Khóa luận Tổng hợp một số dẫn xuất của 3-Aminocoumarin

........................................................ 30 III.1.1.1 Phương trình phản ứng ......................................................................... 30 III.1.1.2 Cơ chế phản ứng ........................................................................................ 30 III.1.2 Tổng hợp 3-acetylaminocoumarin (2)................................................ 30 III.1.2.1 Phương trình phản ứng ......................................................................... 30 III.1.2.2 Cơ chế phản ứng ........................................................................................ 31 III.1.2.3 Nghiên cứu cấu trúc ................................................................................. 32 III.1.2.3.1 Phổ hồng ngoại của (2)................................................................... 32 III.1.2.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của (2) ..................... 33 III.1.3 Tổng hợp 3-aminocoumarin (3) ............................................................ 34 III.1.3.1 Phương trình phản ứng ......................................................................... 34 III.1.3.2 Cơ chế phản ứng ........................................................................................ 34 III.1.3.3 Nghiên cứu cấu trúc ................................................................................. 36 III.1.3.3.1 Phổ hồng ngoại của (3)................................................................... 36 III.1.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của hợp chất (3) .. 37 III.2 TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA 3-AMINOCOUMARIN ................. 38 III.2.1 Tổng hợp 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) ..................... 38 III.2.1.1 Phương trình phản ứng ......................................................................... 38 III.2.1.2 Cơ chế phản ứng ........................................................................................ 38 III.2.1.3 Nghiên cứu cấu trúc ................................................................................. 39 III.2.1.3.1 Phổ hồng ngoại của (4)................................................................... 39 III.2.1.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của hợp chất (4) .. 40 III.2.2 Tổng hợp các hợp chất N-(coumarin-3-yl)carbonamide ............ 41 III.2.2.1 Phương trình phản ứng ......................................................................... 41 III.2.2.2 Cơ chế phản ứng ........................................................................................ 41 III.2.2.3 Nghiên cứu cấu trúc ................................................................................. 42 III.2.2.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) ......................................................................... 42 III.2.2.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) ..................................... 44 III.2.2.3.3 Phổ HR-MS của hợp chất (5a) ..................................................... 48 III.3 TÓM TẮT KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHỔ HỒNG NGOẠI VÀ PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ PROTON CỦA CÁC HỢP CHẤT ............................................................... 50 III.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN XUẤT CỦA 3- AMINOCOUMARIN. .............................................................................................................. 52 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................. 56 LỜI MỞ ĐẦU Cùng với tốc độ phát triển ngày càng nhanh của các ngành khoa học kỹ thuật nói chung và hóa học nói riêng, các hợp chất hữu cơ mà đặc biệt là các dị vòng ngày càng được quan tâm nghiên cứu do những ứng dụng hết sức quan trọng mà chúng mang lại. Các hợp chất dị vòng có mặt ở hầu hết các lĩnh vực của đời sống như: y học, nông nghiệp, công nghiệp, Coumarin là một loại dị vòng benzopyrone - một nhóm chất ưu việt tồn tại trong tự nhiên cũng như nhân tạo đã và đang được quan tâm nghiên cứu bởi khả năng ứng dụng của chúng trong kỹ thuật cũng như trong y học. Các sản phẩm 3- aminocoumarin N-thế được thấy có một số tác dụng sinh học như: kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của côn trùng, chống dị ứng, tác động lên hệ thần kinh trung ương; bên cạnh đó, một số hợp chất đã được sử dụng như thuốc chống ung thư [7]. Novobiocin - một dẫn xuất của 3-benzamidocoumarin là chất kháng sinh đã được cấp phép để điều trị các bệnh nhiễm trùng và hiệu quả của nó đã được xác nhận trong thử nghiệm lâm sàng. Ngoài ra, 3-aminocoumarin N-thế còn thể hiện nhiều tính chất quang hóa và đã được sử dụng để đánh dấu huỳnh quang. Từ những ứng dụng quan trọng của hợp chất 3-aminocoumarin, chúng tôi thực hiện đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của 3-aminocoumarin”  Mục đích nghiên cứu Tổng hợp 3-aminocoumarin Tổng hợp dẫn xuất của 3-aminocoumarin • N-(coumarin-3-yl)pivalamide • Ethyl (coumarin-3-yl)carbamate • 1-(Coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea Khảo sát tính chất vật lý (trạng thái, nhiệt độ nóng chảy, màu sắc, dung môi kết tinh) của các hợp chất tổng hợp được. Nghiên cứu cấu trúc của các chất tổng hợp được. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn với 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis.  Phương pháp nghiên cứu • Nghiên cứu tài liệu. • Thực nghiệm tổng hợp các chất. • Nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất thông qua phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS. • Thực nghiệm thăm dò hoạt tính kháng khuẩn. CHƯƠNG I TỔNG QUAN I.1 KHÁI QUÁT VỀ COUMARIN Coumarin (2H-chromen-2-one) là một loại của hợp chất benzopyrone, tồn tại trong thực vật được biết từ năm 1820 trong hạt của cây Dipteryx odorata Willd thuộc họ đậu. Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và còn có tên địa phương là “coumarou”, do đó mà có tên coumarin. Hợp chất benzopyrone gồm một vòng benzen kết hợp với một vòng pyrone, có hai loại thường gặp là benzo-α-pyrone thường được gọi là coumarin và benzo-γ-pyrone thường được gọi chromone. O O O O Phân tích tia X cho thấy coumarin có cấu tạo gần như phẳng. O 139,0 143,1 134,4 134,4 O 120,4 136,7137,8138,3139,1 136,8 136,9 139,5 117,30 121,60 121,60 117,20 121,90 120,00 Độ dài liên kết tính bằng pm (1pm = 10-12m) Ở trạng thái tự nhiên, coumarin là một chất kết tinh không màu, dễ thăng hoa và có mùi thơm. Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon thì dễ tan trong dung môi kém phân cực. Coumarin tồn tại nhiều trong các loài thực vật: Cỏ mực, Ba dót, Mần tưới, Bạch chỉ, Tiền hồ, Ammi visnaga, Sài đất, Mù u, Hoàng kỳ, Cúc La Mã, Quế được sử dụng rộng rãi trong các loại nước hoa, các ngành công nghiệp mỹ phẩm, nông nghiệp và dược phẩm. Một số dẫn xuất coumarin đã được tổng hợp để phục vụ cho điều trị bệnh tim mạch, lão hóa, tính chất kháng khuẩn và Benzo-α-pyrone Benzo-γ-pyrone quang. Hóa học của coumarin ngày càng được quan tâm phát triển thêm nhiều sản phẩm hữu ích. I.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP COUMARIN Coumarin có thể được tổng hợp bằng các phản ứng cổ điển như phản ứng Perkin, Pechmann hoặc Knoevenagel. Thời gian gần đây, các phản ứng để tổng hợp các hợp chất dị vòng thuận lợi hơn được quan tâm là phản ứng Wittig, Kostanecki-Robinson và Reformatsky [9, tr.38-45].  Các phản ứng Perkin, Knoevenagel, Reformatsky, Kostanecki-Robinson và phản ứng Wittig đều có sự tham gia của vòng benzen có hai nhóm thế (-COR và –OH) ở vị trí ortho: • Phản ứng Perkin Vòng coumarin được hình thành nhờ phản ứng ngưng tụ aldol giữa ortho- hydroxybenzaldehyde với anhydride acetic có mặt xúc tác natri acetate. CHO OH O O O + NaOAc O O • Phản ứng Knoevenagel Phản ứng ngưng tụ của aldehyde với hợp chất methylene hoạt động khi có mặt ammonia hoặc amine đều được biết như là phản ứng Knoevenagel. Xúc tác thường sử dụng trong phản ứng là base, hoặc hỗn hợp của amine và acid carboxylic, hoặc acid Lewis trong môi trường đồng thể. Khi sử dụng xúc tác là acid malonic hoặc pyridine thì gọi là sự kết hợp Doebbner. CHO OH RO O RO O + base ROOC COOR OH O O • Phản ứng Wittig Ban đầu là sự tạo thành alkene nhờ phản ứng giữa hợp chất carbonyl với phosphonium ylide, alkene tiếp tục thực hiện chuyển hóa đóng vòng để tạo hợp chất coumarin. CHO OH R + Ph3P=CHCO2Et Et2NPh t0 CO2CH2CH3 OH R O O R • Phản ứng Reformatsky Phản ứng Reformatsky là sự ngưng tụ giữa aldehyde hoặc ketone với α- halo ester có mặt xúc tác kẽm tạo thành β-hydroxy ester. Trong điều kiện phản ứng thích hợp sẽ xảy ra quá trình đóng vòng tạo coumarin. COR OH Br O O + Zn C(OZnBr)CH2CO2CH2CH3 R OH H3O C(OH)CH2CO2CH2CH3 R OHO O R • Phản ứng Kostanecki - Robinson Vòng coumarin được tạo thành từ quá trình acyl hóa giữa các ketone ortho-hydroxyaryl với các anhydride acid béo kết hợp với phản ứng đóng vòng nội phân tử R1 O OH R2 O O O R2 R1 O O R2 O O O R1 R2 +  Phản ứng Pechmann và phản ứng Ponndorf đều có sự tham gia của hợp chất phenol • Phản ứng Pechmann Một phương pháp để tổng hợp vòng coumarin rất có giá trị là phản ứng Pechmann. Trong phản ứng này, vòng coumarin được tạo thành nhờ sự ngưng tụ giữa phenol với β-ketoesters có mặt xúc tác acid. Phản ứng giữa ester acetoacetate và dẫn xuất thường được gọi là phản ứng Pechmann-Duisberg. OHR7 R4 O R3 O O O R4 R3 OR7 + • Phản ứng Ponndorf Phản ứng được thực hiện giữa aryl halogenua hoặc phenol với alkyne ở nhiệt độ phòng cùng với sự đóng vòng nội phân tử sẽ tạo thành coumarin. R1 OH R2 R3+ R1 O O R2 O R2 O R1 R3=COOH, COOEt I.3 ỨNG DỤNG CỦA COUMARIN Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus - là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Các aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2) là một nhóm các chất độc cấp tính và là tác nhân gây ung thư. Sau khi thâm nhập vào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thủy phân và trở thành M1 ít độc hơn. Aflatoxin B1 đã được tổng hợp từ 5- benzyloxy-4-methyl-7methoxy coumarin . Các hợp chất này đều chứa khung coumarin trong phân tử. O OMeO OBn Me O O O O O O H H (–)aflatoxin B1 Kháng sinh nhóm coumarin như novobiocin, coumermycin A1 và clorobiocin là chất ức chế mạnh enzyme DNA gyrase. Các kháng sinh này đã được phân lập từ các loài Streptomyces khác nhau và tất cả đều chứa gốc 3-amino-4- hydroxycoumarin. Novobiocin đã được cấp phép ở Mỹ để điều trị cho người nhiễm vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus, S. epidermidis. Novobiocin và các dẫn xuất của nó cũng đã được nghiên cứu như thuốc chống ung thư tiềm năng [3,7]. O O OH H N CH3 O O OHO CH3 CH3 OHOH2N O OCH3 Novobiocin Một trong những sắc tố màu vàng được phân lập từ các tuyến mùi hương của hải ly đã được xác định là urolithin-A và urolithin-B. Alternariol (3,4- benzocoumarin) là chất kháng khuẩn đầu tiên được phân lập từ nấm Alternaria tenus. Benzocoumarins autumnariol và autumnarriniol phân lập từ củ hành tạo thành các thành phần hương vị của Shilajit. Furocoumarin glapalol và coumasterol cũng đã được cô lập. Sự tích tụ và biến đổi đồng thời của các hợp chất được gọi là phytoalexin (rotenonones, stemonone và stemonal) trong quá trình chuyển hóa được cho là cơ chế kháng bệnh ở thực vật [11]. Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của coumarin Hợp chất Hoạt tính sinh học Cyclocoumarol Chống đông Glycosides coumarin thơm mang C-2 và nhóm thế C-3-alkoxy Chống đái tháo đường và sát trùng 7-(Bromomethyl)-4-(furan-3- yl)coumarin Ức chế sinh tổng hợp leukotriene trong điều trị đau thắt ngực, ngăn ngừa sự hình thành của dịch bệnh xơ vữa động mạch, và chống dị ứng Dẫn xuất 4-methoxycoumarin Điều trị xơ hóa Dẫn xuất 3-acyl-7-nitro-6,8- diakylcoumarin Tăng khả năng điều tiết Dẫn xuất 3-benzazolyl-7- aminoalkylcoumarin Đầu dò chuẩn đoán cho bệnh tích tụ tinh bột Dẫn xuất 7-(2-Piperizinyl)coumarin Giảm đau Furo[3,2g]4-hydroxy-9- alkenylcoumarin Kháng khuẩn Dẫn xuất bis-4-hydroxycoumarin Chống đông máu Dẫn xuất 6-hydroxy-3,4- dihydrocoumarin Chống lão hóa, làm trắng da Bảng 1.2 Ứng dụng quang của coumarin Hợp chất Ứng dụng 3-[4-bromoethyl] phenyl-7- Thuốc thử dẫn suất huỳnh quang cho (diethylamino)coumarin acid carboxylic trong áp suất chất lỏng cao Chromatography Dẫn xuất 4-hydroxycoumarin Cung cấp thuốc nhuộm phân tán Dẫn xuất 3-aryl-7- diethylaminocoumarin Vật liệu huỳnh quang Dẫn xuất 7-amino-4-hydroxymethyl coumarin Làm lồng acid butyric γ-amine (GABA) để điều tra các mạch thần kinh trong mô Axit N-(cacbonyl coumarin-3-yl)-α- amino Đánh dấu huỳnh quang cho các acid amine và dipeptides. I.4 MỘT SỐ PHẢN ỨNG CHUYỂN HÓA CỦA 3-AMINOCOUMARIN Muhammed Abd Khadom đã tiến hành chuyển hóa 3-aminocoumarin qua hai giai đoạn: Giai đoạn một là giai đoạn tạo thành bốn hợp chất base Schiff nhờ phản ứng ngưng tụ giữa 3-amino coumarin (1) với aldehyde thơm. Giai đoạn hai là phản ứng giữa base Schiff (2a-d) với 4-hydroxy coumarin để tạo thành sản phẩm (3a-d). O O NH2 aromatic aldehyde O O N Ar O O OH O O OH N H Ar OO O O O N H Ar OO (1) (2a-d) (3a-d) a: Ar=C6H4NO2-m b: Ar=C6H4OH-p c: Ar=C6H4OCH3-p d: Ar=C6H5 Các hợp chất (2a-d) và (3a-d) đều đã được thăm dò hoạt tính sinh học và cho kết quả kháng tốt với một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Psedomonase aeruginosa. Ngoài ra các hợp chất trên còn kháng một số loài nấm như Aspergllus niger, Penicillium italicum, Fusarium oxysporum. [10]. Sử dụng thuốc kháng sinh Amoxicillin làm tiêu chuẩn cho vi khuẩn và Mycostatin là tiêu chuẩn cho nấm. Kết quả đo đường kính kháng khuẩn, kháng nấm (mm) của các hợp chất này được biểu diễn ở bảng 1.3 và 1.4. Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất (2a-d) và (3a-d) Hợp chất Đường kính kháng khuẩn (mm) S. aureus B. subtilis B. cereus P. aeruginosa 2a 22 27 16 24 2b 28 22 19 18 2c 10 25 14 20 2d 26 16 22 13 3a 17 18 13 9 3b 25 20 12 6 3c 25 20 10 10 3d 20 12 23 11 Amoxicillin 29 20 12 26 Bảng 1.4 Hoạt tính kháng nấm của hợp chất (2a-d) và (3a-d) Hợp chất Đường kính kháng nấm (mm) A. niger P. italicum F. oxysporum 2a 14 17 22 2b 12 15 10 2c 14 18 20 2d 16 18 18 3a 15 16 22 3b 13 22 16 3c 13 17 16 3d 16 12 10 Mycostatin 12 19 25 Các tác giả M. A. Al-Haiza, M. S. Mostafa và M. Y. El-Kady đã tiến hành cho 3-aminocoumarin (1) phản ứng với benzoyl isothiocyanate tạo thành 3-(3’- coumarinyl)-N-benzoylthiourea (2). Từ (2) lại tiếp tục chuyển hóa thành dẫn xuất 2-thioxo-1,3,5-trihydropyrimidine-4,6-dione (3) hoặc thiazolidin-4-one (4). Alkyl hóa (1) tạo thành hợp chất (5), (7a-b) và base Shiff (8a-d) [8]. O NHCSNHCOPh O CH2(COOC2H5)2 O O N N O O S COPh O N O S PhCON O ClCH2COOH (2) (3) (4) ONH2 O O N(CH2Ph)3 O Cl O H N O N N SR Ph O N O Ar a: R=CH3 b: R=CH2Ph a: Ar=C6H4NO2-p b: Ar=C6H4Cl-p c: Ar=C6H4Br-p d: Ar=2-thienyl (1) (5) (7a-b) (8a-d) benzyl cloride (6a-b) aromatic aldehydes PhCOCNS Tất cả các hợp chất được thử hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus) và vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas aurignosa, Echerichia coli,Enterobacter aerogenes) cũng như một số chủng nấm (Aspergillus niger, Penicillium italicum, Fusarium oxysporum) bằng phương pháp lọc đĩa giấy sau khi hòa tan trong N,N- dimethylformamide với nồng độ là 1mg/ml. Sử dụng thuốc kháng sinh Amoxicillin làm tiêu chuẩn cho vi khuẩn và Mycostatin là tiêu chuẩn cho nấm ở nồng độ 1000ppm. Bảng 1.5 Hoạt tính kháng nấm của hợp chất (2) đến (8a-d) Hợp chất Đường kính kháng nấm (mm) A. niger P. italicum F. oxysporum 2 16 18 22 3 12 18 22 4 14 12 14 5 13 12 10 7a 14 18 20 7b 14 15 18 8a 10 18 20 8b 10 16 18 8c 12 22 20 8d 10 12 22 Mycostatin 12 20 26 Bảng 1.6 Hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất (2) đến (8a-d) Hợp chất Đường kính kháng khuẩn (mm) S. aureus B. subtilis B. cereus P. aurignosa E. coli E. aerogenes 2 24 12 14 11 14 16 3 26 10 18 12 25 14 4 22 16 20 10 20 14 5 10 9 9 11 - 16 7a 28 16 13 19 13 13 7b 20 15 22 14 18 12 8a 26 10 18 12 10 10 8b 25 11 18 7 14 11 8c 22 11 12 6 12 13 8d 28 12 19 10 13 14 Amoxicillin 29 12 20 11 36 10 Aminocoumarin ngày càng được quan tâm nghiên cứu, trong đó nhiều công trình sử dụng 3-aminocoumarin như là chất chìa khóa để chuyển hóa thành nhiều hợp chất có ứng dụng như hợp chất amide, azometine, các dẫn xuất chứa dị vòngNhiều hợp chất đã được chứng minh là có tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, chống đông máu, chống viêm; một số dẫn xuất được sử dụng làm phụ gia cho thực phẩm và mỹ phẩm [10]. Vì những ứng dụng mà các dẫn xuất của 3-amino coumarin mang lại, chúng tôi quyết định chọn đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của 3-aminocoumarin”. CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM Các hợp chất chứa dị vòng 3-aminocoumarin và dẫn xuất của nó được chúng tôi tổng hợp theo sơ đồ phản ứng sau: NH2 COOH (CH3CO)2O NHCOCH3 COOH CHO OH O H N O O O NH2 O H2O//HCll C6H5NCS O NH O H N S R--CO--Cll O H N R O O (11) (22) (33) (44) (55aa--b) 55aa:: R==OCH2CH3 5b:: R==C(CH3)3 II.1 TỔNG HỢP 3-AMINOCOUMARIN II.1.1 Tổng hợp acetylglycine (1) II.1.1.1 Phương trình phản ứng H2N COOH O NH COOH O O O CH3COOH+ + (1) II.1.1.2 Hóa chất - 14,5 gam (0,14 mol) anhydride acetic - 5,0 gam (0,06 mol) glycine II.1.1.3 Cách tiến hành Cho 14,5 gam anhydride acetic (0,14 mol) vào dung dịch chứa 5,0 gam glycine (0,06 mol) trong 75 ml nước. Khuấy hỗn hợp phản ứng 20 phút ở nhiệt độ thường rồi để 24 giờ trong tủ lạnh. Lọc lấy kết tủa tách ra, rửa bằng nước lạnh. Để khô thu lấy sản phẩm dưới dạng chất rắn màu trắng. Sản phẩm được dùng trực tiếp để tổng hợp 3-acetylaminocoumarin mà không cần tinh chế thêm. II.1.2 Tổng hợp 3-acetylaminocoumarin (2) II.1.2.1 Phương trình phản ứng OH H O H N O CH3 O H N O CH3 OHO O + + 2H2O (2) H N (1) II.1.2.2 Hóa chất - 5,0 gam (0,043 mol) acetylglycine - 12,2 gam (0,1 mol) salicylaldehyde - 5 ml anhydride acetic - Piperidine (d = 0,862g/cm3) - Diethyl ether II.1.2.3 Cách tiến hành Cho vài giọt piperidine vào dung dịch của 5,0 gam acetylglycine (0,043 mol) và 12,2 gam salicylaldehyde (0,1 mol) trong 5,0 ml anhydride acetic (0,049 mol). Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng 6 giờ. Để nguội hỗn hợp phản ứng, thêm 10 ml nước và tiếp tục đun hồi lưu hỗn hợp trong 30 phút. Lọc lấy chất rắn tách ra, rửa bằng diethyl ether. Để cho ether bay hơi hết rồi mang kết tinh trong ethanol. Sản phẩm thu được là tinh thể hình kim màu cam, nhiệt độ nóng chảy là 200-203oC (phù hợp với tài liệu [12]). Hiệu suất phản ứng đạt 50,72%. II.1.3 Tổng hợp 3-aminocoumarin (3) II.1.3.1 Phương trình phản ứng O H N O CH3 O H2O O NH2 O CH3COOH+ + (3) HCl (2) II.1.3.2 Hóa chất - 5,0 gam (0,024 mol) 3-acetylaminocoumarin - Ethanol - 5 ml acid chlohydric - Natri hydrocarbonat II.1.3.3 Cách tiến hành Cho 5,0 gam 3-acetylaminocoumarin (0,024 mol) vào 25 ml ethanol nóng, thêm 5,0 ml acid chlohydric đặc. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng 2 giờ. Sau khi để nguội, thêm nước và trung hòa hỗn hợp phản ứng bằng natri hydrocarbonat. Làm lạnh, lọc lấy chất rắn tách ra, kết tinh lại trong ethanol. Sản phẩm thu được là tinh thể hình kim màu trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy là 127oC (phù hợp với tài liệu [12]). Hiệu suất phản ứng đạt 55%. II.2 TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA 3-AMINOCOUMARIN II.2.1 Tổng hợp 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) II.2.1.1 Phương trình phản ứng O O NH2 + C6H5NCS O H N H N S O (4)(3) II.2.1.2 Hóa chất - 1,16 gam (0,01 mol) 3-aminocoumarin - 1,35 gam (0,01 mol) phenyl isothiocyanate - Ethanol II.2.1.3 Cách tiến hành Hoà tan 1,16 gam 3-aminocoumarin (0,01 mol) trong ethanol rồi cho thêm 1,35 gam phenyl isothiocyanate (0,01 mol). Đun cách thuỷ hỗn hợp trong 4 giờ rồi để nguội. Lọc lấy chất rắn tách ra, kết tinh lại trong dioxane : ethanol. Để khô thu lấy tinh thể dưới dạng hình kim, màu vàng nhạt có nhiệt độ nóng chảy là 124,1-124,4oC. Hiệu suất phản ứng đạt 33,4%. II.2.2 Tổng hợp ethyl (coumarin-3-yl)carbamate II.2.2.1 Phương trình phản ứng O O NH2 Cl O O + O O H N O O (5a)(3) HCl CH3 + CH3 II.2.2.2 Hóa chất - 0,805 gam (0,005 mol) 3-aminocoumarin - 0,543 gam (0,005 mol) ethyl carbonochloridate - 0,41 gam (0,005 mol) natri acetate khan - 5 ml Dioxan II.2.2.3 Cách tiến hành Vừa lắc vừa nhỏ từ từ dung dịch lạnh của 0,543 gam ethyl carbonochloridate (0.005 mol) trong 5 ml đioxan vào dung dịch lạnh chứa 0,805 gam 3-aminocoumarin (0,005 mol) và 0,41 gam natri acetate khan (0,005 mol) trong 10 ml đioxan. Tiếp tục lắc thêm 1 giờ ở nhiệt độ thường rồi đun nóng ở 70-80oC trong 1 giờ nữa. Sau khi để nguội, đổ hỗn hợp phản ứng vào 100 ml nước đá vụn. Lọc lấy kết tủa tách ra, kết tinh lại trong ethanol : nước. Để khô thu lấy sản phẩm dưới dạng chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 156,4-157oC. Hiệu suất phản ứng đạt 74,5%. II.2.3 Tổng hợp N-(coumarin-3-yl)pivalamide II.2.3.1 Phương trình phản ứng O O NH2 Cl C(CH3)3 O + O O H N C(CH3)3 O (5b)(3) + HCl II.2.3.2 Hóa chất - 0,805 gam (0.005 mol) 3-aminocoumarin - 0,603 gam (0,005 mol) isobutyl chloride - 0,41 gam (0,005 mol) natri acetate khan - 5ml Dioxan II.2.3.3 Cách tiến hành Vừa lắc vừa nhỏ từ từ dung dịch lạnh của 0,603 gam isobutyl chloride (0.005 mol) trong 5,0 ml đioxan vào dung dịch lạnh chứa 0,805 gam 3- aminocoumarin (0,005 mol) và 0,41 gam natri acetate khan (0,005 mol) trong 10 ml đioxan. Tiếp tục lắc thêm 1 giờ ở nhiệt độ thường rồi đun nóng ở 70-80oC trong 1 giờ nữa. Sau khi để nguội, đổ hỗn hợp phản ứng vào 100 ml nước đá vụn. Lọc lấy kết tủa tách ra, kết tinh lại trong ethanol : nước. Để khô thu được sản phẩm dưới dạng chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 124,1-124,4oC. Hiệu suất phản ứng đạt 40,8%. II.3 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN XUẤT CỦA 3-AMINOCOUMARIN Việc thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn với 2 loại khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis được tiến hành như sau: Nấu môi trường MPA bao gồm các thành phần: 5 gam cao thịt, 5 gam peptone, 5 gam natri clorua khan, 20 gam agar và 1000 ml nước cất. Khuấy đều và nấu hỗn hợp đến khi sệt lại, hấp hỗn hợp trong nồi áp suất. Đổ hỗn hợp lần lượt lên các đĩa petri trong tủ cấy vô trùng, để yên trong 24 giờ. Cấy trải vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis lên môi trường MPA trong đĩa petri, dùng khoan nút chai khoan một lỗ giữa đĩa. Hút 0,1 ml chất ở các nồng độ 1% và 2% cho vào lỗ khoan. Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4-8 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ, sau đó đo đường kính vô khuẩn D-d (mm). Trong đó: - D đường kính vòng vô khuẩn chất khảo sát (mm) - d là đường kính vô khuẩn của dung môi hòa tan (mm) II.4 NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC II.4.1 Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất được đo bằng máy SMP3 ở phòng thực hành Hóa đại cương, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. II.4.2 Phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại (IR) của các chất được đo trên máy Shimadzu FTIR-8400S theo phương pháp ép viên với KBr tại Khoa Hóa học, Trường Đai học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. II.4.3 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) Phổ 1H-NMR của các chất được đo trên máy Bruker Avance 500MHz (dung môi DMSO) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. II.4.4 Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) Phổ HR-MS của các chất được đo trên máy Bruker micrOTOF-Q 10187 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 TỔNG HỢP 3-AMINOCOUMARIN III.1.1 Tổng hợp acetylglycine (1) III.1.1.1 Phương trình phản ứng H2N COOH O NH COOH O O O CH3COOH+ + (1) III.1.1.2 Cơ chế phản ứng Giai đoạn quyết định của phản ứng tạo thành acetylglycine (1) xảy ra theo cơ chế cộng nucleophile vào carbon carbonyl: nguyên tử nitơ trong glycine đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào carbon carbonyl trong anhydride acetic. Sau đó xảy ra sự tách loại CH3COOH để tạo sản phẩm cuối cùng [4, tr 611]. O O O H2N COOH + O NH COOH O O H H N COOH O -CH3COO - H CH3COO - O N H COOH CH3COOH + (1) III.1.2 Tổng hợp 3-acetylaminocoumarin (2) 3-Acetylaminocoumarin được tổng hợp theo phương pháp mà tài liệu [12] đã mô tả. III.1.2.1 Phương trình phản ứng OH H O H N O CH3 O H N O CH3 OHO O + + 2H2O (2) H N (1) III.1.2.2 Cơ chế phản ứng Theo tài liệu [2], đầu tiên cặp electron trên nguyên tử oxi ở chức phenol của hợp chất salycilandehyde đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào carbon carbonyl trong hợp chất acetylglycine. Sau đó tách loại một phân tử nước tạo hợp chất (1’). H O O H H N OHO O CH3 + O H H N O CH3 O O OH -H2O O H N O CH3 O O (1) (1') Tiếp theo, piperidine - với vai trò của một base - lấy một proton trong nhóm metylen linh động của (1’) để tạo carbanion. Carbanion tấn công vào carbon carbonyl để khép vòng nội phân tử, sau đó tách nước để tạo thành sản phẩm (2). OH N O CH3 O O H NH O H N O CH3 O O O H N O CH3 O O +H O H N O CH3 OH O -H2O O H N O CH3 O (2) (1') III.1.2.3 Nghiên cứu cấu trúc III.1.2.3.1 Phổ hồng ngoại của (2) Trên phổ IR của hợp chất (2) xuất hiện các pic hấp thụ ở 3331 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết N-H, pic hấp thụ ở 1709 cm-1 là của liên kết C=O lacton, ở 1682 cm-1 là của liên kết C=O amide. Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của hợp chất (2) III.1.2.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của (2) Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 9 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối 3 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 phù hợp với cấu trúc dự đoán của (2). Trong vùng từ trường mạnh xuất hiện một tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 3 và độ chuyển dịch δ = 2,17 ppm được quy kết là tín hiệu của proton H10 trong nhóm methyl. Trong vùng từ trường yếu xuất hiện một tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 9,76 ppm là tín hiệu của proton H9 trong nhóm amide. Do H4 không có tương tác spin - spin với proton nào nên tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 8,61 ppm được quy kết là của proton H4. Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện cụm tín hiệu trong khoảng 7,32÷7,71 ppm là vùng tín hiệu đặc trưng cho các proton của vòng thơm. Trong vòng coumarin, dị tố O đẩy electron làm mật độ electron ở H6 và H8 cao hơn mật độ electron tại H5 và H7, nên tín hiệu của proton H6 và H8 dịch chuyển về trường mạnh hơn so với proton H5 và H7. Giữa proton H5 và H6 có tương tác spin - spin tương đương giữa proton H7 và H6, do đó proton H6 sẽ cho tín hiệu doublet - doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,33 ppm (3J1 = 3J2 = 7,5 Hz). Proton H8 tương tác spin - spin với proton H7, do đó tín hiệu doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,39 ppm (3J = 8,0 Hz) được quy kết là của proton H8. Hai tín hiệu còn lại ở trường yếu hơn là của proton H5 và proton H7. Proton H5 tương tác spin - spin với proton H6 và H7 nên tín hiệu thu được là doublet - doublet. Như vậy, độ chuyển dịch δ = 7,70 ppm (3J = 7,5 Hz, 4J = 1,0 Hz) với cường độ tương đối bằng 1 là của proton H5. Cuối cùng tín hiệu doublet – doublet - doublet với độ chuyển dịch δ = 7,50 ppm. (3J1 = 7,5 Hz, 3J2 = 8,0 Hz, 4J = 1,0 Hz) được quy kết là của proton H7. Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất (2) III.1.3 Tổng hợp 3-aminocoumarin (3) 3-Aminocoumarin được tổng hợp theo phương pháp mà tài liệu [12] đã mô tả. III.1.3.1 Phương trình phản ứng O H N O CH3 O H2O O NH2 O CH3COOH+ + (3) HCl III.1.3.2 Cơ chế phản ứng Theo tài liệu [5, tr 678] , quá trình thủy phân amide (2) thành amine trong môi trường acid xảy ra qua 5 giai đoạn: Giai đoạn 1: quá trình proton hóa của oxygen carbonyl tạo cation trung gian bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng. Vai trò của proton trong giai đoạn này là proton hóa oxygen của nhóm carbonyl, làm tăng tính electrophile của carbon carbonyl. OH N O CH3 O (2) O HH H O H N O CH3 O H + H2O O H N O CH3 O H O H N O CH3 O H O H N O CH3 O H Giai đoạn 2: phân tử nước đóng vai trò là tác nhân nucleophile tấn công vào carbon carbonyl. O H N O CH3 O H O HH O H N O CH3 O H O H H Giai đoạn 3: sự chuyển vị proton giữa oxi và nitơ trong môi trường acid. O H N O CH3 O H O H H O H2 N O CH3 O H O H Giai đoạn 4: phân cắt liên kết C-N tạo thành sản phẩm amine. O H2 N O CH3 O H O H O O NH2 O CH3 O H H+ Giai đoạn 5: nguyên tử nitơ của amine với cặp electron tự do đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào acid để lấy proton, chuyển amine thành ion NH3+ bền vững trong môi trường acid. O O NH2 O CH3 O H H O O NH3 O CH3 O H+ III.1.3.3 Nghiên cứu cấu trúc III.1.3.3.1 Phổ hồng ngoại của (3) Trên phổ IR của hợp chất (3) xuất hiện hai pic hấp thụ ở 3428 cm-1 và 3329 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết N-H (đối xứng và bất đối xứng) trong nhóm NH2, pic hấp thụ ở 1709 cm-1 là của liên kết C=O lacton. Khi so sánh phổ của (3) với (2) thấy đã có sự thay đổi (xem bảng 3.1). Bảng 3.1 So sánh phổ IR của hợp chất (2) và (3) Hợp chất Tần số dao động (cm-1) N-H C=O (2) 3331 1709 (C=O lacton) 1682 (C=O amide) (3) 3428 3329 1709 (C=O lacton) Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của hợp chất (3) III.1.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của hợp chất (3) Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 7 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối 2 : 1 : 2 : 1 : 1 phù hợp với cấu trúc dự đoán của (3). Tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 2 và độ chuyển dịch δ = 5,70 ppm là tín hiệu của proton H9 trong nhóm amine. Tín hiệu của proton trong nhóm N-H ở hợp chất (3) đã dịch chuyển về trường mạnh hơn so với hợp chất (2). Điều này xảy ra là do trong hợp chất (3) đã mất đi nhóm C=O là nhóm rút electron kế cận nhóm N-H, vì thế mật độ electron tại N-H trong hợp chất (3) cao hơn mật độ electron tại N-H trong hợp chất (2). Một tín hiệu singlet nữa với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 6,71 ppm được quy kết là của proton H4. So với hợp chất (2) tín hiệu của proton H4 trong hợp chất (3) đã chuyển dịch về trường mạnh hơn. Trong hợp chất (2) và (3), proton H4 đều bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng +R của nhóm N-H và hiệu ứng –R của nhóm C = O lacton, nhưng tại (2) hiệu ứng +R còn ảnh hưởng lên nhóm C=O amide làm cho mật độ electron bị giải tỏa bớt nên tín hiệu phổ dịch chuyển về trường yếu; còn tại (3) hiệu ứng +R chỉ tập trung vào H4 làm mật độ eletron tăng lên, vì thế mà tín hiệu phổ của H4 dịch chuyển về trường mạnh. Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện cụm tín hiệu trong khoảng 7,18÷7,42 ppm là vùng tín hiệu đặc trưng cho các proton của vòng thơm. Tín hiệu doublet - doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,41 ppm (3J = 7,0 Hz, 4J = 2,0 Hz) ứng với proton H5. Tín hiệu doublet - doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,27 ppm (3J = 8,5 Hz, 4J = 2,0 Hz) ứng với proton H8. Tín hiệu multiplet với cường độ tương đối bằng 2 và độ chuyển dịch δ = 7,21 ppm được quy kết là proton (H6, H7). Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất (3) III.2 TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA 3-AMINOCOUMARIN III.2.1 Tổng hợp 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) III.2.1.1 Phương trình phản ứng O O NH2 + C6H5NCS O H N H N S O (4)(3) III.2.1.2 Cơ chế phản ứng Theo tài liệu [6, tr 1143], phản ứng giữa (3) và phenyl isothiocyanate xảy ra theo cơ chế cộng nucleophile. Nguyên tử nitơ trong nhóm –NH2 đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào carbon electrophile của phenyl isothiocyanate. Sau đó là sự chuyển vị của proton để tạo thành sản phẩm (4). O O NH2 + O H2 N N S O (3) N S O H N H N S O (4) III.2.1.3 Nghiên cứu cấu trúc III.2.1.3.1 Phổ hồng ngoại của (4) Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của hợp chất (4) Trên phổ IR của hợp chất (3) xuất hiện các pic hấp thụ ở 3335 cm-1 và 3308 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết N-H, pic hấp thụ ở 1686 cm-1 là của liên kết C=O lacton. Ngoài ra còn có dao động hóa trị của liên kết C=C thơm ở tần số 1636 cm-1 và 1584 cm-1, của C-H thơm ở tần số 3061 cm-1. III.2.1.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của hợp chất (4) Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của hợp chất (4) Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 12 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối 1 : 4 : 3 : 1 : 1 : 1 : 1 phù hợp với cấu trúc dự đoán của (4). Hai tín hiệu singlet ở vùng trường yếu với cường độ tương đối đều bằng 1 là tín hiệu của proton H9 và H10. Proton H9 nằm cạnh vòng coumarin nên mật độ electron sẽ bị giải tỏa nhiều hơn so với proton H10. Vì vậy, proron H9 sẽ cho tín hiệu ở trường yếu hơn proton H10. Do đó, tín hiệu singlet ứng với độ chuyển dịch δ = 10,60 ppm là của proton H9, tín hiệu singlet với độ chuyển dịch δ = 9,60 ppm là của proton H10. Do proton H4 không tương tác spin - spin với bất kỳ proton nào nên tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 9,14 ppm được quy kết là của H4. Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện cụm tín hiệu trong khoảng 7,18 ÷ 7,73 ppm là vùng tín hiệu đặc trưng cho proton của vòng thơm. Do proton H13 tương tác spin - spin với proton H12 và H14 là hai proton tương đương nhau nên sẽ cho tín hiệu triplet. Như vậy, tín hiệu triplet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,20 ppm (3J = 7,5 Hz) được quy kết là của proton H13. Trong vòng coumarin, dị tố O đẩy electron làm cho mật độ của electron tại H6 và H8 cao hơn mật độ electron tại H5 và H7. Nguyên tử nitơ tại vị trí 10 cũng cho electron, làm mật độ electron tại H11 và H15 cao hơn mật độ electron tại H12 và H14. Do đó tín hiệu của proton H6, H8, H11, H15 sẽ dịch chuyển về trường mạnh hơn so với proton H5, H7, H12, H14. Tín hiệu multiplet với cường độ tương đối bằng 4 và độ chuyển dịch δ = 7,39 ppm được quy kết là của proton H6, H8, H11, H15. Khi so sánh phổ 1H-NMR của hợp chất (4) với phổ của hợp chất (2) ta quy kết được tín hiệu doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,72 ppm (3J = 8,0 Hz) là tín hiệu của proton H5. Tín hiệu multiplet còn lại với cường độ tương đối bằng 3 và độ chuyển dịch δ = 7,54 ppm là tín hiệu của proton H7, H12 và H14. III.2.2 Tổng hợp các hợp chất N-(coumarin-3-yl)carbonamide III.2.2.1 Phương trình phản ứng O O NH2 Cl R O + O O H N R O (5a-b) 5a: R=OCH2CH3 5b: R=C(CH3)3 (3) III.2.2.2 Cơ chế phản ứng Phản ứng giữa (3) và carbonyl chloride để tạo thành amide (5a-b) xảy ra theo cơ chế cộng nucleophile vào hợp chất carbonyl với hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Nguyên tử nitơ trong nhóm –NH2 đóng vai trò tác nhân nucleophile tấn công vào carbon carbonyl mang một phần điện tích dương. Đây là giai đoạn chậm quyết định tốc độ phản ứng. Giai đoạn 2: Quá trình tách nguyên tử clo và loại proton H+ tạo sản phẩm cuối cùng. O NH2 O Cl R O + O H2 N O R O Cl O H2 N O R O -Cl- -H O H N O R O (3) (5a-b) III.2.2.3 Nghiên cứu cấu trúc III.2.2.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) Trên phổ IR của cả hai hợp chất (5a, 5b) (xem ví dụ ở hình 3.7) đều cho một pic hấp thụ ở trên 3300 cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết N-H. Hợp chất (5b) cho các pic hấp thụ đặc trưng cho các liên kết C=O ở 1717 cm-1 và 1678 cm-1, tương tụ như amide (2). Trong khi đó, do ảnh hưởng của nhóm -OC2H5, tín hiệu cúa các nhóm C=O trong hợp chất (5a) đều chuyển về tần số cao, tương ứng là 1728 cm-1 và 1712 cm-1. Ngoài ra, trên phổ IR của các hợp chất (5a, 5b) đều còn các pic hấp thụ trong khoảng 2850-2950 cm-1 ứng với dao động hóa trị của liên kết Csp3-H. Một số pic hấp thụ tiêu biểu của các hợp chất (5a, 5b) có so sánh với hợp chất (2) được biểu diễn ở bảng 3.2 Bảng 3.2 So sánh phổ IR của hợp chất (5a-b) và (2) Hợp chất R Tần số dao động (cm-1) N-H C = O Csp3-H 2 -CH3 3331 1709 1682 2933 5a -OC2H5 3383 1728 1712 2982 2960 5b -C(CH3)3 3418 1717 1678 2967 2872 Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của hợp chất (5a) III.2.2.3.2 Phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR)  Phổ 1H-NMR của hợp chất ethyl (coumarin-3-yl)carbamate. Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 11 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối 3 : 2 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 phù hợp với cấu trúc dự đoán của (5a). Trong vùng trường mạnh có một tín hiệu triplet với cường độ tương đối bằng 3 và độ chuyển dịch δ = 1,25 ppm (3J = 7,2 Hz) được quy kết là tín hiệu của proton H11 của nhóm methyl. Proton H11 tương tác spin - spin với hai proton H10 là hai proton tương đương. Theo quy tắc (n+1) tín hiệu thu được trên phổ ở dạng triplet. Một tín hiệu quartet với cường độ tương đối bằng 2 và độ chuyển dịch δ = 4,17 ppm (3J = 7,2 Hz) là tín hiệu của proton H10 của nhóm metylen. Proton H10 tương tác spin-spin với 3 proton H11 là các proton tương đương nên tín hiệu phổ thu được là quartet [theo quy tắc (n+1)]. Trong vùng trường yếu có hai tín hiệu singlet: một tín hiệu với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 8,98 ppm là tín hiệu của proton H9, một tín hiệu khác với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 8,23 ppm là tín hiệu của proton H4. Hai tín hiệu này đều ở dạng singlet là do cả proton H9 và proton H4 đều không tương tác spin - spin với proton nào. Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện cụm tín hiệu trong khoảng 7,31÷7,70ppm là vùng tín hiệu đặc trưng cho proton của vòng thơm. Trong vòng coumarin, dị tố O đẩy electron làm mật độ electron ở H6 và H8 cao hơn mật độ elctron tại H5 và H7, nên tín hiệu của proton H6 và H8 dịch chuyển về trường mạnh hơn so với proton H5 và H7. Proton H6 tương tác spin - spin với proton H5, H7 và H8, do đó proton H6 sẽ cho tín hiệu doublet – doublet - doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,33 ppm (3J1 = 7,5 Hz, 3J2 = 8,0 Hz, 4J = 1,2 Hz). Proton H8 tương tác spin - spin với proton H7 và proton H6, đáng lẽ tín hiệu phải ở dạng doublet - doublet, nhưng có lẽ do độ phân giải của máy chưa đủ lớn nên ta chỉ quan sát được tín hiệu doublet. Do đó tín hiệu doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,38 ppm (3J = 8,0 Hz) được quy kết là của proton H8. Hai tín hiệu còn lại ở trường yếu hơn là của proton H5 và proton H7. Proton H5 tương tác spin - spin với proton H6 và H7 nên tín hiệu thu được là doublet - doublet. Như vậy, độ chuyển dịch δ = 7,69 ppm (3J = 7,5 Hz, 4J = 1,5 Hz) ứng với proton H5. Cuối cùng tín hiệu doublet - doublet - doublet với độ chuyển dịch δ = 7,49 ppm (3J1 = 3J2 = 8,0 Hz, 4J = 1,5 Hz), cường độ tương đối bằng 1 ứng với proton H7. Hình 3.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất (5a)  Phổ 1H-NMR của hợp chất N-(coumarin-3-yl)pivalamide Về cường độ tín hiệu, trên phổ 1H-NMR cho thấy có tổng cộng 15 proton được tách thành các tín hiệu với cường độ tương đối 9 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 phù hợp với cấu trúc dự đoán của (5b). Trong vùng trường mạnh xuất hiện một tín hiệu singlet với cường độ tương đối bằng 9 và độ chuyển dịch δ = 1,25 ppm là tín hiệu của proton H10 trong nhóm methyl. Trong vùng trường yếu có hai tín hiệu singlet một tín hiệu với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 8,62 ppm là tín hiệu của proton H9, một tín hiệu khác với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 8,51 ppm là tín hiệu của proton H4. Hai tín hiệu này đều ở dạng singlet là do cả proton H9 và proton H4 đều không tương tác spin - spin với proton nào. Trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện cụm tín hiệu trong khoảng 7,34÷7,73 ppm là vùng tín hiệu đặc trưng cho proton của vòng thơm.Trong vòng coumarin, dị tố O đẩy electron làm mật độ electron ở H6 và H8 cao hơn mật độ elctron tại H5 và H7, nên tín hiệu của proton H6 và H8 dịch chuyển về trường mạnh hơn so với proton H5 và H7. Proton H6 tương tác spin - spin với proton H5, H7 và H8, do đó proton H6 sẽ cho tín hiệu doublet - doublet - doublet với độ chuyển dịch δ = 7,36 ppm (3J1 = 3J2 = 7,5 Hz, 4J = 1,0 Hz). Proton H8 tương tác spin - spin với proton H7 và proton H6, đáng lẽ tín hiệu phải ở dạng doublet - doublet, nhưng có lẽ do độ phân giải của máy chưa đủ lớn nên ta chỉ quan sát được tín hiệu doublet. Do đó tín hiệu doublet với cường độ tương đối bằng 1 và độ chuyển dịch δ = 7,42 ppm (3J = 8,5 Hz) được quy kết là của proton H8. Hai tín hiệu còn lại ở trường yếu hơn là của proton H5 và proton H7. Proton H5 tương tác spin - spin với proton H6 và H7 nên tín hiệu thu được là doublet - doublet. Như vậy, độ chuyển dịch δ = 7,72 ppm (3J = 8,0 Hz, 4J = 1,5 Hz) ứng với proton H5. Cuối cùng tín hiệu doublet – doublet - doublet với độ chuyển dịch δ = 7,52 ppm (3J1 = 7,5 Hz, 3J2 = 8,0 Hz, 4J = 1,5 Hz), cường độ tương đối bằng 1 ứng với proton H7. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất (5a) và (5b) cho phép chúng tôi kết luận rằng các dẫn xuất amide của 3-aminocoumarin đã được tổng hợp thành công. Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của hợp chất (5b) III.2.2.3.3 Phổ HR-MS của hợp chất (5a) Chúng tôi chọn (5a) (C12H11NO4, M = 233,0688) làm đại diện cho các dẫn xuất amide của 3-aminocoumarim để khảo sát phổ HR-MS. Trên phổ HR - ESI MS xuất hiện pic ion phân tử (M + H) và các pic [(M + H) + 1], [(M + H) + 2], [(M + H) + 3] như dự kiến, cụ thể như sau: (M + H) là 234,0761 (100%), [(M + H) + 1] là 235,0793 (13,64%), [(M + H) + 2] là 236,0815 (1,68%), [(M + H) + 3] là 237,0840 (0,15%). Hình 3.10: Phổ HR-MS của hợp chất (5a) III.3 TÓM TẮT KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHỔ HỒNG NGOẠI VÀ PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ PROTON CỦA CÁC HỢP CHẤT Kết quả phân tích phổ IR và phổ 1H-NMR được tóm tắt ở bảng 3.3 và 3.4 Bảng 3.3 Tính chất vật lý và một số pic hấp thụ tiêu biểu trên phổ IR của các hợp chất đã tổng hợp Hợp chất Màu sắc, trạng thái Nhiệt độ nóng chảy (0C) Hiệu suất (%) Phổ IR (ν, cm-1) N-H C-H C = O C = C thơm 1 Chất rắn, màu trắng 205-207 85,5 - - - - 2 Hình kim, màu cam 203 50,7 3331 3093 2930 1709 1682 1605 3 Hình kim, màu trắng 127 55 3428 3329 3024 3060 1709 1589 4 Hình kim, vàng nhạt 204,8- 205,2 33,4 3335 3308 3061 1686 1584 5a Chất rắn, màu trắng 119-119,3 74,5 3383 3086 2982 2961 1728 1712 1636 1600 5b Chất rắn, màu trắng 124,1- 124,4 40,8 3418 2967 2872 1717 1678 1609 Bảng 3.4 Tín hiệu trên phổ 1H-NMR của các hợp chất O O H N 45 6 7 8 9 R (3) O H N H N S O (4) 45 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 O O H N O R 45 6 7 8 9 10 (2,5a,5b) Vị trí Tín hiệu [δ (ppm), J(Hz)] (2) R=CH3 10 (3) (4) (5a) R=O-CH2-CH3 10 11 (5b) R=C(CH3)3 10 4 8,61 (1H), s 6,71 (1H), s 9,14 (1H), s 8,23 (1H), s 8,51 (1H), s 5 7,70 (1H), d-d, 3J = 7,5; 4J = 1,0 7,41 (1H), d-d, 3J = 7,0; 4J = 2,0 7,72 (1H), d, 3J = 8,0 7,69 (1H), d-d, 3J = 7,5; 4J = 1,5 7,72 (1H), d-d, 3J = 8,0; 4J = 1,5 6 7,33 (1H), d-d, 3J1 = 3J2 = 7,5 7,21; m 7,39; m 7,33 (1H), d-d-d, 3J1 = 7,5; 3J2 = 8,0; 4J = 1,2 7,36 (1H), d-d-d, 3J1 = 3J2 = 7,5; 4J = 1,0 7 7,50 (1H), d-d-d, 3J1 = 7,5; 3J2 = 8,0; 4J = 1,0 7,21; m 7,54; m 7,49 (1H), d-d-d, 3J1 = 3J2 = 8,0; 4J = 1,5 7,52 (1H), d-d-d, 3J1 = 7,5 3J2 = 8,0; 4J = 1,5 8 7,39 (1H), d, 3J = 8,0 7,27 (1H), d-d, 3J = 8,5; 7,39, m 7,38 (1H), d, 3J = 8,0 7,42 (1H), d, 3J = 8,5 4J = 2,0 9 9,76 (1H), s 5,70 (1H), s 10,60 (1H), s 8,98 (1H), s 8,62 (1H), s 10 2,17 (3H), s - 9,60 (1H), s 4,17 (2H), q, 3J = 7,2 1,25 (9H), s 11 - - 7,39; m 1,25 (3H), t, 3J = 7,2 - 12, 14 7,54; m 13 - - 7,20 (1H), t, 3J = 7,5 - - 15 - - 7,39; m - - III.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DẪN XUẤT CỦA 3-AMINOCOUMARIN. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất (4), (5a), và (5b) với hai chủng vi khuẩn là Escherichia coli và Bacillus subtilis. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5 Đường kính vô khuẩn [(D-d), mm] Nồng độ Vi khuẩn 4 5a 5b 1% Escherichia coli - 4 - Bacillus subtilis - 4 - 2% Escherichia coli 6 6 - Bacillus subtilis 4,5 7 - Dựa vào bảng trên cho thấy khả năng kháng khuẩn của hợp chất (5a) với cả hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis là tương đương nhau ở cả hai nồng độ 1% và 2%. Hợp chất (4) chỉ có tính kháng ở nồng độ 2%, trong đó tính kháng với Escherichia coli mạnh hơn Bacillus subtilis. Hợp chất (5b) lại không thấy có tính kháng với chủng vi khuẩn nào trong hai chủng vi khuẩn đã khảo sát. CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Từ acetylglycine, chúng tôi tiến hành tổng hợp ra 3-acetylaminocoumarin (2) và tổng hợp thành công 3-aminocoumarin (3). Tiếp tục chuyển hóa (3) với phenyl isothiocyanate tạo hợp chất thiourea (4), với các carbonyl chloride tạo hai dẫn xuất amide chứa dị vòng coumarin (5a, 5b). Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp được 6 chất gồm: • Acetylglycine (1) • 3-Acetylaminocoumarin (2) • 3-Aminocoumarin (3) • 1-(Coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) • Ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) • N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b) Trong đó, các hợp chất (4), (5a), (5b) chưa thấy trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo. Các hợp chất (1), (2), (3) có nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ proton phù hợp với các tài liệu tham khảo đã công bố. Tất cả các chất đều đã được xác định các tính chất vật lý (nhiệt độ nóng chảy, trạng thái, màu sắc, dung môi kết tinh...) và phân tích cấu trúc phân tử bằng các phương pháp phổ IR, 1H-NMR, HR-MS, từ đó cho phép chúng tôi kết luận các chất trên đã được tổng hợp thành công Kết quả thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của ba dẫn xuất của 3-aminocoumarin cho thấy hợp chất (4) và (5a) có khả năng kháng Escherichia coli và Bacillus subtilis ở mức độ yếu. Kết quả khảo sát cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất (4), (5a), (5b) vẫn còn yếu, do đó chúng tôi dự kiến chuyển hóa 3-aminocoumarin theo các hướng khác nhằm tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn. Một trong các hướng đang được chúng tôi khảo sát là chuyển hóa (5a) với hydrazine để tạo ra dẫn xuất hydrazide, sau đó ngưng tụ với các aldehyde thơm để tạo thành các dẫn xuất N- thế. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Tiến Công (2009), các phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB ĐHSPTPHCM. [2]. Abdul Amir H. kadhum, Abu Bakar mohamad, Ahmed A. Al-Amiery and Mohd S. Takriff (2011), "Antimicrobial and Antioxidant Activities of New Metal Complexes Derived from 3-Aminocoumarin", molecules, 16, 6969-6984. [3]. Aoife Lacy and Richard O'kennedy (2004), "Studies on Coumarins and Coumarin-Related compounds to Determine their Therapeutic Role in the Treatment of Cancer", Current Pharmaceutical, 10(30), 3797-3811. [4]. Arun Sethi (2003), Systematic Lab Experiments in Organic Chemistry, New Age International Publishers. [5]. Christopher S. Foote, Brent L. Veron, Eric V. Anslyn (2010), Organic Chemitry, Cengage Learning. [6]. Joseph M. Hornback (2006), Organic Chemistry, Thomson Learning. [7]. Lal Dhar S. Yadav, Santosh Singh, Vijai K. Rai (2009), "A one-pot [Bmim]OH-mediated Synthesis of 3-benzamidocoumarins", Tetrahedron Letters, 50, 2208-2212. [8]. M. A. Al-Haiza, M. S. Mostafa and M. Y. El-Kady (2005), "Preparation of Some New Coumarin Derivatives with Biological Activity", Scientific Journal of King Faisal University (Basic and Applied Sciences), 6(1), 75-94. [9]. M. Iqbal Choudhary (2009), Frontiers in Medicinal Chemistry, Bentham Science Publishers Ltd. [10]. Muhammed Abd Khadom (2007), "Prepartion of Some New Coumarin Derivatives with Measuring Biological Activity", J. of Al-Anbar University for Pure Science, 1(3), 52-57. [11]. Rao S Bezwada (2008), Chemistry of coumarins, INDOFINE Chemical Company. [12]. V Maddi, SN Mamledesai, D Satyanarayana, S Swamy (2007), “Synthesis and Antiinflammatory Activity of Substituted (2-oxochromen-3- yl)benzamides”, Indian journal of Pharmaceutical Sciences, 69(6), 847-849. Phụ lục 1: Phổ IR của hợp chất 3-acetylaminocoumarin (2) P H Ụ L Ụ Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3-acetylaminocoumarin (2) Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR (giãn rộng) của hợp chất 3-acetylaminocoumarin (2) Phụ lục 4: Phổ IR của hợp chất 3-aminocoumarin (3) Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3-aminocoumrin (3) Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR (giãn rộng) của hợp chất 3-aminocoumarin (3) Phụ lục 7: Phổ IR của hợp chất 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) Phụ lục 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR (giãn rộng) của hợp chất 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) Phụ lục 10: Phổ IR của hợp chất ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR (giãn rộng) của hợp chất ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) Phụ lục 13: Phổ HR-MS của hợp chất ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) Phụ lục 14: Phổ IR của hợp chất N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b) Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR của hợp chất N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b) Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR (giãn rộng) của hợp chất N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b)