Kỹ thuật chuyển gen và các phương pháp chuyển gen ở thực vật

CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT Kỹ thuật di truyền Là kỹ thuật chuyển gen để tạo ra giống cây trồng, vật nuôi hay vi sinh vật như ý muốn của con người Một phân đoạn ADN trên nhiễm sắc thể chịu trách nhiệm về một đặc tính của sinh vật Gene Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen được quan tâm hay từng phần của gen đó. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào. 3. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu nhận được các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen. Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả, gồm: + Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn…) + Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi trường + Gen kháng thuốc diệt cỏ + Gen cải tạo các đặc tính về chất lượng (thay đổi thành phần axít béo, tăng cường thành phần axít không no, tăng cường thành phần các axít amin không thay thế, gen chín chậm, v.v…) QUÁ TRÌNH BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT ĐƯỢC THỰC HIỆN NHƯ THẾ NÀO? Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp). Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật. Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây. Trong giai đoạn này, các mô tế bào được chuyển gen được chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây. Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công. CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN ĐỐI VỚI HỆ THỐNG TÁI SINH - Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia in vitro nhanh. - Các mô, tế bào này phải có khả năng tiếp nhận gen mới. - Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen. - Cây tái sinh phải có tỷ lệ sống (khi đưa ra ngoài đất trồng) cao, tần số biến dị thấp (tối thiểu), và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tiếp tục tiến hành chuyển gen trong điều kiện in-vivo sau này. - Các phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) đều chuyển gen vào các tế bào, hay mô – nói cách khác tế bào và mô là đơn vị tiếp nhận gen mới. Các loại mô sử dụng làm hệ thống tái sinh: ► Phải có khả năng tái sinh cao và thuận lợi cho việc chuyển gen. ●Mô sẹo có nguồn gốc khác nhau. ●Mô lá, thân mầm ● Phôi non, phôi trưởng thành VÍ DỤ VỀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÁC CÂY BIẾN NẠP TỪ CÁC TẾ BÀO KHÁC NHAU GIAI ĐOẠN CHUYỂN GEN Các véctơ chuyển gen Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN mang đoạn gen cần biến nạp. Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến nạp có thể thực hiện được. Cấu trúc của véctơ chuyển gen 1. Có một đoạn ADN khởi động (promoter). Đây là một đoạn ADN có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã. Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã (CaMV-35S-promoter, nos-promoter …) Cấu trúc của véctơ chuyển gen 2. Có một đoạn ADN kết thúc (terminator). Đây là đoạn ADN cần thiết cho sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mARN khỏi sợi khuôn ADN. Đoạn kết này thường có một trật tự tín hiệu polyadenin, như AATTAA hoặc AACCAA, giúp cho phân tử mARN bền vững hơn. 4. Một đoạn ADN chứa các trật tự nucleotid đặc trưng cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn, thường ký hiệu là MCS (multi-cloning sites). Nhờ đoạn ADN người ta có thể dùng enzym giới hạn đặc hiệu để cắt và tái tổ hợp phân tử ADN của véctơ với đoạn ADN mang gen cần biến nạp. 3. Một đoạn ADN chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản (replication; Điểm tái bản) thường có nguồn gốc vi khuẩn, như ColE1. Cấu trúc của véctơ chuyển gen 5. Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes). Các gen này thường tổng hợp nên các phân tử protein giúp phân biệt các tế bào đã được biến nạp khỏi các tế bào không được biến nạp (gen chọn lọc), hoặc ghi nhận sự hoạt động của gen biến nạp (gen chỉ thị). Cấu trúc của véctơ chuyển gen Các gen chọn lọc thường có tính trội, thông thường có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng hoạt động của chúng được kiểm soát bởi các promoter kiểu Eukaryote. Các gen chọn lọc phổ biến gồm: ۞ Các gen kháng kháng sinh như kanamycin (neomycin phosphotransferase-nptII), hygromycin (hygromycin phosphostransferase-hpt), streptomycin (streptomycin phosphotransferaza),... ۞ Các gen kháng chất diệt cỏ, như glyphosate hoặc bialaphos (phosphinothricin, BASTA): gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hoá cho enzyme làm bất hoạt BASTA là phosphinothricin acetyltransferaza (PAT). ۞ Các gen khác (gen pmi – phosphate manose isomerase- chuyển hoá manose thành glucose. Nhờ vậy, cây có thể sống trên môi trường không có glucose (manose là nhân tố chọn lọc) GIỚI THIỆU VỀ GEN CHỌN LỌC (selectable marker gene) BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Các nhân tố chọn lọc Kanamycin Hygromycin Basta Manose GEN CHỈ THỊ (reporter gene) ♣ Các gen gen chỉ thị là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào hệ gen thực vật và bắt đầu hoạt động hay chưa. ♣ Các gen chỉ thị thường được dùng bao gồm: +  - galactosidase * +  - glucuronidase (GUS) * + Neomycin-phosphatase (NPT) + Chloramphenicol-acetyl transferase (CAT) + Alkaline phosphatase + Luciferase * + Protein phát huỳnh quang xanh lục GFP * (green fluorescence protein) và các dẫn xuất của nó. + Protein chuyển trạng thái năng lượng cộng hưởng phát huỳnh quang FRET (fluorescent resonance energy transfer) Sử dụng gen chỉ thị gus NGUYÊN TẮC Sự biểu hiện của gen gus ở mô hoa, mô lá và phôi ngô non được chuyển gen Sử dụng gen chỉ thị Luciferase Nguyên tắc Luciferase là một loại protein có trọng lượng 62 kDa phát ra ánh sáng ở bước sóng 562 nm (màu vàng-xanh lục). Là gen được phát hiện và tách ra từ loài côn trùng Photynis pyralis. Sử dụng gen chỉ thị Luciferase Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein) GFP là một loại protein có trọng lượng 32 kDa phát ra ánh sáng ở bước sóng 509 nm (màu xanh lục sáng). Là gen được phát hiện và tách ra từ loài sứa Aequorea victoria. Sử dụng gen chỉ thị GFP (green fluorescene protein) Ở thực vật Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM CÁC VÉCTƠ MANG GEN BIẾN NẠP ĐƯỢC CHUYỂN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT NHƯ THẾ NÀO? 1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens / A. rhizogens 2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp - Phương pháp dùng súng bắn gen (particle inflow gun / bombardment) - Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện (electroporation) - Phương pháp chuyển gen nhờ PEG (polyethylene glycol) - Phương pháp vi tiêm (microinjection) Các bước thực hiện phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 1. Thiết kế véctơ mang gen biến nạp 2. Nhân (tách dòng – cloning) véctơ nhờ vi khuẩn E. coli 3. Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E. coli sang Agrobacterium 4. Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào / mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen biến nạp sang mô / tế bào đích 5. Chọn lọc các tế bào / mô đã được biến nạp thành công 6. Tái sinh mô / tế bào đã được biến nạp thành công thành cây biến nạp hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp) Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium - Vi khuẩn A. tumefaciens không sản xuất được một số acid amin như octopin, nopaline. Để tồn tại, nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân huỷ các chất này để lấy năng lượng. Trong quá trinh cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật Bản chất phân tử của quá trình phát sinh khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens gây ra ở thực vật: trong quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào bị thương của cây các tế bào bị thương tiết ra hợp chất thu hút các tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens. Các tế bào vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp vào chúng một loại plasmid đặc hiệu gây nên tình trạng khối u - Đó là plasmid Ti (tumor inducing). Ti plasmid mang các gen tổng hợp IAA, các amino acide như octopine hay nopalin để giúp cho vi khuẩn phát triển. Con người lợi dụng tính chất này của Agrgobacterium để chuyển gen vào tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Có 3 nhân tố liên quan đến sự tạo khối u của Ti-plasmid + T-DNA được chuyển vào tế bào chủ ở dạng một nhân tố di động + Các gen vùng vir (virulence) là nơi có các gen sản xuất các protein cần cho sự biến dạng tế bào thực vật để Ti-plasmid có thể thâm nhập. + Các gen khác có trong nhiễm sắc thể của Agrobacterrium chịu trách nhiệm liên kết tế bào vi khuẩn với mô thực vật Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tương đối lớn, gồm 150.000-200.000 cặp nucleotit. Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000-30.000 cặp nucleotit có khả năng thâm nhập vào bộ genom của tế bào chủ, đó là đoạn T-ADN. T-ADN có chứa các gen gây ra sự sinh trưởng vô điều khiển của các tế bào thực vật. đó là các gen mã hoá auxin và cytokinin gây ra sự sinh sản vô tổ chức của tế bào bị nhiễm. Những enzym chịu trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào trong genom của tế bào chủ được mã hoá bởi các đoạn vir (virulence) Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN Các Ti - plasmid cải biên được cắt bỏ các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn vir và phần T-ADN tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu quả cho việc đưa ADN lạ vào tế bào thực vật ở cả các loài cây một và hai lá mầm. Người ta đưa gen cần chuyển vào Ti plasmid, sau đó đưa vào Agrobacterium Dùng agrobacterium lây nhiễm mô thực vật. Theo đặc tính của mình, vi khuẩn chuyển các gen vào tế bào thực vật. Như vậy việc chuyển gen đã được hoàn thành Nhiệm vụ của người thực nghiệm là tái sinh tế bào hay mô thành cây, sau đó kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở cây tái sinh. Đầu tiên, là sự hình thành một vết đứt (nick) tại vị trí vùng biên phải RB của đoạn T-ADN. Đoạn gen này sau đó được tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình thành một đoạn đứt thứ hai. Đoạn đứt này thường không cố định đối với các plasmid khác nhau. Trong khi các axít nucleic trống tạo ra trên plasmid được lấp đầy theo nguyên tắc bổ trợ của các axít nucleic thì đoạn T-ADN được tách ra được bám bởi một protein bám sợi đơn (SSBP - single strand binding protein). Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T-ADN được chuyển vào nhiễm sắc thể cây chủ theo một cơ chế đến nay chưa biết rõ. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Thiết kế véctơ Ti plasmid mang gen biến nạp Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật và tái sinh cây Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 1. Số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp. Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao. 2. Tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm. 3. Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện 4. Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền Nhược điểm Ưu điểm Phương pháp này được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm. Nhưng hiệu quả chuyển gen ở các cây một lá mầm còn thấp. Trong khi nhiều cây một lá mầm là những cây lương thực quan trọng như lúa, ngô, lúa mỳ ... Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Phương pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen LUỒNG KHÍ HELI LUỒNG KHÍ HELI Màng nổ Màng mang Hạt mang ADN Màng dừng Buồng chân không Mô thực vật Môi trường nuôi cấy mô TV Phương pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen Phương pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen Phương pháp biến nạp gen bằng xung điện Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện thường được sử dụng cho việc chuyển gen vào các tế bào trần (protoplast). Tế bào trần là tế bào đã được loại bỏ thành tế bào bằng việc xử lý với các enzym (cellulase, pectinase) để thu được cấu trúc tế bào chỉ còn chất nguyên sinh và màng nguyên sinh chất. Người ta thường sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao phát xung trong thời gian cực ngắn (khoảng 5 - 6/1000 giây) để tạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đường kính khoảng 30 m, mà qua đó các ADN biến nạp có thể thâm nhập vào tế bào. Tế bào thực vật có vỏ xenlulo giữ cho tế bào có hình dáng nhất định. Các hợp chất pectin nằm trong vỏ làm nhiệm vụ kết gắn các tế bào với nhau Máy xung điện Phương pháp biến nạp gen bằng xung điện Phương pháp biến nạp gen bằng xung điện Phương pháp biến nạp gen nhờ PEG (polyethylene glycol) Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần. Ở nồng độ cao, PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, ADN biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào protoplast. Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công. Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền Nhược điểm Ưu điểm Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản copy của gen trong tế bào biến nạp có thể lớn. Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm. Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen. Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tế bào trần, vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài cây trồng. Phương pháp biến nạp gen nhờ PEG (polyethylene glycol) Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Đến nay, các tế bào đã được sử dụng phương pháp này để chuyển gen gồm các tế bào protoplast, các tế bào tiền phôi của hợp tử hay hạt phấn Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Các phương pháp chuyển gen khác ♦ Ngoài các phương pháp trên đây, người ta còn sử dụng phương pháp siêu âm (ultrasonication). Nhưng nói chung, đến nay phương pháp này được sử dụng hạn chế và mới dừng ở mức phòng thí nghiệm. ♦ Trong một số trường hợp người ta có thể kết hợp các phương pháp với nhau. Chẳng hạn trong biến nạp gen ở ngô người ta sử dụng kết hợp phương pháp súng bắn gen để gây tổn thương tế bào biến nạp trước khi chuyển nạp gen bằng Agrobacterium. Lá lúa và mô thực vật được chuyển gen chỉ thị GUS Cây chuyển gen trên môi trường chọn lọc theo tính kháng hygromycin Cây cúc chuyển gen trên môi trường chọn lọc XU HƯỚNG ÁP DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN “Sự kiện” chuyển gen (Transformation Events) Events Một tế bào đơn sẽ phân chia và phân hóa thành một cây hoàn chỉnh. Khái niệm "event" thường được dùng để phân biệt các giống cây trồng tạo ra bằng công nghệ gen. Một “event” là sự chèn vào của một gen cần chuyển cụ thể vào một vị trí đặc trưng trên một NST. Một khi một “event” được tạo ra trong một tế bào đơn, nó được duy trì từ tế bào này sang tế bào khác khi nhiễm sắc thể tự nhân lên và các tế bào phân chia tái sinh thành cây hoàn chỉnh Một sự kiện “event” sau đó được truyền từ bố mẹ sang con cháu qua các tế bào giao tử mang một bản copy thông tin di truyền của bố mẹ. Cuối cùng, các sự kiện này kết thúc ở trên cánh đồng của nông dân vì chúng được truyền qua quá trình lai tạo hoặc sản xuất hạt. 3 yếu tố để phân biệt các “event” là: Gen nào đã được chèn vào ? Gen được chèn vào vị trí cụ thể nào trên NST (locus) ? Bao nhiêu bản sao của gen đã được chèn vào locus đó? Hình ảnh dưới đây mô tả một tế bào được chuyển gen khi gen xâm nhập vào nhân và chèn vào NST. Vị trí chèn vào trên NST là không thể đoán trước. Số lượng bản chèn vào khi sử dụng Agrobacterium được dự đoán là khoảngtừ 1-2 trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn. Hơn nữa % tế bào được chuyển nhờ Agrobacterium thường cao hơn súng bắn gen. Vì thế phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thường được lựa chọn để sử dụng. Các Events mong muốn thường là hiếm Các sự kiện mong muốn là các sự kiện có mang gen được chuyển được chèn vào một phần của NST cho phép sự thể hiện của gen đó mà không ảnh hưởng gì đến các gen khác của cây trồng (gen có sẵn). Tuy nhiên hầu hết các sự kiện đều bị loại bỏ hoặc đào thải trong quá trình phát triển của các giống cây trồng hoặc cây lai. Một tỷ lệ lớn các sự kiện được tạo ra bằng công nghệ gen thậm chí chỉ dừng lại ở mức độ phòng thí nghiệm hay nhà kính mà thôi. Các sự kiện khác được loại bỏ sớm trong quá trình lai tạo hay các giai đoạn đánh giá trên đồng ruộng.  Đôi khi, trong quá trình chuyển gen, gen được chuyển đẩy một gen khác ra và nó chiếm vị trí của gen này. Sự thực là khi một gen được chèn vào ADN của NST theo cách tương tự như chúng ta chen ngang khi xếp hàng ở siêu thị.ADN của NST bị cắt đứt và gen cần chuyển chèn vào đó. Một hay nhiều bản copy bao gồm các gen chỉ thị sẽ chèn vào vị trí này. Mặc dù vậy, một vấn đề có thể xảy ra là nếu gen mới tự nó chèn vào giữa gen có sẵn. Trong trường hợp này, mã hóa ADN của gen có sẵn sẽ bị thay đổi và gen này sẽ không thể mã hóa cho ARN thông tin chính xác. Có thể so sánh các sự kiện như khi chúng ta thêm một chữ vào giữa một từ và từ này không còn nghĩa nữa. Nếu gen này là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển, cây sẽ bị chết. Nếu gen đó quan trọng đối với một tính trạng, ví dụ như sự phát triển của rễ trong điều kiện đất có pH thấp, đột biến sẽ không thể được nhận biết cho đến khi cây được đặt trong các điều kiện này. Chính vì thế cần phải loại bỏ các đột biến có hại trong quá trình chọn lọc.  Một khả năng khác là cây được chuyển gen nhưng mức thể hiện của gen này lại rất thấp. NST có chứa một số đoạn gọi là 'junk DNA'. Các đoạn này có thể mã hóa cho các gen không sử dụng thường xuyên hoặc đoạn ADN không rõ mục đích. Khi gen cần chuyển chèn vào các vị trí này, sự thể hiện của chúng thường là rất thấp hoặc thậm chí không tồn tại. Vì vậy,các cây chuyển gen cũng cần phải được chọn lọc để thể hiện được đúng mức độ. Sự biểu hiện thấp của gen cũng có thể xảy ra khi nếu mã di truyền của nó bị thay đổi hoặc bị can thiệp trong các bước chuyển gen. Tóm tắt các sự kiện có khả năng xảy ra trong quá trình chuyển gen Gene Silencing Hiệu quả kinh tế xã hội của các lĩnh vực khác nhau của công nghệ sinh học Source: Mayer-Tasch, 2005 Thế hệ cây trồng biến đổi gen thứ nhất đã thương mại hóa: 1. Ngô kháng sâu 2. Đậu tương kháng sâu 3. Ngô kháng thuốc diệt cỏ 4. Đậu tương kháng thuốc diệt cỏ 5. Ngô kháng sâu + kháng thuốc diệt cỏ 6. Đậu tương kháng sâu + kháng thuốc diệt cỏ 7. Cải dầu, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ 8. Bông kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Cây đậu tương chuyển gen ♦ Kháng sâu (Bt) ♦ Kháng sâu bệnh (insect resistance) ♦ Góp phần làm giảm lượng thuốc trừ sâu cần sử dụng (bảo vệ môi trường và giảm chi phí sản xuất) ♦ Thay đổi thành phần axít béo ♦ Làm thay đổi thành phần và giá trị dinh dưỡng Cây ngô chuyển gen ♦ Kháng bệnh ♦ Kháng sâu bệnh (Bt) ♦ Kháng mọt sau thu hoạch (CMx, serpin) ♦ Chín sớm ♦ Rút ngắn thời gian trồng trọt ♦ Kháng thuốc diệt cỏ … MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Cây cà chua chuyển gen: ♦ Gen kéo dài thời gian chín ♦ Làm chậm quá trình chín nhũn quả ♦ Tăng cường chất lượng quả và kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch ♦ Gen kháng bệnh virút: Kháng với virút CMV ♦ Góp phần giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng trong quá trình trồng trọt Cây cà chua chuyển gen kháng virút (bên trái) trong khi cây không được chuyển gen kháng mẫn cảm với virút CMV - Cucumber mosaic Virus - khi trồng trên đồng ruộng (bên phải) MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Cây bông chuyển gen kháng sâu Bt ♦ Mang gen kháng sâu Bt ♦ Góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu Bông chuyển gen Bt kháng sâu bệnh (phải) và bông không chuyển gen mẫn cảm với sâu bệnh (trái) MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Giống lúa được chuyển gen tổng hợp -carotene (giống lúa vàng). Sau quá trình tiêu hoá, -carotene được chuyển hoá thành vitamin A. Khoảng 120 triệu trẻ em trên thế giới bị các rối loạn do thiếu vitamin A. Giống lúa vàng mang lại “niềm hy vọng” trong việc bảo vệ khoảng 1 đến 2 triệu bệnh nhân bị các rối loạn do thiếu vitamin A. MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Cây đu đủ (Carica papaya L.) được chuyển gen kháng bệnh virút (trái) và cây đối chứng (phải) Có khả năng kháng virút CMV Được đánh giá là góp phần vào việc phục hồi nền công nghiệp sản xuất đu đủ ở Hawaii. MỘT SỐ THÀNH TỰU BIẾN NẠP GEN Ở THỰC VẬT Kháng các điều kiện bất lợi phi sinh học Kháng mặn Chịu hạn Chịu lạnh Kháng các điều kiện bất lợi sinh học Kháng sâu Kháng virus Kháng nấm Kháng bệnh vi khuẩn Bất dục đực nhân Kháng thuốc diệt cỏ Tăng thời gian bảo quản Tăng dinh dưỡng Tăng cường chất lượng - Thay đổi thành phần dầu - Tăng cường chất lượng gỗ Sản xuất hoạt chất sinh học Các đặc tính đang được nghiên cứu Kháng sâu, bệnh Cải tiến chất lượng, tăng cường hàm lượng vitamin, vi lượng, axit amin không thay thế….. Chống chịu các điệu kiện bất lợi phi sinh học, mặn, hạn, lạnh…. Kháng thuốc diệt cỏ Năng suất cao Sourse: Norman Borglag, 2005 Cây biến đổi gen thế kỷ 21 Ngô chịu hạn USA Cà tím kháng sâuIndia, Philippines, Bangladesh Lúa kháng sâu China, Iran Lúa tăng cường vitamin, vi lượng Philippines, India, Bangladesh, and Indonesia Hoa hồng xanh Japan Thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cải tiến Source: Grant (2009) Lúa vàng 2 35 ug beta-carotene/gram Hơn 30 lần so với lúa vàng 1 Cà chua tím Hàm lượng anthocyanin cao hơn bình thường 20% Một số giống cây chuyển gen khác Hành không làm chảy nước mắtGene: lachrymatory factor synthase Giống chín sớm/muộn, có hàm lượng carotenoid caoGenes: DET1, LeETR4, ACC oxidase Ngô cao Lysine Gene: ZLKR/SDH Thực phẩm không chứa chất gây dị ứng, có hàm lượng axit omega 3, axit oleic caoGenes: AraH2, FAD2 Một số nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam Lúa biến đổi gen có hàm lượng vitamin A cao Gạo thường Gạo CG Trần Thị Cúc Hoà, Viên Lúa ĐBSCL Chọn lọc các dòng chuyển gen sử dụng Imaging PAM Phân tích PCR Phân tích Southern Dòng bèo Wolffia chuyển gen VP2 nuôi trong điều kiện in vitro Bèo tấm Wolffia Cây xoan ta Melia azedarach chuyển gen G20 và gene 4CN1 cải thiện khả năng sinh trưởng và chất lượng gỗ Đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng PRSV Chuyển gen, chọn lọc và tái sinh Trồng các dòng chuyển gen trong nhà lưới Ti-vector attB1 attB2 attB2 attB1 Gene CP Gene CP Phân lập gen CP của virus PRSV và thiết kế vector Ti-plasmid VIP kháng sâu  Yếu tố phiên mã: chịu hạn - Quá trình biến nạp gen thực hiện trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc nhiều vào thời gian, không gian, mùa vụ, thời tiết, v.v... - Các gen được chuyển có tính đặc thù cao hơn nhiều. Các gen tương ứng chính xác với các tính trạng mong muốn được lựa chọn dùng cho quá trình biến nạp, loại bỏ được các tính trạng không mong muốn. - Quá trình chuyển một gen mong muốn vào một cá thể diễn ra nhanh hơn nhiều. Chỉ cần sau một thế hệ, tính trạng mong muốn được biểu hiện và thu nhận, trong khi các phương pháp truyền thống thường cần nhiều thế hệ. - Mức độ “linh động” của các gen được chuyển lớn hơn nhiều. Nhiều gen của loài này có thể được chuyển vào loài khác và biểu hiện thành các tính trạng hoàn toàn mới. Ðiều này không thể thực hiện được khi sử dụng các phương pháp tạo giống truyền thống - Tăng năng suất nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất. Điều này đặc biệt đúng khi các gen được dùng cho biến nạp vào thực vật thường là các gen làm tăng năng suất, giảm thời gian trồng trọt, tăng khả năng trao đổi chất, kháng các loại sâu bệnh. Nhờ vậy, thời gian, công lao động, vật tư hoá chất cần cho quá trình sản xuất nông nghiệp sẽ được giảm đi nhiều dẫn đến sự giảm chi phí sản xuất và hạn chế ô nhiễm môi trường.