Khóa luận Phối hợp thuốc có nguồn gốc tự nhiên với màng gelatin – Alginat trong điều trị

heo vaø da eách. Phöông phaùp naøy khaéc phuïc ñöôïc haïn cheá veà nguoàn da nhöng cuõng gaëp nhöõng khoù khaên trong vieäc baûo quaûn vaø khoâng coù tính töông hôïp sinh hoïc. ƒ Maøng oái: ñaây laø phöông phaùp khaù ñôn giaûn vaø reû tieàn. Maøng oái ñöôïc thu nhaän töø caùc beänh vieän phuï saûn. Haïn cheá: maøng oái caàn phaûi ñöôïc kieåm tra vaø saøng loïc caån thaän vôùi caùc beänh truyeàn nhieãm. Söï baùm dính cuûa maøng oái vaøo veát thöông cuõng keùm hieäu quaû hôn so vôùi maøng phuû baèng da. Maøng oái moûng vaø keùm beàn deã laøm tieát dòch neân caàn ñöôïc bao phuû baèng moät lôùp phuû huùt giöõ thöù caáp ñeå ngaên khoâng bò troùc. 4.1.2.Vaät lieäu sinh toång hôïp ƒ Maûnh gheùp ñôn lôùp: - Maøng silicone phun (Hydron): goàm boät poly(hydroxyethyl methacrylate) vaø polyethylene glycol loûng ñöôïc phun leân beà maët veát boûng taïo thaønh moät lôùp maøng moûng, ñöôïc öùng duïng ñeå laøm saïch beà maët veát boûng ñoä 3, tuy nhieân maøng deã bò bong troùc vaø giaù thaønh cao. - Gel loûng töø copolymer agar vaø acrylamide: coù taùc duïng che phuû vaø laøm saïch veát thöông kích thích söï laønh hoùa nhanh tuy nhieân laïi khoâng baùm dính ñöôïc vaøo veát thöông. - Maøng collagen: coù khaû naêng baùm dính töï nhieân vôùi veát thöông do keát hôïp vôùi caùc sôïi huyeát fibrin, coù taùc ñoäng caàm maùu treân veát thöông bò vôõ maïch vaø coù Khoùa luaän toát nghieäp tính khaùng nguyeân thaáp. Tuy nhieân collagen coù khuynh höôùng taïo sôïi cöùng vaø doøn neân keùm beàn. ƒ Maûnh gheùp ña lôùp: - Biobrane: laø vaät lieäu 2 lôùp toång hôïp goàm 1 lôùp nylon lieân keát coäng hoùa trò chaët cheõ vôùi collagen töø heo. Lôùp ngoaøi cuûa biobrane laø moät lôùp cao su silicone coù caùc loã nhoû ñeå kieåm soaùt tính thaám nöôùc cuûa vaät lieäu. Biobrane meàm deûo, baùm dính toát, beàn ñöôïc duøng laøm vaät phuû ngaén haïn. - Maøng 2 lôùp collagen - GAG (glycoaminoglycan): goàm lôùp beân trong laø collagen - chondroitinosulfate vaø lôùp ngoaøi laø silicone moûng. Daïng saûn phaåm thöông maïi ñöôïc bieát ñeán laø maøng Integra. ƒ Maûnh gheùp nuoâi caáy teá baøo: Maûnh gheùp goàm caùc teá baøo bieåu bì laáy töø da cuûa beänh nhaân ñöôïc nuoâi treân maøng collagen cô baûn. Moät soá saûn phaåm thöông maïi ñöôïc saûn xuaát theo hình thöùc naøy goàm: maøng Dermagraft, maøng Orcel, maøng Promogran… 4.2.Caùc öùng duïng cuûa vaät lieäu sinh toång hôïp trong ñieàu trò boûng [2] Trong ñieàu trò boûng saâu dieän roäng, ñeå taïm thôøi che phuû toån khuyeát da trong coâng taùc chöõa boûng vieäc söû duïng caùc vaät lieäu sinh hoïc laø heát söùc caàn thieát, thöôøng ñöôïc öùng duïng trong caùc tröôøng hôïp sau: - Phuû caùc khuyeát toån da sau caét boû hoaïi töû boûng. - Boûng saâu maø khoâng coù ñuû nguoàn da töï thaân ñeå gheùp hay khuyeát toån coøn moâ hoaïi töû chöa ñuû ñieàu kieän ñeå gheùp da. - Boûng trung bì saâu: vaät lieäu sinh hoïc coù taùc duïng che phuû taïm thôøi sau khi caét boû hoaïi töû vaø coù taùc ñoäng kích thích quaù trình bieåu moâ hoùa. - Boûng saâu dieän raát lôùn: coù taùc duïng thay theá da taïm thôøi ñeå che phuû vuøng toån thöông chôø thôøi gian nuoâi caáy teá baøo söøng töï thaân ñuû soá löôïng ñeå caáy leân moâ haït. - Phuû caùc moâ haït xaáu taïo dieàu kieän toát cho gheùp da töï thaân. - Khi gheùp da thaát baïi nhieàu laàn. Khoùa luaän toát nghieäp 4.3.Caùc yeâu caàu ñoái vôùi vaät lieäu sinh hoïc che phuû taïm thôøi veát thöông boûng [2],[5] - Baùm dính nhanh leân beà maët veát thöông. - Giaûm söï tieát dòch, maát nöôùc, maát ñieän giaûi vaø protein qua veát thöông. - Giaûm söï ñau ñôùn taïi veát thöông. - Che phuû taïm thôøi caùc vuøng moâ saâu bò loä ra do toån thöông nhö daây thaàn kinh, gaân, cô, xöông. - Haïn cheá söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån taïi veát thöông. - Kích thích söï laønh hoùa veát thöông. - Coù ñaëc tính meàm maïi, coù theå co daõn khi cöû ñoäng caùc chi. - Ñöôïc khöû truøng dieät khuaån, khoâng mang nguoàn beänh ñeán cho veát thöông boûng. - Khoâng ñoäc, khoâng gaây ñaùp öùng mieãn dòch, khoâng gaây dò öùng. - Deã cung caáp, reû tieàn. - Baûo quaûn ñöôïc laâu, coù daïng cheá phaåm deã nhìn. 5. TAÏO MAØNG PHOÁI HÔÏP TRONG ÑIEÀU TRÒ BOÛNG Hieän nay xu höôùng treân theá giôùi laø söû duïng caùc vaät lieäu töï nhieân trong thieát keá maøng phuû veát thöông. Trong ñoù caùc maøng phuû coù giaøn giaùo laø collagen ñöôïc söû duïng phoå bieán vì noù laø thaønh phaàn cuûa chaát neàn ngoaïi baøo, giuùp toå chöùc hình thaønh moâ môùi trong quaù trình laønh hoùa veát thöông, ñaëc bieät laø trong caùc tröôøng hôïp boûng trung bì. Caùc teá baøo môùi seõ di chuyeån treân caùc sôïi collagen vaø ñi vaøo trong veát thöông ñang laønh. Ngoaøi ra maøng che phuû laøm töø collagen coøn coù tính khaùng nguyeân thaáp neân coù tính töông hôïp sinh hoïc cao. Thaønh phaàn cuûa maøng phoái hôïp goàm: gelatin, alginat, taùc nhaân khaâu maïch EDC vaø caùc hôïp chaát töø thieân nhieân. 5.1.Gelatin [1] , [17] , [29] Khoùa luaän toát nghieäp Gelatin ñöôïc thu nhaän töø söï thuûy phaân giôùi haïn sôïi collagen. Collagen ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao laøm thaùo caáu truùc xoaén ba taïo caùc chuoãi taùch rôøi, ñöôïc laøm laïnh vaø haáp thu nöôùc maïnh seõ taïo thaønh gelatin. Gelatin coù chöùa 18 loaïi axit amin (khoâng coù tryptophan va cystine), coù haøm löôïng glycine, proline vaø hydroxyproline cao. Arginin 7.80% Alanine 8.90% caùc amino acid khaùc 27.60% glutamic acid 10.00% hydroxyprolin 11.90% prolin 12.40% glycin 21.40% Hình 1.3: Thaønh phaàn caùc acid amin coù trong gelatin Gelatin khoâng tan trong nöôùc laïnh nhöng deã tan trong nöôùc aám. Khi theâm nöôùc laïnh nhöõng haït gelatin seõ tröông phoàng taêng ñeán 5-10 laàn troïng löôïng. Khi taêng nhieät ñoä treân 400C nhöõng haït gelatin naøy hoøa tan ñeå taïo thaønh dung dòch. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán ñoä hoøa tan cuûa gelatin laø nhieät ñoä, noàng ñoä vaø kích thöôùc haït. Gelatin ñöôïc söû duïng nhieàu trong caùc öùng duïng y sinh ñaëc bieät öùng duïng laøm maøng phuû veát thöông nhôø moät soá öu ñieåm: khoâng coù tính khaùng nguyeân, hoaït hoùa ñaïi thöïc baøo, hieäu quaû caàm maùu cao, coù theå ñöôïc haáp thu hoaøn toaøn in-vivo. Khoùa luaän toát nghieäp Hình 1.4: Caáu truùc hoùa hoïc cuûa gelatin 5.2.Alginat [1] , [6] , [28] Alginat laø moät polysaccharide maïch thaúng, khoâng phaân nhaùnh, phaân töû löôïng trung bình khoaûng 200000 dalton. Thaønh phaàn chính cuûa alginat laø acid alginic caáu taïo bôûi caùc ñôn vò acid guluronic vaø acid mannuronic lieân keát vôùi nhau bôûi daây noái α-(14)-L-guluronic (G) vaø β-(14)-D-mannuronic (M) (hình 1.5). Alginat ñöôïc saûn xuaát töø taûo naâu Phaeophyta, trong taûo caùc acid chuû yeáu ôû daïng muoái hoãn hôïp (Na, K, Mg, Ca). Alginat coù tính öa nöôùc, töông hôïp sinh hoïc cao vaø reû tieàn. Alginat ñöôïc söû duïng nhieàu trong caùc öùng duïng y sinh nhö laøm maøng phuû veát thöông, giaøn nuoâi caáy teá baøo, phaãu thuaät…Alginat cuõng ñöôïc söû duïng trong caùc heä phaân phaùt thuoác. Khi ñöôïc söû duïng alginat seõ bò phaân caét thaønh caùc goác ñöôøng ñôn giaûn hôn vaø coù theå ñöôïc haáp thu hoaøn toaøn. Hình 1.5: Thaønh phaàn caáu truùc cuûa alginat Khoùa luaän toát nghieäp 5.3.Taùc nhaân khaâu maïch [1], [17], [30], [31] Vaät lieäu gheùp döïa treân collagen vaø gelatin thöôøng bò phaân huûy bôûi enzyme collagenase hieän dieän trong caùc veát thöông ñang laønh. Phöông phaùp hieäu quaû ñeå giaûm toác ñoä phaân huûy cuûa vaät lieäu gheùp laø taïo caùc lieân keát cheùo hoùa hoïc baèng caùc taùc nhaân khaâu maïch. Caùc loaïi taùc nhaân khaâu maïch thöôøng duøng: - Taùc nhaân vaät lyù: nhieät, böùc xaï ion hoùa. - Taùc nhaân hoùa hoïc: formaldehyde, glutaraldehyde, carbodiimide, caùc hôïp chaát diepoxy, diisocynate, dextran dialdehyde. Tuøy thuoäc vaøo loaïi taùc nhaân taïo lieân keát seõ aûnh höôûng ñeán caáu truùc, khaû naêng haáp thu, khaû naêng tröông nöôùc, ñoä baùm dính …cuûa vaät lieäu toång hôïp. Tính ñoäc cuûa taùc nhaân khaâu maïch laø vaán ñeà caàn ñöôïc quan taâm khi phaùt trieån caùc vaät lieäu sinh hoïc. Taùc nhaân khaâu maïch ñöôïc duøng cho thieát maøng ôû ñaây laø chaát hoùa hoïc 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (hình 1.6). EDC ñöôïc bieát laø khoâng coù ñoäc tính vaø coù tính töông hôïp sinh hoïc do EDC khoâng hôïp nhaát vaøo trong caáu truùc xoáp ñöôïc khaâu maïch maø ñöôïc bieán ñoåi thaønh daãn xuaát urea hoaø tan trong nöôùc. Hình 1.6 : Caáu truùc cuûa EDC EDC laø daãn xuaát tan trong nöôùc cuûa carbodiimide. Carbodiimide xuùc taùc söï taïo thaønh lieân keát amide giöõa nhoùm carboxyl (-COOH) hay nhoùm phosphat (-PO4) vôùi nhoùm amin (-NH2) baèng caùch hoaït hoùa nhoùm carboxyl hoaëc nhoùm phosphat hình thaønh daãn xuaát O -urea. Khoùa luaän toát nghieäp EDC deã bò maát hoaït tính trong dung dòch nöôùc neân thöôøng söû duïng dung moâi höõu cô ñeå hoøa tan. Hình 1.7: Moâ phoûng quaù trình khaâu maïch taïo hydrogel cuûa EDC 5.4.Caùc hôïp chaát töï nhieân 5.4.1.Daàu muø u: [8], [14], [15], [18], [19] Daàu muø u chieát xuaát töø haït caây muø u (Calophyllum inophyllum) coù taùc duïng taùi sinh moâ toát, laøm mau laønh veát thöông, coù tính khaùng khuaån, khaùng vieâm, choáng oxi hoùa toát ñaõ ñöôïc chöùng minh trong daân gian vaø treân laâm saøng, ñöôïc öùng duïng nhieàu trong ñieàu trò boûng. Thaønh phaàn chính trong daàu muø u: ƒ Chaát beùo: coù hoaït tính taùi sinh moâ, laøm laønh veát thöông, goàm : - Lipid trung tính - Glycolypid - Phospholypid - 1 acit beùo duy nhaát laø Calophyllic acid Khoùa luaän toát nghieäp ƒ Caùc chaát thuoäc nhoùm coumarin: coù hoaït tính dieät khuaån, khaùng vieâm, choáng oxi hoùa, goàm: - Calophyllolide (4-phenyl coumarin): laø chaát khaùng vieâm nonsteroid. - 6-desoxyjacareubin, calophyllum B, friedelin, canophyllic acid, canophyllol: coù tính saùt khuaån, coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc chuûng vi khuaån: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, Bacilus subtilis, Klessiella pneumonia, Corinebacterium diptheriae vaø moät soá vi khuaån gram döông khaùc. Rieâng thaønh phaàn friedelin coøn coù khaû naêng khaùng naám Trichophyton schoenleinii (hieän dieän treân da, toùc gaây beänh nöôùc aên chaân, beänh vaûy neán) - Calanolide A, costatolide: coù khaû naêng öùc cheá enzyme reverse transcriptase caàn söï sao cheùp cuûa virus HIV. Ngoaøi ra coøn moät soá thaønh phaàn khaùc chöa roõ taùc duïng. Daàu muø u ôû daïng loûng coù maøu vaøng saùng, muøi thôm deã chòu, khoâng tan trong nöôùc, khi boâi leân choã veát thöông ñöôïc da haáp thuï hoaøn toaøn vaø taïo thaønh maøng moûng che phuû veát thöông, laøm cho veát thöông mau khoâ, choùng laønh, taïo caûm giaùc eâm dòu. Daàu muø u coù theå söû duïng ôû daïng nguyeân chaát hay pha loaõng 50% vôùi daàu döøa hoaëc dung moâi höõu cô thích hôïp maø khoâng giaûm hieäu löïc. Tuy nhieân trong ngaønh nhöõng öùng duïng laøm myõ phaåm thì daàu muø u thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng tinh chaát ñeå ñaûm baûo khoâng gaây kích öùng cho moïi loaïi da, haáp thu nhanh [33] Calophyllolide Calophyllic acid Hình 1.8: Coâng thöùc caáu taïo moät soá chaát trong daàu muø u. Khoùa luaän toát nghieäp 5.4.2.Tinh daàu traøm [6], [7], [13], [20] ÔÛ Vieät Nam tinh daàu traøm chuû yeáu ñöôïc chieát xuaát töø laù cuûa caây traøm gioù (Meulaleuca leucadendron var. miromelaleucetum) vaø caây traøm cöø (Meulaleuca leucadendron var. macromelateucetum). Tinh daàu traøm coù daïng loûng trong suoát, khoâng maøu hay maøu luïc nhaït, muøi thôm ñaëc tröng. Tinh daàu khoâng tan trong nöôùc, tan trong ethanol, aceton, ether, CHCl3, daàu thöïc vaät… Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa tinh daàu traøm: - Tinh daàu traøm gioù: 1,8 cineol (30%), -terpinolen, -terpinen, trans- cariophilen, linalol… - Tinh daàu traøm cöø: 1,8 cineol (2%), -terpinolen (10%), -terpinen (10%), β- malien (15%)… Nhöõng nghieân cöùu veà tính khaùng khuaån cuûa tinh daàu traøm cho thaáy thaønh phaàn terpinen vaø linalol coù taùc duïng khaùng khuaån maïnh coøn thaønh phaàn 1,8- cineol coù taùc duïng khaùng naám, choáng co thaét. linalol Hình 1.9: Coâng thöùc caáu taïo moät soá nhoùm chaát trong tinh daàu traøm Tinh daàu traøm laø moät chaát saùt khuaån maïnh, coù phoå khaùng khuaån roäng, coù khaû naêng khaùng: - Vi khuaån gram döông: Bacillus subtilis, Bacillus ceneus, Enterococcus feacalis, Corynebacterium spp, caùc chuûng khaùng Methicillin: Staphylococcus Khoùa luaän toát nghieäp aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus feacalis… - Vi khuaån gram aâm: Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei… - Naám: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis. - Virus: Herpes simplex. Do coù tính saùt khuaån maïnh neân tinh daàu traøm thöôøng ñöôïc duøng trong phaãu thuaät laøm chaát saùt khuaån ngoaøi da, thuoác saùt truøng ñöôøng hoâ haáp, thuoác taåy ueá, taåy truøng…Tinh daàu traøm thöôøng ñöôïc duøng ñeå chöõa caùc veát thöông coù muû, veát loeùt do coù tính saùt truøng vaø caàm maùu, coù taùc duïng taêng taùi taïo teá baøo laøm choùng laønh seïo. 5.4.3.Hôïp chaát chieát xuaát töø rau maù [6], [8], [23], [24], [25] Madecassol laø loaïi thuoác coù taùc ñoäng kích thích söï sinh toång hôïp collagen ñöôïc ñieàu cheá töø dòch chieát laù rau maù (Centella asiatica) . Coù nhieàu daïng saûn phaåm laø cao chieát ñaëc, daïng thuoác môõ, thuoác boät, daïng vieân neùn. Thaønh phaàn chính cuûa thuoác laø asiaticoside, asiatic vaø madecassic acid laø caùc saponin triterpenoid nhoùm ursan coù trong laù rau maù. Caùc chaát naøy coù taùc duïng taêng toång hôïp collagen, glycosaminoglycan, fibronectin (laø caùc chaát neàn taûng cuûa trung bì); kích thích söï hình thaønh lipid vaø protein caàn thieát cuûa da ; ñaåy nhanh quaù trình bieåu moâ hoùa vaø hình thaønh moâ haït ; laøm cho veát thöông choùng laønh. Madecassol vaø moät soá caùc saûn phaåm chieát xuaát töø rau maù ñaõ ñöôïc öùng duïng roäng raõi laøm thuoác choùng laønh seïo, laøm lieàn caùc veát moå, veát thöông, chöõa loeùt, boûng maø khoâng ñeå laïi seïo. Khoùa luaän toát nghieäp Hình 1.10: Thaønh phaàn triterpenoid trong rau maù 5.4.4.Ngheä [7], [9], [26] Töø laâu ngheä (Curcuma longa L.) ñaõ ñöôïc bieát ñeán laø moät thaûo döôïc coù taùc ñoäng toát trong vieäc haøn gaén caùc veát thöông, veát loeùt, laøm lieàn seïo. Boä phaän söû duïng chính cuûa caây ngheä laø phaàn thaân reã chöùa thaønh phaàn polyphenol laø curcuminoid coù taùc duïng choáng oxi hoùa vaø khaùng vieâm maïnh. Tinh daàu ngheä chieám khoaûng 5 -15% coù taùc duïng khaùng naám, vi khuaån, kí sinh truøng. Trong ñieàu trò boûng, söû duïng tinh daàu ngheä ôû giai ñoaïn sôùm coù taùc duïng loaïi boû hoaïi töû boûng, trong giai ñoaïn muoän coù taùc duïng taêng sinh taùi taïo bieåu moâ, choáng taïo seïo loài. 5.5.5.Môõ traên [38] Môõ traên ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå ñieàu trò boûng khaù phoå bieán trong daân gian. Thaønh phaàn caùc acid beùo vaø vitamin A coù trong môõ traên coù taùc duïng ñaåy maïnh quaù trình taïo bieåu moâ vaø taïo beà maët ñaøn hoài cho da, laøm nhanh laønh veát thöông Khoùa luaän toát nghieäp boûng, veát loeùt, laøm meàm vaø mòn da nhaát laø da khoâ khi trôøi laïnh. Môõ traên thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng keát hôïp trong caùc saûn phaåm laøm ñeïp da. 1.VAÄT LIEÄU 1.1.Ñoái töôïng nghieân cöùu Maøng sinh hoïc gelatin- alginat ñöôïc taåm moät soá thuoác thieân nhieân thöôøng duøng trong ñieàu trò boûng laø hoãn hôïp daàu muø u vaø tinh daàu traøm, daàu trò boûng Trancumin, hoãn hôïp cuûa tinh daàu traøm vaø tinh chaát rau maù Madecassol® 1.2.Duïng cuï - Thieát bò - Pipetman (100µl, 1000µl) - Ñaàu típ (100µl, 1000µl) - Pipet thuûy tinh (10ml) - Quaû boùp cao su - Becher (50ml, 100ml, 250ml, 1000ml) - Oáng ñong (250ml, 500ml) - Bình ñònh möùc (1000ml) - Ñuõa khuaáy - Caù khuaáy töø - Ly thuûy tinh - Giaáy baïc - Giaáy thaám - Ñiaõ petri nhöïa (5cmx1,2cm) - Hoäp nhöïa - Ñiaõ petri thuûy tinh (ñöôøng kính 9cm) - Que caáy voøng - Que caáy goøn - Cuvet - Oáng nghieäm - Ñeøn coàn Khoùa luaän toát nghieäp - Loï naâu 5ml, 100ml - Chuoàng nuoâi chuoät - Khay inox - Dao lam - Dao moå - Keùo, keïp cong, keïp thaúng - Thanh kim loaïi gaây boûng (1,6 cmx1,6 cm) - Gaïc voâ truøng - Baêng keo vaûi - Loï nhöïa ñöïng maãu - Caân phaân tích (Mettler AEO) - Maùy khuaáy töø gia nhieät (KIA, Myõ vaø OSA, Anh) - Maùy laéc - Maùy vortex - Maùy ño maät ñoä quang (Gallenkamp, Nhaät) - Noài haáp khöû truøng (Nhaät) - Tuû saáy - Tuû caáy voâ truøng - Tuû aám 370C - Tuû laïnh –20oC, tuû laïnh –80oC (Sannyo, Nhaät) 1.3. Nguyeân vaät lieäu – Hoaù chaát - Chuoät nhaét traéng Mus musculus var. Albino coù troïng löôïng 28- 30g/con, cuøng löùa tuoåi, thu nhaän taïi Khoa Döôïc lyù - Vieän Y hoïc daân toäc TP.HCM. - Caùc chuûng vi khuaån: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli töø Phoøng Vi sinh vaø Sinh hoïc phaân töû, Khoa Sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân Tp. HCM. - Gelatin (Merck, Ñöùc): daïng boät mòn. - Alginat (Kanto, Nhaät): daïng boät mòn. Khoùa luaän toát nghieäp -1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride – EDC (Sigma) - Daàu muø u (ñöôïc baøo cheá bôûi Vieän y döôïc hoïc daân toäc TP.HCM) - Daàu trò boûng Trancumin: thaønh phaàn chính goàm môõ traên, ngheä, tinh daàu traøm (saûn phaåm cuûa coâng ty coå phaàn döôïc phaåm OPC) - Tinh daàu traøm - Madecassol® (saûn phaåm cuûa DELPHARM, Phaùp) - Tween 20 (Sigma) - Aceton 99,5% (Trung Quoác) - Diethyl ether 99,5% (Trung Quoác) - Formol 10% - NaCl 8,5 o/oo - Dung dòch PBS (Dulbeccos Phosphate buffer saline): [10] KCl 0.2g KH2PO4 0.2g NaCl 8.0g Na2HPO4.12H2O 2.885g Nöôùc caát 1000ml - Moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån NA (nutrient agar): [11] Cao thòt 3g Pepton 5g NaCl 5g Agar 20g Nöôùc caát 1000ml - Coàn 96o, 70o - Nöôùc caát 1 laàn - Nöôùc caát 2 laàn. Khoùa luaän toát nghieäp 2. PHÖÔNG PHAÙP 2.1.Taïo maøng gelatin- alginat [1] - Pha dung dòch gelatin 1% vaø alginat 1% : caân vaø khuaáy gelatin (ôû 50oC), alginat (ôû nhieät ñoä phoøng) vôùi nöôùc caát 2 laàn trong 3 giôø. - Troän vaø khuaáy dung dòch gelatin 1% vaø alginat 1% ñeå thu ñöôïc hoãn hôïp gelatin: alginat (G:A) theo tæ leä (w/w) 8G:2A trong 30 phuùt. - Roùt 10g hoãn hôïp dung dòch vaøo ñiaõ petri nhöïa (5 cm x1,2 cm). - Ñeå laïnh ôû –70oC trong 40 giôø. - Laéc chaäm (100 voøng/phuùt) töøng maøng G:A trong 20ml hoãn hôïp aceton: nöôùc caát (tyû leä 9:1) coù chöùa 60mg EDC (0,3% EDC) trong 24 giôø. - Laáy maøng ra laøm khoâ maøng baèng giaáy thaám sau ñoù ñeå khoâ laïnh ôû –70oC trong 24 giôø. 2.2.Khaûo saùt khaû naêng mang vaø thaûi thuoác cuûa maøng gelatin- alginat ñöôïc ngaâm vôùi caùc hôïp chaát töï nhieân ™ Chuaån bò 3 loaïi thuoác ñeå ngaâm maøng ƒ Hoãn hôïp daàu muø u vaø tinh daàu traøm: Vì daàu muø u coù taùc duïng taùi sinh moâ toát nhöng coù khaû naêng khaùng khuaån haïn cheá (taùc ñoäng maïnh treân vi khuaån gram döông vaø yeáu treân vi khuaån gram aâm) [13] neân ñöôïc phoái hôïp vôùi tinh daàu traøm laø moät chaát coù taùc duïng saùt truøng maïnh coù phoå khaùng khuaån roäng (taùc ñoäng maïnh leân caû vi khuaån gram döông, gram aâm, naám moác vaø virus) [20] theo tyû leä 1:1 (v/v). Daàu muø u vaø tinh daàu traøm ñöôïc söû duïng ôû daïng nguyeân chaát. ƒ Hoãn hôïp tinh daàu traøm vaø hôïp chaát Madecassol chieát xuaát töø rau maù: Madecassol coù taùc duïng chính laø kích thích sinh toång hôïp collagen, laøm taêng khaû naêng taùi sinh moâ nhöng laïi khoâng coù tính khaùng khuaån [13] neân ñöôïc söû duïng keát hôïp vôùi tinh daàu traøm. Boät thuoác madecassol ñöôïc pha troän vôùi tinh daàu traøm nguyeân chaát ñeå ñöôïc hoãn hôïp tinh daàu chöùa 1% madecassol. ƒ Daàu trò boûng Trancumin: ñöôïc söû duïng ôû daïng nguyeân chaát. Khoùa luaän toát nghieäp Caû 3 loaïi thuoác ñeàu ñöôïc pha troän vôùi dung dòch Tween 20 vôùi tæ leä 0,5% nhaèm laøm nhuõ hoùa tinh daàu coù trong töøng loaïi thuoác giuùp cho khaû naêng ñi vaøo beân trong caáu truùc maøng cuûa tinh daàu toát hôn traùnh ñöôïc söï baùm dính treân beà maët maøng deã bò röûa troâi. Dung dòch tween 20 söû duïng vôùi tyû leä 0,5% ñöôïc chöùng minh laø khoâng gaây taùc haïi leân cô theå vaø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán tính khaùng khuaån cuûa thuoác [13], {21], [22]. ™ Maøng ngaâm thuoác - Caét maøng ñaõ ñöôïc laøm khoâ laïnh thaønh töøng mieáng coù kích thöôùc 1 cm x 1cm. - Ngaâm töøng mieáng maøng trong 2ml dung dòch töøng loaïi thuoác ôû 370C trong 24 giôø. - Maøng sau khi ngaâm thuoác ñöôïc laáy ra vaø tieáp tuïc ngaâm trong dung dòch PBS ôû 370C theo caùc nghieäm thöùc N0, N1, N2, N3, N4 ñeå thöû nghieäm khaû naêng khaùng khuaån. Vôùi N0 : khoâng ngaâm trong PBS N1 : ngaâm trong PBS 1 ngaøy N2, N3, N4: ngaâm trong PBS 2 ngaøy, 3 ngaøy, 4 ngaøy (thay PBS moãi ngaøy) - Caáy caùc chuûng vi khuaån Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli coù maät ñoä 106 teá baøo/ml (ño ôû böôùc soùng 610 nm) leân caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng NA. - Ñaët caùc mieáng maøng theo caùc nghieäm thöùc ngaâm PBS leân caùc ñiaõ moâi tröôøng coù vi khuaån, uû trong 24 giôø ôû 370C. - Ño ñöôøng kính voøng khaùng khuaån. - Laëp laïi thí nghieäm 3 laàn. 2.3.Baûo quaûn voâ truøng maøng gelatin- alginat Maøng gelatin- alginat sau khi laøm khoâ laïnh ñöôïc ngaâm trong 5ml thuoác trong 24 giôø sau ñoù ñöôïc ñoùng goùi vaø chieáu tia gamma vôùi lieàu 25 kGy baèng nguoàn cobalt 60 taïi Trung taâm coâng ngheä böùc xaï thaønh phoá Hoà Chí Minh. Ñaây laø lieàu Khoùa luaän toát nghieäp phoå bieán ñeå dieät khuaån, phuø hôïp vôùi söï an toaøn tuyeät ñoái [12] vaø giöõ ñöôïc haøm löôïng caùc axit amin trong thaønh phaàn cuûa maøng ôû möùc chaáp nhaän ñöôïc. Maøng sau khi chieáu xaï ñöôïc baûo quaûn ôû 00C. 2.4.Kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng gelatin - alginat ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï Maøng gelatin- alginat ngaâm thuoác sau khi ñöôïc chieáu xaï vaø baûo quaûn sau khoaûng thôøi gian 7 ngaøy ñöôïc caét thaønh töøng mieáng nhoû (1 cm x1 cm) ñaët treân ñiaõ thaïch coù vi khuaån uû ôû 370C trong 24 giôø. Ño ñöôøng kính voøng khaùng khuaån. 2.5.Thöû nghieäm maøng gelatin- alginat ngaâm thuoác treân chuoät nhaét traéng ñöôïc gaây boûng - Chuoät nhaét traéng Mus musculus var. Albino sau khi mua veà ñöôïc nuoâi oån ñònh trong 1 tuaàn, boá trí moãi con moät chuoàng vôùi cuøng ñieàu kieän chaêm soùc vaø aên uoáng nhö nhau. - Caïo loâng moät beân vuøng töø vai ñeán löng chuoät. - Chuoät ñöôïc gaây meâ baèng eter roài gaây boûng nhieät khoâ (ñoä 3, 4) baèng mieáng kim loaïi nung noùng treân ngoïn löûa ñeøn coàn trong 30 giaây, thôøi gian gaây boûng laø 3 giaây taïi vuøng löng chuoät. - Sau 2 ngaøy gaây boûng, caét loïc hoaïi töû taïi vuøng gaây boûng. - Chia chuoät thaønh 5 nhoùm thí nghieäm (baûng 2.1) - Choïn 3 moác thôøi gian sau khi ñieàu trò: 4 ngaøy (N4), 7 ngaøy (N7), 10 ngaøy (N10) ñeå theo doõi tieán trình laønh hoùa veát thöông boûng. - ÔÛ moãi moác thôøi gian khaûo saùt, tieán haønh: * Nhaän xeùt daáu hieäu laâm saøng. * Thu maãu moâ (goàm vuøng moâ toån thöông vaø vuøng moâ laønh xung quanh), coá ñònh trong formol 10%, ñaùnh giaù veà maët moâ hoïc tieán trieån veát thöông boûng trong quaù trình ñieàu trò taïi Khoa Giaûi phaãu beänh - Beänh vieän Chôï Raãy vôùi caùc böôùc chính: caét loïc  khöû nöôùc  coá ñònh maãu  caét maãu  nhuoäm tieâu baûn vôùi hematoxylin vaø eosin  daùn lame  quan saùt vaø ñaùnh giaù keát quaû. Khoùa luaän toát nghieäp Baûng 2.1: Caùc nhoùm chuoät thí nghieäm STT Nhoùm thí nghieäm Soá löôïng chuoät (con) Soá laàn laëp laïi 1 Ñoái chöùng (ñeå töï nhieân, khoâng ñieàu trò) 3 2 2 Ñaép gaïc sulfadiazin baïc 3 2 3 Ñaép maøng GA ngaâm hoãn hôïp daàu muø u vaø daàu traøm (maøng MU) 3 2 4 Ñaép maøng GA ngaâm thuoác trò boûng Trancumin (maøng T) 3 2 5 Ñaép maøng GA ngaâm hoãn hôïp daàu traøm vaø madecassol (maøng MT) 3 2 2.6. Xöû lyù soá lieäu Soá lieäu thu nhaän ñöôïc xöû lyù baèng chöông trình Excel, chöông trình Statgraphic 7.0 (cuûa Tröôøng ñai hoïc Michigan – Myõ) bao goàm: tính toaùn thoáng keâ sai soá chuaån vaø ñoä khaùc bieät coù yù nghóa nhoû nhaát (Least Significant Different – LSD) ôû möùc xaùc xuaát p = 95% baèng phöông phaùp phaân tích phöông sai (Analysis of Variance – ANOVA). Khoùa luaän toát nghieäp Hình 2.1: Gelatin daïng boät Hình 2.2: Alginat daïng boät Hình 2.3: Taùc nhaân khaâu maïch EDC Hình 2.4: Tinh daàu traøm Hình 2.5: Daàu muø u Hình 2.6: Daàu trò boûng Trancumin Khoùa luaän toát nghieäp Hình 2.7: Chuoät ñöôïc nuoâi rieâng moãi con moät chuoàng Hình 2.8: Caïo loâng chuoät Hình 2.9: Hô noùng thanh kim loaïi gaây boûng Hình 2.10: Gaây boûng chuoät Hình 2.11: Chuoät ñöôïc baêng boù sau khi ñaép maøng Khoùa luaän toát nghieäp KEÁT QUAÛ 1.Taïo maøng gelatin - alginat Maøng sinh hoïc che phuû veát thöông ñöôïc taïo ra coù thaønh phaàn goàm gelatin vaø alginat vaø moät taùc nhaân taïo lieân keát cheùo khaâu maïch laø EDC. EDC hoaït ñoäng khaâu maïch thoâng qua söï taïo thaønh lieân keát amide giöõa nhoùm carboxyl vaø nhoùm amin. Söï khaâu maïch coù theå xaûy ra giöõa alginat (nhoùm carboxyl) vôùi gelatin (nhoùm amin) hay ngay trong caáu truùc cuûa gelatin (mang caû nhoùm carboxyl vaø nhoùm amin) ñeå taïo thaønh daãn xuaát urea hoaø tan, taïo caáu truùc maøng [1] Töø nhöõng keát quaû nghieân cöùu tröôùc [1], cho thaáy maøng gelatin – alginat (maøng GA) ñöôïc taïo ra vôùi tæ leä thaønh phaàn gelatin : alginat laø 8 :2 vaø noàng ñoä chaát khaâu maïch EDC laø 0,3% (kí hieäu maøng GA 82x3) cho keát quaû thöû nghieäm toát nhaát neân ñöôïc choïn ñeå khaûo saùt trong thí nghieäm naøy. Maøng GA 82x3 coù moät soá ñaëc ñieåm sau: ƒ Coù caáu truùc loã xoáp, ñöôøng kính loã töø 10-100 µm. Chöùc naêng chuû yeáu cuûa caáu truùc loã xoáp trong maøng phuû veát thöông laø giuùp haáp thu dòch muû, dòch vieâm taïi vuøng veát thöông; giuùp cho söï taêng sinh vaø di chuyeån cuûa teá baøo, nguyeân baøo sôïi; haáp thu vaø mang moät soá thuoác. Maøng GA 82x3 coù kích thöôùc loã phuø hôïp cho söï haáp thu caùc thuoác trò boûng ( do caùc thuoác naøy ñeàu ôû daïng tinh daàu vaø ñaõ ñöôïc laøm nhuõ töông hoùa baèng taùc nhaân nhuõ töông hoùa laø tween 20 taïo thaønh caùc haït nhoû coù ñöôøng kính thay ñoåi töø 0,01-100 µm) [37], ñaëc bieät thuaän lôïi cho söï di chuyeån cuûa teá baøo ôû beân trong maøng (ñöôøng kính teá baøo bieåu bì vaø nguyeân baøo sôïi cuûa da vaøo khoaûng 10-13 µm). ƒ Khaû naêng haáp thu nöôùc toát: 3,13 ± 0,86 g nöôùc/g maøng. Khaû naêng haáp thu nöôùc cuûa maøng nhôø vaøo söï coù maët cuûa caùc nhoùm chöùc öa nöôùc nhö –OH, COOH, COONH2 trong thaønh phaàn cuûa gelatin vaø alginat. Khaû naêng haáp thu nöôùc laø moät trong nhöõng chæ tieâu quan troïng ñeå ñaùnh giaù vaät lieäu phuû veát thöông. Khoùa luaän toát nghieäp Hình 3.1: Maøng gelatin – alginat 2.Ñaùnh giaù khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng gelatin - alginat ñöôïc ngaâm vôùi caùc hôïp chaát töï nhieân Khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng.gelatin- alginat ngaâm thuoác ñöôïc ñaùnh giaù thoâng qua ñöôøng kính voøng khaùng khuaån ño ñöôïc theo caùc moác thôøi gian. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.1; baûng 3.2; baûng 3.3. Baûng 3.1 Khaû naêng khaùng Pseudomonas aeruginosa cuûa maøng gelatin – alginat ngaâm vôùi caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Maøng GA ngaâm thuoác N0 N1 N2 N3 N4 LSD (p=95%) Daàu muø u + daàu traøm (maøng MU) 36.3 ±2.67 13.5 ±2.83 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 4.12 Daàu Trancumin (maøng T) 27.2 ±6.17 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 Daàu traøm+ Madecassol (maøng MT) 45.7 ±3.56 25.8 ±8.5 16.8 ±2.89 13.7 ±3.67 0.0 ±0.00 7.40 LSD (p =95%) 6.62 Töø baûng 3.1 coù bieåu ñoà 3.1 Khoùa luaän toát nghieäp Bieåu ñoå 3.1: Ñöôøng kính voøng khaùng Pseudomonas aeruginosa cuûa caùc maøng gelatin – alginat ngaâm caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñ öô øng k ín h vo øng k ha ùng k hu aån (m m ) N0 N1 N2 N3 N4 Ngaøy Maøng MU Maøng T Maøng MT Töø baûng 3.1 vaø bieåu ñoà 3.1 coù nhaän xeùt: - Khaû naêng khaùng Pseudomonas aeruginosa cuûa töøng maøng GA ngaâm thuoác laø khaùc nhau ôû moãi ngaøy: + Maøng MU: khaùng toát ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm roõ sau 1 ngaøy ngaâm trong PBS, khoâng coù khaû naêng khaùng sau khi ngaâm trong PBS 2 ngaøy. + Maøng T: chæ coù khaû naêng khaùng ôû ngaøy 0. + Maøng MT: khaùng toát ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm ñaùng keå sau caùc ngaøy ngaâm trong PBS, khoâng coù khaû naêng khaùng sau khi ngaâm trong PBS 4 ngaøy. - Khaû naêng khaùng Pseudomonas aeruginosa cuûa caùc maøng GA ngaâm caùc thuoác khaùc nhau ôû ngaøy 0 (khoâng ngaâm trong PBS) coù söï khaùc bieät ñaùng keå. Maøng MT coù khaû naêng khaùng toát nhaát. Khoùa luaän toát nghieäp Baûng 3.2. Khaû naêng khaùng Staphylococcus aureus cuûa maøng gelatin – alginat ngaâm vôùi caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Maøng GA ngaâm thuoác N0 N1 N2 N3 N4 LSD (p=95%) Daàu muø u + daàu traøm (maøng MU) 36.3 ±2.33 20.2 ±0.94 15.3 ±2.22 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 2.76 Daàu Trancumin (maøng T) 32.7 ±2.44 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 Daàu traøm+ Madecassol (maøng MT) 72.5 ±10.27 43.2 ±9.83 41.5 ±5.00 19.8 ±1.5 0.0 ±0.00 11.42 LSD (p =95%) 10.58 Töø baûng 3.2 coù bieåu ñoà 3.2 Bieåu ñoå 3.2: Ñöôøng kính voøng khaùng Staphylococcus aureus cuûa caùc maøng gelatin – alginat ngaâm caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Ñ öô øng k ín h vo øng k ha ùng k hu aån (m m ) N0 N1 N2 N3 N4 Ngaøy Maøng MU Maøng T Maøng MT Töø baûng 3.2 vaø bieåu ñoà 3.2 coù nhaän xeùt: - Khaû naêng khaùng Staphylococcus aureus cuûa töøng maøng GA ngaâm thuoác laø khaùc nhau ôû moãi ngaøy: Khoùa luaän toát nghieäp + Maøng MU: khaùng toát ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm ñaùng keå sau 1 ngaøy vaø 2 ngaøy ngaâm trong PBS, khoâng coù khaû naêng khaùng sau khi ngaâm trong PBS 3 ngaøy. + Maøng T: chæ coù khaû naêng khaùng toát ôû ngaøy 0. + Maøng MT: khaùng raát maïnh ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm ñaùng keå sau khi ngaâm trong PBS 1 ngaøy, khaû naêng khaùng ôû thôøi ñieåm ngaâm trong PBS 1 ngaøy vaø 2 ngaøy khoâng coù söï khaùc bieät, coù söï khaùc bieät ñaùng keå so vôùi ngaøy thöù 3, khoâng coù khaû naêng khaùng sau khi ngaâm trong PBS 4 ngaøy. - Khaû naêng khaùng Staphylococcus aureus cuûa maøng MU vaø maøng T ôû ngaøy 0 (khoâng ngaâm trong PBS) khoâng coù söï khaùc bieät ñaùng keå nhöng coù söï khaùc bieät ñaùng keå so vôùi maøng MT. Maøng MT coù khaû naêng khaùng toát nhaát. Baûng 3.3. Khaû naêng khaùng Escherichia coli cuûa maøng gelatin – alginat ngaâm vôùi caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Maøng GA ngaâm thuoác N0 N1 N2 N3 N4 LSD (p=95%) Daàu muø u + daàu traøm (maøng MU) 48.0 ±3.43 26.5 ±1.57 22.0 ±8.57 15.0 ±4.29 0.0 ±0.00 8.34 Daàu Trancumin (maøng T) 33.3 ±2.29 15.7 ±3.72 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 0.0 ±0.00 5.20 Daàu traøm+ Madecassol (maøng MT) 80.3 ±8.29 41.7 ±10.00 31.7 ±5.15 26.3 ±6.58 29.0 ±3.43 11.79 LSD (p =95%) 9.86 10.46 Töø baûng 3.3 coù bieåu ñoà 3.3 sau: Khoùa luaän toát nghieäp Bieåu ñoå 3.3: Ñöôøng kính voøng khaùng Escherichia coli cuûa caùc maøng gelatin – alginat ngaâm caùc loaïi thuoác ôû caùc moác thôøi gian 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ñ öô øng k ín h vo øng k ha ùng k hu aån (m m ) N0 N1 N2 N3 N4 Ngaøy Maøng MU Maøng T Maøng MT Töø baûng 3.3 vaø bieåu ñoà 3.3 coù nhaän xeùt: - Khaû naêng khaùng Escherichia coli cuûa töøng maøng GA ngaâm thuoác laø khaùc nhau ôû moãi ngaøy: + Maøng MU: khaùng toát ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm ñaùng keå sau khi ngaâm trong PBS, khoâng coù söï khaùc bieät nhieàu giöõa caùc ngaøy ngaâm trong PBS, khoâng coøn khaû naêng khaùng sau khi ngaâm trong PBS 4 ngaøy. + Maøng T: coù khaû naêng khaùng toát ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm roõ reät sau khi ngaâm trong PBS 1 ngaøy vaø khoâng coøn khaû naêng khaùng ôû nhöõng ngaøy tieáp theo. + Maøng MT: khaùng raát maïnh ôû ngaøy 0, khaû naêng khaùng giaûm ñaùng keå sau khi ngaâm trong PBS 1 ngaøy, khaû naêng khaùng ôû thôøi ñieåm ngaâm trong PBS 1 ngaøy vaø 2 ngaøy khoâng coù söï khaùc bieät, khaû naêng khaùng ôû ngaøy thöù 2, 3, 4 cuõng khoâng coù söï khaùc bieät nhieàu, vaãn coøn khaùng toát sau khi ngaâm trong PBS 4 ngaøy. - Khaû naêng khaùng Escherichia coli cuûa caùc maøng GA ngaâm caùc thuoác khaùc nhau ôû ngaøy 0 (khoâng ngaâm trong PBS) coù söï khaùc bieät ñaùng keå. Maøng MT coù khaû naêng khaùng toát nhaát. Khoùa luaän toát nghieäp ¾ Nhaän xeùt chung veà khaû naêng khaùng cuûa caùc maøng GA ngaâm caùc hôïp chaát töï nhieân: ƒ Taát caû caùc maøng GA ngaâm caùc hôïp chaát töï nhieân laø: hoãn hôïp daàu muø u vaø tinh daàu traøm (maøng MU), daàu trò boûng Trancumin (maøng T), hoãn hôïp tinh daàu traøm vaø thuoác boät Madecassol chieát xuaát töø rau maù (maøng MT) ñeàu coù khaû naêng khaùng caû 3 chuûng vi khuaån: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli laø nhöõng vi khuaån thöôøng hieän dieän nhaát vaø gaây ra nhieãm khuaån huyeát taïi veát thöông boûng [2]. Ñieàu naøy chöùng toû maøng GA coù khaû naêng mang vaø thaûi thuoác ƒ Khaû naêng khaùng khuaån cuûa caùc maøng GA ngaâm thuoác giaûm khi ngaâm maøng trong PBS. ƒ Maøng GA ngaâm hoãn hôïp tinh daàu traøm vaø thuoác boät Madecassol (maøng MT)coù khaû naêng khaùng maïnh nhaát vôùi caû 3 chuûng vi khuaån vaø duy trì ñöôïc tính khaùng khuaån sau khi ngaâm trong PBS. Khoùa luaän toát nghieäp KHAÛ NAÊNG KHAÙNG KHUAÅN CUÛA CAÙC MAØNG GELATIN - ALGINATE Hình 3.2: Voøng khaùng P. aeruginosa Hình 3.3: Voøng khaùng P. aeruginosa cuûa maøng MU ôû ngaøy 0 cuûa maøng MT ôû ngaøy 0 Hình 3.4: Voøng khaùng P. aeruginosa Hình 3.5: Voøng khaùng S. aureus cuûa maøng T ôû ngaøy 0 cuûa maøng MU ôû ngaøy 0 Hình 3.6: Voøng khaùng S. aureus Hình 3.7: Voøng khaùng S. aureus cuûa maøng T ôû ngaøy 0 cuûa maøng MT ôû ngaøy 0 Khoùa luaän toát nghieäp Hình 3.8: Voøng khaùng E.coli Hình 3.9: Voøng khaùng E.coli cuûa maøng MU ôû ngaøy 0 cuûa maøng MT ôû ngaøy 0 Hình 3.10: Voøng khaùng E.coli Hình 3.11: Khaû naêng khaùng P.aeruginosa cuûa maøng T ôû ngaøy 0 cuûa maøng GA khoâng ngaâm thuoác Hình 3.12: Khaû naêng khaùng S. aureus Hình 3.13: Khaû naêng khaùng E.coli cuûa maøng GA khoâng ngaâm thuoác cuûa maøng GA khoâng ngaâm thuoác Khoùa luaän toát nghieäp 3. Kieåm tra hoaït tính cuûa maøng gelatin- alginat ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï Moät trong nhöõng chæ tieâu quan troïng cuûa vaät lieäu sinh hoïc duøng trong ñieàu trò boûng laø coù theå tieät truøng ñöôïc ñeå khoâng mang nguoàn beänh ñeán cho veát thöông, deã daøng baûo quaûn vaø baûo quaûn ñöôïc laâu [5]. Maøng gelatin- alginat sau khi taïo ra ñöôïc ngaâm trong caùc hôïp chaát töï nhieân vöøa coù tính chaát khaùng khuaån vöøa coù hoaït tính laøm taêng khaû naêng laønh hoùa veát thöông ñöôïc ñem chieáu xaï ñeå tieät truøng vaø baûo quaûn. Lieàu chieáu xaï 25 kGy laø lieàu phoå bieán ñeå dieät khuaån, khoâng laøm bieán tính caáu truùc maøng. Hình 3.14: Maøng gelatin – alginat vaø caùc maøng ngaâm thuoác ñöôïc ñoùng goùi vaø tieät khuaån Tuy nhieân lieàu chieáu xaï vaø thôøi gian baûo quaûn coù theå laøm aûnh höôûng ñeán tính chaát cuûa caùc hôïp chaát töï nhieân coù trong maøng.Vì vaäy caàn thieát phaûi kieåm tra laïi hoaït tính cuûa maøng ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï vaø baûo quaûn. Keát quaû kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng GA ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï vaø baûo quaûn sau 7 ngaøy ñöôïc theå hieän ôû baûng 3.4 Khoùa luaän toát nghieäp Baûng 3.4: Khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng gelatin – alginat ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï vaø baûo quaûn sau 7 ngaøy Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Maøng GA ngaâm thuoác P. aeruginosa S. aureus E.coli Daàu muø u + daàu traøm (maøng MU) 40.0 ±0.00 37.5 ±0.35 40.0 ±1.41 Daàu Trancumin (maøng T) 48.0 ±0.00 32.0 ±0.00 24.5 ±0.71 Daàu traøm +Madecassol (maøng MT) 53.5 ±2.12 32.0 ±0.00 57.0 ±1.41 LSD (p =95%) 3.90 1.30 3.90 Töø bảng 3.4 coù nhaän xeùt: Taát caû caùc maøng GA ngaâm thuoác sau khi chieáu xaï vaø baûo quaûn 7 ngaøy ñeàu coù khaû naêng khaùng 3 chuûng vi khuaån Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Khaû naêng khaùng khuaån giöõa caùc loaïi maøng ngaâm thuoác khaùc nhau coù söï khaùc bieät ñaùng keå. Maøng MT khaùng toát nhaát vôùi P. aeruginosa vaø E.coli; maøng MU khaùng toát nhaát vôùi S. aureus. 4.Thöû nghieäm maøng gelatin- alginat ngaâm thuoác treân chuoät nhaét traéng ñöôïc gaây boûng Baûng 3.5: Tieâu chuaån ñaùnh giaù möùc ñoä laønh hoùa veát thöông ôû da (Khoa giaûi phaãu beänh – Beänh vieän Chôï Raãy) Möùc ñoä A Möùc ñoä B Möùc ñoä C Möùc ñoäD 1. Söï taùi taïo thöôïng bì: - Möùc ñoä laønh - Ung thö hoùa - Phaùt trieån taùi taïo: +++ - ++ - + - - - Khoùa luaän toát nghieäp + Taêng sinh teá baøo gai vaø söøng + Thoaùi trieån lôùp ñaùy baøo +++ - ++ - + - - + 2. Taêng sinh nguyeân baøo sôïi +++ ++ + - 3. Taêng sinh maïch maùu +++ ++ + - 4. Söï xaâm nhaäp cuûa baïch caàu: - Baïch caàu ña nhaân trung tính - Ñaïi thöïc baøo - Baïch caàu xuyeân maïch + - - + - - ++ + + +++ + ++ 5. Boäi nhieãm: - Vi khuaån - Naám - - - - + + + + 6. Vieâm: - Bì noâng - Bì trung - Haï bì + + + + Ghi chuù: +++: raát nhieàu Möùc ñoä A: taùi taïo toát, vieâm nheï, saép laønh ++ : nhieàu, trung bình Möùc ñoä B: taùi taïo toát, coøn vieâmvaø phuø. + : coù, coù ít Möùc ñoä C: taùi taïo trung bình, vieâm, phuø neà. - : khoâng coù Möùc ñoä D: khoâng taùi taïo. Keát quaû ñaùnh giaù möùc ñoä laønh hoùa veát thöông boûng theo thôøi gian ñöôïc theå hieän ôû baûng 3.6. Khoùa luaän toát nghieäp Baûng 3.6: Dieãn tieán laønh hoùa veát thöông ôû caùc nhoùm chuoät thí nghieäm theo caùc moác thôøi gian Thôøi gian ñieàu trò Nhoùm ñieàu trò 4 ngaøy 7 ngaøy 10 ngaøy Ñoái chöùng C C C Ñaép gaïc sulfadiazin baïc C C B Ñaép maøng GA taåm daàu muø u + tinh daàu traøm C C B Ñaép maøng GA taåm daàu Trancumin C C B Ñaép maøng GA taåm daàu traøm + Madecassol C B A Keát quaû ñaùnh giaù moâ da chuoät cho thaáy: - Chuoät ñöôïc gaây boûng nhieät khoâ, bong lôùp thöôïng bì, phaù huûy tôùi lôùp trung bì, maïch maùu xung huyeát, veát boûng da caáp. - Ôû caû 5 nhoùm ñieàu trò theo caùc moác thôøi gian ñeàu coù moät soá bieåu hieän chung: ƒ Lôùp thöôïng bì chöa phuû kín hoaøn toaøn, coøn loeùt. ƒ Khoâng coù daáu hieäu ung thö hoùa. ƒ Lôùp ñaùy baøo khoâng thoaùi hoùa. ƒ Coù söï taêng sinh teá baøo gai vaø teá baøo söøng, nguyeân baøo sôïi ƒ Coù söï taùi taïo maïch maùu. ƒ Coù söï xaâm nhaäp cuûa baïch caàu, söï hieän dieän cuûa ñaïi thöïc baøo vaø baïch caàu xuyeân maïch ôû moác thôøi gian 4 ngaøy ñieàu trò. - Söï khaùc bieät giöõa caùc nhoùm ñieàu trò vaø thôøi gian ñieàu trò ñöôïc ñaùnh giaù treân möùc ñoä bieåu hieän cuûa töøng chæ tieâu. Cuï theå: ™ Nhoùm ñoái chöùng (khoâng ñieàu trò): + Ngaøy 4: soá löôïng baïch caàu ña nhaân trung tính raát nhieàu, ñaïi thöïc baøo, baïch caàu xuyeân maïch nhieàu ñeå baûo veä vaø doïn saïch vuøng veát thöông, vieâm saâu vaø coù hoaïi töû moâ, thöôïng bì baét ñaàu taùi taïo. Khoùa luaän toát nghieäp + Ngaøy 7: löôïng baïch caàu ña nhaân trung tính vaãn coøn nhieàu, coøn ñaïi thöïc baøo vaø baïch caàu xuyeân maïch, cô theå caàn phaûi huy ñoäng baïch caàu ñeán ñeå baûo veä vuøng veát thöông, chöa ngaên chaën ñöôïc söï nhieãm khuaån, thöôïng bì taùi taïo. + Ngaøy 10: soá löôïng baïch caàu ñaõ giaûm tuy nhieân coù hieän töôïng boäi nhieãm vi khuaån vaø naám, veát thöông chöa saïch, coøn loeùt roäng. ™ Nhoùm ñaép gaïc: + Ngaøy 4: coù söï hieän dieän cuûa baïch caàu ña nhaân trung tính vaø ñaïi thöïc baøo, quaù trình taùi taïo thöôïng bì hình thaønh. + Ngaøy 7: coøn baïch caàu xuyeân maïch vaø ñaïi thöïc baøo, chöa ngaên chaën ñöôïc söï xaâm nhieãm, coù boäi nhieãm vi khuaån vaø naám taïi vuøng veát thöông, vieâm saâu, coù taùi taïo thöông bì. + Ngaøy 10: soá löôïng baïch caàu giaûm, veát thöông saïch thuùc ñaåy quaù trình laønh hoùa, vieâm trung bì, coøn loeùt. ™ Nhoùm ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp daàu muø u vaø tinh daàu traøm: + Ngaøy 4: coù söï hieän dieän cuûa baïch caàu ña nhaân trung tính vaø ñaïi thöïc baøo, quaù trình taùi taïo thöôïng bì hình thaønh. + Ngaøy 7: löôïng baïch caàu xuyeân maïch giaûm, coù nhieãm vi khuaån, phuø neà, thöôïng bì taùi taïo. + Ngaøy 10: soá löôïng baïch caàu giaûm, khoâng coù nhieãm truøng, veát thöông saïch, vieâm bì noâng, thöôïng bì phaùt trieån. ™ Nhoùm ñaép maøng GA taåm daàu trò boûng Trancumin: + Ngaøy 4: baïch caàu ña nhaân trung tính vaø baïch caàu xuyeân maïch nhieàu, coù söï nhieãm khuaån, phuø neà, vieâm bì noâng, taùi taïo thöôïng bì. + Ngaøy 7: löôïng baïch caàu xuyeân maïch giaûm, coù nhieãm vi khuaån, moâ haït hình thaønh vaø xô hoùa. + Ngaøy 10: khoâng coøn baïch caàu xuyeân maïch, vieâm nheï, veát thöông saïch, loeùt nheï. Khoùa luaän toát nghieäp ™ Nhoùm ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp tinh daàu traøm vaø hôïp chaát Madecassol: + Ngaøy 4: coù nhieàu baïch caàu ña nhaân trung tính, ñaïi thöïc baøo, baïch caàu xuyeân maïch ñeå baûo veä vuøng thöông toån, thöôïng bì baét ñaàu taùi taïo + Ngaøy 7: löôïng baïch caàu giaûm, coøn baïch caàu xuyeân maïch, vieâm bì noâng, loeùt nheï, thöôïng bì taùi taïo, veát thöông saïch. + Ngaøy 10: coøn ít baïch caàu, khoâng coù nhieãm truøng, veát thöông saïch giai ñoaïn saép laønh. - Caên cöù vaøo keát quaû ñaùnh giaù moâ hoïc , ruùt ra moät soá keát luaän sau: ƒ Ôû taát caû caùc nhoùm thí nghieäm trong nhöõng ngaøy ñaàu (4 ngaøy) ñeàu coù söï huy ñoäng cuûa baïch caàu ña nhaân trung tính, ñaïi thöïc baøo ñeán vuøng veát thöông ñeå ngaên chaën söï xaâm nhieãm, laøm saïch veát thöông, kích thích cho quaù trình laønh hoùa. Coù nhaän xeùt caùc maøng GA ngaâm thuoác khoâng laøm ngaên caûn quaù trình ñaùp öùng bình thöôøng cuûa cô theå. ƒ Ôû nhoùm ñoái chöùng (khoâng ñieàu trò): cô theå khoâng ngaên chaën ñöôïc söï xaâm nhieãm, dieãn tieán quaù trình laønh hoùa dieãn ra chaäm. ƒ Nhoùm ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp daàu muø u + tinh daàu traøm vaø nhoùm ñaép maøng GA taåm thuoác trò boûng Trancumin coù khaû naêng ngaên ñöôïc söï xaâm nhieãm, thuùc daåy quaù trình laønh hoùa, tuy nhieân coù hieän töôïng phuø neà. ƒ Nhoùm ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp tinh daàu traøm+ Madecassol coù taùc ñoäng toát cho quaù trình ñieàu trò, ngaên caûn söï nhieãm, giaûm vieâm, ñaåy nhanh söï laønh hoùa. Quaù trình laønh hoùa nhanh hôn so vôùi caùc nhoùm khaùc. HÌNH MINH HOÏA KEÁT QUAÛ PHAÂN TÍCH MO DA CHUOÄT (H-Ex200) Khoùa luaän toát nghieäp Hình 3.15: Caáu truùc ñaïi theå da chuoät Hình 3.16: Moâ da chuoät sau khi gaây tröôùc khi gaây boûng. boûng 48 giôø. Toån thöông boûng Hình 3.17: Moâ da boûng khoâng ñieàu trò Hình 3.18: Moâ da boûng ñaép gaïc sau 10 ngaøy. Nhieãm truøng saâu ñeán sulfadiazin baïc sau 10 ngaøy. lôùp cô. Moâ haït vieâm Khoùa luaän toát nghieäp Hình 3.19: Moâ da boûng ñaép maøng GA Hình 3.20: Moâ da boûng ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp daàu muø u vaø daàu traøm sau taåm daàu trò boûng Trancumin sau 10 ngaøy 10 ngaøy. Teá baøo sôïi taùi taïo nhieàu, hình Teá baøo sôïi taêng sinh. thaønh maïch maùu. Hình 3.21: Moâ da boûng ñaép maøng GA taåm hoãn hôïp tinh daàu traøm + Madecassol sau 10 ngaøy. Taùi taïo moâ xô vaø maïch maùu, veát thöông saïch. KEÁT LUAÄN ƒ Phoái hôïp ñöôïc caùc chaát töï nhieân thöôøng duøng trong ñieàu trò boûng leân maøng gelatin – alginat. Maøng gelatin – alginat coù khaû naêng naïp vaø thaûi thuoác. ƒ Maøng gelatin – alginat mang caùc chaát töï nhieân coù taùc duïng toát trong ñieàu trò toån thöông boûng treân chuoät thí nghieäm: ngaên caûn ñöôïc söï xaâm nhieãm, giaûm vieâm, ñaåy nhanh quaù trình laønh hoùa. ƒ Maøng gelatin – alginat phoái hôïp vôùi hoãn hôïp tinh daàu traøm vaø hôïp chaát Khoùa luaän toát nghieäp Madecassol chieát xuaát töø rau maù coù taùc duïng ñieàu trò boûng toát nhaát trong caùc nhoùm thí nghieäm. ÑEÀ NGHÒ ƒ Nghieân cöùu theâm caùch ñöa caùc chaát töï nhieân khaùc vaøo trong maøng gelatin – alginat ñeå ñieàu trò boûng. ƒ Taêng thôøi gian khaûo khaùt quaù trình laønh hoaù treân chuoät thí nghieäm ñeå xem thôøi gian laønh veát thöông cuûa chuoät ñaép maøng laø bao laâu ñeå xaùc ñònh lieàu thuoác ñieàu trò thích hôïp. ƒ Tieán haønh thöû nghieäm laâm saøng maøng gelatin – alginat phoái hôïp vôùi thuoác töï nhieân trong ñieàu trò toån thöông boûng ôû ngöôøi. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi lieäu tieáng Vieät: [1] Traàn Leâ Baûo Haø, Thieát keá vaø ñaùnh giaù maøng gelatin-alginat trong ñieàu trò toån thöông boûng, Luaän vaên thaïc syõ khoa hoïc tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân, 2004. [2] Leâ Theá Trung, Boûng – nhöõng kieán thöùc chuyeân ngaønh, Nxb y hoïc Haø Noäi, 1997, tr. 21 -109, 206 -209, 297 - 310, 453 - 482. [3] Trònh Höõu Haèng, Ñoã Coâng Quyønh, Sinh lyù hoïc ngöôøi vaø ñoäng vaät, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät Haø Noäi, 2001, tr. 173, 184 -187. [4] Phaïm Hoaøng Phieät, Mieãn dòch sinh lyù beänh, Nxb Tp Hoà Chí Minh, 2000, tr. 120 -133. [5] Voõ Huy Daâng, Coâng ngheä vaät lieäu trong y sinh hoïc, 2002, tr. 350-358. [6] Traàn Huøng, Baøi giaûng döôïc lieäu hoïc,2004, tr. 38-39, 86-87, 144-145. [7] Leâ Ngoïc Thaïch, Tinh daàu, Nxb ñaïi hoïc quoác gia Tp Hoà Chí Minh, 2003, tr. 386. [8] Traàn Ñình Lyù, 1900 loaøi caây coù ích ôû Vieät Nam, Nxb Theá giôùi, 1993. [9] Ñoã Vaên Sôn, Caåm nang caây thuoác trong moãi gia ñình, Nxb Toång hôïp Tp. Khoùa luaän toát nghieäp HCM,2000. [10] Phan Kim Ngoïc, Giaùo trình thöïc taäp cô sôû Coâng ngheä sinh hoïc ñoäng vaät, Nxb Ñaïi hoïc quoác gia TP Hoà Chí Minh, 2002, tr. 25. [11] Traàn Linh Thöôùc, Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät trong nöôùc, thöïc phaåm vaø myõ phaåm, Nxb Giaùo duïc, 2002, tr. 198. [12] Phan Vaên Duyeät, Phöông phaùp vaät lyù vaø lyù sinh phoùng xaï duøng trong noâng nghieäp sinh hoïc vaø y hoïc, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät Haø Noäi, 1998, tr. 52 - 71 [13] Traàn Ngoïc Tieáng, Söû duïng tinh daàu traøm cöø vaø ramasol töø rau maù ñeå laøm laønh nhanh veát thöông, Taïp chí hoäi döôïc hoïc. [14] Huyønh Thò Ngoïc Lan, Nguyeãn Vaên Thanh, Hoaù hoïc xaùc ñònh nhoùm hôïp chaát coù taùc duïng taùi sinh moâ trong daàu muø u, Taïp chí hoäi döôïc hoïc. [15] Phaïm Thò Ngoïc Ñoaøi, Nguyeãn Thò Dieãm Chi, Nghieân cöùu taïo maøng sinh hoïc trò phoûng töø Acetobacter xylinum, Taïp chí hoäi döôïc hoïc. Taøi lieäu tieáng Anh: [16] Young Seon Choi, Sung Ran Hong , Young Moo Lee, Studies on gelatin- containing artificial skin, Biomaterials, pp. 409-417. [17] Sung Woo Kim (2004), The study of chitosan/gelatin based films crosslinked by proanthocyanidins as biomaterial, UMI number: 1421773 [18] Mahmud, S., Rizwani G.R., Ahmad, Antimcrobial studies on fractions and pure compounds of Calophyllum inophyllum Linn, Pakistan Journal of Pharmacology, Vol 15 (2), pp 13 - 25, 1998. [19] Leder, E., Dietrich, P., On the chemical constitution of Calophylloide and calophyllic acid from the nuts of Calophyllum inophyllum, Bulletin of the French chemical society No 5, pp 546 – 549, 1953. [20] Puangoi Lohakachornpan, Chemical compositios and Antimicrobial activities of essential oil from Melaleuca leucadendron var. minor. [21] Robert R.S.Nelson, Selection of resistance to the essential oil of Melaleuca alternifolia in Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2000) 45, 547 - 551. [22] Celso Vataru Nakanura, Tania Ueda Nakamura, Antibacterial activity of Khoùa luaän toát nghieäp Ocimum gratissimum L. essential oil, Mem Institude Oswaldocruz Rio de Janeiro, Vol.95 (5): 675 – 678. [23] Maquart, Chastang et al (1999), Triterpens from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds, European Journal of Dermatology, Vol.9, Issue 4, 289-96. [24] Bonte, Dumas et al (1994), Influence of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside on human collagen I synthesis, Planta Med, Arp; 60 (2) 135-5. [25] Vogel, Desowza, Effect of triterpenoid isolated from Centella asiatica on granuloma tissue, Acta Therapy 1990; 16:285-97. [26] Geoffrey Nicholas Roth, Bioactive constituents of Curcuma longa, L., Department of Horticulture, UMI number 1383399, 1996. [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [36] [37] [38] Khoùa luaän toát nghieäp