Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng kỹ thuật RT - Pcr để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

này có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu. Có nhiều loại DNA polymerase Sử dụng cho phản ứng PCR. Nhìn chung, các DNA polymerase có chung đặc điểm là chịu nhiệt, không bị biến tính hay bị huỷ ở nhiệt độ biến tính DNA. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR Dung dịch đệm bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl, MgCl2, gelatin. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tùy thuộc vào loại DNA polymerase. Trong thành phần dung dịch đệm cho phản ứng PCR đôi khi người ta bổ sung MgCl2 ở nồng độ 0.5 – 5.0 mM. Dung dịch đệm có vai trò trong việc tạo sự kết hợp giữa các dNTP, kích hoạt DNA polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR. 2.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao. 14 Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, sống ở các suối nước nóng. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus themophilus có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mạch RNA khuôn và ion Mg++, nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và Mg++, Tth polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Primer và nhiệt độ lai Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR. Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Việc lựa chọn primer cần tuân theo một số nguyên tắc sau: - Trình tự primer được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi. - Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không nên cách nhau quá xa. Thành phần các nucleotide của các mồi cần cân bằng, tránh các cặp G – C lặp đi lặp lại quá nhiều lần. - Các mồi được chọn cần phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gene. - Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3 kb và chiều dài lý tưởng là nhỏ hơn 1 kb. Các thành phần khác của phản ứng PCR - Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. - Nồng độ ion Mg++ cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 15 2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR Thiết bị quan trọng nhất dùng cho phương pháp PCR là máy luân nhiệt. Yêu cầu quan trọng nhất của thiết bị này là việc thay đổi nhiệt độ phải diễn ra nhanh và chính xác. Ngoài ra, các eppendorf dùng cho phản ứng phải cùng một kiểu. 2.4. Phƣơng pháp RT - PCR RT-PCR ( reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA; sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA. 2.4.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy thuộc vào mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết vào nhiều vị trí trên mRNA 2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngƣợc Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược vào năm 1970 đã giải thích tại sao bộ gene RNA của virus tạo khối u có thể chuyển thành dạng DNA trong tế bào bị nhiễm. Ngày nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp cDNA invitro tương ứng với RNA mẫu. 16 Enzyme phiên mã ngược của avian myeloblastosis virus (AMV) và dòng Moloney của virus murine leukemia (Mo-MLV). Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi primer sử dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có nhóm 3’ OH. Loại enzyme này không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease. Khi sử dụng loại enzyme này đòi hỏi trong phản ứng phải có nồng độ dNTP cao. - Enzyme được mã hóa bởi AMV, có hoạt tính RNase nên có thể cắt nửa phần của RNA-DNA và có thể dính chặt vào đầu 3’ của sợi DNA nếu phản ứng phiên mã ngược bị dừng lại giữa chừng trong quá trình tổng hợp (dẫn liệu từ Rotawicz và cộng sự,1988).Vì vậy sự hoạt động ở mức độ cao của RNase H cùng với việc phiên mã ngược có xu hướng ngặn chặn việc tạo ra cDNA và làm giảm chiều dài của nó. - Enzyme murine phù hợp cho RT-PCR hơn vì hoạt tính RNase của nó yếu hơn. Tuy nhiên, Mo-MLV sẽ hoạt động tối ưu ở điều kiện nhiệt độ thấp (370C) hơn so với enzyme AMV (420C), chính đặc điểm này làm cho Mo-MLV không thuận lợi trong các phản ứng mà RNA có nhiều cấu trúc bậc hai. Những dạng biến thể của enzyme phiên mã ngược Mo-MLV không có hoạt tính RNase: nhiều dạng enzyme loại này đã được thương mại hóa, chúng có thể được sử dụng để biến đổi một lượng mẫu lớn và tổng hợp cDNA dài hơn so với các dòng hoang dại ( dẫn liệu từ Gerard và cộng sự. 1988). Thêm vào đó, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao (trên 500C), điều này sẽ thuận lợi khi RNA có nhiều cấu trúc bậc hai. Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus. Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có sự hiện diện của Mn2+ (Myers và Gelfand, 1991. dẫn liệu). Đặc điểm thuận lợi của loại enzyme này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube phản ứng . Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1- 2 kb, thêm vào đó việc sử dụng Mn2+ trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp cDNA có độ đặc hiệu thấp. Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT và random hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại đó enzyme phiên mã ngược hoạt động. 17 2.4.3 Các primer trong phiên mã ngƣợc Có ba loại primer thường được sử dụng cho quá trình phiên mã ngược của phản ứng RT-PCR. Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là thường tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’. Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược, primer oligo T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Mồi oligo T thường được sử dụng như là một “mồi phổ dụng” cho việc tổng hợp ra một cDNA thông thường. Oligonucleotide antisense: Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình tự đích đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên, khi sử dụng oligonucleotide làm mồi cho quá trình phiên mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết kế sao cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của oligonucleotide sử dụng làm primer cho việc tổng hợp cDNA. Random hexanucleotide: Loại primer này thường được sử dụng khi mRNA đích có kích thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai. Khi đó việc tổng hợp cDNA không thể được thực hiện một cách hiệu quả bằng cách sử dụng mồi oligo dT hay mồi oligonucleotide antisense (Lee và Caskey, 1990, dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 13). Trong đa số các trường hợp sử dụng kỹ thuật RT-PCR những primer oligonucleotide antisense được thiết kế để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của mRNA đích là những primer được ưu tiên chọn lựa. Primer oligo dT là lựa chọn tốt nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn cuối cùng vì random hexamer thường không đặc hiệu và tạo ra cDNA có kích thước không đồng đều, chúng thường được sử dụng khi các primer trước sử dụng không thành công. 18 Ly trích/tách chiết RNA AA(A)n Tổng hợp cDNA Primer đặc hiệu Primer oligo dT Random hexamer primer AA(A)n AA(A)n GSP AA(A)n Oligo dT N6 N6 AA(A)n AA(A)n AA(A)n Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR AA(A)n AA(A)n AA(A)n Primer xuôi Primer xuôi Primer xuôi AA(A)n AA(A)n AA(A)n Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR Primer ngược Primer xuôi Tiếp tục chu kỳ nhiệt Sơ đồ 2.1. Quá trình hoạt động của các primer trong phiên mã ngược(13) 19 Phần III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp kéo dài từ ngày 01/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu Xây dựng quy trình RT-PCR phát hiện virus PRRS từ ba nguồn Taq khác nhau. Xây dựng quy trình điện di để phát hiện RNA tổng số. Ly trích RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh của heo nghi nhiễm PRRSV bằng cách sử dụng hai phương pháp ly trích theo bộ kit và sử dụng TRIzol. Chẩn đoán virus PRRS từ mẫu thu nhận bằng quy trình RT-PCR đã thiết lập. 3.3. Vật liệu và hoá chất 3.3.1. Mẫu xét nghiệm Mẫu RNA chuẩn được cung cấp từ Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan (Pháp). Mẫu nuôi cấy tế bào (trước đó đã kiểm tra cho kết quả ELISA dương tính) được cung cấp từ Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh: 10 mẫu Mẫu huyết thanh và mẫu phổi được thu nhận từ các trại heo: 71 lượt mẫu. Trong đó mẫu huyết thanh là 41 mẫu, mẫu phổi là 6 mẫu. 3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR Cặp primer theo tác giả Rovira được thiết kế dựa vào trình tự của vùng đọc mở số 7 (ORF7) của virus PRRS giống Olot/91 (Rovira và cộng sự) và được cung cấp bởi công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp. Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau: 20 Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng Tên Trình tự nucleotide (5’ đến 3’) Vị trí trên genome P1 CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 14647 đến 14667 (Lelystad) 2948 đến 2968 (VR2332) P2 GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 14938 đến 14918 (Lelystad) 3248 đến 3228 (VR2332) Rovira 1 CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA Độ dài đoạn gene nhân lên: 400bp Rovira 2 GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC 3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA a. Bộ kit chiết tách RNA của công ty QIAGEN: QIAamp® Viral RNA Mini Kit b. Vật liệu và hóa chất trong phương pháp Sử dụng TRIzol - Chất phản ứng TRIzol (Tripure Isolation Reagent, Boehringer Mannheim) - Chloroform - Glycerol - Isopropanol - Ethanol 75 % - Nước cất hai lần khử ion và khử RNase bằng cách xử lý với DEPC (diethyl pyrocarbonate) 3.3.4. Vật liệu và hóa chất điện di RNA - Gel biến tính - Dung dịch biến tính và đặt mẫu - Dung dịch MOPS dùng cho điện di RNA 3.3.5. Vật liệu và hóa chất sử dụng cho RT-PCR - Nước không có RNase - TaqBeat ™ Hot Start Polymerase wax beads (Promega) - Taq polymerase (Biorad) - Taq DNA Polymerase (ABgene) - dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Promega ) - Cặp mồi - RNA mẫu chuẩn 21 - RNA thu được từ mẫu ly trích - AMV reverse transcriptase (Promega) - MgCl2 (Promega) - Recombinant RNasin ® Ribonuclease Inhibitor (Promega) - Reverse transcription 10X buffer (Promega) 3.3.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT - PCR - Agarose (Biorad) - TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, Nước cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng) - Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE) - Ladder 100bp - Ethidium bromide 3.4. Thiết bị và dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C) - Tủ -700C ( Sanyo Ultra Low) - Tủ - 200C ( CFC Free Sanyo Brandt) - Tủ mát 40C - Máy vi sóng (Electrolux) - Máy chụp gel (Biorad) - Máy PCR (BioRad) - Máy vortex - Bộ nguồn và bồn điện di - Micropipet, đầu tip và eppendorf 3.5. Các phƣơng pháp 3.5.1. Bảo quản mẫu dịch nuôi cấy tế bào Quá trình nuôi cấy tế bào giúp gia tăng số lượng virus nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ly trích và thu nhận RNA. Dịch nuôi cấy tế bào được thu nhận từ Trung Tâm Thú Y Vùng sau khi rã đông nhiều lần để giải phóng virus ra khỏi tế bào nuôi cấy. Dịch nuôi cấy được giữ ở -700C cho đến khi tiến hành quá trình ly trích. 22 3.5.2. Chuẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh Mẫu máu được thu nhận từ những heo có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm virus PRRS (sẩy thai, heo con sinh ra chết). Sau đó, mẫu máu được để đông tự nhiên và thu lấy phần huyết thanh bên trên. Phần huyết thanh được trữ đông ở -700C cho đến khi ly trích. 3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus từ huyết thanh và từ dịch nuôi cấy tế bào theo TRIzol Bước 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào - Cho 100 l huyết thanh/dịch nuôi cấy tế bào vào ống eppendorf, sau đó cho thêm 1 ml chất phản ứng TRIzol vào ống. - Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA - Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để ổn định trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở 40C để phân tách thành các phần khác nhau. Bước 3: Kết tủa RNA - Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào một eppendorf mới. Thêm 0.5ml isopropanol và 1µl glycerol vào eppendorf có chứa dịch thu được. - Vortex để trộn đều, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ phần dịch nổi và thu lấy phần tủa có chứa RNA. Bước 4: Rửa RNA - Cho 500μl ethanol 75 % vào phần tủa, tiến hành đảo nhẹ và đều khắp ống. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. - Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối RNA trong không khí trong 5 đến 10 phút sao cho bốc hơi hết ethanol . Bước 5: Hòa tan RNA - Hoà tan khối RNA trong 10 l nước không có chứa RNase. Giữ ở -200C cho đến khi sử dụng 23 3.5.4. Điện di RNA trên gel biến tính Dung dịch dùng đặt mẫu 2X Dung dịch dùng đặt mẫu là một dung dịch có màu xanh với các thành phần bromophenol blue 0,1 %, EDTA 1,6mM, formaldehyde 0,36M, glycerol 8 %, formamide 12,04 %, FA (formaldehyde agarose) gel buffer 1,6M. Dung dịch này có thể giữ trong 3 tháng ở điều kiện 20C - 80C. Dung dịch điện di Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch MOPS 1M, bao gồm FA gel buffer 1X, formaldehyde 2,5M, nước không có RNase, pH = 7. Chuẩn bị gel biến tính cho quá trình điện di Cân 0,3 g agarose, cho thêm 16 ml nước cất hai lần khử ion đã được xử lý với DEPC, đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường trong khoảng 2,5 phút). Để nguội khoảng 600C, tiếp tục cho vào 4ml FA gel buffer và 360μl formaldehyde 37 – 40 %, lắc đều. Sau đó tiến hành đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc trong khoảng 45 phút, rút lược ra khỏi gel và cho vào dung dịch điện di sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Tiến hành điện di Cho 5 l dịch mẫu thu nhận được sau quá trình ly trích vào 5 l dung dịch buffer biến tính 2X. Ủ hỗn hợp trên trong 5 phút ở 650C Cho nhanh hỗn hợp dung dịch trên vào nước đá trong khoảng 1 phút. Cho 0,5 l ethidium bromide 10 mg/ml vào hỗn hợp trên và để ổn định trong khoảng 1 phút. Đặt mẫu vào gel biến tính đã được cho sẵn vào dung dịch điện di trong 15 phút. Tiến hành quá trình điện di với hiệu điện thế 30 volt cho đến khi buffer đặt mẫu di chuyển khoảng 3/4 gel. Quan sát kết quả điện di dưới tia UV nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad. 24 3.5.5. Kỹ thuật RT-PCR trên RNA của virus Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Trong phản ứng này, đầu tiên mồi Rovira 2 sẽ tiến hành phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ vào enzyme AMV reverse transcriptase, sau đó tiến hành sự khuếch đại đoạn cDNA vừa được tạo ra. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng được trình bày sau đây. Thành phần phản ứng RT-PCR: Thành Phần DDung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối TaqBeat ® Hot Start MgCl2 dNTPs RNAsin ® inhibitor AMV reverse transcriptase Reverse transcriptase buffer Primer Rovira 1 Primer Rovira 2 Nước không chứa RNase RNA mẫu 1,25 U/viên 25 mM 10 mM 20 U/µl 50 U/µl 10 X 5 µM 5 µM 1 viên 2,5 µl 0,75 µl 0,5 µl 0,25 µl 2,5 µl 0.2 µl 0,2 µl 13,1 µl 5.0 µl 1,25 U/viên 2,5 mM 0,3 mM 10 U 12,5 U 1 X 0.04 µM (1 pmol) 0.04 µM (1 pmol) Tổng thể tích 25 µl Ngoài ra, chúng tôi còn thay thế TaqBeat® Hot Start bằng Taq DNA polymerase của công ty Biorad và Taq DNA polymerase của công ty ABgene để chạy cùng một quy trình nhiệt. Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR 25 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR Bảng 3.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR Bƣớc Hoạt động Nhiệt độ Thời gian 1 Phiên mã ngược 480C 30 phút 2 Tiền biến tính 950C 10 phút 3 Biến tính 950C 15 giây 4 Bắt cặp và kéo dài 600C 2 phút 5 lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ 6 Hoàn thành 720C 7 phút 7 Giữ sản phẩm 40C Sau khi thiết kế thành công quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn, chúng tôi đã sử dụng quy trình trên để phát hiện sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu RNA ly trích được. 3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR Hoá chất dùng đặt mẫu vào gel (loading dye) Hóa chất dùng để đặt mẫu vào gel là một dung dịch có màu xanh với các thành phần bromphenol blue (0,25 %), sucrose (40 %), TE vừa đủ. Dung dịch điện di Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch TBE 0,5X, bao gồm Tris HCl (3,94 mg), acid boric (1,39g), Na2EDTA (93,06mg), nước cất vô trùng (500ml). Dung dịch được điều chỉnh đến pH = 8.3 với NaOH 0,1 %. Dung dịch nhuộm gel Dung dịch nhuộm gel gồm có TBE (1X), ethidium bromide (10mg/ml) Chuẩn bị gel cho quá trình điện di Dùng điện di ngang với gel agarose có nồng độ 1 %. Cách chuẩn bị gel như sau: Cân 0,25g agarose, thêm 25ml TBE (0,5X), đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm được mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lược ra khỏi gel và cho vào dung dịch TBE sẵn sàng cho việc đặt mẫu. 26 Tiến hành điện di Trộn dung dịch gồm 10µl mẫu và 2µl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di trong 30 phút với cường độ dòng điện là 250mA và hiệu điện thế 100V. Nhuộm mẫu Sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi buồng điện di và ngâm vào dung dịch ethidium bromide trong khoảng 30 phút. Quan sát kết quả điện di Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, được quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad 27 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả RT - PCR trên mẫu RNA chuẩn của PRRSV 4.1.1. RT-PCR với Taq beat Đầu tiên, để thiết lập quy trình RT-PCR, chúng tôi đã tiến hành phương pháp RT-PCR một bước trên mẫu chuẩn (quy trình đã được mô tả bên trên), sử dụng cặp primer của tác giả Rovira và Taq Beat Hot Start. Kết quả được thể hiện trong hình 4.1. Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq Beat. Ghi chú: Lad: Thang chuẩn Nồng độ gel: 1% Mẫu 1: Mẫu chuẩn Hiệu điện thế: 100V Thời gian điện di: 30 phút Từ kết quả ở hình 4.1 cho thấy cặp mồi Rovira và Taq Beat Hot Start có thể giúp khuếch đại đoạn RNA 400bp giống như đã nói ban đầu. Như vậy, từ kết quả này có thể khẳng định sử dụng TaqBeat™ Hot Satrt polymerase và cặp primer của tác giả Rovira trong việc phát hiện sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong mẫu phân tích. Trong sản phẩm thu được, ngoài băng chính với kích thước mong muốn, chúng tôi còn thấy một băng phụ có kích thước rất nhỏ. Điều này rất thường gặp trong phản ứng PCR. Việc thay đổi các thành phần phản ứng để làm mất băng phụ đòi hỏi phải có thời gian và tiêu tốn nhiều hóa chất cho quá trình thí nghiệm. Do đó chúng tôi chưa có điều kiện để khử đi băng phụ này. Tuy nhiên quy trình này cho kết quả ổn định và có 400bp 500bp Lad 1 28 thể tin cậy được nên chúng tôi đã quyết định sử dụng quy trình này vào việc kiểm tra sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu ly trích sau đó. 4.1.2 RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene Ngoài ra để thử nghiệm khả năng của một số loại Taq khác trong kỹ thuật RT- PCR một bước để phát hiện virus gây bệnh PRRS, chúng tôi đã thực hiện quy trình RT-PCR môt bước giống như trên nhưng thay đổi Taq Beat Hot start bằng Taq polymerase của công ty BioRad và của công ty ABgene (qui trình đã được mô tả bên trên). Kết quả của thử nghiệm này được thể hiện trong hình 4.2. Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của Biorad và ABgene Ghi chú: Giếng 1: Taq polymerase của công ty Biorad Giếng 2: Taq polymerase của công ty ABgene Lad: Thang chuẩn Nồng độ gel: 1% Hiệu điện thế: 100V Thời gian điện di: 30 phút Trên hình 4.2, tất cả các sản phẩm đều có kích thước tương đương 400 bp khi so sánh với thang chuẩn. Từ kết quả trên chúng tôi kết luận hai loại Taq này vẫn có khả năng phát hiện RNA của virus gây bệnh PRRS trong mẫu chuẩn bằng cặp primer Rovira 1 và Rovira 2. Trong hình 4.2, bên cạnh các sản phẩm mong muốn chúng tôi lại thấy xuất hiện một băng phụ rất rõ. Đây là một sai sót rất thường gặp khi thực hiện phản ứng PCR. Nguyên nhân có thể do: - Hoạt lực của enzyme phiên mã ngược bị giảm. 1 2 Lad 400bp 500bp 29 - Nhiều primer nên chúng tự bắt cặp với nhau. - Cặp primer đang sử dụng có độ đặc hiệu không cao đối với tất cả các dòng khác của virus gây bệnh PRRS. - Hàm lượng của một số thành phần trong phản ứng cao: Primer, dNTPs, MgCl2. - Tuy vậy, kết quả trên có thể chấp nhận được và đáng tin cậy. Do vậy, chúng tôi đã sử dụng các loại Taq này để kiểm tra sự hiện diện của RNA virus PRRS trong các mẫu ly trích sau này. 4.2 Kết quả RT - PCR trên mẫu RNA ly trích 4.2.1 RT-PCR với Taq Beat trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng TRIzol Sau khi xây dựng được quy trình RT-PCR trên mẫu chuẩn với Taq Beat™ Hot Start, Taq polymerase của công ty Biorad và công ty ABgene, chúng tôi thực hiện RT- PCR sử dụng Taq Beat Hot Start với RNA ly trích từ 5 mẫu huyết thanh của các heo đã có kết quả ELISA dương tính với virus gây bệnh PRRS. RNA này được chiết xuất theo quy trình Sử dụng TRIzol. Kết quả được thể hiện trên hình 4.3 Ghi chú: Giếng C: mẫu chuẩn Lad: Thang chuẩn Giếng 5, 10, 16, 21, 22: Các mẫu ly trích theo TRIzol Lad: Thang chuẩn Nồng độ gel: 1% Hiệu điện thế: 100 V Thời gian: 30 phút Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo TRIzol. C 10 16 21 22 Lad 5 400bp 30 Kết quả trên hình 4.3 cho thấy mẫu chuẩn có một băng có kích thước 400bp đúng như mong đợi. Tuy nhiên, tất cả các mẫu ly trích đều không cho một sản phẩm khuếch đại nào. Điều này có thể do các mẫu này không có RNA của virus do đó quá trình khuếch đại đã không xảy ra. Tuy nhiên cũng có thể giải thích là do quy trình ly trích bằng TRIzol chưa ổn định nên không thu nhận được RNA của virus. Để chứng minh giả thuyết này, chúng tôi đã tiến hành lại quá trình ly trích bằng TRIzol một lần nữa trên các mẫu ban đầu và một số mẫu khác nhưng vẫn không thu được kết quả dương tính trên mẫu ly trích (kết quả không trình bày). Để đảm bảo có thể thu nhận được RNA của virus nếu chúng có hiện diện trong các mẫu huyết thanh, chúng tôi đã tiến hành quá trình ly trích bằng cách sử dụng bộ kít QIAamp ® Viral RNA Mini Kit. Tuy nhiên kết quả thu được vẫn là âm tính trên các mẫu ly trích khi thực hiện RT-PCR với Taq Beat Hot Start. Điều này có thể do mẫu huyết thanh không có hoặc có rất ít RNA virus. Do đó chúng tôi sử dụng các mẫu đã qua giai đoạn tăng sinh bằng nuôi cấy tế bào và sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit. 4.2.2 Kết quả RT - PCR theo quy trình dùng Taq ABGENE trên các mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào đƣợc ly trích theo bộ kit Ghi chú: Giếng C: mẫu chuẩn Giếng 23, 24, 25, 34, 35: Các mẫu ly trích theo bộ kit Lad: Thang chuẩn 24 400 bp Hình 4.4: Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo bộ kít C 23 25 34 43 24 400 bp 31 Hình 4.5: Sản phẩm điện di RNA sau quá trình ly trích Trong lần này, chúng tôi ly trích RNA từ 5 mẫu dịch nuôi cấy tế bào với kết quả ELISA có phản ứng dương tính với virus PRRS (mẫu 23, mẫu 24, mẫu 25, mẫu 34, mẫu 43). Những mẫu này đã qua ly tâm để loại bỏ phần tủa tế bào. Tiến hành RT- PCR trên các mẫu ly trích và một mẫu chuẩn (mẫu C). Kết quả cho thấy chỉ mẫu chuẩn có một băng dương tính và các mẫu ly trích còn lại không có kết quả. Để đảm bảo sự chính xác của kết quả, chúng tôi tiếp tục ly trích lại bằng bộ kit, tuy nhiên kết quả vẫn là âm tính. Do đó, có thể nhận định rằng các mẫu nuôi cấy và huyết thanh heo không chứa virus PRRS tại thời điểm lấy mẫu. 4.3 Điện di RNA trên mẫu ly trích Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận RNA tổng số, chúng tôi đã tiến hành ly trích theo quy trình sử dụng TRIzol trên mẫu phổi. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5 Trên hình 4.5, theo chúng tôi là hai băng của RNA ribosome trên gel biến tính. Vì không có thang chuẩn có kích thước lớn (5kb) nên chưa thể xác định được đây là hai loại RNA ribosome nào. Tuy nhiên, ở đây chúng tôi chỉ kiểm tra khả năng thu nhận RNA sau quá trình ly trích nên với kết quả này có thể kết luận với quy trình ly trích trong thí nghiệm hoàn toàn có thể thu nhận được RNA nếu có sự tồn tại RNA trong mẫu kiểm tra. Ghi chú: Nồng độ gel: 1,5 % Hiệu điện thế: 30 V 32 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer Trong khi mẩu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS dòng Olot/91 đã được phát hiện một cách ổn định dựa vào kỹ thuật RT-PCR một bước với cặp mồi của tác giả Rovira; quy trình ly trích đã được chứng minh cho hiệu quả cao trong việc ly trích RNA; mẫu xét nghiệm đã qua kiểm tra ELISA cho kết quả dương tính nhưng chúng tôi vẫn chưa phát hiện một mẫu nào có sự hiện diện của virus. Như vậy, bên cạnh việc nghi ngờ trong mẫu xét nghiệm không có sự tồn tại virus gây bệnh PRRS còn có thể do tính đặc hiệu của cặp mồi Rovira đang sử dụng. Do đó chúng tôi đã sử dụng chương trình Blast của trang web httt://www.ncbi.nlm.nih.gov/ để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp primer này. Từ kết quả kiểm tra này cho thấy cặp primer của tác giả Rovira chỉ có khả năng khuếch đại đặc hiệu một loài duy nhất là Olot/91. Các loài khác thì tính đặc hiệu của cặp primer này là rất thấp. Trong khi dó cặp mồi P1, P2 của tác giả Meritxel Donadeu qua kiểm tra cho thấy có khả năng bắt cặp đặc hiệu với RNA của nhiều chủng virus PRRS khác nhau (xem phụ lục). Sử dụng cặp mồi P1, P2 như vậy sẽ làm tăng khả năng phát hiện virus PRRS trong mẫu. 4.5. RT - PCR sử dụng cặp primer p1, p2 Dựa vào kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hai cặp primer, chúng tôi đã thử nghiệm việc sử dụng cặp primer P1, P2 trong phản ứng RT-PCR một bước đã được thiết kế ở trên để phát hiện virus PRRS trong mẫu huyết thanh ly trích (quy trình và thành phần hóa chất tham gia phản ứng giống như quy trình sử dụng cặp primer Rovira). Trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành RT-PCR trên một mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích RNA đã kiểm tra qua quy trình RT-PCR sử dụng cặp mồi theo tác giả Rovira cho kết quả âm tính để dễ dàng so sánh hai cặp primer. Kết quả của thí nghiệm được thể hiện trong hình 4.8. 33 Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primerP1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5 mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol. Ghi chú: Giếng B12, 326, 160, 156, 62: Các mẫu ly trích theo TRIzol Giếng C: mẫu chuẩn Nồng độ gel: 1 % Hiệu điện thế: 100V Thời gian điện di: 30 phút Như vậy kết quả trên hình 4.8 cho thấy mẫu RNA chuẩn có một băng rất đậm và rõ hơn nhiều so với khi sử dụng cặp mồi Rovira, thêm vào đó khi sử dụng cặp mồi P1, P2 không thấy xuất hiện băng phụ như thường thấy khi sử dụng cặp primer của tác giả Rovira. Điều này chứng tỏ độ nhạy và độ đặc hiệu của cặp primer P1, P2 là rất cao. Các mẫu xét nghiệm đều không thấy có sự xuất hiện băng mong muốn. Do đó, dựa vào kết quả cuối cùng này và các kết quả thực hiện trong toàn quá trình thí nghiệm, chúng tôi có thể kết luận trong các mẫu ly trích không có sự hiện diện của virus gây bệnh PRRS. 62 156 B12 160 C 326 34 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Quy trình RT-PCR sử dụng trong nghiên cứu hoàn toàn cho phép phát hiện được RNA của virus PRRS. Quy trình ly trích sử dụng TRIzol hoàn toàn có khả năng thu nhận RNA. Quy trình điện di RNA tổng số có khả năng kiểm tra RNA tổng số sau quá trình ly trích. Tất cả các mẫu đều không tồn tại virus PRRS ở thời điểm lấy mẫu. Sự hiện diện kháng thể kháng virus gây bệnh PRRS trong huyết thanh không đồng nghĩa với việc có sự hiện diện virus trong máu heo có kháng thể. 5.2. Đề nghị Cần hoàn thiện hơn nữa quy trình ứng dụng RT-PCR trong việc phát hiện virus PRRS, khử băng phụ và giảm các thành phần phản ứng nhằm làm giảm giá thành cho một phản ứng xét nghiệm. Thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiện virus gây bệnh PRRS trên các mẫu mới lấy từ thú bệnh trong vòng 24 giờ. Sử dụng song song các cặp mồi Rovira 1,2 và P1, P2 để thực hiện phản ứng RT- PCR phát hiện virus PRRS. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Quách Tuyết Anh, 2003. Một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae trên mẫu bệnh tích phổi heo nhục hoá. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 2. Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện. Một số bệnh mới do virus ở gia súc và gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp, 2002. 3. Lê Quang Nguyên, 2003. Xây dựng quy trình phát hiện virus gây bệnh đầu vàng YHV (Yellow Head Virus) trên tôm xú (Penaeus monodon) dựa trên phương pháp RT- PCR. Luận vặn tốt nghiệp. Khoa Sinh. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu nƣớc ngoài 4. A. Rovira, M. Balasch, J. Segalés, L. Garcia, J. P;ana-durán, C. Rosell, H. Ellerbrok, A. Mankerz, and M.Domingo. 2002. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine respiratory syndrome virus and porcine circovirus. Journal of Virology. Vol.76, No. 7. 5. Brown T.A. Gene cloning an introduction. 3 rd edition, UMIST, Manchester, UK. p. 229 – 249. 6. Chomzynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate- phenol- chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159. 7. Christopher-Hennings J., E. A. Nelson, K. D. Rossow, J. L.Shivers, M. J. Yaeger, C. C. L. Chase, R.A. Gardano, J. E. collins và D. A. Benfield, 1998. Identification of porcine 36 reproduction and respiratory syndrome virus in semen and tissues from vasectomized and nonvasectormized boars. Vet. Pathol. 35: 260 – 267. 8. Donadeu M, Arias M, Gomez-Tejedor C, et al. Using polychainreaction to obtain PRRS-free piglets from endemically infected herd. Swine health prod. 1999; 7(6): 255- 261. 9. Fun In Wang, 1994. Minimal residues of porcine reproduction and respiratory syndrome virus in pig carcases and boar semen. Proc. Natl. Sci. counc. ROC(B). Vol.33, No.4, 1994. PP. 167-174. 10. Horter C. D., Pogranicniy R. M., Cheng chang C., R. B.Evans, Kyong-Jin Yoon, J. J. Jimmerman, 2002. Characteration of the carrier State in Porcine reproduction and respiratory syndrom virus infection. Veterinary Microbiology. 86 (2002) p:213 – 218. 11. Meng X.J., Paul P.S., Halbur P.G., Lum M.A., 1995. Phylogenetic analysis of the putative M (ORF6) and N (ORF7) gene for porcine reproduction and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication of the existense of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 140: 745-55. 12. Prieto C., José M. Castro, 2005. Procine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar: a review. Theriogenology. 63: 1-16.* 13. Sambrook and Russell. 2001. Molecule cloning a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. Vol 2. p8.47- 8.53. 14. Wagstrom E. A., Kyong- Jin Joon, and Jeffrey J Zimmerman,. Diagnostic performance of a RT-PCR test for the detection of porcine reproduction and respiratory syndrome in serum. Iowa State University. ADL-R1602. 37 Các trang web 15. C9-Livestock %209 %20(Kamakawa).pdf 16. 17. 18. 19. 20. 38 PHỤ LỤC  Chuẩn bị môi trƣờng không có RNase và RNA Khi làm việc với RNA, cần phải cẩn thận nhằm tạo ra một môi trường không có RNase. Ribonuclease tồn tại ở khắp nơi. RNase rất bền vững và khó bị bất hoạt. Để thành công, cần phải duy trì một môi trường không có RNase trước và trong khi thực hiện các thao tác tinh sạch và các phân tích sau đó. Sau đây là một số chú ý và kỹ thuật cần ghi nhớ khi làm việc với RNA: 1. Nguồn lây nhiễm RNA thông thường là RNA của da, vi khuẩn và nấm, chúng hiện diện rất nhiều trong bụi và trên các thiết bị. Để ngăn chặn sự nhiễm RNA cần phải mang găng tay trong suốt thời gian làm thí nghiệm và sử dụng các thiết bị vô trùng khi thực hiện các thao tác chiết tách hay phân tích. 2. Sử dụng các thiết bị vô trùng và chỉ sử dụng một lần. Những vật liệu này đòi hỏi phải sạch RNA. 3. Cần xử lý sạch RNA cho các dụng cụ trước khi thực hiện thao tác. Thông qua việc rửa các vật liệu bằng nhựa bằng 0.1N NaOH/1mM EDTA và sau đó với nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate). Những công cụ này cần được sử lý sạch RNase bằng cách ngâm với nước DEPC 0.005% và gia nhiệt bằng cách sấy. 4. Nước cất hai lần khử ion cần được xử lý để đảm bảo không có sự hiện diện của RNase. Có thể kiểm tra điều này bằng cách ủ RNA trong nước mong muốn và sau đó kiểm tra bằng cách điện di. 5. Tất cả các dụng cụ và hoá chất thao tác trên RNA cần được dùng riêng. 6. Việc hấp riêng không có ý nghĩa để bất hoạt RNase. Tất cả các dung dịch trong phòng thí nghiệm đều cần phải được xử lý với DEPC 0.05% bằng cách ủ qua đêm. Tất cả các dịch trên cần phải được hấp trong 30 phút. Thêm nữa là không được sử dụng DEPC chung với những dung dịch đệm có Tris.  Duy trì điều kiện không có RNase trong phản ứng Recombinant Rnasin (a,b) giúp giữ RNA không bị thoái hoá bằng cách ức chế một vài RNase mà không gây trở ngại cho các phản ứng về sau. Bảo vệ RNA trong phản ứng là một điều kiện cho sự thành công của thí nghiệm. RNase inhibitors là một công cụ rất mạnh trong việc duy trì một môi trường không có RNase. Để đảm bảo sự thành công RNase inhibitor cần không gây trở ngại cho các enzyme trong phản ứng. Rnasin® cần sử dụng với tỉ lệ 1:1 với RNase. Những kháng thể ức chế khác có lẽ hiện diện với một tỉ lệ quá nhỏ không đủ sức bảo vệ RNA trong phản ứng.  Chuẩn bị hóa chất cho điện di RNA Deionize formamide: Cho Dowex® XG8 mixed-bed resin vào formamide và khuấy trộn trong nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ. Sau đó lọc hai lần bằng giấy lọc Whatman ® . Chia nhỏ ra và trữ lạnh ở -700C. 5X MOPS buffer - 10mM MOPS - 2,5 mM sobium acetate - 0,5 mM EDTA - pH 7.0 Ta tiến hành quá trình pha MOPS Buffer 5X như sau: + Chẩn bị chai khoảng 1lít + Cho vào đó 500 ml nước cất hai lần khử ion và đã được xử lý với DEPC. + Tiếp tục cho vào 12,5g MOPS + Tiếp tục cho vào 1,229g sodium acetate + Tiến hành lắc đều cho đến khi các hoá chất trong chai tan hết. + Tiếp tục cho vào chai 6ml EDTA (5,972ml) + Điều chỉnh đến pH = 7.0 với NaOH 10N + Tiếp tục cho nước cất hai lần khử Ion và đã được xử lý với DEPC vào để đạt thể tích là 600ml. + Chia nhỏ ra mỗi 200ml và tiến hành hấp khử trùng. Quá trình này có thể làm cho dung dịch buffer chuyển sang màu vàng nhưng điều này không ảnh hưởng đến chất lượng buffer. Chẩn bị buffer điện di Pha 500ml buffer điện di như sau + Chẩn bị 100ml 5X dung dịch MOPS + Cho thêm 2 ml formaldehyde 37 – 40% + Thêm nước đã khử DEPC cho đến khi đạt thể tích 500ml Chẩn bị buffer biến tính và đặt mẫu Pha 1ml dung dịch 2X này như sau: + Cho 149,2 ml bromophenol blue 0,67% vào eppendorf 1,5 ml + Cho thêm 1,6 μl EDTA 1M + Thêm 80 μl glycerol 100% + Thêm 29,2 μl formol 37 – 40% + Thêm 121,2 μl formamide + Thêm 618,4 μl dung dịch MOPS 2,6 X  Quy trình ly trích RNA theo bộ kít QIAamp Ổn định mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250C) Ổn định buffer ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra buffer AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng. Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở nhiệt độ phòng. Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào một tube 1.5 ml. Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer ở trên. Vortex nhẹ để trộn đều trong 15 giây. Nếu mẫu cần phải rã đông thì chỉ nên rã đông một lần. Bước 3: Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong vòng 10 phút (thời gian hơi kéo dài hơn một chút). Bước 4: Ly tâm nhẹ để mẫu dính bên trên rơi xuống. Bước 5: Thêm 560 µl ethanol (96-100%), vortex nhẹ trong 15 giây, sau đó ly tâm nhẹ để mẫu dính bên trên rơi xuống. Bước 6: Hút 630µl dịch ở trên cho vào QIAamp spin column (trong một tube 2ml). chú ý không làm dính vành. đóng nắp, ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1 phút. Cho QIAamp spin column vào một tube 2 ml sạch và loại bỏ tube có chứa dịch lọc. (có thể ly tâm với tốc độ cao hơn ). Bước 7: Mở QIAamp spin column và lặp lại bước 6. Bước 8: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận và thêm 500 µl Buffer AW1, đóng nắp lại và tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1 phút. Lấy QIAamp spin column và cho vào một tube 2 ml mới. Bỏ tube có chứa dịch đi. Bước 9: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận, thêm 500 µl buffer AW2, đóng nắp lại và ly tâm với tốc độ 20000 x g (14000 vòng) trong 3 phút. Có thể thực hiện ngay bước 10 hay thực hiện bước 9a. Bước 9a: Chuyển QIAamp spin column vào một tube 2 ml mới, loại bỏ tube cũ có chứa dịch lọc. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng trong một phút. Bước 10: Chuyển QIAamp spin column vào một tube ly tâm 1,5 ml mới. Loại bỏ tube cũ có chứa dịch lọc. Cẩn thận mở nắp QIAamp spin column và thêm 60 µl AVE. Đóng nắp lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1 phút.  Bảng kết quả ELISA của một số mẫu huyết thanh Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 S/P 0,4 0,64 0,54 1,05 1,44 1,13 0,72 0,46 0,54 1,04 0,41 Mẫu 12 13 14 15 16 17 18 19 10 21 22 S/P 0,5 0,88 1,18 1,41 0,64 0,62 0,3 0,89 1,24 1,13 0,24 S/P≥ 0,4: Dương tính; 0,3 ≤ S/P ≥ 0,39: Nghi ngờ; S/P ≤ 0,3: âm tính.  Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer Rovira dựa vào phần mềm Blast của trang web / Sequences producing significant alignments: Score (Bits) E Value gi|1061205|emb|X92942.1|PRRSENVNP Porcine reproductive and re... 48.1 0.002 gi|51094057|gb|AY588319.1| PRRSV LV4.2.1, complete genome 43.9 0.042 gi|21303335|gb|AY035944.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303331|gb|AY035943.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303327|gb|AY035942.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|21303323|gb|AY035941.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|2695776|emb|AJ223078.1|PRR223078 Porcine respiratory and r... 43.9 0.042 gi|30315358|gb|AF511526.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|30315355|gb|AF511525.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|10764661|gb|AF298882.1|AF298882 Porcine reproductive and r... 43.9 0.042 gi|63109378|gb|DQ009653.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|63109376|gb|DQ009652.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|63109374|gb|DQ009651.1| Porcine respiratory and reproducti... 43.9 0.042 gi|39980583|gb|AY395081.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|39980575|gb|AY395080.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|39980567|gb|AY395079.1| Porcine reproductive and respirato... 43.9 0.042 gi|11125727|gb|M96262.2|LEYPOLYENV Lelystad virus, complete geno 43.9 0.042 gi|294331|gb|L04493.1|PRWPOLGLYM Porcine reproductive and res... 43.9 0.042 gi|38146324|gb|AY366525.1| Porcine reproductive and respirato... 39.8 0.74 gi|30315361|gb|AF512378.1| Porcine respiratory and reproducti... 35.7 13 gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO Puumala virus segment L, genom 35.7 13 gi|54111111|dbj|AB177636.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13 gi|54111105|dbj|AB177633.1| Chuzan virus gene for outer capsi... 35.7 13 gi|54111101|dbj|AB177631.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13 gi|54111099|dbj|AB177630.1| D'Aguilar virus gene for outer ca... 35.7 13 gi|49860681|gb|AY554397.1| Classical swine fever virus 96TD, com 33.6 55 gi|18482493|gb|AY072924.1| Classical swine fever virus isolat... 33.6 55 gi|42560487|gb|AY526727.1| Classical swine fever virus strain... 33.6 55 gi|42560485|gb|AY526726.1| Classical swine fever virus strain... 33.6 55 gi|49349068|gb|AF147806.2| Gallid herpesvirus 2, complete genome 31.5 231  Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer P1, P2 dựa vào phần mềm Blast của trang web Sequences producing significant alignments: Score (Bits) E Value gi|38385769|gb|AY457635.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|56111975|gb|AY656998.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|56111973|gb|AY656997.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|56111971|gb|AY656996.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|56111969|gb|AY656995.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|56111967|gb|AY656994.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|45827261|gb|AY569974.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|45827254|gb|AY569973.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|45827247|gb|AY569972.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|55792918|gb|AY796316.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|31747018|gb|AY262352.1| PRRSV HB-2(sh)/2002, complete genome 39.4 0.020 gi|61658265|gb|AY947888.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|61658263|gb|AY947887.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|61658259|gb|AY947885.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|61658257|gb|AY947884.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|61658255|gb|AY947883.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|25361009|gb|AY150312.1| PRRSV HB-1(sh)/2002, complete genome 39.4 0.020 gi|55376015|gb|AY775136.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|51980219|gb|AY612613.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|53774092|gb|AY745499.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|51094057|gb|AY588319.1| PRRSV LV4.2.1, complete genome 39.4 0.020 gi|22658020|gb|AF176348.2| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|32441468|gb|AY256686.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|32441466|gb|AY256685.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|20271246|gb|AF494042.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|21303335|gb|AY035944.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|21303331|gb|AY035943.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|21303327|gb|AY035942.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|21303323|gb|AY035941.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|27549163|gb|AY150564.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566269|gb|AY209228.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566267|gb|AY209227.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566265|gb|AY209226.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566263|gb|AY209225.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566261|gb|AY209224.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566259|gb|AY209223.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566257|gb|AY209222.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566255|gb|AY209221.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566253|gb|AY209220.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566249|gb|AY209218.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566247|gb|AY209217.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566245|gb|AY209216.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566243|gb|AY209215.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566241|gb|AY209214.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566239|gb|AY209213.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566237|gb|AY209212.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566235|gb|AY209211.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566233|gb|AY209210.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566231|gb|AY209209.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566227|gb|AY209207.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566225|gb|AY209206.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566223|gb|AY209205.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566221|gb|AY209204.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566219|gb|AY209203.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566217|gb|AY209202.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566215|gb|AY209201.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566213|gb|AY209200.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566211|gb|AY209199.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566209|gb|AY209198.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566207|gb|AY209197.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566205|gb|AY209196.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|28566203|gb|AY209195.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|30315361|gb|AF512378.1| Porcine respiratory and reproducti... 39.4 0.020 gi|30315358|gb|AF511526.1| Porcine respiratory and reproducti... 39.4 0.020 gi|30315355|gb|AF511525.1| Porcine respiratory and reproducti... 39.4 0.020 gi|60280978|gb|AY885248.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|66735372|gb|DQ056373.1| Porcine respiratory and reproducti... 39.4 0.020 gi|3097890|gb|U64934.1|PRU64934 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097887|gb|U64933.1|PRU64933 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097885|gb|U64932.1|PRU64932 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097883|gb|U64931.1|PRU64931 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097881|gb|U64930.1|PRU64930 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097879|gb|U64929.1|PRU64929 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|3097877|gb|U64928.1|PRU64928 Porcine reproductive and resp... 39.4 0.020 gi|66735498|gb|AF066183.4| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|3242811|gb|AF066068.1|PRRSVORF2 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|12744849|gb|AF325691.1|AF325691 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|12711601|gb|AF317692.1|AF317692 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|38146324|gb|AY366525.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|39980583|gb|AY395081.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|39980575|gb|AY395080.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|39980567|gb|AY395079.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|12240324|gb|AF331831.1|AF331831 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|40646796|gb|AY424271.1| Porcine reproductive and respirato... 39.4 0.020 gi|11934970|gb|AF297104.1|AF297104 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11934968|gb|AF297103.1|AF297103 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11934966|gb|AF297102.1|AF297102 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11934964|gb|AF297101.1|AF297101 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11934962|gb|AF297100.1|AF297100 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11934960|gb|AF297099.1|AF297099 Porcine reproductive and r... 39.4 0.020 gi|11192298|gb|U87392.3|PRU87392 Porcine reproductive and res... 39.4 0.020 gi|11125727|gb|M96262.2|LEYPOLYENV Lelystad virus, complete geno 39.4 0.020 gi|5001624|gb|AF095498.1|AF095498 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001623|gb|AF095497.1|AF095497 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001622|gb|AF095496.1|AF095496 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001621|gb|AF095495.1|AF095495 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001620|gb|AF095494.1|AF095494 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001619|gb|AF095493.1|AF095493 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001618|gb|AF095492.1|AF095492 Porcine reproductive and re... 39.4 0.020 gi|5001617|gb|AF095491.1|AF095491 Porcine reproductive an