Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn lúa thơm miền Bắc bằng chỉ thị SSR

vẫn tăng bình quân mỗi năm khoảng 1,0 triệu tấn [6]. Đặc biệt từ năm 2008, trị giá tăng vọt gần 100% so với năm trước do giá gạo trên thị trường Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 15 tăng đột biến, đạt gần 2,7 tỷ USD, đưa năm 2008 trở thành năm đánh dấu mốc kim ngạch xuất khẩu gạo vượt con số 2 tỷ USD. Đặc biệt, trong vòng ba năm trở lại đây, xuất khẩu gạo đã liên tiếp lập kỷ lục về số lượng và trị giá. Năm 2009, xuất khẩu gạo đã tăng vọt lên mức hơn 6 triệu tấn. Đến năm 2010, xuất khẩu gạo tiếp tục đạt mức kỷ lục mới về cả số lượng và trị giá với 6,75 triệu tấn và thu được gần 3 tỷ USD. Bảng 1.5: Diện tích, năng suất và sản lượng lúa ở Việt Nam qua một số năm Chỉ tiêu Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (nghìn tấn) 2000 7.666,3 42,432 32.529,5 2001 7.492,7 42,853 32.108,4 2002 7.504,3 45,803 34.447,2 2003 7.452,2 46,387 34.568,8 2004 7.443,8 48,212 35.887,8 2005 7.339,5 49,514 36.341,0 2006 7.324,0 48,900 35.849,5 2007 7.201,0 49,800 35.867,5 (Nguồn: Niên giám thống kê 2007, TCTK, XNB thống kê 2008)[15]. Diện tích lúa cả năm giai đoạn 2000 - 2007 đã giảm 465 ngàn ha. Hai vùng có diện tích trồng lúa lớn nhất nước là Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) và Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có tổng cộng là 4,795 ngàn ha, chiếm 66,6% tổng diện tích trồng lúa cả năm của cả nước. Trong những năm qua diện tích trồng lúa ở các vùng này đã giảm tới 362 ngàn ha, chiếm 77,8% số diện tích bị cắt giảm. Các vùng trồng lúa khác trong nước cũng trong tình trạng diện tích sản xuất ngày càng giảm. Riêng hai vùng Đông Bắc và Tây Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 16 Bắc lại tăng về diện tích trồng lúa, tổng cộng tăng 25 ngàn ha. Đó là do tình trạng thiếu lương thực tại chỗ nên người dân phải mở rộng diện tích trồng lúa. Năng suất lúa trung bình cả nước tăng 7,4 tạ/ha, từ 42,4 tạ/ha lên gần 50 tạ/ha, tăng 17,5%, bình quân mỗi năm tăng 2,5%. Các vùng có năng suất cao là ĐBSCL, ĐBSH và Nam Trung Bộ. Trong đó vùng ĐBSH đạt năng suất lúa cao nhất nước nhưng tốc độ tăng lại thấp nhất nước, thể hiện khi năng suất đã ở mức cao thì khả năng tăng thêm là nhỏ và khó khăn hơn khi năng suất còn ở mức thấp. Mục tiêu của Việt Nam trong những năm tới là tiếp tục coi trọng an ninh lương thực mà chủ yếu là dựa vào sản xuất lúa, tiếp tục phát triển sản xuất những giống lúa cho năng suất cao ở những vùng đặc biệt khó khăn về lương thực, nhưng trên phạm vi cả nước phải chuyển mạnh sang sản xuất lúa gạo có chất lượng cao, tạo ra sản phẩm có giá trị cao nhằm nâng cao thu nhập cho người trồng lúa. 1.3. Tổng quan về lúa chất lượng * Giới thiệu một vài loại lúa thơm đặc sản Bắc bộ Lúa thơm khu vực đồng bằng Bắc bộ chủ yếu tập trung ở 2 nhóm: + Nhóm lúa Tám: Nhóm này gồm nhiều giống lúa mùa chính vụ, nhưng có một số giống lúa muộn như Tám Xoan, Tám Đen, Tám Đỏ. Trong những năm 60 trở về trước, lúa Tám có diện tích khá lớn, nhất là các tỉnh Trung du và đồng bằng Bắc bộ. Lúa Tám thường được trồng ở chân ruộng nhiều màu, nhưng cũng có những giống thích hợp với ruộng xấu hơn. Năm 1964, lúa Tám chiếm 22% diện tích canh tác lúa ở Bắc bộ ( Bùi Huy Đáp, 1999) [5]. Bằng phương pháp phân tích isozyme, phân tích khoảng cách di truyền, các giống lúa Thơm Việt Nam lần đầu tiên được xác định thuộc nhóm Japonica ( Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [13]. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 17 Các giống lúa Tám phần lớn là những giống hạt nhỏ dài, chiều dài của hạt lúa thay đổi từ 7,6 mm đến 8,5 mm và chiều rộng của hạt từ 1,7 mm đến 2,7 mm. Tỷ lệ chiều dài/rộng là 3. Đặc biệt Tám Xoan có hạt rất dài, tỷ lệ dài/rộng lên tới 4,5. Trong các giống lúa Tám qúy nhất là giống Tám Xoan và Tám Thơm. Các loại Tám thường có hạt màu vàng tươi, thời gian sinh trưởng trên dưới 150 ngày. Hai giống này có phẩm chất cao như: hạt nhỏ, gạo trong, cơm mềm dẻo, có mùi thơm đậm, tuy nhiên hai giống này khó trồng do đòi hỏi ruộng tốt nên diện tích gieo trồng tương đối hạn hẹp (Bùi Huy Đáp, 1999) [5]. + Nhóm lúa Dự: Lúa Dự thường là những nhóm chính vụ hoặc hơi sớm, thời gian sinh trưởng 130 đến 138 ngày. Giống thường được cấy ở chân ruộng nhiều màu, lúa Dự khác hẳn lúa Tám ở màu sắc tai lá, bẹ lá và mỏ hạt. Lúa Dự có hạt dài từ 7,9 mm đến 8,5 mm; chiều rộng hạt từ 2,4 mm đế 2,8 mm. Tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng là 3. Màu sắc hạt thay đổi từ vàng rơm đến vàng sẫm. Gạo Dự là loại gạo qúy được nhiều người ưa chuộng. Nhưng so với Tám thơm thì hạt gạo Dự thô hơn, kém trong, hạt có nhiều nhựa, khó nấu và cơm ít thơm hơn. * Nghiên cứu tính trạng mùi thơm Mùi thơm là tính trạng do ảnh hưởng của hợp chất 2 acetyl 1-1- pyrroline gây ra. Gen điều khiển mùi thơm của gạo đã được nhiều tác giả nghiên cứu và có nhiều kết luận khác nhau. Theo Ghose & Butany (1952), Sood & Siddiq (1979), Berner & Hofl (1986) thì tính trạng mùi thơm do một gen lặn điều khiển. Theo Tripathi & Rao (1979) do hai gen lặn hoạt động bổ sung (tỷ lệ thơm và không thơm ở thế hệ F2 là 9:7). Một số tác giả khác lại cho rằng tính trạng mùi thơm do 3 - 4 gen lặn điều khiển. Theo Inger (1996) và Renetal (1999), mùi thơm của hạt gạo là do hợp chất 2 acetyl - 1 - pyrroline kết hợp với nhiều loại dầu, chất phenolics Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 18 và các hợp chất vô cơ khác tạo thành. Chính vì thế, hầu hết các giống lúa thơm chỉ thích hợp với một số vùng sinh thái nào đó mà thôi. Theo thang điểm SES của IRRI 1996 về mùi thơm của gạo sau khi nấu chín thành cơm như sau: + Điểm 0: Không thơm + Điểm 1: Hơi thơm + Điểm 2: Thơm Mùi thơm của lúa gạo phụ thuộc phần lớn vào bản chất của giống. Tuy nhiên mùi thơm của các giống lúa thơm lại biến động mạnh mẽ dưới tác động của môi trường, kỹ thuật canh tác và kỹ thuật bảo quản sau thu hoạch mặc dù cơ chế của chúng chưa được làm rõ. Cùng một giống gạo thơm nhưng khi gieo trồng ở nơi này cho mùi thơm đặc trưng nhưng ở nơi khác lại thơm rất ít hoặc không thơm. Ví dụ: Mùi thơm của Basmati cần nhiệt độ lạnh của môi trường nơi canh tác, mùi thơm của Khao Dawk Mali và các giống lúa thơm cổ truyền Việt Nam có thể do ảnh hưởng của đất đai nơi canh tác. 1.4. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị phân tử 1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua chỉ thị ADN Chỉ thị phân tử dựa trên ADN là công cụ hiệu quả vượt xa chỉ thị hóa sinh và hình thái trong việc đánh giá đa dạng di truyền. Lợi thế của các chỉ thị phân tử dựa trên ADN là có thể xác định được những khác biệt nhỏ nhất ở mức ADN, có khả năng tạo ra hàng chục, hàng trăm locus và trên mỗi locus có thể phát hiện được nhiều allele cùng một lúc. Nhờ có chỉ thị ADN, ngày nay việc đánh giá đa dạng di truyền lúa đã trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn nhiều, tuy nhiên các kỹ thuật có liên quan đến chỉ thị ADN đòi hỏi phải đầu tư lớn và tốn kém. Có rất nhiều chỉ thị ADN đang được sử dụng và liên tục được phát triển. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 19 1.4.2. Một số chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng PCR  Chỉ thị phân tử RAPD ( Random Amplified Plymorphic DNA) RAPD (đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong những phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do William(1990), Wesh và cs. Phát minh. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bội ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên dài 10 nucleotide. Các mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau của hai mạch đơn đối diện của đoạn ADN khuôn. Nếu các điểm gắn mồi nằm trong khoảng cách có thể nhân bội được (thường từ 200 - 2000 nucleotitde) thì đoạn ADN đó được nhân lên. Ưu điểm chính của kỹ thuật này là không cần phải biết trình tự nucleotide ở ADN được nhân bội, kỹ thuật tương đối đơn giản, nhanh và dễ thực hiện [41]. Chỉ thị RAPD thường được dùng để phân tích và xác định quan hệ di truyền giữa các cá thể trong công tác lai tạo hay phân loại. Chúng cũng được sử dụng để xác định các gen kiểm soát hoặc liên quan đến một tính trạng nào đó của cây trồng. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD không ổn định khi tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện khác nhau. Như vậy RAPD là phương pháp PCR sử dụng mồi ngẫu nhiên cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định.  Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Tác giả Vos và cs (Vos và cs, 1995) lần đầu tiên phát triển kỹ thuật AFLP. ADN genome được cắt thành các phân đoạn có kích thước khác nhau, trong số đó sẽ có các phân đoạn mang các đầu mút giống nhau. Nếu như sử dụng một đoạn nối (adaptor) như nhau có gắn thêm một số oligonucleotide được chọn lọc trước để định hướng cho việc gắn của các cặp mồi PCR, thì tất cả những đoạn ADN có đầu mút giống nhau sẽ được nhân bội. Khi thay đổi Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 20 số lượng và trật tự các oligonucleotide được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn ADN khác nhau [39]. Kỹ thuật này ra đời mang lại nhiều thuận lợi cho phân tích di truyền và lập bản đồ. AFLP kết hợp được sự chính xác của RFLP và sự tiện lợi của PCR vì vậy AFLP đã nhanh chóng trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng ADN tổng số sử dụng cho kĩ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế của AFLP là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và dị hợp, giá thành cho nghiên cứu tương đối cao.  Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại trình tự đơn giản) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6 bp (Litt ADN Luty, 1989; Jacob et al, 1991). Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại [26]. + Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. + Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác. + Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 21 nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL). * Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền (Hokanson và cs., 1998) [24]. SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer và cs, 1994). SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Tác giả Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 22 Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR. Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần (Hokanson và cs., 1998) [24]. Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. Hiện nay, đã có khoảng 2.740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157 kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR (Akagi và cs., 1996 [16], Chen và cs., 1997 [20]; Chen và cs., 2002 [19]; Cho và cs., 2000 [22]; Coburn và cs., 2002 [23]; McCouch, 2002 [29]; Paunaud và cs.,1996 [33]). 1.4.3. Ứng dụng của chỉ thị SSR trong nghiên cứu đa đạng di truyền, chọn tạo các giống lúa thơm Trên thực tế, việc chọn giống lúa chất lượng dựa trên kiểu hình rất khó do có sự tương tác giữa các gen. Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen quy định mùi thơm, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn. Xác định gen thơm bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen thơm và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen thơm trong quần thể phân li. Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen thơm khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 23 Tác giả Sujatha (2004) nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati bằng chỉ thị SSR. Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa thơm (bao gồm 22 giống lúa Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài) dựa trên 6 chỉ thị SSR. Kết quả cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn nằm trong cùng một nhóm khác. Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cung cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái. Kết quả nghiên cứu này cũng giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng (Sujatha, 2004) [34]. Tác giả Shu Xia Sun và cộng sự (2008) tiến hành kiểm tra gen thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (Bacterial Artificial Chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1.1) [35]. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 24 Hình 1.1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8 Tác giả K. Kibria và cộng sự (2009), phân tích đa dạng di truyền gen thơm của lúa bằng chỉ thị SSR và RAPD. Công trình nghiên cứu được thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 4 năm 2008 tại Viện hạt nhân Nông nghiệp (Bina), Mymensingh, Bangladesh. Kết quả chạy SSR của ba mồi (RM223, RM342A và RM515) thu được kết quả 46 băng, mức trung bình của allele dao động từ 1,78 đến 2,49 [25]. Tác giả Malik Ashiq Rabbani và cộng sự (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan. Nghiên cứu được thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm thuộc nhóm lúa Indica. Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker SSR được phân bố trên khắp bộ gen của lúa. Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ số allele dao động 2 - 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,259 - 0,782 (trung bình là 0,571). Sau khi số liệu được phân tích bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5 giống không thơm, hai giống lúa Japonica). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm. Kết quả nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 25 này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả người nông dân và người tiêu dùng [28]. Tác giả Olufowote và cộng sự (1997) đã nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP. Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến. Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến. Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các allele cao hơn chỉ thị AFLP. Các tác giả cũng chỉ ra rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có thể nghiên cứu các allele dị hợp tử ở lúa [32]. Tác giả Natalya (2000) đã sử dụng chỉ thị RFLP đánh giá đa dạng di truyền của 342 giống lúa Việt Nam và nhận thấy rằng các giống lúa được thu thập từ miền Nam Việt Nam thuộc nhóm Indica và các giống lúa thu từ miền Bắc thì phần lớn thuộc nhóm Japonica. Sau nghiên cứu tác giả đã đưa ra kết luận Việt Nam là một nước có đa dạng di truyền lúa thuộc loại cao nhất thế giới [20]. Tác giả Mahmoud (2005) tiến hành nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và 8 mồi AFLP. Kết quả thu được cho thấy mức độ đa hình tương ứng với chỉ thị RAPD, SSR và AFLP là 72,2%, 90% và 67,9% . Cũng qua kết quả này, tác giả khẳng định rằng các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa (Mahmoud M. Saker và ctv., 2005) [27]. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 26 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng chỉ thị SSR của tác giả Raj (Raj và ctv., 2006). Tác giả đã sử dụng 32 cặp mồi, kết quả nghiên cứu cho thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC dao động từ 0,00 (RM259 và RM230) đến 0,83 (RM420). Theo Singh Balwant và cộng sự (2011), nghiên cứu đa dạng di truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR, hình thái, đánh dấu hóa lý. Kết quả SSR marker phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao động từ 0,139 - 0,99 với trung bình 0,589 cho mỗi mồi [35]. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 27 Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Vật liệu sử dụng nghiên cứu bao gồm 17 giống lúa chất lượng được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, đang được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật (Bảng 2.6). 15 cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau (Bảng 2.7). Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 28 Bảng 2.6: Danh sách 17 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu TT SĐK Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu 1 233 Tám tức Tây Bắc Tây Bắc T1 2 259 Tám trắng Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T2 3 268 Tám đen Hà Đông Hà Nội T3 4 287 Tám thơm Hải Dương Hải Dương T4 5 290 Tám thơm Thái Bình Thái Bình T5 6 305 Tám tròn Hải Dương Hải Dương T6 7 307 Tám đứng Hải Dương Hải Dương T7 8 313 Tám xoăn có râu Hải Dương Hải Dương T8 9 314 Tám xoan Bắc Ninh Bắc Ninh T9 10 316 Tám nghệ hạt đỏ - T10 11 317 Tám xoan Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T11 12 1048 Tám xoan Hải Hậu Nam Định T12 13 2375 Tám thơm ấp bẹ Nam Định Ninh Bình T13 14 5117 Tám Xuân Đài Nam Định T14 15 5118 Tám tiêu - T15 16 5119 Tám Xuân Hồng - T16 17 5120 Tám Nghĩa Hồng Nam Định T17 (-): chưa rõ nguồn gốc Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 29 Bảng 2.7: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước (bp) 1 RM 13 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’ 5 124-154 2 RM 30 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’ 6 171-183 3 RM 282 3’-CTGTGTCGAAAGGCTGCAC-5’ 5’ –CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG-3’ 3 128-151 4 RM 135 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’ 3 119-131 5 RM 142 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’ 4 235-238 6 RM 143 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’ 3 195-207 7 RM 270 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’ 12 104-117 8 RM 153 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’ 5 196-234 9 RM 162 3’ –CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG-5’ 5’ - GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG-3’ 6 201-238 10 RM 171 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’ 10 310-356 11 RM 172 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’ 7 159-165 12 RM 174 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’ 2 207-222 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 30 13 RM 224 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’ 11 120-152 14 RM 245 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’ 9 136-146 15 RM 515 3’-TAGGACGACCAAAGGGTGAG-5’ 5’-TGGCCTGCTCTCTCTCTCTC-3’ 8 205-231 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến.  Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.  Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn.  Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800µl CTAB buffer và 60 µl SDS 10%.  Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.  Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.  Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa ADN.  Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ.  Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 31  Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.  Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% . 2.2.2. Phản ứng PCR Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau: STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất hai lần khử ion 3,2 2 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM 1 3 dNTPs 10mM 1,0 4 Taq ADN polymerase 1U/µl 0,8 5 Mồi xuôi 5µM 1,5 6 Mồi ngược 5µM 1,5 7 ADN 10g/µl 1 Tổng thể tích của một phản ứng 10,0 * Chương trình PCR: Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ I 94 5 phút 1 II 94 1 phút 35 56 45 giây 72 1 phút III 72 7 phút 1 Giữ mẫu ở 40C Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 32 2.2.3. Điện di sản phẩm PCR + Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):  Nước cất khử ion: 22,2ml  10X TBE: 1,5ml  Dung dịch acrylamide 40%: 6ml  Dung dịch APS 10%: 300µl  Dung dịch TEMED: 25µl  Tổng thể tích gel: 30ml Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. + Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 ở điều kiện 150V. Thời gian điện di khoảng 50-60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It. 2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN.  Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN  Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN  Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu) Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 33 - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC =1 - Pi2 Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh. - Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi giống lúa được tính theo công thức: YM X H  % Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR. Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN. M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu. - Tính tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức: M Z M % Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng AND. M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy Cetyl- Trimethyl- Amonium- Bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic. ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy các băng ADN tổng số của các giống lúa Tám thơm thu được gọn, sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ ADN cao, đủ tiêu chuẩn để thực hiện các phản ứng PCR và cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.2: ADN tổng số của 17 giống lúa nghiên cứu. 3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 35 Tần số và kích thước các allele trên từng cặp mồi được thể hiện bảng 3.8: Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 36 Bảng 3.8. Tần số allele trên từng cặp mồi TM KT (bp) Tên mẫu allele f f2 1-sumf2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 RM13 155 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 135 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 120 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 13 0.765 0.585 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.612 0.39 RM30 130 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 13 0.765 0.585 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 4 0.235 0.055 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.640 0.36 RM282 110 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0.375 0.141 105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 1 0 0 0 1.5 0.094 0.009 95 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0.188 0.035 85 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 1 0 1 1 1 5.5 0.344 0.118 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 16 0.303 0.70 RM135 135 0 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0.029 0.001 125 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 4 0.235 0.055 120 0 0.5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 12.5 0.735 0.541 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.597 0.40 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 37 RM142 235 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 1.000 1.000 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0 RM143 275 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.063 0.004 250 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 12 0.750 0.563 235 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0.188 0.035 ∑ 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 0.602 0.40 RM270 120 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 7 0.412 0.170 105 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 10 0.588 0.346 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.516 0.48 RM153 225 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.059 0.003 210 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0.235 0.055 200 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0.5 0 3.5 0.206 0.042 190 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0.5 1 6.5 0.382 0.146 180 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.261 0.74 RM162 230 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 16 1.000 1.000 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 16 1.000 0.00 RM171 350 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 320 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 0.824 0.678 310 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.059 0.003 0.30 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.696 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 38 RM172 170 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0.5 0.029 0.001 160 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 3 0.176 0.031 155 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0.5 0 1 0 0 10.5 0.618 0.381 150 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0.176 0.031 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.445 0.56 RM174 220 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 13 0.765 0.585 205 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 0.235 0.055 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.640 0.36 RM224 150 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0.176 0.031 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0.059 0.003 130 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 13 0.765 0.585 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.619 0.38 RM245 150 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 3 0.176 0.031 145 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0.118 0.014 135 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 12 0.706 0.498 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.543 0.46 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 39 RM515 235 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 5 0.294 0.087 225 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 10 0.588 0.346 210 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.059 0.003 200 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.059 0.003 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.439 0.56 z 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 M% 0.00 0.00 0.00 6.67 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 6.67 6.67 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 x 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 y 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 15-y 15 15 15 14 15 15 15 15 15 15 14 14 15 15 15 15 15 H% 0.00 6.67 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 7.14 6.67 0.00 0.00 6.67 0.00 ( TM: Tên mồi; x: Tổng số ellele dị hợp; y, z: Tổng số ellele khuyết) Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 40 Như vậy, qua kết quả bảng 3.8 cho thấy:  Số mồi thể hiện 5 allele: 1 mồi (RM153) tương ứng với kích thước (bp): 180, 190, 200, 210, 225.  Số mồi thể hiện 4 allele: 3 mồi (RM282, RM172, RM515) tương ứng với các kích thước (bp): + RM282: 85, 95,105, 110. + RM172: 150, 155, 160, 170. + RM515: 200, 210, 225, 235.  Số mồi thể hiện 3 allele: 6 mồi (RM13, RM135, RM143, RM224, RM171, RM245) tương ứng với các kích thước (bp): + RM13: 120, 135, 155. + RM135:120, 125, 135. + RM143: 235, 250, 275. + RM224: 130, 135, 150. + RM171: 310, 320, 350. + RM245:135, 145, 150.  Số mồi thể hiện 2 allele: 3 mồi (RM30, RM270, RM174, RM224) tương ứng với các kích thước (bp): + RM30: 125,130. + RM270: 105, 120. + RM174: 205, 220.  Số mồi thể hiện 1 allele: 2 mồi (RM142, RM162) tương ứng với các kích thước (bp): + RM142: 235. + RM162: 230. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 41 Bảng 3.9: Số allele thể hiện và hệ số PIC của 15 cặp mồi SSR TT Tên Mồi Vị trí trên NST Số allele PIC 1 RM13 5 3 0,39 2 RM30 6 2 0,36 3 RM282 3 4 0,70 4 RM135 3 3 0,40 5 RM142 4 1 0,00 6 RM143 3 3 0,40 7 RM270 12 2 0,48 8 RM153 5 5 0,74 9 RM162 6 1 0,00 10 RM171 10 3 0,30 11 RM172 7 4 0,56 12 RM174 2 2 0,36 13 RM224 11 3 0,38 14 RM245 9 3 0,46 15 RM515 8 4 0,56 Tổng 42 7,09 Trung bình 2,8 0,48 Qua kết quả thu được ở bảng 3.9, cho thấy: Với 15 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên có 13 cặp mồi cho kết quả đa hình và 2 cặp mồi cho kết quả đơn hình - chỉ thu được 1 allele (RM142 và RM162). Tổng số allele thu được trên 15 cặp mồi SSR là 42 allele, trung bình 2,8 allele/cặp mồi. Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,48. Trong đó: Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 42 + Giá trị PIC của cặp mồi RM13 là: 0,39. + Giá trị PIC của cặp mồi RM30 bằng cặp mồi RM174 là: 0,36. + Giá trị PIC của cặp mồi RM282 là: 0,70. + Giá trị PIC của cặp mồi RM135 bằng cặp mồi RM143 là: 0,40. + Giá trị PIC của cặp mồi RM142 bằng cặp mồi RM162 là: 0.00. + Giá trị PIC của cặp mồi RM270 là 0,48. + Giá trị PIC của cặp mồi RM153 là cao nhất: 0,74. + Giá trị PIC của cặp mồi RM171 là 0,30. + Giá trị PIC của cặp mồi RM172 là 0,56. + Giá trị PIC của cặp mồi RM224 là 0,38. + Giá trị PIC của cặp mồi RM245 là 0,46. + Giá trị PIC của cặp mồi RM515 là 0,56. Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM245 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 43 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu Tỷ lệ dị hợp tử (H) và tỷ lệ số liệu khuyết (M) của tập đoàn Tám thơm nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR được trình bày ở bảng 3.10. Bảng 3.10: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu TT Tên giống M% H% 1 Tám tức Tây Bắc 0 0 2 Tám trắng Vĩnh Phúc 0 6,67 3 Tám đen Hà Đông 0 0 4 Tám thơm Hải Dương 6,67 0 5 Tám thơm Thái Bình 0 0 6 Tám tròn Hải Dương 0 0 7 Tám đứng Hải Dương 0 0 8 Tám xoan có râu Hải Dương 0 0 9 Tám xoan Bắc Ninh 0 0 10 Tám nghệ hạt đỏ 0 0 11 Tám xoan Vĩnh Phúc 6,67 0 12 Tám xoan Hải Hậu 6,67 7,14 13 Tám thơm ấp bẹ 0 6,67 14 Tám Xuân Đài 0 0 15 Tám tiêu 0 0 16 Tám Xuân Hồng 0 6,67 17 Tám Nghĩa Hồng 0 0 Tổng 20,01 27,15 Trung bình 1,17 1,60 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 44 Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy: có 3 giống khuyết số liệu ở một mồi duy nhất và cùng tỉ lệ là 6,67% là T4 (Tám thơm Hải Dương), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc), T12 (Tám xoan Hải Hậu). 14 giống còn lại không bị khuyết số liệu. Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình của 17 giống là 1,17%; không có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 17 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê. Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở giống lúa T12 (Tám xoan Hải Hậu) là 7,14%. Có 3 giống (Tám trắng Vĩnh Phúc), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T16 (Tám Xuân Hồng) có tỷ lệ dị hợp là 6,67%. Còn lại 13 giống có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là các giống này đều đồng hợp trong phạm vi 15 mồi nghiên cứu (chỉ có một băng ADN duy nhất/mồi). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn khá thấp là 1,60%. Hình 3.4: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM515 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 45 Hình 3.5: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM270 3.4. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa chất lượng nghiên cứu Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 15 cặp mồi SSR với tập đoàn 17 giống lúa chất lượng nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền (Bảng 3.4) và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chất lượng (hình 3.5). Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 46 Hình 3.6: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chất lượng nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 47 Bảng 3.11: Mối quan hệ di truyền giữa 17 giống lúa chất lượng Giống T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T1 1.00 T2 0.22 1.00 T3 0.47 0.40 1.00 T4 0.18 0.53 0.37 1.00 T5 0.56 0.40 0.47 0.37 1.00 T6 0.40 0.12 0.27 0.24 0.40 1.00 T7 0.40 0.27 0.33 0.30 0.65 0.40 1.00 T8 0.65 0.27 0.47 0.30 0.75 0.47 0.65 1.00 T9 0.56 0.17 0.33 0.18 0.56 0.47 0.47 0.75 1.00 T10 0.27 0.12 0.12 0.24 0.33 0.47 0.22 0.33 0.47 1.00 T11 0.73 0.18 0.37 0.20 0.63 0.44 0.44 0.73 0.86 0.44 1.00 T12 0.63 0.18 0.44 0.14 0.37 0.30 0.24 0.44 0.53 0.24 0.60 1.00 T13 0.56 0.17 0.27 0.18 0.47 0.40 0.33 0.56 0.47 0.33 0.53 0.44 1.00 T14 0.33 0.17 0.17 0.18 0.33 0.33 0.27 0.40 0.47 0.40 0.53 0.37 0.47 1.00 T15 0.40 0.12 0.17 0.18 0.33 0.27 0.33 0.40 0.47 0.33 0.53 0.44 0.75 0.56 1.00 T16 0.56 0.08 0.27 0.08 0.33 0.33 0.22 0.40 0.47 0.27 0.53 0.63 0.56 0.47 0.56 1.00 T17 0.40 0.12 0.22 0.18 0.33 0.33 0.22 0.40 0.33 0.27 0.37 0.30 0.75 0.47 0.56 0.56 1.00 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 48 Qua kết quả thu được ở bảng 3.11 và hình 3.6 cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền của 17 giống lúa Tám nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,08 (T4 - Tám thơm Hải Dương và T16 - Tám Xuân Hồng) đến 0,86 (T9 - Tám xoan Bắc Ninh và T11 - Tám xoan Vĩnh Phúc) Dựa vào sơ đồ mối quan hệ di truyền của 17 giống lúa, ở mức tương đồng di truyền 36%, 17 mẫu giống lúa nghiên cứu được chia thành 3 nhóm: * Nhóm I: Có 12 giống lúa bao gồm các giống T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T5 (Tám thơm Thái Bình), T8 (Tám xoan có râu Hải Dương), T7 (Tám đứng Hải Dương), T9 (Tám xoan Bắc Ninh), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc), T16 (Tám Xuân Hồng), T14 (Tám Xuân Đài), T15 (Tám tiêu), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17 (Tám Nghĩa Hồng). Xét ở mức tương đồng di truyền 48%: 12 giống trong nhóm I được chia làm 3 nhóm phụ: - Nhóm I.1 gồm có 3 giống lúa: T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T116 (Tám Xuân Hồng). Hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,63 (T1 và T12), và (T12 và T16). Hệ số di truyền tương đồng thấp nhất (giữa giống T1 và giống T16) là 0,56. - Nhóm I.2 gồm có 5 giống lúa: T5 (Tám thơm Thái Bình), T7 (Tám đứng Hải Dương), T8 (Tám xoăn có râu Hải Dương), T9 (Tám xoan Bắc Ninh) và T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc). Trong đó hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,44 đến 0,86. T9 và T11 có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,86. - Nhóm I.3 gồm 4 giống lúa: T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17(Tám Nghĩa Hồng), T14 (Tám Xuân Đài) và T15 (Tám tiêu). Trong đó có hệ số tương đồng cao nhất là 0,75 (giữa T13 và T15). Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống còn lại dao động từ 0,47 đến 0,74. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 49 * Nhóm II: Gồm giống lúa T6 (Tám tròn Hải Dương) và T10 (Tám nghệ hạt đỏ). Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 giống trong nhóm này là 0,47. * Nhóm III: Gồm các giống lúa T2 (Tám trắng Vĩnh Phúc), T3 (Tám đen Hà Đông), T4 (Tám thơm Hải Dương). Nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,37- 0,53. T2 và T4 có hệ số tương đồng di truyền cao nhất. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Tập đoàn lúa Tám thơm bản địa miền Bắc nghiên cứu rất đa dạng về các thành phẩn allele. Kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR thu được tổng số 42 loại allele, trung bình 2,8 allele/cặp mồi. Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,48. Hệ số PIC đạt giá trị cao nhất (0,74) ở cặp mồi RM153 với 5 allele thể hiện. Các giống lúa nghiên cứu có độ thuần di truyền rất cao (tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 1,60%). Tập đoàn 17 giống lúa chất lượng nghiên cứu rất đa dạng, có hệ số tương đồng di truyền giữa các giống dao động từ 0,08 đến 0,82. Xét ở mức tương đồng di truyền 36%: 17 mẫu giống lúa nghiên cứu được chia thành 3 nhóm: + Nhóm I: Gồm có 12 giống hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,22 - 0,86 và được chia làm 3 nhóm phụ. + Nhóm II: Gồm có 2 giống hệ số tương đồng di truyền là 0,47. + Nhóm III: Gồm có 3 giống có hệ số tương đông từ 0,37- 0,53. Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chất lượng của Việt Nam. 2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen lúa Tám thơm ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chất lượng ở mức phân tử. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995), ‘‘Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống lúa”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), “Di truyền phân tử - những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng”, NXB nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 3. Phạm Văn Chương (2001), “ Hiện trạng và xu thế phát triển sản xuất lúa gạo ở Việt Nam ”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, số 5. 4. Lê Doãn Diên, “Nâng cao chất lượng lúa gạo phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu”, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội 2003, trang 37 - 150. 5. Bùi Huy Đáp (1999), “Một số vấn đề về cây lúa”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 6. Trần Văn Đạt, “Sản xuất lúa gạo thế giới - hiện trạng và khuynh hướng phát triển trong thế kỷ 21’’, NXB Nông nghiệp, 2005. 7. Trần Văn Đạt (2002), “Tiến trình phát triển sản xuất lúa gạo tại Việt Nam tù thời nguyên thủy đến hiện đại”, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Lang (2002), “Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống lúa chất lượng cao”. Báo cáo khoa học, An Giang. 9. Nguyễn Thị Lang, Trương Bá Thảo, Bùi Chí Bửu (2004), “Nghiên cứu di truyền trên gen thơm của cây lúa”. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. 10. Tạ Minh Sơn, Nguyễn Tấn Hinh, Lê Vĩnh Thảo, Vũ Tuyên Hoàng, Nguyễn Hữu Nghĩa, Trương Văn Kính, Nghiễn Trọng Khanh (2006), “Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa giai đoạn 2001-2005”. Kỷ yếu Hội nghị tổng kết khoa học và công nghệ nông nghiệp 2001 - 2005, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 52 11. Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp (1999), "Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng lúa". Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1999, tr. 1205-1215 12. Lê Vĩnh Thảo, Bùi Chí Bửu, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Văn Vương (2004), “Các giống lúa đặc sản, giống lúa chất lượng cao và kỹ thuật canh tác”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 13. Đỗ Khắc Thịnh, Nguyễn Ngọc Quỳnh, Dương Ký, Nguyễn Văn Huấn (1997), “Kết quả tuyển chọn giống lúa mùa FRG67 cho vùng đất phèn, nhiễm mặn, ảnh hưởng thuỷ triều ven thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Nông nghiệp và Công Nghiệp Thực Phẩm (11/1997) 14. Nguyễn Thanh Tuyền, Trần Văn Chiến (2005), “Kỷ yếu Hội nghị khoa học Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam’’, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 15. Tổng cục Thống kê (2008), “Niên giám thống kê năm 2008”, NXB Thống kê, Hà Nội. * Tài liệu nước ngoài 16. Akagi H, Yokozeki Y, Inagaki A, Fujimura T (1996). Microsatellite DNA markers for rice chromosomes. Theor Appl Genet 93:1071. 17. Berner DK, Hoff BJ (1986) Inheritance of scent in American long grain rice. Crop Science 26: 876-878. 18. Chang T.T. (1985). Crop history and genetic conservation. Rice, A case study. In: Iwova state. Journal of research, 59, pp. 425-455 19. Chen X, Cho Y, McCouch S (2002). Sequence divergence of rice microsatellites in Oryza and other plant species. Mol Gen Genomics. 268: 331-343. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 53 20. Chen X, Temnykh S, Xu Y, Cho YG, McCouch SR (1997). Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet, 95:553. 21. Cheng C. Y. Motohashi R., Tsuchimoto S., Fukuta Y., Ohtsubo H. (2003). Polyphyletic of cultivated rice: based on the interspersion pattern of SINEs. Mol.Biol.Evol , pp.67-75 22. Cho YG., Ishii T, Temnykh S, Chen X, Lipovich L, McCouch SR, Park WD, Ayres N, Cartinhour S (2000). Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet 100-713. 23. Coburn JR, Temnykh SV, Paul EM and McCouch SR (2002). Design and application of microsatellite marker panels for semiautomated genotyping of rice (Oryza sativa L.). Crop Science 42-2092. 24. Hokanson SC, Szewc-McFadden AK., Lamboy WF and McFerson JR (1998). Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in Malus × domestica borkh. Core subset collection. Theor. Appl. Genet 671-683. 25. Kibria K, Nur F, Begum SN, Islam MM, Paul SK, Rahman KS, and Azam SMM (2009). Molecular Marker based Genetic Diversity Analysis in Aromatic Rice Genotypes Using SSR and RAPD Markers. Int. J. Sustain. Crop Prod. 4(1):23-34. 26. Litt M, Luty JA (1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet 44: 397 - 401. 27. Mahmoud M. Saker, Sawsan S. Youssef, Naglaa A. Abdallah, Hany S. Ashandy and AhmedM. El Sharkawy (2005), Genetic analysis of some Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 54 Egyptian rice genotypes using RAPD, SSR and AFLP, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (9), pp. 882-890. 28. Malik AR, Muhammad SM, Zabta KS and Kazuko YS (2010). Genetic analysis of Basmati and non-Basmati Pakistani rice (Oryza sativa L.) cultivars using microsatellite markers. Pak. J. Bot. 42(4): 2551-2564. 29. McCouch SR, Leonid T, Xu Y, Lobos KB, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Z, Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, DeClerck G, Schneider D, Cartinhour S, Ware D, Stein L (2002). Development and Mapping of 2240 new SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.). DNA Res 9:199-207. 30. Natalya V. Alpatyeva (2000), Genetic diversity of Vietnamese landraces of rice by RFLP markers,Research study in NIAR, Japan. 31. Oka H. I. (1988), Origin of cultivatied rice. J. Sci. Societies press, Tokyo. 32. Olufowote JO, Xu Y, Chen X, Park WD, Beachell HM, Dilday RH, Goto M and McCouch SR (1997). Comparative evaluation of within-cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers. Genome 38: 1170-1176. 33. Panaud O, Chen X, McCouch SR (1996). Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet 252-597. 34. Sujatha K, Upadhyay R, Kaladhar K, Rani NS and Sarla N (2004). Genetic relationship among aromatic short grain and Basmati rice based on ISSR and SSR markers. Rice Genetic Newsletter vol 21. 35. Singh Balwant, Singh S.P, Kumar J, 2011. Assessment of genetic diversity of aromatic rices (Oryza sativa L.) using morphological, physiochemical and SSR markers. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 55 35. Shu Xia Sun, Fang Yuan Gao, Xian Jun Lu, Xian Jun Wu, Xu Dong Wang,Guang Jun Ren and Hong Luo.2008. Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L). Genetics and Molecular Biology, 31, 2, 532-538. 36. Tateoka, T., 1963. Taxononic Studies of Oryza III. Key to the species and their enumeration. Bot. Mag. Tokyo 76: 165-173. 37. Tateoka, T., 1964. Notes on some grasses. XVI. Embryo structure of the genus Oryza in relation to the systematics. Amer. J. Bot. 51: 539-543. 38. Temnykh S, Park WD, Ayres N, Cartinhour S, Hauck N (2000). Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet. 100-697. 39. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee TVD, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl Acids Res. 23(21): 4407 - 4414. 40. Welsh J and McClelland M (1990). Genomic fingerprinting produced by PCR with arbitrary primers. Nucl. Acids Res. 18: 7213-7218. 41. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA and Tingey SV (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl Acids Res. 18: 6531-6535. * Wedside 42. uang-Viet.pdf. 43. 44. www.gramene.org, 2006. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 56 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh Khoa Sinh- KTNN Lớp K34A- Sinh 57