Khóa luận Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli

ụ thuộc vào tuyến ức thƣờng là các trình tự polimer lặp lại nhƣ lipopolysaccharide của Escherichia coli, flagellin của Salmonella, vỏ polysaccharide của vi khuẩn Pneumococcus, dextrans, levans và polyglutamic acid. Bởi vì chúng là những trình tự polimer lặp lại nên một phân tử có thể gắn với nhiều thụ thể immunoglobulin trên bề mặt tế bào B do đó không cần tế bào T helper cung cấp thêm tín hiệu để gây ra đáp ứng tạo kháng thể của tế bào B nhƣ KN phụ thuộc vào tuyến ức (hình 2.6). KN không phụ thuộc tuyến ức gắn trực tiếp vào các SIg trên bề mặt tế B và kích thích tế bào B tiết ra kháng thể. Kháng nguyên không phụ thuộc vào tuyến ức chỉ gây ra đáp ứng tạo IgM ở tế bào B và không biệt hóa thành tế bào nhớ vì chúng không kích hoạt tế bào T helper tiết interleukine nên không chuyển từ sản xuất IgM sang IgG. Nhƣ vậy, đối với KN không phụ thuộc tuyến ức, đáp ứng thứ phát không tạo ra lƣợng KT nhiều hơn đáp ứng nguyên phát (hình 2.7). Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 14 2.2. VI KHUẨN E. coli [1] [9] 2.2.1. Định nghĩa Escherichia coli còn đƣợc gọi là faecal coli, thuộc nhóm coliform phân, có hình que, gram âm, có kích thƣớc khoảng 2-3 x 1,5 ; có khả năng di động nhờ các tiên mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Chúng có mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật và ngƣời, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già. 2.2.2. Đặc tính sinh hóa Có khả năng phát triển ở 44oC. Lên men đƣờng glucose, lactose, manitol, sorbitol, phản ứng -galactosidase dƣơng tính. Indol dƣơng tính, methyl red dƣơng tính, Voges-Proskauer âm tính, citrate âm tính. Không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, KCN (potasium cyanic), malonate, adonitol, inositol, không sinh H2S. Do đó, E. coli đƣợc phát hiện do khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44oC, có kết quả nghiệm pháp IMViC phù hợp. 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysacharide (LPS). Những kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn. Theo Leminor, kháng nguyên O thƣờng đặc trƣng cho từng loài (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Các kháng nguyên O có thể đƣợc phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Để thực hiện phản ứng này, huyễn dịch vi khuẩn phải đƣợc đun nóng ở nhiệt độ 100oC trong vòng 1 giờ, sau đó cho thử với phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu. Chúng giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 160 loại kháng nguyên O (R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [9]. 15 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K Kháng nguyên K nằm ở bề mặt tế bào nên là nguyên nhân không tạo ra phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 100 loại kháng nguyên K (Øiskov et al, 1971) [9]. Kauffmann chia kháng nguyên K thành 3 nhóm dựa vào ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng ngƣng kết, tính kháng nguyên và khả năng vi khuẩn gắn kết với kháng thể. a. Kháng nguyên K type L Là kháng nguyên vỏ có bản chất protein, giúp vi khuẩn có khả năng bám dính và cho phản ứng ngƣng kết với hồng cầu. Là kháng nguyên không chịu nhiệt, bị phá hủy sau khi đun nóng 100oC trong 1h. Do đó, sau khi đun nóng huyễn dịch vi khuẩn có thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà không gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K. b. Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, vi khuẩn có kháng nguyên này khi mọc trên môi trƣờng sẽ cho khuẩn lạc dạng nhầy và chỉ cho kết quả ngƣng kết của kháng nguyên O sau khi huyễn dịch vi khuẩn đã đƣợc đun nóng 121oC trong 2h. c. Ngoài ra còn một nhóm kháng nguyên K type B, nhƣng sự tồn tại của nhóm KN này chƣa đƣợc xác định chính xác. 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H Là kháng nguyên có bản chất protein, không bền với nhiệt độ, bị hủy bởi cồn nhƣng đề kháng với formone. Kháng nguyên này có ở những dòng E. coli di động. Theo Morris J.A. (1985) và Sussman M. (1985), hiện nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE [10] [11] Kháng huyết thanh thu đƣợc không những chứa kháng thể mà còn có một số chất khác. Để tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh ta có thể dùng phƣơng pháp sắc kí, kết tinh hay tủa trong muối… Phƣơng pháp tủa kháng thể trong amonium sulfate là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất để tách protein ra khỏi dung dịch. Trong dung dịch, protein liên kết với nƣớc bằng các liên kết hydrogen thông qua các nhóm ion tích điện của chúng. Khi ta thêm vào một lƣợng lớn các ion nhỏ, tích điện lớn nhƣ amonium hay sulfate thì 16 những nhóm này cạnh tranh với protein để gắn vào các phân tử nƣớc, do đó làm giảm khả năng hòa tan của protein và chúng kết tủa lại. Protein kết tủa có thể hòa tan lại trong môi trƣờng có nồng độ amonium sulfate thấp hơn. Khả năng kết tủa của các protein khác nhau thì khác nhau tùy thuộc vào số lƣợng và vị trí các nhóm cực tích điện, trọng lƣợng phân tử của protein, pH của dung dịch, nhiệt độ xảy ra sự kết tủa. Để tủa kháng thể ngƣời ta thƣờng sử dụng amonium sulfate (đôi khi dùng sodium sulfate). Nồng độ muối để kháng thể kết tủa ở các loài khác nhau thì khác nhau. Hầu hết các kháng thể của thỏ có thể kết tủa ở dung dịch muối bão hòa 40%, còn ở chuột phải từ 45-50%. Bởi vì hầu hết các thành phần khác của huyết thanh không kết tủa ở khoảng nồng độ muối này và không có sự khác biệt lớn giữa hai nồng độ trên nên nồng độ muối bão hòa 50% là mức thích hợp nhất cho hầu hết các ứng dụng khác nhau. Một điểm bất lợi của kháng thể tủa trong amonium sulfate bão hòa là kháng thể không đƣợc tinh sạch vì khi kết tủa ngoài kháng thể còn có các phân tử protein có trọng lƣợng phân tử lớn khác. Do đó, ngoài việc tủa trong muối amonium sulfate cần phải kết hợp với một số phƣơng pháp khác nếu yêu cầu kháng thể cuối cùng phải đƣợc tinh sạch hoàn toàn. 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH [7] Một trong các phƣơng pháp cổ điển để loại muối ra khỏi protein kháng thể là thẩm tích. Dung dịch protein đƣợc chứa trong bao thẩm tích làm bằng cellulose có thắt nút ở hai đầu. Bao này đƣợc đặt trong cốc lớn chứa dung dịch đệm có ái lực thấp và để ở nhiệt độ lạnh có khuấy trộn vừa phải. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ cho phép những phân tử muối có kích thƣớc nhỏ đi ra ngoài còn các phân tử protein kháng thể có kích thƣớc lớn đƣợc giữ lại trong bao thẩm tích. Sự khuếch tán các phân tử muối vào trong dung dịch đệm thẩm tích vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích đạt trạng thái cân bằng (thƣờng khoảng 5-6 giờ). Nếu sau khi đạt trạng thái cân bằng mà dung dịch protein chƣa loại hết muối thì ta đặt bao thẩm tích trên vào một dung dịch đệm mới và cứ tiếp tục nhƣ thế cho đến khi loại hết muối ra khỏi dung dịch protein. Trong quá trình thẩm tích, ngoài muối còn có các chất chuyển hóa có kích thƣớc nhỏ nhƣ ATP, coenzyme… cũng bị loại ra khỏi bao thẩm tích. 17 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại. ( 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ [2] [5] 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) Sự liên kết một paratop của KT với một epitop của KN tƣơng ứng đƣợc thiết lập và duy trì nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ (<10 Kcal/mol) nhƣng không phải là liên kết cộng hóa trị. Các lực liên kết KN-KT:  Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO- và NH3 + đối diện nhau của acid amin trong các chuỗi polypeptid.  Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H+ và N- hoặc O-  Các liên kết kị nƣớc giữa các acid amin kị nƣớc.  Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử . 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT Sự liên kết KN-KT có 3 đặc điểm là: phản ứng phát nhiệt, có tính đặc hiệu và thuận nghịch  Phản ứng phát nhiệt Sự liên kết giữa các KN-KT là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2 đến 40 Kcal/mol. 18  Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT thể hiện ở chỗ một vị trí paratop của KT chỉ kết hợp với một epitop của KN do đó nếu ta biết một trong hai yếu tố của phản ứng KN-KT thì có thể nhận biết đƣợc yếu tố còn lại. Tuy nhiên tính đặc hiệu của phản ứng chỉ là tƣơng đối.  Tính chất thuận nghịch Phức hệ KN-KT có thể bị phân li do nhiệt, môi trƣờng acid (pH<3), hoặc do môi trƣờng có lực ion cao. Do đó có thể rửa chiết để tách riêng KT in vitro ngay cả khi phức hệ KN-KT đƣợc hình thành in vivo. 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT Vì KT hòa tan trong dung dịch nên đặc tính của phản ứng KN-KT phụ thuộc rất lớn vào hình dạng KN. Nếu KN ở dạng hạt (vi khuẩn hoặc hồng cầu) kết hợp với KT tƣơng ứng sẽ tạo thành các hạt ngƣng kết thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha Pha thứ nhất: đặc trƣng bởi sự gắn phần Fab của KT với các quyết định KN trên bề mặt KN dạng hạt nên không nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra nhanh đƣợc gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Pha thứ hai: đặc trƣng bởi sự liên kết chéo của các kháng thể đa hóa trị, các KN dạng hạt đa hóa trị để tạo thành dạng khối đủ lớn có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra chậm hơn và theo nguyên lí lí hóa đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy đƣợc. Mạng lƣới ngƣng kết chỉ có thể hình thành đối với các KT có ít nhất hai hóa trị. KT IgG khó xảy ra phản ứng ngƣng kết hơn so với KT IgM, vì IgG chỉ có hai vị trí gắn kết với KN trong khi đó IgM có tới năm vị trí liên kết với KN. Khả năng ngƣng kết của IgM cao hơn 100 lần so với IgG. 19 (A) Không xảy ra khi cả hai vị trí của IgG đều gắn vào một thể vi khuẩn. (B) Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các thể vi khuẩn. (C) Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM. Hình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên (trích dẫn liệu của Lê Văn Hùng, 2002) [2] 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT  pH  Thời gian và nhiệt độ ủ KT IgM phản ứng tốt ở 4 – 22oC KT IgG phản ứng tốt ở 37oC.  Nồng độ KN và KT  Lực ion (nồng độ của muối): nếu giảm lực ion thì sự hấp thụ KT đƣợc tăng cƣờng.  Trở ngại do sự sắp xếp các phân tử trong không gian (Steric Hindrance): khi các KN khác nhau nằm sát nhau thì các KT tƣơng ứng với mỗi loại KN có thể cản trở sự gắn kết do sự cạnh tranh với các phân tử khác. 2.6. PROTEIN A Protein A là một loại protein bề mặt của thành tế bào Staphylococcus aureus có khối lƣợng phân tử 42 kDa. Nó gắn với vùng hằng định của immunoglobulin. Phân tử này có thể gắn với KT ở hai vị trí Fcγ (vùng hằng định của IgG liên quan đến chức 20 năng phản ứng lại kích thích) và Fab (đoạn Ig chịu trách nhiệm cho việc nhận biết KN). Protein A gắn vào vùng hằng định thứ hai và thứ ba trên mảnh Fc của chuỗi nặng (Deisenhofer, 1981) nên mỗi phân tử IgG có hai vị trí gắn với protein A. Bởi vì mỗi protein A có 4 vị trí có thể gắn kết với IgG (Sjödahl, 1997) nên sự kết hợp hai dạng protein này tạo ra nhiều dạng phức hợp khác nhau. Không phải tất cả các immunoglobulin gắn protein A với cùng ái lực. KT của ngƣời, thỏ và chuột lang gắn với ái lực mạnh nhất và giảm dần ở heo, chuột, ngựa, bò cái (Kronvall et al. 1970; Goudswaard et al. 1978). KT từ dê, chuột (rat), gà, chuột đồng (hamster) gắn với lực yếu hơn nhiều. Ngoài ra trong một loài các lớp immunoglobulin khác nhau gắn protein A cũng với ái lực khác nhau. Ví dụ trong lớp IgG của ngƣời thì IgG1, IgG2, IgG4 gắn protein A với ái lực cao trong khi đó IgG3 gắn với ái lực rất yếu. Tƣơng tự ở chuột IgG2a gắn với ái lực cao, IgG2b, IgG3 gắn với ái lực trung bình còn IgG1 gắn với ái lực rất yếu (Ey et al, 1978). Nhƣng sự khác biệt này không quan trọng đối với KT đa dòng vì trong kháng huyết thanh đa dòng có chứa tất cả các phân lớp của IgG chống lại KN. Sự gắn kết KT với protein A đƣợc ứng dụng để tinh sạch KT bằng phƣơng pháp sắc kí. Protein A đƣợc gắn vào giá đỡ bằng cyanogen bromide đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất ( ví dụ: protein A – Sepharose CL- 4B; Pharmacia). Mỗi ml phức hợp trên có thể gắn với 10-20 mg IgG (tƣơng đƣơng với 1-2 ml kháng huyết thanh). Kháng thể gắn với protein A chủ yếu là nhờ các tƣơng tác kị nƣớc (Deisenhofer, 1981) và có thể bị phá vỡ ở pH thấp. Ngoài ra sử dụng KT gắn với protein A để thực hiện phản ứng ngƣng kết với KN thì hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn rất nhiều lần so với khi không có protein A. Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus. vp331/Staphylococci/proteinA.gif 21 PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian: từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm  Phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM  Phòng thí nghiệm Vi Sinh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thu nhận và tinh sạch kháng thể.  Hiệu quả đáp ứng miễn dịch theo các quy trình tiêm khác nhau: ngắn ngày và dài ngày. 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM  Thỏ: 6 con  Vi khuẩn E.coli gây bệnh phù đầu ở heo (chủng O139:K82 hay H28), vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo (K88+ hay E68).  Vi khuẩn Staphylococcus aureus  Hoá chất môi trƣờng Muối amonium sulfate (NH4)2SO4 NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.12H2O Natri clorua NaCl Sodium azide NaN3 PBS Môi trƣờng TSB  Thiết bị và dụng cụ Máy khuấy từ Máy li tâm Syringe loại 1 ml, 20 ml 22 Ống falcon 50 ml 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm Dịch vi khuẩn đƣợc chuẩn bị theo sơ đồ 3.1 Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo rskov, 1977) 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm  Đƣờng tiêm: tiêm dƣới da  Hàm lƣợng vi khuẩn khoảng 109 CFU/ml dịch tiêm.  Thỏ thí nghiệm đƣợc tiêm theo 2 qui trình ngắn ngày và dài ngày. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày qua bảng 3.1 và 3.2 Nuôi E. coli chủng gốc (O139:K82) trong môi trƣờng canh TSB Cấy trên đĩa petri môi trƣờng thạch TSA ủ 37oC qua đêm ủ 37oC qua đêm Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Dịch rửa Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vòng/phút trong 30 phút) Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hòa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin Dịch huyền phù kháng nguyên E. coli Hòa tan trong nƣớc muối sinh lí, điều chỉnh sao cho đạt nồng độ 109 tế bào/ml để 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi 23 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm  Thí nghiệm 1: qui trình ngắn ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 1) Số thỏ thí nghiệm: 2 con (thỏ 1 và 2) Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày (theo rskov, 1977) Ngày Tiêm (ml) Lấy máu (ml) 0 1 Mũi gây mẫn cảm 1 0,5 4 1 Mũi nhắc lại 1 5 1 9 1 Mũi nhắc lại 2 10 2 14 1 Mũi nhắc lại 3 15 2 19 1 Mũi nhắc lại 4 20 2 25 40 30 40 35 Lấy hết Các lần lấy máu 1 ml để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính.  Thí nghiệm 2: qui trình dài ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 2) Số thỏ thí nghiệm: 4 con (thỏ 2,3,4 và 5) 24 B ả n g 3 .2 G â y m iễ n d ịc h t h u k h á n g t h ể th eo q u i tr ìn h d à i n g à y ( q u i tr ìn h v iệ n P a st eu r T p . H C M ) L . m áu = l ấy m áu L ấy m áu k iể m t ra k h án g t h ể v ào c ác n g ày : 0 , 1 4 , 4 2 , 7 0 , 9 8 , 1 2 6 , 1 5 4 . M ũ i n h ắc l ại 5 1 5 4 L .m áu (m l) L ấy h ết 1 4 0 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 4 1 2 6 L .m áu (m l) 5 0 1 1 2 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 3 9 8 L .m áu (m l) 5 0 8 4 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 2 7 0 L .m áu (m l) 1 5 6 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 M ũ i n h ắc l ại 1 4 2 L .m áu (m l) 1 2 8 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 M ũ i m ẫn c ảm 1 4 L .m áu (m l) 1 1 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 0 L .m áu (m l) 1 N g ày T h ỏ 6 5 4 3 25 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh Kháng huyết thanh thu vào các ngày 25, 30, 35 ở qui trình 1 (bảng 3.1) và ở các ngày 98, 126, 154 ở qui trình 2 (bảng 3.2)  Trƣớc khi lấy máu tráng ống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% Vnƣớc muối sinh lí = 0,1 % thể tích máu  Lấy máu ở tĩnh mạch tai  Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống  Cho NaN3 vào VNaN3 = 0,05% Vmáu  Để qua đêm ở 4oC  Tách lấy huyết thanh, sau đó li tâm bỏ phần cặn. Kháng huyết thanh đƣợc chia làm 2 phần: Phần 1: để nguyên kháng huyết thanh, bổ sung glycerol (Vglycerol = 10% VKHT). Bảo quản ở 4oC. Phần 2: kháng huyết thanh đƣợc tủa trong amonium sulfate bão hòa. KHT nguyên đƣợc sử dụng trực tiếp trong phản ứng ngƣng kết hoặc cho gắn với protein A của Staphylococcus aureus hoặc xử lí hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn E. coli E68 và sau đó dùng cho phản ứng ngƣng kết đánh giá hiệu giá kháng thể. Việc xử lí KHT đƣợc tiến hành theo sơ đồ 3.2 Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh KHT KHT nguyên (bổ sung glycerol) KHT kết tủa, thẩm tích Hấp phụ Gắn protein A Định tính Định lƣợng 26 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà  Máu sau khi để ở 4oC qua đêm, đem li tâm tách kháng huyết thanh  Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh lƣợng PBS 1X (VPBS = 3Vhuyết thanh)  Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch amonium sulfate 100%S V (NH4)2SO4 = Vhuyết thanh + VPBS Huyết thanh thỏ / PBS 1X đƣợc để trong nƣớc đá bào trên máy khuấy từ Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S. Sau khi cho hết lƣợng (NH4)2SO4 vào tiếp tục khuấy 45 – 60 phút  Để 4oC qua đêm  Li tâm tách kết tủa  Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45%  Cho vào ống 50 ml, giữ tủa / amonium sulfate 45% ở 4oC Đối với trƣờng hợp lấy 1 ml máu: sau khi lấy máu cho 0,01 ml NaN3 để ở 4 o C qua đêm. Sau đó đem li tâm tách huyết thanh và cho glycerol vào (Vglycerol = 10 % Vh. thanh). 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể Kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% đƣợc phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích.  Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích đƣợc cắt ra và rửa qua nƣớc cất, sau đó cho vào cốc nƣớc cất chứa 2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nƣớc cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứa cồn 30o, bảo quản ở 4oC. Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh 27  Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% vào bao thẩm tích  dùng kẹp kẹp 2 đầu bao thẩm tích lại  đặt bao thẩm tích vào dung dịch buffer PBS  để 5-6 giờ ở 4 oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích nhƣ trên sau đó thu kháng thể để xác định hiệu giá. Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh Kháng huyết thanh nguyên và kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate, thẩm tích đƣợc xử lí để loại bỏ các kháng thể không đặc hiệu hoặc gắn với protein A của S. aureus. trƣớc thẩm tích sau thẩm tích 28 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu Kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí hấp phụ theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.3 Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa thạch TSA đƣờng kính 15 cm Ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Pha với 1 ml kháng huyết thanh (hoặc kháng thể đã thẩm tích) + 6 ml dung dịch phenol 0,25% Ủ 50oC trong 2h Li tâm 4000 vòng/phút trong 1h Thu dịch kháng thể trong Nuôi E. coli chủng gốc (K88+) trong môi trƣờng canh TSB 5-6h ở 37oC 29 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus Kháng thể có trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với protein A của Staphylococcus aureus theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.4 Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus Nuôi Staphylococcus aureus trong môi trƣờng canh TSB ủ 5-6h ở 37oC Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa petri môi trƣờng TSA ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 10 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Li tâm (4000 vòng/phút trong 30 phút) bỏ dịch nổi Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hòa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin Pha loãng trong nƣớc muối sinh lí để đạt nồng độ thử nghiệm Li tâm bỏ dịch nổi ủ 4oC qua đêm Ủ 50oC trong 2h Cho kháng huyết thanh vào với tỉ lệ KHT : dịch VK là 1:4 hoặc 1:9 Dịch kháng thể gắn với protein A của S. aureus 30 3.4.4. Đánh giá 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có tính chất định tính, thƣờng sử dụng KN đã biết và đƣợc nhuộm màu để phát hiện KT tƣơng ứng trong huyết thanh, thƣờng dùng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. a. Cách thực hiện Nhỏ tách riêng trên phiến kính 1 giọt kháng huyết thanh (nguyên hoặc gắn S. aureus) thu đƣợc sau khi tiêm kháng nguyên gây miễn dịch và 1 giọt kháng huyết thanh thu đƣợc trƣớc khi tiêm kháng nguyên để làm đối chứng âm. Sau đó nhỏ thêm 1 giọt dịch vi khuẩn (vi khuẩn O139:K82 đƣợc cấy trên môi trƣờng canh TSB và ủ 37oC qua đêm) và lắc nhẹ để trộn đều vi khuẩn với KHT, kết quả đƣợc đọc sau đó khoảng 30 giây đến 1 phút . b. Đọc kết quả  Nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn thì trong huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh sẽ hình thành nên rất nhiều hạt ngƣng kết lớn màu trắng đục và đều khắp giọt huyễn dịch, nhìn thấy rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính (+). Tùy theo kích thƣớc hạt ngƣng kết lớn hay nhỏ mà ta đánh giá phản ứng dƣơng tính là: + nếu hạt ngƣng kết nhỏ, ít nhƣng vẫn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng +++ nếu hạt ngƣng kết rất lớn, nhiều màu trắng đục và thấy rất rõ bằng mắt thƣờng ++ nếu hạt ngƣng kết ở dạng trung gian giữa + và +++  Nếu huyễn dịch vi khuẩn vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (-). Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (-) (+++) 31 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm là phản ứng vừa có tính định tính, vừa có tính định lƣợng hàm lƣợng kháng thể (bán định lƣợng). Phản ứng này thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, thú y học nhƣ chẩn đoán giang mai, thƣơng hàn, bạch lị gà, sẩy thai truyền nhiễm gia súc… a. Chuẩn bị dịch kháng nguyên Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm b. Cách thực hiện Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch KHT (nguyên, kết tủa và thẩm tích có hoặc không có hấp phụ E68) pha loãng trong PBS 1X theo cơ số 2. Sau đó cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch kháng nguyên  ủ 37oC trong 2 giờ và để 4oC qua đêm. Ngoài ra cần phải có ống đối chứng chứa 0,3 ml dịch kháng nguyên và 0,3 ml PBS 1X. Cấy E. coli chủng gốc O139:K82 vào môi trƣờng canh TSB ủ 37oC qua đêm Cho formalin vào (Vformalin = 0,3% Vdịch VK ) Để 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vòng / phút trong 30 phút) Hòa tan phần rắn trong PBS 1X (VPBS = Vdịch VK) Dịch kháng nguyên 32 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm c. Đọc kết quả Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc là: (+) khi các hạt ngƣng kết tạo thành mạng lƣới lắng đều khắp đáy ống nghiệm. (-) khi vi khuẩn lắng tập trung giữa đáy ống nghiệm. Kháng thể đƣợc định hiệu giá ở nồng độ kháng huyết thanh pha loãng cao nhất có xảy ra phản ứng ngƣng kết và ống đối chứng thì không ngƣng kết. 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI  Thời điểm xuất hiện kháng thể.  Hiệu giá kháng thể. 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ So sánh hiệu giá kháng thể thu đƣợc từ 2 qui trình trên. 33 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Định tính Để xác định thời điểm xuất hiện và thời gian tồn tại của kháng thể trong kháng huyết thanh (KHT) ta thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với KHT thu đƣợc sau khi li tâm tách huyết thanh. 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày (35 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều tăng dần từ 0,5 ml đến 2 ml dịch vi khuẩn. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 5 ngày. Sau khi tiêm mũi nhắc lại thứ 4 tiến hành lấy máu thu kháng thể, lấy máu 3 lần mỗi lần cách nhau 5 ngày và lần cuối cùng lấy hết máu. Trƣớc khi gây miễn dịch và sau mỗi lần tiêm kháng nguyên vi khuẩn 4 ngày tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính, kết quả đƣợc trình bày bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trƣớc khi tiêm - - Sau mũi mẫn cảm - - Sau mũi nhắc lại 1 - - Sau mũi nhắc lại 2 + + Sau mũi nhắc lại 3 + + Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + + Lấy máu lần 2 + + Lấy máu lần 3 + + Ghi chú:  Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 34 Dựa vào bảng kết quả ta thấy qui trình ngắn ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu đã gây đƣợc đáp ứng miễn dịch trên thỏ, tạo kháng thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Kháng thể xuất hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) và vẫn tồn tại cho đến lần lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần cuối – mũi 4 ). 4.1.1.2. Qui trình dài ngày (154 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều từ cao xuống thấp. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 28 ngày. Kể từ khi tiêm mũi nhắc lại thứ 3 tiến hành lấy máu thu kháng thể sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày. Trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm mũi mẫn cảm, các mũi nhắc lại 14 ngày tiến hành lấy máu để thử phản ứng ngƣng kết xác định sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 (liều tiêm 1 ml) Thỏ 4 (liều tiêm 1,5 ml) Thỏ 5 (liều tiêm 2 ml) Trƣớc khi tiêm - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± - Sau mũi nhắc lại 1 ± ± Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± ± Sau mũi nhắc lại 3 ± + Sau mũi nhắc lại 4 + ++ Kết quả cho thấy sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Qui trình dài ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu cũng đã tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ với kháng thể có thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 4.1.2. Định lƣợng Để xác định hiệu giá kháng thể ta thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với KHT lúc đầu và KHT đã thẩm tích (KHT tủa trong ammonium sulfate và thẩm tích) ở các độ pha loãng khác nhau. 35 Trong thí nghiệm này chỉ tiến hành định hiệu giá kháng thể của KHT thu đƣợc ở lần lấy máu thứ 1,2,3 sau mũi nhắc lại 4 (qui trình ngắn ngày) và sau mũi nhắc lại thứ 3, thứ 4 (qui trình dài ngày). 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trung bình Lần 1 Huyết thanh 1/1600 1/1600 1/1600 KHT đã thẩm tích 1/960 1/480 1/720 Lần 2 Huyết thanh 1/960 1/1280 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/240 1/640 1/440 Lần 3 Huyết thanh 1/480 1/960 1/720 KHT đã thẩm tích 1/640 1/480 1/560 Ghi chú:  Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Dựa vào kết quả bảng 4.3 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh giảm dần ở các lần lấy máu, lƣợng kháng thể nhiều nhất trong mẫu máu lấy lần 1 và thấp nhất ở lần 3. Kết quả cũng cho thấy hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi tủa trong amonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn kháng huyết thanh lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệ u g iá K T Thỏ 1 Thỏ 2 Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu. 36 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.2 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình ngắn ngày 4.1.2.2. Qui trình dài ngày Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 Thỏ Lấy máu Thỏ 3 Thỏ 4 Trung bình Sau mũi nhắc lại 3 Huyết thanh 1/1280 1/960 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/960 1/640 1/800 Sau mũi nhắc lại 4 Huyết thanh 1/1280 1/2560 1/1920 KHT đã thẩm tích 1/320 1/1920 1/1120 Dựa vào kết quả bảng 4.4 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở mũi nhắc lại 4 bằng hoặc cao hơn mũi nhắc lại 3. Hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 4 không giảm so với mũi nhắc lại lần 3 mà đặc biệt tăng cao 1/2560 so với 1/960 ở thỏ 4. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Thỏ 3 Thỏ 4 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau. 37 Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày có hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tủa bằng ammonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh thô lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 2500 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình dài ngày 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ 4 ở qui trình ngắn ngày và sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ 4 ở qui trình dài ngày. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 4.5. Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày Qui trình ngắn ngày Qui trình dài ngày Lần 1 1/1600 Sau mũi nhắc lại 3 1/1120 Lần 2 1/1120 Sau mũi nhắc lại 4 1/1920 Lần 3 1/720 Trung bình 1/1147 Trung bình 1/1520 Kết quả cho thấy trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 4 ở qui trình ngắn ngày thấp hơn trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 3 và 4 ở qui trình dài ngày. 38 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta cho kháng thể trong KHT gắn với protein A của Staphylococcus aureus. 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh KHT thỏ 1 thu đƣợc ở lần lấy máu cuối cùng (lấy máu lần 3) đƣợc gắn với S. aureus ở các nồng độ khác nhau theo quy trình 3.4. Thực hiện phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau VKHT : VS. aureus Nồng độ S. aureus (tế bào / ml) 1:4 1:9 10 9 ++ + 10 10 ++ + 10 11 ++ + 10 12 ++ + 10 13 ++ ++ 10 14 +++ ++ 10 15 +++ ++ Ghi chú: Đối chứng  KHT của lần lấy máu thứ 3 (thỏ 1) không xử lí với S. aureus cho kết quả (+)  KHT trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch đƣợc xử lí với S. aureus cho kết quả (-) Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy: Phản ứng ngƣng kết thấy rõ nhất khi KHT gắn với S. aureus có nồng độ 1014, 1015 tế bào/ ml. Trong đó, nồng độ S. aureus 1014 cho kết quả không khác nồng độ 1015. Tỉ lệ thể tích KHT kết hợp với S. aureus là 1:4 cho kết quả ngƣng kết trên phiến kính rõ hơn tỉ lệ 1:9. Nhƣ vậy việc xử lí gắn kháng thể với protein A của S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, giúp cho việc đọc kết quả đƣợc dễ dàng hơn. 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus Việc xử lí kháng huyết thanh với S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, điều này có thể sẽ cho phép xác định chính xác hơn thời điểm xuất hiện 39 kháng thể. Dựa vào kết quả ở mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết thanh với dịch vi khuẩn S. aureus có nồng độ 1014 tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn là 1:4. Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7 a. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - Sau mũi mẫn cảm - - - - Sau mũi nhắc lại 1 - - - - Sau mũi nhắc lại 2 + + + ++ Sau mũi nhắc lại 3 + ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + ++ + ++ Lấy máu lần 2 + + + ++ Lấy máu lần 3 + +++ + + So với KHT không gắn S. aureus thì KHT gắn S. aureus cho kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính rõ ràng hơn. Tuy nhiên không có sự khác biệt về thời điểm phát hiện kháng thể. Ở cả hai trƣờng hợp đều cho kết quả phản ứng ngƣng kết dƣơng tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần 2. b. Qui trình dài ngày Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 Thỏ 4 Thỏ 5 Không xử lí với S.aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Không xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± ± + - + Sau mũi nhắc lại 1 ± ± ± + Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± + ± + Sau mũi nhắc lại 3 ± ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 + +++ ++ +++ 40 Kết quả cho thấy kháng thể nếu đƣợc gắn với protein A của S. aureus sẽ cho phản ứng ngƣng kết rõ hơn so với kháng thể không gắn protein A. Sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Đặc biệt ở thỏ 5, sau khi xử lí với S. aureus đã có thể phát hiện đƣợc kháng thể ngƣng kết ngay sau mũi tiêm mẫn cảm trong khi với kháng huyết thanh không xử lí cho kết quả (-). 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ có các kháng thể đặc hiệu chung cho các loài vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng huyết thanh. Nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ các kháng thể đặc hiệu chung này. Trong thí nghiệm, chúng tôi đã thử cho KHT hấp phụ với kháng nguyên chủng vi khuẩn E. coli E68 để trong KHT chỉ còn lại những kháng thể đặc hiệu cho H28. KHT đƣợc hấp phụ với vi khuẩn E. coli E68, sau đó định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) Thỏ Lấy máu T1 T2 Trung bình H. thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Lần 1 Không h. phụ (n=2) 1/1600 1/960 1/1600 1/480 1/1160 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/48 1/48 1/20 1/41 Lần 2 Không h. phụ (n=2) 1/960 1/240 1/1280 1/640 1/780 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/6 1/48 1/48 1/38 Lần 3 Không h. phụ (n=2) 1/480 1/640 1/960 1/480 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/24 1/10 1/32 1/20 1/22 41 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) Thỏ Lấy máu T3 T4 Trung bình H. thanh KT đã thẩm tích H. thanh KT đã thẩm tích Mũi nhắc lại 3 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/960 1/960 1/640 1/960 Hấp phụ E68 (n=2) 1/16 1/12 1/64 1/24 1/29 Mũi nhắc lại 4 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/320 1/2560 1/1920 1/1520 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/6 1/128 1/96 1/70 Dựa vào kết quả bảng 4.9 và 4.10 ta thấy có sự giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của KHT đã hấp phụ so với KHT không hấp phụ. 0 200 400 600 800 0 00 40 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hi ệu gi á K T Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ ở qui trình ngắn ngày 42 0 500 1000 1500 2000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.6 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ ở qui trình dài ngày 4.2. THẢO LUẬN 4.2.1. Định tính Khi tiêm kháng nguyên lần đầu thì khoảng 7 ngày sau kháng thể xuất hiện trong huyết thanh nhƣng ở hàm lƣợng thấp nên khó phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp thông thƣờng đặc biệt là phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính có độ nhạy rất thấp. Kháng thể chỉ đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp này khi nồng độ kháng thể lên đến đỉnh điểm (khoảng 12-15 ngày sau khi tiêm kháng nguyên). Ở qui trình ngắn ngày, kháng thể chỉ phát hiện đƣợc trong huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày). 14 ngày là thời gian đủ để hàm lƣợng kháng thể trong máu lên cao nên có thể phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Kháng thể vẫn tiếp tục tồn tại trong máu ở các mũi nhắc lại tiếp theo (khoảng cách giữa 2 mũi nhắc lại cách nhau 5 ngày). Trong KHT của lần lấy máu cuối cùng (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) vẫn còn sự hiện diện của kháng thể. Ở qui trình dài ngày, kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với KHT sau khi tiêm mũi gây mẫn cảm và các mũi nhắc lại 1,2 không rõ ràng. Có thể kháng thể xuất hiện trong KHT sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày nhƣng do hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh còn thấp nên khó phát hiện đƣợc. Ở các mũi nhắc lại thứ 3 và thứ 4 thì phản ứng ngƣng kết cho kết quả rõ hơn. Có thể do tiêm nhắc lại cùng một loại kháng nguyên vào cơ thể giúp tăng cƣờng việc chọn lọc các dòng kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên phát triển tạo ra các kháng thể có ái lực mạnh hơn và nhiều hơn. 43 Để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch, mũi gây mẫn cảm nên tiêm thêm vi khuẩn lao và vaccine ho gà vì hai loại kháng nguyên này kích thích sự tổng hợp một số cytokin cần thiết giúp kích thích miễn dịch mạnh hơn. Ngoài ra, sử dụng tá chất cũng làm tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch. 4.2.2. Định lƣợng 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày Kháng thể phát hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lần 2 (14 ngày sau khi tiêm mũi mẫn cảm). Do số lƣợng KHT thu đƣợc sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 quá ít không đủ để định lƣợng nên không thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 mà chỉ định lƣợng đƣợc KHT sau mũi nhắc lại lần 4 (tiêm lần cuối) ở các thời điểm khác nhau (5, 10, 15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh giảm dần qua các lần lấy máu. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao nhất ở đợt lấy máu lần 1 (5 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) và thấp nhất ở đợt lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Đáp ứng miễn dịch giảm dần có thể do việc ngừng cung cấp kháng nguyên. Qui trình ngắn ngày không tạo đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và kéo dài. Với cùng một liều tiêm, ở lần lấy máu thứ nhất, hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 1 và thỏ 2 bằng nhau. Nhƣng ở lần lấy máu thứ 2, thứ 3 hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 2 cao hơn thỏ 1 có lẽ do ở mỗi cá thể có sức đề kháng, trạng thái thể chất và thần kinh của cơ thể khác nhau nên khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. 4.2.2.2. Qui trình dài ngày Thông thƣờng hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh ở các mũi nhắc lại sau phải cao hơn mũi nhắc lại trƣớc nhƣng ta thấy hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 3 ở các mũi nhắc lại lần 3 và lần 4 bằng nhau có thể do đáp ứng miễn dịch của thỏ 3 đã đạt đến ngƣỡng cao nhất nên không tăng lên nữa hoặc do thỏ bị bệnh nên sức để kháng giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch, ngoài ra việc tiêm thuốc trị bệnh thỏ cũng ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch. Ở mũi nhắc lại lần 3, hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ 3 (liều tiêm mẫn cảm 1ml) cao hơn thỏ 4 (liều tiêm mẫn cảm 1,5 ml). Điều đó chứng tỏ liều tiêm 1 và 1,5 ml không ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch mà phụ thuộc chủ yếu vào khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cá thể . 44 Ở thỏ 4, hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở mũi nhắc lại lần 4 cao hơn mũi nhắc lại lần 3 rất nhiều so với thỏ 3. Điều này cho thấy đặc điểm cá thể giữ vai trò nhất định trong đáp ứng miễn dịch với các yếu tố kháng nguyên xâm nhập. Ở cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày, hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh nguyên cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh đã tủa với ammonium sulfate và thẩm tích. Điều này có thể do trong quá trình tủa và rửa tủa thì một số protein kháng thể bị biến tính hoặc bị trôi mất. So với qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cho lƣợng kháng thể cao (tăng dần ở các lần lặp lại). Do đó nếu gây miễn dịch để thu kháng huyết thanh nên chọn qui trình dài ngày vì thu đƣợc lƣợng KHT nhiều hơn (có thể lặp lại đến mũi nhắc lại thứ 7) và kháng thể tạo ra có ái lực cao với kháng nguyên hơn. Tuy nhiên số thú thí nghiệm chƣa nhiều vì vậy việc lặp lại là cần thiết để có những kết luận chắc chắn hơn. 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có độ nhạy rất thấp, chỉ phát hiện đƣợc kháng thể trong KHT ở nồng độ cao. Do đó để tăng độ nhạy nhằm xác định chính xác hơn sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh ta có thể cho kháng thể gắn với protein A của S. aureus. Protein A trên thành vi khuẩn S. aureus có khả năng gắn với IgG của thỏ rất tốt. Khi cho kháng thể đã gắn với protein A phản ứng với kháng nguyên thích hợp thì kháng thể cùng với S. aureus ngƣng kết với kháng nguyên do đó hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn nhiều lần so với kháng thể không gắn protein A. Do đó việc gắn kháng thể với protein A của S. aureus sẽ làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy tỉ lệ kết hợp giữa kháng huyết thanh và S. aureus cũng tác động đến kết quả của phản ứng ngƣng kết. Thử nghiệm cho thấy tỉ lệ thích hợp giữa KHT và dịch vi khuẩn S. aureus trong nghiên cứu là 1:4 với nồng độ S. aureus là 1014 tế bào/ ml. 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Khi đƣa kháng nguyên vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể chống lại các quyết định kháng nguyên (các epitop). Nếu kháng nguyên có một quyết định KN thì cơ thể chỉ tạo ra một loại kháng thể đặc hiệu với quyết định KN đó. Nếu KN có nhiều quyết định KN khác nhau thì ứng với một quyết định KN thì cơ thể sẽ tạo ra một KT phù hợp. 45 Vi khuẩn E. coli là kháng nguyên gồm nhiều quyết định KN khác nhau, trong đó có một số quyết định KN giống nhau cho tất cả các chủng E. coli . Kháng thể tạo ra sẽ có một số kháng thể đặc hiệu cho tất cả các chủng E. coli do đó việc định tính kháng thể kháng một chủng E. coli nào đó sẽ không chính xác. Chủng O139:K82 (H28) và chủng K88+ (E68) đều thuộc nhóm E. coli gây bệnh trên heo nên chúng có một số yếu tố kháng nguyên giống nhau. Do đó khi dùng chủng E68 để hấp phụ huyết thanh sẽ loại đi kháng thể chung cho E68 và H28 nên trong huyết thanh chỉ còn lại các kháng thể đặc hiệu cho H28. Vì vậy việc thực hiện phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh đã hấp phụ E68 sẽ cho hiệu giá thấp hơn. 46 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 1. Kháng thể ngƣng kết phát hiện đƣợc trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày. 2. Hiệu lực gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên biến đổi tùy theo qui trình gây miễn dịch. 3. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc kháng nguyên E. coli trên thỏ là 28 ngày tạo hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao hơn so với khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc là 5 ngày. 4. Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính KHT có thể đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 5. Xử lí kháng huyết thanh bằng cách kết tủa và thẩm tích làm giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh. 5.2. ĐỀ NGHỊ 1. Với qui trình ngắn ngày cần định lƣợng KHT sau mũi nhắc lại thứ 2, thứ 3 để xác định thời điểm kháng thể trong KHT nhiều nhất. 2. Nên thử nghiệm sử dụng chất bổ trợ để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ. 3. Lặp lại thí nghiệm với số lƣợng thú thí nghiệm lớn hơn để đánh giá chính xác hơn hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở hai qui trình trên. 47 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng việt 1. Nguyễn Ngọc Hải, 1999. Phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh phù trên heo sau cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh. Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Lê Văn Hùng, 2002. Giáo trình miễn dịch học thú y. NXB Nông Nghiệp, TP.HCM. 191 trang. 3. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Miễn dịch học cơ sở. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. tr 3-119. 4. Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hóa sinh miễn dịch. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Nguyễn Nhƣ Thanh, 1996. Miễn dịch học. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 6. Bộ môn miễn dịch - sinh lí bệnh trƣờng đại học Y Hà Nội, 1997. Miễn dịch học. NXB Y học Hà Nội. Phần tiếng Anh 7. Cooper G. Terrance, 1977. The Tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York, USA. p 257-277, 355-405. 8. Dress W. D. Immunization of experimental animals. Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume 1 (Edited by D. M. Weir, Co-editors L. A. Herzenberg, Caroline black well, Leonone A. Herzenberg). Black well Scientific Publications. p 8.1-8.18. 9. Gross J. R. and Rowe B., 1985. Serotyping of Escherichia coli. The Virulence of Escherichia coli (M. Sussman). Academic Press, London, England. p 345- 356. 10. Harlow Ed and Lane David, 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. p 92-137, 286-299. 11. Mahler R. Henry and Cordes H. Eugene, 1967. Biological chemistry. Harper & Row, New YorK, USA. p 63-69 12. Sojka J. W., M.R.C.V.S, 1965. Escherichia coli in domestic animals and poultry. Commonwealth Agricultural Bureaux Farham Royal, Bucks, England. p 205-212. 48 13. Tizar Ian R., 1992. Immunology: an introduction, Third Edition. Sauders College Publishing, New York, USA. p 13-25, 112-128, 167-189, 219-236. Internet me%20Course.jpg RC/VL/GG/antiBD_mol.html 49 PHẦN 7 PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) tổng hợp: Casein enzymic hydrolysate 17 g/l Popaic digest of soyabean meal 3 g/l Sodium chloride 2,5 g/l Dipotassium phosphate 2,5 g/l Dextrose 2,5 g/l pH = 7,3 ± 0,2 (ở 25oC) Pha chế: cân 30g bột TSB hòa trong 1l nƣớc cất, đun sôi cho tan sau đó đem hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Nếu pha môi trƣờng TSA thì bổ sung thêm 17,5g agar. Thành phần đệm PBS 10X NaCl 84,74g NaH2PO4.2H2O 10,14g Na2HPO4.12H2O 51,93g NaN3 5g Pha đệm: cân tất cả thành phần trên hòa tan trong nƣớc cất để đƣợc 1l dung dịch đệm PBS 10X Pha PBS 1X: 100 ml đệm PBS 10X + 900 ml nƣớc cất  1000 ml PBS 1X Pha amonium sulfate bão hòa 100%S: cân 767g (NH4)2SO4 hòa trong 1l nƣớc cất. Hỗn hợp đƣợc khuấy từ có đun nóng cho tan hết muối, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Pha amonium sulfate bão hòa 45%S: 450 ml (NH4)2SO4 100%S + 550 ml PBS 1X  1000 ml (NH4)2SO4 45%S 50 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai Hình 7.3 Tiêm dƣới da 51 Bảng 1: Kết quả phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với kháng huyết thanh ở độ pha loãng cao nhất có phản ứng ngƣng kết xảy ra của thỏ 1 và thỏ 2 Bảng 2: Kết quả phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với kháng huyết thanh ở độ pha loãng cao nhất có phản ứng ngƣng kết xảy ra của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ Lấy máu Thỏ 3 Thỏ 4 H. thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Mũi nhắc lại 3 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/1280 1/1280 1/640 1/1280 1/640 1/640 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/16 1/16 1/8 1/16 1/64 1/64 1/32 1/16 Mũi nhắc lại 4 Không h. phụ (n=2) 1/1280 1/1280 1/320 1/320 1/2560 1/2560 1/2560 1/1280 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/4 1/8 1/128 1/128 1/128 1/64 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 H thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Lần 1 Không h. phụ (n=2) 1/1600 1/1600 1/1280 1/640 1/640 1/2560 1/640 1/320 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/32 1/64 1/32 1/64 1/8 1/32 Lần 2 Không h. phụ (n=2) 1/640 1/1280 1/320 1/160 1/1280 1/1280 1/640 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/8 1/4 1/64 1/32 1/64 1/32 Lần 3 Không h. phụ (n=2) 1/320 1/640 1/640 1/640 1/640 1/1280 1/640 1/320 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/16 1/4 1/16 1/32 1/32 1/8 1/32