Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng

PHẦN I: MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề: Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời sống. Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản phẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học. Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nước trên thề giới. Trong vòng 30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh ngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng. Nó không chỉ thành công trong việc khám phá những bí ẩn của sự sống giúp con người nhìn nhận bản chất thế giới quan sinh học rõ ràng minh bạch, mà sự thành công của sinh học và công nghệ sinh học còn nằm ở chỗ nó tạo ra những sản phẩm chuyên về sinh – y – nông nghiệp – công nghệ sinh học với đủ mọi cấp độ quy mô. Từ sự phát triển này, con người đã thừa hưởng nhiều thành quả không thể chối cãi: những công cụ chẩn đoán bệnh tật hiệu quả, các khuynh hướng giải quyết các vấn đề môi trường, nông nghiệp. Đi sâu hơn vào bản chất của sự thành công này, chúng ta không thể “quên ơn” những nghiên cứu từ trong phòng thí nghiệm. [2] Và nếu đặt câu hỏi “Công cụ nào trong phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu ?” Có thể dễ dàng tìm thấy câu trả lời từ những nhà nghiên cứu sinh y công nghệ sinh học: tế bào và nuôi cấy tế bào là công cụ quan trọng hầu như không thể thiếu trong các nghiên cứu. Quả thật không thể nói hết công lao của tế bào và kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu y sinh công nghệ sinh học ngày nay. Chỉ dám nói rằng: Không có chúng, sẽ không có ngành sinh học hiện đại và công nghệ sinh học. Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứ u các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng. Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào động vật nói riêng đang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết mức trên nhiều phương diện khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng to lớn mà hiện nay người ta chưa lường hết được. Nhằm bổ sung cho mình những kiến thức mới về kỹ thuật nuôi cấy tế bào cũng như xem xét những thành tựu mà kỹ thuật này đã đem lại, được sự hướng dẫn và cho phép của thầy giáo Ngô Đắc Chứng, tôi đã quyết định tìm hiểu về đề tài: “Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng”. Do thời gian hạn chế, chắc chắn đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, mong quý thầy cô và bạn đọc thông cảm và góp ý để đề tài này được hoàn thiện hơn. II. Phương pháp tiếp cận và phạm vi của đề tài - Mặc dù hiện nay kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được thực hiện trên rất nhiều đối tượng khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật thậm chí cả con người. Mỗi đối tượng khác nhau thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào có sự khác biệt lẫn nhau. Nhưng trong phạm vi của đề tài này chúng tôi chỉ xin trình bày về kỹ thuật nuôi cấy tế bào trên đối tượng động vật (bao gồm cả trên con người) và những ứng dụng của nó. - Để thực hiện đề tài này tôi đã sưu tầm thông tin, hình ảnh từ các nguồn khác nhau như giáo trình, bài giảng, tạp chí, các phương tiện thông tin đại chúng, internet,… các tài liệu và hình ảnh sưu tầm được qua việc phân tích so sánh từ nhiều nguồn để đảm bảo tính chính xác và tổng hợp thành bài viết này. PHẦN II: NỘI DUNG I. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là tổ hợp các thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra những cơ quan, bộ phận hoặc cơ thể hoàn chỉnh từ một hay một số tế bào ban đầu. Kỹ thuật này có sự khác nhau đối với các đối tượng khác nhau: Vi sinh vật, thực vật và động vật do đặc điểm riêng biệt của từng loại tế bào. 1. Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như ít biểu hiện tính toàn năng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi trường, tốc độ sinh sản chậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào của cơ thể trưởng thành. Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được phân chia theo 4 nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biểu mô tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài. Ở mô liên kết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài), đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắn với nhau thành một phiến hoặc một bó bởi mô liên kết. Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậc cao. Các tế bào mô thần kinh gồm có thân tế bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần mở rộng dài và mảnh được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng và truyền xung động rất nhanh.[3] 1.1. Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hình dạng thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Các tế bào không dính bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng. Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) (Hình 1a) bắt nguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đường kính từ 10-20 µm. Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự vi khuẩn. 1.2. Các tế bào dính bám Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng. Trong các ứng dụng, người ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast) (Hình 1b và c). Các tế bào dính bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặc plastic. Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụng rộng rãi nhất. Các chai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ ấm. Chai có dung tích 1 l chứa khoảng 100 ml môi trường là thích hợp cho các tế bào vừa sinh trưởng trên thành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không khí. Tuy nhiên, chai trục lăn chỉ dùng cho quy mô phòng thí nghiệm vì diện tích bề mặt trên một đơn vị thể tích của chai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm2/l). Hình 1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy. (a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trưởng trên các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, bao vi thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kích thước hiển vi gọi là microcarrier.[3] 2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop). Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh (in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt. Nhưng phải chờ đến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ sinh học.[5] 2.1. Môi trường nuôi cấy Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thể sống và phát triển được. Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trường. Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương của động vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy. 2.1.1. Môi trường hóa chất Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma. Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra. Vì lý do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trường không có huyết thanh. Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh. Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thế hoàn toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường hóa chất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các chất cần thiết, ít bị lây nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh dưỡng (Cacbonhydrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng). Hiện nay, người ta dùng một số môi trường nuôi cấy như môi trường Eagle, môi trường Dulbecco,… Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu. Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu CO2 môi trường (5-10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi. Độ pH thích hợp là 7,4. Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi trường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển sang vàng nhạt là môi trường bị nhiễm khuẩn. 2.1.2. Nhân tố sinh trưởng Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển. Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%) vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng. Nhưng dùng huyết thanh vừa đắt tiền lại vừa dễ bị nhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bổ trợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferin, ethanolamin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi. 2.1.3. Các chất kháng sinh Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin B thường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy. Tuy nhiên, các chất kháng sinh thường độc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và phải kết hợp với quy trình tiệt trùng chu đáo.[2] Bảng 1. Thành phần môi trường Eagle (1959).[3] Hình 1: Môi trường nuôi cấy (*Nguồn: Website của ĐH Nông nghiệp 1 Hà Nội) 2.2. K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau. Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác. Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen. Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng. Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù. Nếu muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier. Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người. Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc tế bào của mô để nuôi cấy. Mô được phẩu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh nhỏ và được xử lý bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tế bào riêng biệt ở dạng huyền phù. Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do thường ở dạng huyền phù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp. Người ta sử dụng buồng đếm hoặc máy đếm tự động để tính toán số lượng tế bào theo từng giai đoạn phát triển. Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích một phần mẻ cấy trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụng enzyme để tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme có thể gây hại cho tế bào.[2] 2.2.1. Nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture). Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (được gọi là tế bào nhiễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận. Hình 2: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (*Nguồn:CNSH trên người và động vật ) Thu nhận mẫu mô Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (Mảnh nhỏ để nuôi) Tách TB bằng cơ học (nghiền, ép) Tách TB bằng enzyme (ủ,…) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Nuôi mảnh mô thứ cấp Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase Li tâm Nuôi sơ cấp Cấy chuyền Dòng tế bào Tái huyền phù  Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm: - Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống. - Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ. - Bước 3: Nuôi cấy tế bào. 2.2.1.1. Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làm sạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào bảo quan trong dung dịch DPBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô cần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3 mm2 2.2.1.2. Tách rời các tế bào Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: - Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép - Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase - Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng - Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt. Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào. 2.2.1.3. Nuôi cấy - Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào. - Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. - Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex. - Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình Roux) và bỏ sung 1ml môi trường. - Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ. Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp. Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ cấp.[4] 2.2.2. Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy, dù là cấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết. Số thế hệ tế bào tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào. Đối với tế bào gốc thì khả năng sinh trưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trưởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành. Tuy vậy, người ta đã tạo ra được các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởng liên tục trong môi trường cấy chuyền. Đó chính là các tế bào ung thư của cơ thể hoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ung thư hóa” với những biến đổi di truyền. Sự chuyển dạng thường được thực hiện nhờ tác nhân gây đột biến, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất giữ nhiều dòng tế bào “bất tử” nhân tạo như các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) hay tế bào Namalwa (tế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa). 2.2.3. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy. Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha: - Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào. - Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tế bào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. - Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số lượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện tự hoại tế bào thể hiện ở chổ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới. 2.2.4. Các phương thức nuôi cấy Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cấy theo mẻ (batch culture), trong đó tế bào được nuôi vài ngày cho tới khi sinh trưởng dừng lại. Đây là hệ thống nuôi cấy kín vì không cho thêm gì vào và cũng không lấy từ môi trường ra một chất gì. Điều kiện chuẩn: mật độ tế bào trong môi trường là 105/cm3 và nuôi trong 3 ngày cho tới khi mật độ tế bào đạt 106/cm3. Trong khi nuôi cấy phải khuấy lắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường. Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần chất dinh dưỡng và tích lũy nhiều chất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó tế bào sẽ đi vào thoái hóa. Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục tăng sinh, nhưng đến một thời gian nhất định, sinh trưởng sẽ dừng lại vì môi trường đã tích lũy quá nhiều chất độc như amoniac hay lactat,… Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục (continuous culture), trong đó môi trường luôn được đổi mới và các chất độc luôn được loại bỏ tương tự như trong cơ thể. Có hai cách nuôi cấy liên tục: Cách thứ nhất là dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẫn duy trì tế bào trong mẻ cấy cho đến khi số lượng tế bào đạt 107/cm3. Cách thứ hai là đồng thời có thêm hệ thống rút bớt môi trường cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ số tăng trưởng tế bào sẽ tỷ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra. Một hệ cân bằng như vậy được gọi là hệ ổn hóa (chemostat), là một dạng nồi lên men dùng để nuôi cấy liên tục.[2,5] II. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 1. Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật 1.1. Tế bào lai soma Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm. Tuy nhiên in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm chí người ta có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để tạo nên tế bào lai soma (hybridoma) Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khác nhau. Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm chúng vào chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau. Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tế bào lai được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả), còn khi các tế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu được tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật). Như vậy, theo nghĩa đúng đắn thì heterocaryon mới thực sự là tế bào lai (hybridoma). Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tế bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp. Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ dàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích. Một số virut được sử dụng làm nhân tố kích thích đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut chứa ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,…) hoặc các virut gây ung thư (virut Sarcoma Rous),… 1.2. Đặc tính của tế bào lai soma - Sự hoạt hóa của nhân: + Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của gà, người ta thu được tế bào lai có chứa nhân lai ở trạng thái hoạt hóa, trong đó các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã trở nên hoạt hóa, tổng hợp ARN và protein đặc trưng cho gà. + Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa phải so với nhân hồng cầu gà, ví dụ đại thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp ADN và tế bào ở giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ và tổng hợp ít ARN). Khi nuôi cấy các đại thực bào (của chuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo nên các tế bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng hợp ARN tăng 4-10 lần so với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN. Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn. + Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai giữa đại thực bào và tế bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân đại thực bào không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến từ tế bào chất của tế bào melanom. + Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế bào lai rất lâu (vài tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào soma (ví dụ đem tinh tử của chuột cống lai với tế bào soma của chuột nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phân chia. + Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các tế bào soma khác nhau như tế bào chuột cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào này có thể phát triển tới giai đoạn phôi dâu. - Sự thụ tinh là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa cả hai nhân – có thể được xem như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong ống dẫn rứng của con cái hoặc ở phần nào đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được chương trình hóa trong bộ gen của sinh vật. Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinh giữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi là khả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần khả năng hóa vẫn thực hiện được sự thụ tinh. - Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai: Khi sử dụng các dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợp ADN và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng: + Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạt tính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích cực hơn (trừ trường hợp tế bào ít hoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryon được tạo thành từ các tế bào quá già). + Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN và ARN như ở nhân có hoạt tính. Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào có hoạt tính cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài. + Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN diễn ra trong tế bào lai tương tự như ở tế bào bình thường. Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không có hoạt tính vẫn giữ trạng thái bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt đã trở lại hoạt động trong tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều. Những công trình cấy ghép nhân hoặc nhân bản vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạn biệt hóa mà tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họ gen hay toàn bộ genom. - Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai: Phân tích bộ nhiễm sắc thể của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung hợp có thực sự là tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc, tập tính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào. Bằng phương pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm cắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền và biến dị của tế bào lai soma. + Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết hợp lại với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai bộ hoặc của cả hai bộ nhiễm sắc thể. Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa chuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể. Sự giữ lại hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy ra không phải ngẫu nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng thái tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro. + Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. Các tế bào bố mẹ được sử dụng để tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể, thường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,… Các nhiễm sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào lai. - Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai: + Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai heterocaryon chứa hai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân độc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon. Các heterocaryon có thể tồn tại rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon. Người ta theo dõi số phận và đời sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính trạng kiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu trúc, sự biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như phản ứng với các tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,… + Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hiện của các gen trong nhiễm sắc thể thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm sắc thể X. + Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ, đặc biệt là các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt hóa cao, ổn định như limpho, tế bào sợi, tế bào gốc hồng cầu,… Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền học, tế bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho công nghệ tế bào.[2] 2. Công nghệ nhân bản vô tính động vật Nhân bản vô tính là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể đa bào không bằng con đường sinh sản hữu tính tự nhiên mà thông qua sự phát triển của tế bào soma bằng cách phân bào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành cơ thể trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với đa số động vật sinh sản hữu tính thì kỹ thuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt. 2.1. Kỹ thuật chuyển nhân: Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất cả các tính trạng của cơ thể giống như bộ NST của hợp tử. Qua quá trình phát triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa để cho ra các tế bào và mô khác nhau. Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong hệ gen theo thời gian và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội bào và ngoại bào. Nhân còn ít biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế bào gốc để nhân bản vô tính là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt hóa. Bình thường người ta tách nhân từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy hoặc hủy nhân để tạo nên một tế bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma và tế bào chất của tế bào trứng. Vì nhân 2n của tế bào cho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do tế bào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi. Khi nhân này được cấy chuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệt hóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử và hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúng chương trình phát triển do các nhân tố của trứng điều khiển. Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch, bằng cách sử dụng nhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi. Năm 1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học tai Philadelphia là R. Briggs và T. King đã nhân bản vô tính con nòng nọc bằng kỹ thuạt chuyển cấy nhân từ tế bào phôi nang ếch. Từ những năm 1960, J. Gordon đã nhân bản vô tính thành công con ếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào ruột ếch. Đến nay người ta đã thành công trong việc nhân bản vô tính nhiều động vật như cá và cả động vật có vú.[2] 2.2. Nhân bản vô tính động vật có vú Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạ con của mẹ dưới sự nuôi dưỡng qua nhau thai. Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô tính khó khăn và phức tạp hơn các loài động vật khác rất nhiều. Từ những năm 1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đầu tiên là Brown, 1978, tại Anh).[2] Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người ta đã nhân bản thành công đối với chuột từ nhân lấy ở giai đoạn phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã thực hiện thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở giai đoạn phôi. Trước năm 1992, các nhà khoa học cho rằng, đối với động vật có vú chỉ có thể nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạn phôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì tính biệt hóa của chúng là không thể đảo ngược. Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997, khi báo chí công bố con cừu Dolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ tế bào tuyến vú của cừu mẹ trưởng thành 6 năm tuổi do I. Wilmut, Campbel và cộng sự ở Viện Roselin (Scottland) thực hiện. Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến vú của một cừu cái giống Finn Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt hóa. Các tế bào này được nuôi cấy, sau đó được đưa vào môi trường rất nghèo huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào. Đồng thời, một trứng của cừu cái giống Scottish Blackface (Đầu đen) có chu kỳ tế bào ngừng ở kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực và một ít tế bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 370C, hoạt hóa bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn Dorset bằng một loạt xung điện khác. Kết quả tạo thành một phôi. Phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng đã thắt của một cừu cái khác. Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúng được cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly. Điều đáng chú ý là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số đó phát triển được thành cừu con. Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tích trên tế bào chứng minh rằng nó đã 12 năm tuổi.[1,2] 3. Ứng dụng trong lĩnh vực y tế. 3.1. Cấy ghép mô, cơ quan Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần như tất cả mọi bộ phận trên cơ thể con người như mũi, tai, xương, gân, thậm chí cả tim, phổi, não... trong phòng thí nghiệm theo đơn đặt hàng từ các bệnh viện. Giống như việc sản xuất các phụ tùng thay thế của xe hơi hay máy vi tính, giới khoa học gọi đây là "thuật giả kim phân tử của thế kỷ 21". Một vòng dạo quanh các "xưởng chế tạo linh kiện thay thế" Tại một phòng thí nghiệm ở Aberdeen (Anh). Các bác sĩ sau gần nửa tháng làm việc và chờ đợi đã vừa "chế tác" thành công một chiếc mũi dành cho cô gái xinh đẹp người Nigeria 20 tuổi. Cô bị mất chiếc mũi dọc dừa của mình trong ca phẫu thuật ung thư vòm miệng. Cách làm của các bác sĩ ở đây như sau: thoạt đầu, họ nuôi cấy miếng sụn mũi mới dưới da cánh tay cô gái. Khi nó phát triển đến kích thước thích hợp, họ tách nó ra và sau đó sẽ ghép nó vào vị trí mũi cũ trong ca phẫu thuật chỉnh hình mặt cho cô gái sắp được tiến hành. Tương tự, trong phòng thí nghiệm này, người ta cũng đang thử nghiệm tái tạo "hai trái đào tiên" cho nạn nhân của ung thư vú. Còn tại thành phố Worcester, các bác sĩ thuộc Đại học Massachusetts vừa tiến hành xong một cuộc làm mới một mẩu khuỷu tay cho một người đàn ông 37 tuổi sau khi ông bị mất nó vì tai nạn giao thông. Người ta đã lấy vài ba tế bào xương đơn chiếc của nạn nhân cấy vào hỗn hợp polimer rồi ghép nó vào vị trí bị khuyết nơi khuỷu tay nạn nhân. Sau thời gian 3 tháng, tế bào sinh sôi nảy nở và hình thành nên mẩu khuỷu tay y như đã mất, nó hoàn thiện tới mức, bệnh nhân - một họa sĩ chuyên nghiệp - lại có thể vẽ tranh như bình thường. Các nhà công nghệ sinh học thuộc hãng Bio Tissue của Đức từ lâu đã nổi tiếng với kỹ thuật sản xuất những khớp nối của ngón tay. Tại đây, những khớp nối này được nuôi cấy hàng loạt trong các ống nghiệm. Người ta đã sử dụng mẫu sụn và xương lấy từ xương sườn và khớp háng. Sau thời gian 3 tuần, trên khuôn mẫu đã hình thành khớp nối mới, sau đó các bác sĩ phẫu thuật thuộc đại học ở Freiburg ghép thành công cho bệnh nhân bị tai nạn hay bị bệnh phong. Các phòng thí nghiệm và trung tâm công nghệ sinh học tương tự như vậy xuất hiện như nấm sau mưa trên toàn thế giới. "Ngoài mô, sụn, xương, tại những cơ sở đó, người ta còn tạo ra không ít cơ quan nội tạng như: gan, mật, thận, tim, phổi..." - TS. Stanislaw Wronky - nhà thần kinh học Ba Lan, người đầu tiên trên thế giới nuôi cấy thành công đường tiết niệu nhân tạo tiết lộ. Cách đây 3 năm, các bác sĩ địa phương đã ghép sản phẩm đầu tiên cho cậu bé 15 tuổi. Sản phẩm thứ 2 được ghép cho một người đàn ông 24 tuổi - "cả hai đến nay đều hoạt động không có gì phải chê trách" - TS. Wronky khẳng định. Chính ông cũng đã tiến hành các công trình nghiên cứu nuôi cấy da cho các bệnh nhân bị bỏng. Ngay trong năm nay, ông đang triển khai chương trình nuôi cấy thành mạch và các động mạch nhân tạo. Rõ ràng, với những gì vừa được chứng kiến, người ta có thể thấy rằng khoa học và y học đã bắt đầu một kỷ nguyên mới với một gương mặt mới trong đó nhân tố có thể làm thay đổi toàn bộ gương mặt ấy chính là những nhà sinh học tế bào. Chỉ với vài ba tế bào gốc và những ống nghiệm, họ có thể tạo ra những "phiên bản" của sự sống giống y như nguyên bản. "Chúng tôi sẽ có đủ khả năng tái tạo dường như tất cả các mô và bộ phận cơ thể bị thương tổn, thậm chí cả toàn bộ cánh tay" - Jay Vacanti ở Boston tuyên bố. Hiện tại trong khuôn khổ dự án quốc tế mang tên LIFE (Living Implants From Engineering), những thử nghiệm nuôi cấy cơ tim đầu tiên đã được tiến hành với cả hai tâm thất và van tim. Các chuyên gia khẳng định rằng, muộn nhất trong 10 năm tới, công trình sẽ hoàn thành. Những thí nghiệm gây choáng váng cho nhiều người của GS. Makoto Asashima ở Đại học tổng hợp Tokyo là chứng cứ thuyết phục về điều đó: trong phòng làm việc của ông, không ít cơ quan nội tạng đang từng ngày lớn lên trong ống nghiệm không khác gì hạt ngô hạt đỗ. Để nuôi cấy chúng, GS. Makoto sử dụng tế bào gốc có khả năng phát triển thành hầu hết các mô của cơ thể: da, xương, não, gan, hoặc tim. Nhà bác học người Nhật Bản này đổ vào ống nghiệm những chất dinh dưỡng thích hợp như protein và các hormon tăng trưởng (thành phần của chúng được giữ bí mật tuyệt đối), tiếp theo ông đưa vào đó vài ba tế bào gốc. Những tế bào phôi gốc này sẽ tự hình thành ra mô bất kỳ, tùy thuộc vào "khuôn mẫu" mà chúng được nuôi cấy. Khi tế bào bắt đầu hình thành những dạng mô cụ thể, chúng sẽ được đặt vào giữa hai lớp phôi dinh dưỡng khác nhau. Sau một thời gian nhất định, từ những ống nghiệm sẽ xuất hiện các bộ phận thay thế mà ông cần. Trước đó không ai nghĩ rằng lại có thể dễ dàng nuôi cấy những cơ quan phức tạp đến như thế ngay trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều ngạc nhiên lớn hơn là những cơ quan đó lại có thể hoạt động bình thường, thậm chí còn rất "trơn tru" khi được thay thế vào cơ thể sống. Sắp tới đây, các bệnh viện lớn có thể sẽ không còn phải đau đầu đi tìm kiếm những nguồn hiến, tặng mô và nội tạng cơ thể nữa. Thay vì cấy ghép các mô nội tạng lấy từ thi thể người chết, các bác sĩ có thể đặt hàng với các phòng thí nghiệm và trung tâm sinh học, nơi sản xuất hàng loạt những gì họ cần! "Thuật giả kim" này cũng hứa hẹn sẽ tạo nên một cuộc cách mạng trong việc điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh trung ương. Dẫu thực tế vẫn chưa có ai thử nuôi cấy não người trong ống nghiệm nhưng khoa học đã thành công trong nỗ lực ghép tế bào não nhân tạo. TS. Michele Levesque - nhà phẫu thuật thần kinh học ở Los Angeles đã tiến hành ca cấy ghép đầu tiên như thế cho người đàn ông 50 tuổi mắc bệnh liệt rung. Ông đã khoan xương hộp sọ bệnh nhân và lấy ra vài ba chục tế bào gốc. Chúng được nhân lên (tới khoảng 6 triệu) và được tiêm thêm một chất hóa học đặc biệt để biến chúng thành tế bào có khả năng sản xuất ra dopamin. Sau khi cấy lô tế bào đã được "tân trang" này vào não, nồng độ hormon dopamin trong não bệnh nhân tăng lên gần 60%. 6 tháng sau ca cấy ghép, sức khỏe bệnh nhân đã được cải thiện rõ rệt và 3 năm sau, bệnh nhân không còn bất cứ dấu hiệu nào của căn bệnh. Thật là một điều kỳ diệu![6] Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy Nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh là một phương pháp hiệu quả, ít tốn kém so với nhiều phương pháp trong điều trị bỏng. Lần đầu tiên, Viện bỏng Quốc gia đã điều trị thành công cho một bệnh nhân nhờ ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy. Thông tin này được BS Đinh Văn Hân, Viện Bỏng quốc gia báo cáo tại Hội nghị Bỏng và Phẫu thuật tạo hình toàn quốc lần thứ IX, diễn ra trong hai ngày 3 - 4/3/2009 tại Hà Nội. Theo BS Hân, trong bỏng và mất da diện rộng, nguồn da ghép tự thân hạn chế thì trị liệu tế bào là một giải pháp lý tưởng. Tuy nhiên, trước đây, các tế bào biểu mô được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, cần có chi phí rất cao, quy trình nuối cấy phức tạp. Vì thế, các bác sĩ Viện bỏng Quốc gia đã thử nghiệm phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh với mục tiêu tạo tấm tế bào sừng tự thân nuôi cấy để điều trị bỏng và vết thương lâu liền. Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với phương pháp nói trên. Để có được thành công này, các bác sĩ đã tiến hành nuôi cấy trên 17 mẫu da lấy từ người tình nguyện và 7 mẫu da lấy từ bệnh nhân bỏng. BS Hân cho biết, sau khi vệ sinh vùng cho da, lấy 3 - 4cm2 da toàn lớp, da này đã được bảo quản trong môi trường huyết thanh, sau đó tiến hành tách tế bào sừng và tiến hành nuôi cấy. Kết quả cho thấy, các mẫu da tự nguyện có tỷ lệ mọc tế bào sừng ở tuần thứ 1, thứ 2 đều cao hơn bệnh nhân bỏng, với tỷ lệ lần lượt là 70,5%, 57,2%. Còn tỷ lệ cấy chuyển tế bào sừng thành công ở người tình nguyện và bệnh nhân bỏng lần lượt là 91,25%, 100%. Trên những kết quả bước đầu, các bác sĩ đã quyết định tiến hành ghép tế bào sừng tự thân trên bệnh nhân bỏng. Bệnh nhân được chọn là Đỗ Khương V, 22 tuổi, bị bỏng lửa xăng 56% độ 3, 4 thân chi. Sau khi được hồi sức ổn định, bệnh nhân được ghép da khoảng 50cm2. Kết quả ghép da đạt khoảng 76%, phần còn lại bệnh nhân được ghép tế bào sừng. Ngày thứ 3 sau ghép, các tấm tế bào có độ bám rất tốt trên vết thương. Đến ngày thứ 12 sau ghép, tỷ lệ thành công khoảng 80%. Như vậy, sau 12 ngày điều trị bằng cấy ghép tế bào sừng tự thân, vết thương cơ bản đã khỏi. TS Nguyễn Viết Lượng, Trưởng phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Bỏng quốc gia cho rằng, dù chỉ mới là ca đầu tiên, nhưng thành công trên này cho thấy, phương pháp tác lọc, nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh cho kết quả tốt để tách lớp tế bào sừng. Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém hơn phương pháp nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh. Hơn nữa, phương pháp này phù hợp với các labo nghiên cứu tế bào hiện có tại Việt Nam. Vì vậy, Viện bỏng sẽ tiếp tục hoàn thiện quy trình nuôi cấy, mở rộng trong nghiên cứu lâm sàng để ứng dụng trong điều trị bỏng và vết thương lâu liền, đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng. TS Lượng cho biết thêm, tại Viện bỏng Quốc gia mỗi năm khám, điều trị cho khoảng gần 7.000 bệnh nhân. Ngoài sử dụng các phương pháp điều trị truyền thống, y học cổ truyền dân tộc, trong những năm qua, Viện Bỏng đã ứng dụng hơn 30 kỹ thuật tiên tiến vào điều trị bỏng như: cắt bỏ hoại tử, ghép da sớm, ghép da đồng loại, ghép da mảnh siêu nhỏ, điều trị nhiễm độc, kỹ thuật nuôi dưỡng sớm... đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng. [7] Hình 3: Bệnh nhân bỏng sẽ có thêm cơ hội điều trị khi kỹ thuật mới này tiếp tục được nghiên cứu, ứng dụng rộng vào thực tế (Ảnh:Hồng Hải) 3.2. Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất: Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiều thử nghiệm, trong đó có giai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, khỉ,… Các thử nghiệm này đã gặp phải sử phản đối kịch liệt của các phong trào bảo vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm này nhiều khi không thể mở rộng trên người, thí nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ ra hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất kỳ loại tế bào nào. 3.3. Nuôi cấy tế bào trong độc chất học: Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc. 3.4. Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học: Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học. Các vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có những đóng góp cho lĩnh vực y tế cộng đồng trên thế giới mà điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em, trong ngành thú y là vaccine ngừa bệnh lở mồm long móng ở gia súc. Để sản xuất vaccine, người ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa. Sau đó, virus được ly trích và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng làm vaccine.[1] PHẦN III: KẾT LUẬN 1. Kết luận: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật được ra đời và hoàn thiện muộn hơn những lĩnh vực khác của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ tế bào nói riêng. Điều này bắt nguồn từ lý do cơ bản là tính toàn năng của tế bào động vật khó biểu hiện ở tế bào trưởng thành, chỉ biểu hiện rõ ở tế bào gốc phôi. Mặc dù ra đời muộn nhưng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã mở ra nhiều hướng ứng dụng quan trọng trong đời sống của con người: Nhân bản các nguồn gen quý hiếm, tạo động vật chuyển gen phục vụ chăn nuôi, thử nghiệm các loại hóa chất trị bệnh trước khi đưa vào sử dụng, sản xuất các loại vaccine và đặc biệt, nó đã giúp con người rất nhiều trong vấn đề điều trị các bệnh nan y, thay thế các cơ quan, bộ phận của cơ thể bị tổn thương hoặc thậm chí đã có thể tạo được con người hoàn chỉnh bằng phương pháp nhân bản vô tính. Tuy nhiên, vấn đề này đang gặp phải rất nhiều trở ngại đặc biệt là về đạo đức sinh học. 2. Kiến nghị: Mặc dù đã cố gắng dành thời gian tìm hiểu vấn đề này nhưng tôi thấy kiến thức và hiểu biết của mình trong lĩnh vực này còn quá mới và quá ít. Vì vậy, mong muốn của bản thân tôi là được tiếp tục tìm hiểu vấn đề này trong tương lai ở một cấp độ cao hơn, quy mô rộng hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Đắc Chứng – Sinh sản và phát triển cá thể động vật – NXB ĐH Huế, 2007. PGS. TS. Nguyễn Như Hiền – Công nghệ sinh học, tập 1: Sinh học phân tử và tế bào, Cơ sở khoa học của công nghệ sinh học – NXB Giáo dục, 2007. Nguyễn Hoàng Lộc - Công nghệ tế bào – NXB ĐH Huế, 2006 Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc - Công nghệ sinh học trên người và động vật – NXB Giáo dục, 2007. GS. TS. Vũ Văn Vụ, PGS. TS. Nguyễn Mộng Hùng - Công nghệ sinh học, tập 2: CNSH tế bào – NXB Giáo dục, 2006. Minh Giang - Chế tạo “linh kiện người” - Cuộc cách mạng trong y học – ( /Thong-tin-can-biet/Y-hoc-the-gioi/Che-tao-linh-kien-nguoi-Cuoc -cach-mang-trong-y-hoc.html) Hồng Hải – Ghép thành công tế bào tự thân nuôi cấy – (