vòng B. Hình 3. Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par1 Từ kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17], cấu trúc hợp chất Par 1 được đề nghị là protocetraric acid. Bảng 1. Số liệu phổ của hợp chất Par 1 VỊ TRÍ Hợp chất Par 1 δH δC HMBC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 6.83(s) 10.58(s) 2.42(s) 4.60 116.6 161.1 112.4 163.8 118.6 152.0 164.0 191.7 21.3 111.7 155.0 117.0 151.9 141.7 129.4 170.1 52.9 3,4,9 3,4 1,5,6 2’,3’,4’ CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO H A B 1 3 5 7 8 9 1' 3' 5' 7' 8' 9' Trang 21 9’ 2.40 14.3 1’,5’,6’ 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2 Hợp chất Par 2 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp là chất bột, màu trắng ngà. Phổ 1H-NMR (phụ lục 5). Phổ 13C-NMR (phụ lục 6). Phổ HMBC (phụ lục 7). Biện luận cấu trúc Trên phổ 1H–NMR, ở vùng từ trường thấp, thấy có tín hiệu của một proton vòng thơm mũi đơn tại δH 6.83 (1H, s, H-5) và một proton của nhóm aldehyde mũi đơn tại δH 10.58 (1H, s, H-8). Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của proton nhóm methylen –CH2–O– mũi đơn ở δH 4.60 (2H, s, H-8’) và hai tín hiệu của hai nhóm methyl gắn với vòng thơm tại δH 2.42 (3H, s, H-9) và δH 2.40 (3H, s, H-9’). Những dữ liệu phổ tương tự với hợp chất Par 1 chỉ khác Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’). Phổ 13C–NMR cho thấy hợp chất Par 2 có 19 carbon trong đó có: 1 nhóm aldehyde (δC 191.7), 2 nhóm carboxyl (δC 170.1, 164.0), 1 carbon methine (δC 118.6), 1 nhóm – CH2OH (δC 52.9), 2 nhóm methyl (δC 21.3, 14.3) và các carbon vòng thơm (δC 116.6, 161.2, 112.4, 163.8, 152.0, 111.8, 155.0, 117.0, 151.9, 141.7, 129.4). Trang 22 So sánh dữ liệu phổ 1H–NMR và phổ 13C-NMR của Par 1 và của Par 2 nhận thấy dữ liệu phổ tương tự, nhưng Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’) và δC 57.9 (C-10’). Phổ HMBC của Par 2 hoàn toàn tương đồng với Par 1, nhưng có thêm tương quan của proton của nhóm methoxy với C-8’ và tương quan của nhóm methylen với C-10’ khẳng định Par 2 là dẫn xuất methyl hóa của Par 1 tại vị trí C-8’. Từ các kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17], cấu trúc của hợp chất Par 2 được đề nghị là 8’-O-methylprotocetraric acid. Hình 4. Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par2 Bảng 2. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất Par 1 và Par 2 Vị trí Hợp chất PAR 1 Hợp chất PAR 2 δH, J (Hz) δC HMBC (1H - 13C) δH δC HMBC (1H - 13C) CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO H A B 1 3 5 7 8 9 1' 3' 5' 7' 8' 9' 10' Trang 23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/ 7/ 8/ 9/ 10/ 6.83 s 10.59 s 2.43 s 4.60 s 2.40 s 112.4 161.2 111.8 163.8 118.6 152.0 164.0 191.7 21.3 116.6 155.0 117.6 144.5 141.7 129.4 170.1 52.9 14.3 3, 4, 9 3,4 1,5,6 2’,3’,4’ 1’,5’,6’ 6.83(s) 10.58(s) 2.42(s) 4.60 2.40 3.22 112.5 161.5 112.5 164.4 117.6 152.3 164.6 192.0 21.8 116.5 155.9 116.3 146.0 142.6 131.4 170.8 62.8 15.0 57.9 3,4,8 3,4 1,5,6 2’,3’,4’,10’ 1’,5’,6’ 8’` 3.3. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H1 Phổ 1H-NMR (phụ lục 8). Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm tại δ 6.51 , δ 6.40 (1H, s, 5-H và 5’-H). Trang 24 Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 1 proton aldehyd [δ 10.36 (1H, s)], 1 nhóm proton nhóm metoxy [δ 3.98 (3H, s)], 3 nhóm hydroxy kiềm nối [δ 12.53, 12.47 và 11.91 (1H , s, 4-OH, 2-OH và 2’-OH)] và 3 nhóm metyl [2.69 (3H, s), 2.54 (3H, s), 2.09 (3H, s). Từ các kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[10], cấu trúc của hợp chất Par-H1 được đề nghị là atranorin atranorin 3.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H2 Hợp chất Par-H2 được cô lập từ phân đoạn T1, là chất rắn không màu. Phổ 1H-NMR (phụ lục 9). Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu của 1 proton thuộc vòng thơm tại δ 6.29(1H, s, 5-H). Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 1 proton aldehyd [δ 10.34 (1H, s), 3- CH=O], 1 nhóm metoxy [δ 3.96 (3H, s), -OCOCH3], 2 nhóm hydroxy kiềm nối [δ 12.86 (s, 2-OH), 12.40 (s, 4-OH)]. Từ các kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[8], cấu trúc của hợp chất Par-H2 được đề nghị là methyl haematommate. methyl haematommate Bảng 3: Số liệu phổ của hợp chất Par-H1 và Par-H2 Vị trí Hợp chất Par-H1 Hợp chất Par-H2 δH δH CH3 O O OH CHO HO OH CH3 CH3 OCH3 O CH3 OCH3 O OH CHO HO Trang 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/ 7/ 8/ 9/ 10/ 4-OH 2-OH 2/-OH 6.40 s 10.36 s 2.69 s 6.51 s 2.09 s 2.54 s 3.98 s 12.52 s 12.48 s 11.91 s 6.29 s 10.34 s 2.53 s 3.96 s 12.85 12.40 Trang 26 KẾT LUẬN Từ mẫu địa y Parmotrema sp. thu hái trên núi Tà Cú, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam. Sau khi làm sạch, phơi khô, xay nhuyễn thu được 1kg mẫu. Tiến hành điều chế cao metanol thô. Sử dụng phương pháp ngâm dầm trong dung môi metanol, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dần thu được các loại cao như: cao eter dầu hỏa, cao ethyl acetate, cao cloroform, và cao methanol. Tiến hành sắc ký cột trên cao methanol thu thu được 2 phân đoạn là phần dịch và phần tủa. Từ phân đoạn tủa (10g) sắc kí cột thu được ba phân đoạn( T1-T2-T3). Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica trên phân đoạn T1, thu được hai chất kí hiệu là Par-H1 và Par- H2. Với phân đoạn T3 thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế thu được hai chất kí hiệu là Par 1 và Par 2. Sử dụng các phương pháp quang phổ hiện đại và so sánh với tài liệu tham khảo, đã xác định được cấu trúc của hai hợp chất hữu cơ cô lập được trong địa y Parmotrema sp. như hình. HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO CỦA ĐỀ TÀI CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO CH3 CH3 O OH CHO HO CH3 O O OH CHO HO O CH3 CH3 OCH3 O Acid protocetraric Acid 8’-O-methylprotocetraric Methyl haematomme atranorin Trang 27 Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao methanol. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất còn lại trên các cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] E. J. W. Barrington, Arthur J.Willis, The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London (1974). [2] Ahmadjian V.; Nilsson S, Swedish Lichens.Yb. Am. Swed. Hist. Fdn (1963). [3] B. C. Behera, Neerja Verma, Anjari Sonone, Urmila Markhija, “Antioxidant and antibacterial properties of some cultured lichens”, Bioresource Technology, 99, 776-784 (2008). [4] Muhammad I. Choudhary, Azizuddin Saima Jalil, Atta-ur-Rahman, “Bioactive phenolic compounds from a medicinal lichen, Usnea longissima”, Phytochemistry, 66, 2346-2350 (2005) [5] Yit Heng Choi (2008), Generic potential of lichen-forming fungi in Polyketide biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University. [6] N. K. Honda, F. R. Pavan, R. G. Coelho, S. R. De AndradeLeite, A. C. Micheletti, T. I. B. Lopes, M. Y. Misutsu, A. Beatriz, R. L. Brum, C. Q. F. Leite, Antibacterial activity of lichen substances, Phytomedicine, 1-5 (2009). [7] F. David, J.A. Elix and M.W.Binsamsudin, Two new aliphatic acids from the lichen Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale, Aust. J. Chem, 43, 1297-1300 (1990) [8] Irma S.Rojas, Blas Lotina-Hennsen, Rachel Mata, “Effect of lichen metabolites on thylakoid electron transport and photophosphorylation in isolated spinach chloroplasts”, J. Nat. Prod, 63, 1396-1399 (2002). [9] Marion Millot, Sophie Tomasi, Sourisak Sinbandhit, Joel Boustie, Phytochemical investigation of Tephromela atra: NMR studies of collatolic acid derivatives, Phytochemistry Letters, 1, 139-143 (2008). Trang 28 [10] Porntep C., Suthep W., Nongluksna S., Nattaya N., Aromatase inhibitory, radical scavenging, and antioxidant activities of depsidones and diaryl ethers from endophytic fungus Corynespora cassiicola L36, Phytochemistry, 70, 407-413 (2009). [11] Lai Yeap Foo, David J. Galloway, Pseudodepsidones and other constituents from Xanthoparmelia scabrosa, Phytochemistry, 18, 1977-1980 (1979). [12] Peter Fiedler, Vicente Gambaro, Juan A. Garbarino, Wanda Wilhot, Epiphorellic acids 1 and 2, two diaryl ethers from the lichen Cornicularia epiphorella, Phytochemistry, 25, 461-465 (1986). [13] Changon Seo, Jae Hak Sohn, Jong Seog Ahn, Joung Han Yim, Hong Kum Lee, Hyuncheol Oh, Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory effects of depsidones and pseudodepsidone metabolites from the Antarctic lichen Stereocaulon apinum, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 2801-2803 (2009). [14] Vo Thi Phi Giao (2003), Crustose lichens in Binh Chau-Phuoc Buu Nature Reserive: taxonomy and ecology, Biological master dissertation, University of Natural Sciences Ho Chi Minh city, Vietnam. [15] Elaine R. Carbonero, Anderson V. Montai, Caroline G. Mellinger, Sionara Eliasaro, Guiherme L.Sassaki, Philip A.J.Gorin and Marcello lacomini (2005), “ Glucans of lichenized fungi: significance for taxonomy of the genera Parmotrema and Rimelia”, Phytochemistry, 66, 929-934. [16] Alcir Teixeira Gomes, Neli K. Honda, Fernanda Mesquita Roese, Rozanna M. Muzzi, Maria Rita Marques (2002), “Bioactive derivatives obtained from lecanoric acid, a constituent of the lichen Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale”, Rev. Bras.Farmacogn., 12, 74-75. [17] John A. Elix and Judith H. Wardlaw, 1999. The Structure of Chalybaeizanic Acid and Quaesitic Acid, Two New Lichen Depsidones Related to Salazinic Acid, Aust. J. Chem., 52, 713–715. [18] Thiago I. B. Lopes, Roberta G. Coelho, Nídia C. Yoshida, Neli K. Honda, Radical- scavenging activity of orsellinates, Chem. Pharm. Bull., 56, 1551-1554, 2008 CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO PAR H1-CDCL3-1H Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất Par 1 CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO Phụ lục 2: Phổ 1C-NMR của hợp chất Par 1 Phụ lục 3: Phổ HSQC của hợp chất Par 1 CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất Par 1 CH3 CHO O O CH2OH H3C OH COOH O HO Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất Par 1 CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR của hợp chất Par 2 CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO Phụ lục 7: Phổ HMBC của hợp chất Par 2 CH3 CHO O O CH2OCH3 H3C OH COOH O HO PAR H2-CDCL3-1H CH3 CH3 O OH CHO HO Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của hợp chất Par-H2 Phụ lục 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất Par H1 PAR H1-CDCL3-1H CH3 O O OH CHO HO OH CH3 CH3 OCH3 O