Luận án Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ

Cancer. 2010;116(21):5012- 5021. 111. Othus M, Mukherjee S, Sekeres M, et al. Prediction of CR following a second course of ‘7+ 3’in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia not in CR after a first course. Leukemia. 2016;30(8):1779-1780. 112. Ngô Ngọc Ngân Linh. Tình hình nhiễm khuẩn trên bệnh nhân điều trị đặc hiệu bệnh bạch cầu cấp tại khoa lâm sàng người lớn, bệnh viện Truyền máu-Huyết học, Tp. Hồ Chí Minh, từ 6/2010 đến 2/2011. Y Học Tp Hồ Chí Minh. 2011;15(4):182-187. 113. Chen Y, Xu Y, Fu G, et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for patients with acute leukemia. Chin J Cancer Res. 2013;25(4):389- 396.doi:10.3978/j.issn.1000-9604.2013.07.01 114. Ali MM, Abounader DM, Rybicki LA, et al. Comparative effectiveness of busulfan and fludarabine versus fludarabine and 400 cGy total body irradiation conditioning regimens for acute myeloid leukemia/myelodysplastic syndrome. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2017;23(5):776- 781. 115. Patel SS, Rybicki L, Pohlman B, et al. Comparative effectiveness of busulfan/cyclophosphamide versus busulfan/fludarabine myeloablative conditioning for allogeneic hematopoietic cell transplantation in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome. Hematology/Oncology and Stem Cell Therapy. 2020;13(3):160-165. 116. Forman SJ, Rowe JM. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 2013;121(7):1077-1082. 117. Estey EH. Acute myeloid leukemia: 2019 update on risk‐ stratification and management. American Journal of Hematology. 2018;93(10):1267-1291. PHỤ LỤC 1 PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU  Đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY NGƯỜI LỚN THEO PHÂN NHÓM NGUY CƠ  Nghiên cứu sinh: LẠI THỊ THANH THẢO  Ngành: Nội khoa (Huyết học) - Mã số: 9720107 Mẫu nghiên cứu số: ... Mã bệnh nhân/Số nhập viện: ....... Mã lưu mẫu DTHTB – SHPT: ....... 1. Họ và tên (viết tắt tên): 2. Giới tính: □ Nam □ Nữ 3. Năm sinh: SĐT: 4. Địa chỉ: 5. Nghề nghiệp: 6. Khoa: ....... Bệnh viện: 7. Lí do nhập viện: 8. Tiền căn: Bệnh Điều trị □ Tăng huyết áp □ Bệnh tim thiếu máu cục bộ □ Đái tháo đường □ Viêm/loét dạ dày tá tràng □ Viêm gan siêu vi B □ Viêm gan siêu vi C □ Khác: ...................................... .................................................... 9. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG LÚC NHẬP VIỆN:  Cân nặng: ......... kg; Chiều cao: ......... cm; BMI: ........... kg/m2  ECOG: ............. điểm; Karnofski: ............... %  Thiếu máu □ Có □ Không  Ghi chú: .........................................................  Xuất huyết □ Có □ Không  Ghi chú: ..........................................................  Sốt □ Có □ Không  Nhiệt độ: .................... Thời gian: ........ ngày  Gan to ( cm) □ Có □ Không  Lách to ( cm) □ Có □ Không  Độ: ...........................................  Hạch to □ Có □ Không □ Cổ □ Nách □ Bẹn □ Khác: ..............  Phì đại nướu răng □ Có □ Không  Đau xương □ Có □ Không  Vị trí:  Thâm nhiễm TKTW: □ Có □ Không □ Đau đầu □ Cổ gượng □ Dấu thần kinh định vị: ...................  Thâm nhiễm da: □ Có □ Không  Vị trí:  Sụt cân: □ Có □ Không  Số kg/thời gian:  Vã mồ hôi: □ Có □ Không  Khác: 10. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC TRƯỚC ĐIỀU TRỊ:  Huyết đồ: HC: T/L; Hb: g/dL MCV: fL; MCH: pcg; MCHC: . g/L TC: G/L BC: G/L; Neu: G/L; Mono: G/L Lympho: G/L Eso: G/L; Baso: G/L; LUC: G/L  Phết máu ngoại biên: Tỉ lệ blast trong phết máu ngoại biên: Khác:  Nhóm máu:  Sinh hoá máu và ion đồ: Glucose máu: mg/dl (umol/L) Ure: mg/dl (umol/L); Creatinin: mg/dl (umol/L) AST: U/L; AST: U/L Bilirubin (TP: ......; TT: .......; GT: .......) (mg/dl) LDH máu: ....... U/L; Acid uric máu: ........ mg/dl (umol/L) Na+: ...... K+: ....... Cl-: ....... Ca2+: ....... (mmol/l) Khác:  Siêu vi: HBsAg: ... HBcAb: ... Anti HCV: ... Anti HIV: .... EBV: □ IgM □ IgG CMV: □ IgM □ IgG Khác:  Tủy đồ: Mật độ tế bào tủy: Tỉ lệ blast: % Phân loại theo FAB: Nhuộm hóa tế bào: Peroxydase: Sudan: PAS: Khác:  Dấu ấn miễn dịch: ................................................................................................................ Kết luận: Kiểu hình LAIPs: ................................................................................  TPTNT:  Đông máu: APTT .... s; PT ..... s; INR .....; Fibrinogen .... g/L; D-Dimer: ... ng/ml  Hình ảnh học: X-quang ngực thẳng: Siêu âm bụng: ECG: Siêu âm tim: Khác: 11. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN TẾ BÀO VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ:  Karyotype: .................................................................  FISH: ..............................................................................  PCR: .........................................................................  Đột biến gen FLT3-ITD: Số cặp base chèn vào gen FLT: Vị trí đoạn chèn: Lượng allele mang đột biến FLT3-ITD (%):  Đột biến gen FLT3-TKD: □ Có □ Không Dạng đột biến: Vị trí:  Đột biến NPM1: □ Có □ Không Dạng đột biến: Vị trí: □ Type A □ Type B □ Type D □ Type khác  Đột biến CEPBA: □ Có □ Không □ 1 đột biến: □ 2 đột biến:  Đột biến TP53: □ Có □ Không  Đột biến ASXL1: □ Có □ Không  Đột biến RUNX1: □ Có □ Không 12. CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH: ............................................................................................................. 13. ĐẶC ĐIỂM ĐIỀU TRỊ Đặc điểm Giai đoạn Tấn công Sau tấn công Tăng cường 1 Tăng cường 2 Tăng cường 3 Giảm nhẹ Thời gian từ lúc có triệu chứng đến nhập viện (ngày) Thời gian từ lúc chẩn đoán đến khi hoá trị (ngày) Lí do hoãn hoá trị (nếu có) Phác đồ (ghi rõ tên)  Liều Daunorubicine (mg/m2da)  Liều Cytarabine (mg/m2da)  Liều Idarubicine (mg/m2da)  Liều Mitoxatrone (mg/m2da) Ngày nhập viện Đặc điểm Giai đoạn Tấn công Sau tấn công Tăng cường 1 Tăng cường 2 Tăng cường 3 Giảm nhẹ Ngày bắt đầu hoá trị Thời gian nằm viện (ngày) Ngày hồi phục BCH Ngày hồi phục TC Biến chứng (ghi rõ LS và XN)  Gan  Thận  Tim  Nhiễm trùng  Cơ quan  Tác nhân Thời gian điều trị KSTM (ngày)  Tên kháng sinh Thời gian điều trị kháng nấm (ngày)  Tên kháng nấm Tủy đồ (mật độ tuỷ và blast)  N14 Đặc điểm Giai đoạn Tấn công Sau tấn công Tăng cường 1 Tăng cường 2 Tăng cường 3 Giảm nhẹ  N21 14. ĐẶC ĐIỂM ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ Đặc điểm Giai đoạn Tấn công Tăng cường 1 Tăng cường 2 Tăng cường 3 Đáp ứng □ LBHT □ LBMP □ KĐLB □ Tử vong □ LBHT □ LBMP □ KĐLB □ Tử vong □ LBHT □ LBMP □ KĐLB □ Tử vong □ LBHT □ LBMP □ KĐLB □ Tử vong Tủy đồ (mật độ tuỷ và blast)  N28  N35 Dấu ấn miễn dịch  MRD (%)  Kết luận Sinh học phân tử  Đột biến gen  Karyotype Ngày xuất viện Đặc điểm Giai đoạn Tấn công Tăng cường 1 Tăng cường 2 Tăng cường 3 Ghi chú 15. GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI:  Ngày nhập viện:  Chẩn đoán trước ghép:  Điểm HCT – CI hiệu chỉnh theo tuổi:  Chỉ số nguy cơ bệnh tật (DRI):  Điều trị trước ghép:  Lâm sàng:  Cân nặng: kg; Chiều cao:................ cm; BSA: ......................... m2  ECOG: điểm; Karnofski: ............................................ %  Xét nghiệm  Huyết đồ: HC: T/L; Hb: g/dL MCV: fL; MCH: pcg; MCHC: . g/L TC: G/L BC: G/L; Neu: G/L; Mono: G/L Lympho: G/L; Eso: G/L; Baso: G/L; LUC: G/L  Phết máu ngoại biên: Tỉ lệ blast trong phết máu ngoại biên:  Nhóm máu:  Sinh hoá máu và ion đồ: Glucose máu: mg/dl (umol/L) Ure: mg/dl (umol/L); Creatinin: mg/dl (umol/L) AST: U/L; AST: U/L Ferritin: ....... ng/mL Bilirubin (TP: ......; TT: .......; GT: .......) (mg/dl) LDH máu: ....... U/L; Acid uric máu: ........ mg/dl (umol/L) Na+: ...... K+: ....... Cl-: ....... Ca2+: ....... (mmol/l). Khác:  Siêu vi: HBsAg: .............. AntiHBs: .............. HBcAb total: .............. Anti HCV: .......... Anti HIV: .............. HTLV 1 – 2: .............. Giang mai: .......... KST sốt rét: ........... EBV: □ IgM □ IgG CMV: □ IgM □ IgG Toxoplasma □ IgM □ IgG Khác:  Đông máu toàn bộ: APTT .... s; PT ..... s; INR ......; Fibrinogen ....... g/L  Miễn dịch: Coomb trực tiếp: Hiệu giá kháng thể kháng HLA (nếu có): Hiệu giá kháng thể kháng anti A/B (nếu có):  Hình ảnh học: Xq ngực thẳng: Siêu âm bụng: ECG: Siêu âm tim: MRI - T2*: Khác:  Đặc điểm người cho TBG:  Quan hệ với BN:  Giới tính: Năm sinh: ..................... Nhóm máu ................  Từng mang thai: □ Không □ Có, .......... lần.  Tiền căn bệnh lí:  HLA người bệnh:  HLA người cho:  Phù hợp HLA: ..../10  Siêu vi HBsAg: .............. AntiHBs: .............. HBcAb total: .............. Anti HCV: .......... Anti HIV: .............. HTLV 1 – 2: .............. Giang mai: .......... KST sốt rét: ........... EBV: □ IgM □ IgG CMV: □ IgM □ IgG Toxoplasma □ IgM □ IgG Khác:  Nguồn TBG: □ Máu ngoại vi □ Tuỷ xương □ Máu cuống rốn  Kiểu ghép: □ Sibling □ Haplo □ Unrelated  Kết quả thu thập TBG:  Phác đồ điều kiện hóa:  Liều CD34+ truyền:  Dự phòng GvHD:  Ngày truyền tế bào gốc (N0):  Số ngày giảm bạch cầu hạt (< 1,5 G/L):  Ngày hồi phục bạch cầu hạt:  Số ngày giảm tiểu cầu (< 20 G/L):  Ngày hồi phục tiểu cầu:  Biến chứng trong giai đoạn ghép: □ Buồn nôn, nôn. □ Viêm loét niêm mạc miệng. □ Nhiễm trùng, nhiễm nấm, nhiễm virus.  Ổ nhiễm:  Phân lập được tác nhân: □ Không □ Có:  Thời gian điều trị KSTM:  Loại kháng sinh:  Thời gian điều trị kháng nấm:  Loại kháng nấm:  Số ngày sử dụng kháng vi-rút:  Loại kháng virus: □ Tái hoạt CMV (N ....). □ Viêm bàng quang xuất huyết. □ Bệnh mảnh ghép chống ký chủ cấp (aGVHD) (N ....).  Vị trí: Độ: ....................................... □ Bệnh mảnh ghép chống ký chủ mạn (cGVHD) (N ....).  Vị trí: Độ: ....................................... □ Bệnh lí tắc tĩnh mạch trên gan (VOD). □ Hội chứng rò rỉ mao mạch (CLS). □ Hội chứng mọc mảnh ghép. □ Xuất huyết phế nang lan toả. □ Bệnh vi mạch huyết khối. □ Hội chứng viêm phổi vô căn. □ Khác:  Chimerism:  Ngày xuất viện:  Số ngày nằm viện:  Điều trị sau ghép TBG: □ Có □ Không  Thời gian (bắt đầu – kết thúc):  Thuốc: 16. ĐẶC ĐIỂM GIAI ĐOẠN TÁI PHÁT:  Ngày tái phát:  Vị trí tái phát  Giai đoạn tái phát:  Phương pháp điều trị: □ Hóa trị □ Ghép TBG □ Giảm nhẹ □ Triệu chứng  Phác đồ hóa trị  Đánh giá đáp ứng sau giai đoạn tái phát: □ LBHT □ LBMP □ KĐLB □ Tử vong  Tủy đồ: Mật độ tế bào tủy: Tỉ lệ tế bào blast trong tủy: . %  Dấu ấn miễn dịch: MRD: . % Kết luận:  Sinh học phân tử: ..................................................................................................... 17. Tình trạng hiện tại (Ngày quan sát: .................................): □ LBHT □ Tái phát □ Tử vong 18. Ngày tử vong:  Lí do tử vong: Tp. HCM, ngày. tháng năm. Người thu thập PHỤ LỤC 3 BẢN THÔNG TIN DÀNH CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU VÀ CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tên nghiên cứu: Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ Nghiên cứu viên chính: Lại Thị Thanh Thảo Đơn vị chủ trì: Đại học Y Dược Tp. HCM I. THÔNG TIN VỀ NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu này được tiến hành với mong muốn xác định việc đánh giá hiệu quả điều trị của bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy từ 16 tuổi trở lên dựa theo phân nhóm di truyền học và đột biến gen ở Việt Nam có chính xác và hợp lí hay không? - Chúng tôi tiến hành thu thập thông tin của người tham gia nghiên cứu từ hồ sơ bệnh án của tất cả bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy mới được chẩn đoán tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học và bệnh viện Chợ Rẫy, nhập viện từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2021. - Chúng tôi ghi nhận các triệu chứng lâm sàng và các kết quả xét nghiệm, kể cả xét nghiệm di truyền tế bào (nhiễm sắc thể đồ) và theo sinh học phân tử (đột biến gen). Sau đó, chúng tôi đánh giá hiệu quả điều trị (lui bệnh hoàn toàn, lui bệnh một phần, không lui bệnh, tái phát, tử vong) sau đợt hóa trị đầu tiên, sau hóa trị củng cố 03 chu kì cytarabine liều cao và sau một năm điều trị. - Người tham gia nghiên cứu sẽ không gặp phải những nguy cơ và bất lợi nào trong suốt quá trình tham gia nghiên cứu vì nghiên cứu không can thiệp vào quá trình chẩn đoán, điều trị và theo dõi bệnh. - Người tham gia nghiên cứu được chẩn đoán bệnh, được tiến hành điều trị và theo dõi hiệu quả điều trị theo phác đồ điều trị thường quy của bệnh viện; do đó bệnh nhân có thể đạt được hiệu quả điều trị chuẩn nhất; đồng thời giúp cho những bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy mới được chẩn đoán về sau có thể được chẩn đoán bệnh, theo dõi hiệu quả điều trị một cách chuẩn hơn. - Họ tên người cần liên hệ: Lại Thị Thanh Thảo - Số điện thoại: 0919197263 - Nghiên cứu được thực hiện trên tinh thần tự nguyện tham gia, người tham gia nghiên cứu hoặc người đại diện hợp pháp của người tham gia nghiên cứu được quyền rút khỏi nghiên cứu bất kỳ khi nào. - Trong trường hợp là người vị thành niên, việc lấy bản chấp thuận tham gia từ người đại diện hợp pháp. Họ và tên của người đại diện hợp pháp: Và số điện thoại: - Thông tin về hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được bảo mật bởi người làm nghiên cứu và không được sử dụng cho bất kì mục đích nào khác. II. CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi đã đọc và hiểu thông tin trên đây, đã có cơ hội xem xét và đặt câu hỏi về thông tin liên quan đến nội dung trong nghiên cứu này. Tôi đã nói chuyện trực tiếp với nghiên cứu viên và được trả lời thỏa đáng tất cả các câu hỏi. Tôi chấp thuận tham gia nghiên cứu này. Chữ ký của người tham gia: Họ tên: __________________ Chữ ký ___________________ Ngày tháng năm _________________ Chữ ký của người đại diện hợp pháp (đối với người tham gia từ 16 đến 18 tuổi): Họ tên: __________________ Chữ ký ___________________ Ngày tháng năm _________________ Chữ ký của Nghiên cứu viên/ Người lấy chấp thuận: Tôi, người ký tên dưới đây, xác nhận rằng bệnh nhân/người tình nguyện tham gia nghiên cứu ký bản chấp thuận đã đọc toàn bộ bản thông tin trên đây, các thông tin này đã được giải thích cặn kẽ cho Ông/Bà và Ông/Bà đã hiểu rõ bản chất, các nguy cơ và lợi ích của việc Ông/Bà tham gia vào nghiên cứu này. Họ tên: ___________________ Chữ ký ___________________ Ngày tháng năm _________________ PHỤ LỤC 4 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ, KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG VÀ ĐỘT BIẾN GEN 1. Vật liệu xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ và đột biến gen Bảng 1. Vật liệu xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ và đột biến gen Dụng cụ Thiết bị Hóa chất 1 Falcon 15 Ml 1 Bể ổn nhiệt 1 KCl 2 Falcon 50 mL 2 Máy li tâm 2 HCl 1N 3 Coplin Jar 3 Tủ ủ 37oC 3 NaOH 1N 4 Eppendorf 1,5 mL 4 Máy khuấy từ 4 KH2PO4 5 Micropipet 1 - 10 µL 5 Máy đo pH 5 NaCl 6 Micropipet 10 - 100 µL 6 Máy lai Thermo 6 Na3C6H5O7.2H2O 7 Micropipet 20 - 200 µL 7 Buồng thao tác vô trùng 7 Acid acetic 8 Micropipet 100 - 1000 µL 8 Kính hiển vi ngược 8 Methanol 9 Lam mài 9 Kính hiển vi quang học 9 Cồn 70% 10 Lamen 22 x 22 mm 10 Cân điện tử 10 Nước cất 11 Kẹp 11 Tủ sấy lam 11 Trypsin 2,5% 12 Hộp nhựa 12 Hệ thống kính hiển vi BX51 12 Giemsa 13 Giấy bạc 13 Máy vi tính có phần mềm phân tích NST Ikaros và phần mềm phân tích FISH Isis MetaSystem 13 Democolcine solution 14 Buồng đếm Nerbauer 14 Máy in 14 Tupe Heparin 300UI 15 Pipette tự động 15 Tủ lạnh 4oC 15 Dầu soi kính hiển vi 16 Đĩa 96 giếng 16 Tủ âm sâu -30oC 16 DAPPI 17 Pipette nhựa 17 PPD 18 Đầu bóp cao su 18 Môi trường Marrow Max 19 Giá đựng ống nghiệm 19 NP40 20 Bình xịt tia 21 Khăn mềm 22 Gạc 23 Hộp đựng lam 2. Nhiễm sắc thể đồ Nhiễm sắc thể đồ (NST) đồ là bản ghi lại hình dáng của toàn bộ các NST trong một tế bào. Phương pháp này sử dụng hóa chất colchicine (Demecolchin) làm ngừng quá trình phân bào tại giai đoạn metaphase, thời điểm mà các NST cuộn xoắn cực đại, nhờ đó có thể xác định được số lượng, hình dạng và cấu trúc của các NST. Do đó, Kỹ thuật này giúp phát hiện các bất thường về số lượng NST, cấu trúc, các bất thường phức tạp. Có nhiều phương pháp nhuộm băng như băng G, băng Q, băng C, băng RTrong đó nhuộm băng G được sử dụng rộng rãi để đánh giá các bất thường về số lượng và cấu trúc NST. Các bước thực hiện bao gồm:  Quy trình lấy mẫu và nuôi cấy tế bào Nguyên tắc: tế bào được nuôi cấy và kích thích phân chia sau 24 – 48 giờ đối với mẫu tủy xương. Ở cuối kỳ đầu và kỳ giữa của nguyên phân, NST co xoắn cực đại và tập trung ở thoi vô sắc. Làm ngừng quá trình phân chia này để thu hoạch NST. Cách lấy mẫu: 1 - 2 mL tủy xương hoặc máu ngoại biên (nếu tỉ lệ tương bào hiện diện trong máu ≥ 10%) được lấy trong tube chống đông Heparin 300 UI và được chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ. Chuẩn bị môi trường: MarrowMAXTM có L-Glutamine và Gentamicine Sulfate, chia đều vào các falcon 15 mL và được đưa về 37°C trước khi cấy. Đếm số tế bào có nhân trong 1 mL mẫu bằng buồng đếm Neubauer. Pha loãng 10 µL mẫu với 90 µL PBS , hút 10 µL dịch pha loãng trộn với 90 µL Turk, hút 10 µL cho vào buồng đếm tế bào, đếm tế bào có nhân. Nếu gọi M là tổng số tế bào đếm được trên 4 ô lớn ở 4 góc của buồng đếm, thì số tế bào trong 1 mL mẫu được tính theo công thức: Cấy tế bào: Mỗi falcon cấy có thể tích 5 mL bao gồm môi trường và thể tích mẫu V (được suy ra từ số tế bào N). Falcon cấy được ủ trong tủ 37°C, 5% CO2 trong 24 – 48 giờ.  Quy trình thu hoạch tế bào Nguyên tắc: Sử dụng democolcine gây ức chế hình thành thoi vô sắc, làm cho tế bào đang phân chia dừng lại ở kì giữa nguyên phân để thu nhận NST. Dùng KCl 0,075 M sốc nhược trương để làm trương phồng và phá vỡ tế bào, các NST sẽ phân tán và không xếp chồng lên nhau. Sơ đồ 4.1. Quy trình thu hoạch tế bào (thu nhận NST)  Quy trình nhuộm băng G Nguyên tắc: Enzyme trypsine thủy phân một số protein trên NST, làm nới lỏng cấu trúc NST, cho phép Giemsa liên kết và và bắt màu với DNA, tạo các vùng băng sáng tối khác nhau đặc trưng cho từng NST. Các băng nhạt thể hiện vùng giàu chất nhiễm sắc G-C, các băng sẫm thể hiện vùng tập trung chất dị nhiễm sắc A-T. Trước khi nhuộm, tiêu bản sau cần được làm già ở 56°C trong vòng 4 giờ, sau đó sẽ xử lý lần lượt trong 4 cốc với thời gian thích hợp: Cốc 1: Nhúng tiêu bản trong 5 mL dung dịch trypsin 0,1% (tỉ lệ dung dịch trypsin 2,5%/dung dịch đệm phosphate pH 6,8 = 1:24) khoảng 1 phút 10 giây – đến 1 phút 20 giây. Cốc 2: chuyển tiêu bản qua cốc chứa 5 mL dung dịch đệm phosphate pH 6,8 lạnh, lắc khoảng 20 giây. Cốc 3: chuyển tiêu bản qua cốc chứa 5 mL dung dịch đệm phosphate pH 6,8 lạnh, lắc khoảng 20 giây. Cốc 4: ngâm tiêu bản trong 5 mL dung dịch Giemsa 10% (tỉ lệ dung dịch Giemsa/dung dịch đệm phosphate pH 6,4 = 1:9) 5 phút. Rửa sạch tiêu bản dưới vòi nước. Để khô tiêu bản.  Phân tích NST Tiêu bản sao khi nhuộm băng G sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học, tìm các tế bào ở kì giữa có NST dàn đều và ghi nhận lại tọa độ. Trung bình mỗi mẫu phân tích 20 cụm NST. Phát hiện và phân tích các rối loạn cấu trúc NST trong khi đếm số lượng NST. Lập karyotype: chụp ảnh, phóng ảnh, cắt rời từng chiếc NST, sau đó xếp từng cặp NST bằng kính hiển vi quang điện tử BX51 có kết nối với hệ thống camera, thu nhận hình ảnh qua phần mềm phân tích NST (phần mềm Ikaros - MetaSystems, Đức). Mô tả kết quả NST của mỗi BN bằng quy ước của danh pháp di truyền học quốc tế ISCN 2009. 3. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) là xét nghiệm nhằm phát hiện sự có mặt của một trình tự DNA đặc hiệu trên NST bằng cách sử dụng những đoạn dò (probes) được gắn huỳnh quang có trình tự bổ sung với đoạn DNA đặc hiệu cần phát hiện. Các tín hiệu huỳnh quang sẽ được phát hiện trên kính hiển vi nếu tồn tại đoạn DNA đặc hiệu. Kỹ thuật được tiến hành theo các bước sau: Sơ đồ 4.2. Quy trình kỹ thuật FISH  Cách lấy mẫu Lấy 1 - 2 mL tủy xương trong tube chống đông Heparin 300 UI và chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 4 giờ.  Quy trình thu hoạch tế bào Nguyên tắc: dùng sốc nhược trương bằng dung dịch KCl 0,075 M cho nước vào trong tế bào, làm tế bào căng phồng lên. Sau đó tế bào sẽ được cố định bằng dung dịch Carnoy (Methanol:Acid acetic với tỉ lệ 3:1), rửa sạch và nhỏ tiêu bản. Sơ đồ 4.3. Quy trình thu hoạch tế bào (kỹ thuật FISH)  Lai hóa với đoạn dò đặc hiệu Đánh dấu vùng tế bào cần lai trên lam. Các probe sử dụng lai hóa: Cytocell EVI1 breakapart, Cytocell del(5q) deletion, Cytocell del(7q) deletion, Cytocell AML1/ETO translocation, dual fusion, Cytocell CBFB/MYH11 translocation, dual fusion, Cytocell MLL breakapart. Vortex nhanh và spindown dung dịch. Nhỏ 4 µL dung dịch probe lên vùng đã đánh dấu trên lam. Phủ lamen kích thước 4 x 4 mm vào vùng vừa nhỏ dung dịch probe, dán keo xung quanh lamen. Đặt tiêu bản vào máy Thermo Brite biến tính đã cài nhiệt độ 77°C trong 7 phút. Chuyển tiêu bản vào hộp được làm ẩm ở tủ ủ 37°C từ 19 – 20 tiếng đồng hồ để lai hóa.  Rửa sau lai hóa: Chuẩn bị dung dịch rửa probe: • Corplin jar 1 chứa dung dịch 0,4 x SSC/0,3% NP ~ 40 đặt trong bể ổn nhiệt 75°C trong 60 phút. • Corplin jar 2 chứa dung dịch 2 x SSC/0,1% NP ~ 40 đặt ở nhiệt độ phòng. • Corplin jar 3 chứa dung dịch 4 x SSC để ở nhiệt độ phòng. Tiến hành rửa: • Lấy tiêu bản sau khi ủ, gỡ bỏ keo và lamen bằng kẹp, cho vào corplin jar 1 rửa trong 2 phút, lắc nhẹ tiêu bản. • Chuyển qua corplin jar 2 rửa trong 1 phút, lắc nhẹ tiêu bản. • Để khô tiêu bản, sau đó nhỏ 10 µL dung dịch DAPI 125 ng/ml lên vùng tiêu bản đã đánh dấu, để 1 phút. • Chuyển qua corplin jar 3 rửa nhanh trong 5 giây. • Để khô tiêu bản, tiếp tục nhỏ 10 µL dung dịch PPD lên vùng tiêu bản đã đánh dấu. • Đậy lamen 22 x 22 mm lên vùng tiêu bản có PPD. • Giữ tiêu bản trong hộp tránh sang tuyệt đối ở -20°C trong 45 - 60 phút trước khi phân tích kết quả.  Phân tích kết quả Quan sát và phân tích bằng bằng hệ thống kính hiển vi BX51, máy vi tính và phần mềm phân tích Isis, MetaSystem. 4. RT-PCR các tổ hợp gen và giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger  Ly trích RNA, tổng hợp cDNA Mẫu tủy xương hoặc máu ngoại biên được lấy trong chống đông EDTA. Thực hiện tách chiết RNA bằng Invitrap Spin Universal RNA Mini Kit (Stractec, Đức) theo các bước sau.  Mẫu được thực hiện trong buồng ly trích và xử lý loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch red cell lysis bufer.  Đếm tế bào bạch cầu bằng buồng đếm Neubeur sau đó lấy lượng tế bào khoảng 1 × 107 cho ly trích RNA.  Cho 900 µl Lysis Solution TR vào tube chứa cặn tế bào dùng để ly trích RNA, trộn đều bằng pipette, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.  Ly tâm 11000 vòng, 1 phút, ở nhiệt độ phòng.  Hút dịch trên cho vào tube 2 ml mới (khoảng 650 µl) thêm Ethanol 96- 100% theo tỉ lệ 1:1, trộn đều bằng pipette.  Chuẩn bị cột spin lọc được cung cấp từ kit, hút 800 µl hỗn hợp dung dịch trên vào spin lọc.  Ly tâm 11000 vòng, 1 phút, ở nhiệt độ phòng.  Đổ bỏ dịch, ly tâm 11000 vòng, 1 phút, ở nhiệt độ phòng.  Chuyển spin lọc qua tube 2 ml mới, thêm 600 µl dung dịch Wash Buffer R1.  Ly tâm 9300 vòng, 30 giây, nhiệt độ phòng.  Chuyển Spin lọc qua tube 2 ml mới, thêm 600 µl dung dịch Wash Buffer R2.  Ly tâm 11000 vòng, 1 phút, nhiệt độ phòng.  Đổ bỏ dịch dưới, ly tâm 11000 vòng, 2 phút, nhiệt độ phòng.  Chuyển spin lọc vào tube 1,5 ml mới (tube dùng lưu trữ RNA).  Thêm 30 µl Elution Buffer R giữ ở nhiệt độ phòng 20 phút.  Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.  Ly tâm 11000 vòng, 1 phút, nhiệt độ phòng.  Bỏ spin lọc, thu RNA. Tiến hành tổng hợp cDNA hoặc lưu trữ ở -80°C.  Thực hiện pha mix phản ứng vào tube 0,2 ml đặt trong khay đá các thành phần như sau theo hướng dẫn của nhà sản xuất PrimeScript RT Master Mix kit:  3 µL Rnase Free dH2O,  2 µL 5X PrimeScript RT Master Mix  5 µL RNA.  Dung dịch trên được ủ bằng máy luân nhiệt ABI 2720 theo chu trình luân nhiệt sau: 37°C trong 15 phút, 85°C trong 5 giây, và duy trì ở 4°C cho đến khi lấy ra khỏi máy. cDNA được lưu trữ ở -20°C đến khi sử dụng.  Ly trích DNA Tách chiết DNA từ máu ngoại biên bằng ReliaPrepTM Blood gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm.  Chỉnh nhiệt độ máy ủ ổn định ở 56oC.  Trộn đều mẫu máu hoặc tủy bằng cách vortex nhẹ 10 giây.  Cho vào ống nghiệm 1,5 ml các chất sau: 20 µl Proteinase K, 200 µl mẫu máu hoặc tủy, và 200 µl Cell Lysis Buffer. Trộn đều bằng máy vortex 10 giây. Spin nhẹ bằng máy spindown để kéo toàn bộ dịch trên thành ống nghiệm xuống. Ủ 10 phút ở 56oC.  Chuẩn bị cột lọc ReliaPrepTM binding column và Collection tube.  Thêm 250 µl Binding Buffer vào ống nghiệm 1,5 ml chứa mẫu, Proteinase K và Cell Lysis Buffer. Trộn đều bằng máy vortex 10 giây, spin nhẹ bằng máy spindown.  Chuyển toàn bộ hỗn hợp mẫu vào cột lọc đã chuẩn bị ở trên và ly tâm tube có cột lọc ở 14200 rpm/phút trong 1 phút.  Ly tâm tube có cột lọc thêm 1 phút ở 14200 rpm/phút để chắc chắn loại bỏ hết dịch phía trên màng.  Chuyển cột lọc qua Collection tube mới, thêm 500 µl Column Wash Solution và ly tâm ở 14200 rpm/phút trong 3 phút, lặp lại bước này thêm 2 lần.  Chuyển cột lọc vào ống nghiệm 1,5 ml mới (có ghi mã số, tên BN, loại mẫu và ngày thực hiện). Cho 100µl Nuclease-Free Water vào giữa cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.  Ly tâm 1 phút ở 14200 rpm/phút để thu DNA.  Mẫu DNA còn lại được lưu trữ ở -180C đến -22oC trong 2 năm.  Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu Mỗi tube PCR có thể tích 25 l chứa các thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho mỗi loại), 2 mồi xuôi và ngược (0,5 M cho mỗi loại), 1,25 U TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và cDNA/DNA, bổ sung betain theo nồng độ 1M cho phản ứng khuếch đại các đoạn gen RUNX1. Tiến hành chạy phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế chuyên biệt cho từng gen. Chu kỳ luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) bao gồm 980C trong 3 phút; theo sau là 40 chu kỳ của 980C trong 10 giây, nhiệt độ bắt cặp mồi trong 30 giây và 720C trong 1 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72oC trong 3 phút, duy trì ở 4oC. Sản phẩm PCR sau đó được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose.  Kiểm tra sản phẩm PCR và tinh sạch sản phẩm Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới hệ thống chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ). Kích thước khuếch đại các gen mục tiêu tương ứng theo từng cặp mồi như đã thiết kế. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.  PCR giải trình tự (Cycle Sequencing) Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược (sử dụng mồi PCR). Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm SeqScape, so sánh với trình tự chuẩn của gen mục tiêu trong GenBank để xác định NST. Dữ liệu giải trình tự thô sau khi phân tích bằng phần mềm SeqScape được chúng tôi tiến hành tổng hợp số liệu. PHỤ LỤC 5 ĐỘC TÍNH HOÁ TRỊ LIỆU THEO CTCAE Bất thường Độ 1 Độ 2 Độ 3 Độ 4 Độ 5 Huyết học Giảm neutrophil (G/L) GHD – 1,5 1 – < 1,5 0,5 – < 1 < 0,5 - Giảm tiểu cầu (G/L) GHD - 75 50 - < 75 25 - < 50 < 25 - Thiếu máu [Hb (g/dl)] < 10 8 - 10 < 8 Đe dọa tính mạng Tử vong Sốt giảm bạch cầu hạt Bạch cầu hạt < 1 G/L kèm nhiệt độ một lần > 38,3ºC hay nhiệt độ kéo dài ≥ 38ºC hơn 1 giờ Đe dọa tính mạng; có chỉ định can thiệp khẩn cấp Tử vong Tăng men gan (AST/ALT) GHT – 3 x GHT > 3 – 5 x GHT > 5 – 20 x GHT > 20 x GHT - Tổn thương thận cấp (dựa vào Creatinin) Tăng > 0,3 mg/dl hay tăng từ 1,5 - 2 lần so với mức nền Tăng 2 - 3 lần mức nền Tăng > 3 lần mức nền hay > 4 mg/dl, chỉ định nhập viện Đe dọa tính mạng, lọc máu Tử vong Tiêu hóa Nôn ói Giảm thèm ăn không thay đổi đến thói quen ăn uống Giảm ăn đường miệng không kèm giảm cân nghiêm trọng, suy dinh dưỡng hay mất nước. Cung cấp năng lượng hay nước bằng miệng không thích hợp; ăn đường ống; dinh dưỡng ngoài ruột; hay có chỉ định nhập viện - - Bất thường Độ 1 Độ 2 Độ 3 Độ 4 Độ 5 Loét miệng Không có triệu chứng hoặc nhẹ triệu chứng; không cần can thiệp Đau vừa phải hoặc loét mà không ảnh hưởng đến lượng thực phẩm ăn vào bằng đường miệng, nên điều chỉnh chế độ ăn uống Đau nặng hoặc loét làm ảnh hưởng đến lượng thực phẩm ăn vào bằng đường miệng Đe dọa tính mạng; có chỉ định can thiệp khẩn cấp Rụng tóc Rụng tóc < 50% bình thường, không cần tóc giả Rụng tóc ≥ 50% bình thường, cần tóc giả ngụy trang