Luận án Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển nannochloropsis oculata (droop) hibberd sử dụng làm thực phẩm chức năng

cố định mẫu bằng glutaradehyde trước khi chụp ảnh dưới kính JEOL, JSM-6400 (Nhật Bản). 2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử: đọc và so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. QN1 tiềm năng được tiến hành theo Sambrook và Rusell, (2001). Các chương trình phần mềm chuyên dụng như DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 và BLAST được sử dụng cho phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng Nannochloropsis sp. QN1 trong nghiên cứu. 2.3.3. Khảo sát điều kiện nhân nuôi N. oculata QN1 ở quy mô phòng thí nghiệm: nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (với ba môi trường Walne, F/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 5 – 60 ‰), nhiệt độ (15 – 40 C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11), mật độ tế bào (MĐTB) ban đầu (7, 11, 13 và 15 triệu TB/mL), tỉ lệ CO2 (với nồng độ 1, 2, 5, 10 và 15 % v/v) lên sinh trưởng và phát triển của chủng QN1. 2.3.4. Khảo sát điều kiện nhân nuôi chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100 L: nghiên cứu ảnh hưởng của 3 môi trường dinh dưỡng (F/2, Erd và Walne), nồng độ muối (từ 20- 40 ‰), nhiệt độ (25-28 0C và 35 0C), ánh sáng trắng với CĐAS là 100 mol/m2s, pH (từ 5 đến 9), tỉ lệ CO2 (2 và 5 % v/v) với MĐTB ban đầu (10- 25 triệu TB/mL) lên sinh trưởng của chủng QN1 trong HTNK nói trên. 2.3.5. Xác định sinh trưởng của chủng QN1: bằng đo mật độ quang ở bước sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức), xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard và Sieracki, 2005) sinh khối khô (sấy ở 105 C), hàm lượng chlorophyll a và carotenoit, xác định kích thước tế bào bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5. 2.3.6. Phân tích thành phần và hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit tổng số và các axít béo trong sinh khối chủng QN1 - Xác định hàm lượng lipit trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh và Dyer, (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam. - Thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối của QN1: được xác định bằng máy sắc kí khí HP-6890 theo mô tả của Đặng Diễm Hồng và cs., (2007). - Phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của chủng QN1: được tiến hành theo Horwitz, (2000). 2.3.7. Nghiên cứu quy trình thu hoạch sinh khối chủng QN1: sử dụng kỹ thuật làm lắng (sử dụng các chất trợ lắng như Al2 (SO4)3.18H2O; phèn nhôm kali sulfate dạng muối kép: KAl (SO4)2.12H2O và FeCl3; kỹ thuật ly tâm và sinh khối tảo sau khi thu hoạch sẽ được kiểm tra đánh giá đánh giá hàm lượng lipit và EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit và kim loại nặng. 2.3.8. Nghiên cứu quy trình chế biến bảo quản sinh khối chủng QN1: sinh khối tảo sau khi thu hoạch bằng chất tạo kết bông sẽ được sấy khô theo các phương pháp khác nhau (sấy phun, sấy đông khô, sấy bằng tủ sấy nhiệt, phơi khô). Đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp sấy qua độ ẩm và sự biến đổi của các thành phần dinh dưỡng của tảo trong quá trình chế biến và bảo quản. Sinh khối tảo khô có mức hàm ẩm khác nhau được bảo quản trong các túi nilon dán kín ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Đánh giá độ ổn định của vi tảo trong quá trình bảo quản thông qua theo dõi sự biến đổi của các thành phần dinh dưỡng trong tảo như lipit, protein, cacbohydrat, hàm lượng EPA 2.3.9. Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sinh khối vi tảo N. oculata QN1: tiến hành thử độc tính của sinh khối tảo khô N. oculata QN1 theo Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền của Bộ Y tế (Bộ Y tế, 1996). Các thử nghiệm được tiến hành gồm thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và độc tính bán trường diễn trên thỏ theo các hướng dẫn hiện hành (Đỗ Trung Đàm, 1996; WHO, 2000; OECD, 2001; OEDC, 2008). 2.3.10. Nghiên cứu tác động dược lý của sinh khối tảo N. oculata QN1 lên động vật thực nghiệm: thông qua các bài tập môi trường mở; bài tập mê lộ chữ Y; bài tập nhận thức đồ vật. 2.3.11. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sinh khối tảo QN1 làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng: + Với các chỉ tiêu đã có phương pháp kiểm tra được quy định trong các tiêu chuẩn ngành, dược điển các nước: áp dụng kiểm tra mẫu thử. + Với các chỉ tiêu chưa có sẵn phương pháp: dựa trên các tính chất của hoạt chất cần kiểm tra và các phương tiện phân tích sẵn có để đề xuất phương pháp kiểm tra. Phương pháp đề xuất được hiệu lực hóa bằng các phép thử độ đặc hiệu (định tính) hoặc độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (định lượng). 2.3.12. Nghiên cứu công thức bào chế, xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm và sản xuất thử nghiệm viên nang chứa thành phẩm vi tảo N. oculata QN1: + Dựa trên công dụng, tác dụng của các dược liệu để đưa ra công thức viên và dạng bào chế. + Dựa trên tính chất hóa lý của các thành phần hoạt chất và tá dược để lựa chọn phương pháp bào chế và công thức bào chế phù hợp. Đánh giá sự phù hợp của các lựa chọn thông qua khả năng tạo hạt, làm viên và độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bào chế. + Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và hiệu lực hóa phương pháp kiểm tra chất lượng như đã mô tả trong mục “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở”, áp dụng với thành phẩm là viên nang vi tảo. 2.3.12. Xử lý số liệu Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel. So sánh thống kê được thực hiện qua phân tích one-way ANOVA với giá trị P<0,01 và so sánh các giá trị trung bình với hàm t-test được dùng với độ tin cậy p<0,05. Xử lý số liệu độc tính cấp của sinh khối tảo trên động vật thực nghiệm theo phương pháp thống kê sinh y học, dùng phép kiểm định t-student và test “trước - sau”(Avant - Après) để so sánh các chỉ số. Số liệu được biểu diễn dưới dạng: Giá trị trung bình ± Es (sai số chuẩn) với độ tin cậy P 95 %. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn, sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dƣỡng của các chủng VTB N. oculata ở điều kiện nhân nuôi trong HTNH 3.1.1. Đặc điểm của các chủng vi tảo biển Nannochloropsis spp. nghiên cứu Các chủng Nannochoropsis spp. phân lập ở vùng biển Quảng Ninh, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa năm 2009 có tế bào ở dạng đơn bào, hình cầu, màu xanh, không có roi và có kích thước 1,5 -3,6 ±0,5µm (Hình 3.1 và 3.2). Hình 3.1. Hình thái tế bào của 6 chủng Nannochloropsis spp. phân lập ở vùng biển Nha Trang và Quảng Ninh dƣới kính hiển vi quang học Dựa trên các đặc điểm hình thái (quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét), chúng tôi đã định tên sơ bộ được 6 chủng Nannochloropsis spp. ở các vùng biển Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hòa thuộc về loài Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981. Hình 3.2. Hình thái tế bào của 6 mẫu Nannochloropsis spp. dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM) 3.1.2. Lựa chọn chủng VTB Nannochloropsis spp. phù hợp cho sản xuất thực phẩm chức năng Chủng Nannochloropsis spp. tiềm năng được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng cần phải có một số đặc điểm như khả năng sinh trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng, đặc biệt là hàm lượng EPA cao và có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn. Trong số 6 chủng VTB được sử dụng nghiên cứu, dựa trên khả năng sinh trưởng của các chủng đã phân lập được trong môi trường lỏng (đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit và hydratcacbon), chúng tôi đã chọn được Nannochloropsis sp. QN1 phân lập từ vùng biển Quảng Ninh làm đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3. Định tên khoa học chủng Nannochloropsis sp. QN1 bằng kỹ thuật đọc và so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA Kết quả tách dòng và đọc trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. QN1 được trình bày ở Hình 3.3. Hình 3.3. Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp. QN1 A: DNA tổng số của chủng QN1 (giếng 1); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 (giếng 2); C: Sản phẩm PCR tinh sạch của chủng QN1 (giếng 3); D: PCR checking chủng QN1 (giếng 4, 5 và 6) Giếng M: Thang DNA chuẩn 1 kb Plus Ladder. Kết quả cho thấy độ tương đồng của các loài thuộc chi Nannochloropsis dao động từ 83,0 % đến 99,9 %. Chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân lập ở Quảng Ninh có độ tương đồng cao nhất với loài N. oculata (AF045045) đạt 99,9 %, tiếp theo là N. granulate MBIC10054 (AB052272), N. limnetica (AF251496) và N. oceanica MBIC10440 (AB052277) đạt 99,5 % và thấp nhất là loài N. gaditana (AF133819) đạt 98,3 %. Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh chủng loại (Hình 3.4), chúng tôi có thể kết luận chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân lập được từ vùng biển Quảng Ninh thuộc về loài N. oculata vì chúng có độ tương đồng đạt 99,9 % với loài N. oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số (AF045045). Trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 đã được đăng ký trên GenBank với mã số được cấp là KU 342 038. Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân lập từ vùng biển Quảng Ninh 3.1.4. Sinh trƣởng của chủng N. oculata QN1 trong điều kiện phòng thí nghiệm Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng N. oculata QN1 là môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30 ‰, nhiệt độ 25-30C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH 7, sục khí CO2 có nồng độ 2% (v/v) với tốc độ 0,25 L/phút, mật độ tế bào ban đầu để nhân nuôi đạt 11 triệu TB/mL. 3.2. Nghiên cứu sinh trƣởng của chủng N. oculata QN1 trong HTNK kín 20, 50 và 100 L và xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối chủng tảo này Điều kiện sinh trưởng thích hợp của chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100 L là: môi trường dinh dưỡng Walne; nồng độ muối 30 ‰; nhiệt độ 25-28 ºC; ánh sáng trắng với cường độ 100 µmol/m2/s; pH 7; sục không khí có bổ sung CO2 ở nồng độ 2 % (v/v) với tốc độ sục khí 0,25 L/phút; mật độ tế bào ban đầu tối ưu cho nhân nuôi trong hệ thống nuôi kín là 15-20 triệu TB/mL. So sánh với HTNH, sau 25 ngày nuôi cấy thì MĐTB của tảo N. oculata QN1 ở HTNK 20 L đạt 201,1 x triệu TB/mL, tăng 21,2 % so với HTNH 197,00 x triệu TB/mL. Còn ở các HTNK 50 và 100 L, MĐTB đạt giá trị trung bình cao nhất là 245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 triệu TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy, tương ứng. Sinh khối tảo trong HTNK huyền phù, không bị tạp nhiễm, thời gian vận hành được kéo dài giúp làm giảm chi phí nuôi cấy, năng suất sinh khối luôn ổn định, tiết kiệm diện tích cũng như công sức nuôi cấy. Đã đưa ra được sơ đồ quy trình nuôi trồng loài N. oculata QN1 làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng. 3.2.3. Nghiên cứu quy trình thu hoạch chế biến và bảo quản sinh khối tảo N. oculata QN1 3.2.3.1. Quy trình thu hoạch Điều kiện thu hoạch sinh khối tảo từ các hệ thống nuôi khác nhau: chế độ ly tâm 6000 v/p trong 10 phút với hiệu quả lắng đạt 95 % và 3000 v/p trong 10 phút với hiệu quả lắng đạt 100 % với dịch nuôi tảo không được và được xử lý chất kết bông (KAl (SO4)2.12H2O 0,4 g/L). Hàm lượng, thành phần lipit và axit béo trong sinh khối tảo thu hoạch được từ hai phương pháp ly tâm là tương đương nhau, trong đó hàm lượng lipit tổng số đạt 16,21±1,88 đến 16,72±0,88 % sinh khối khô, hàm lượng EPA đạt 24,73±2,17 đến 26,03±2,12 % so với tổng số axit béo. Đã xây dựng được quy trình thu hoạch sinh khối tảo N. oculata QN1, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng (Hình 3.5). Tính ổn định của vi tảo N. oculata QN1 trong quá trình thu hoạch đã được xác định. Hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit trong sinh khối tảo thu hoạch được bằng phương pháp ly tâm và sử dụng chất kết bông (có rửa sinh khối bằng 2 lần HCl 0,1N và 3 lần bằng nước cất) đạt lần lượt là 15,62±1,23 % và 15,15±1,36 % SKK; 2,3±0,1 và 2,28±0,1 % SKK; 18,21±1,21 và 18,12±1,32 % SKK; 34,7±2,13 và 30,2±2,45% SKK; 1,65±0,05 và 1,61±0,04% SKK; 0,29±0,04 và 0,27±0,03 % SKK. Sinh khối tảo N. oculata QN1 cũng rất giàu các khoáng đa và vi lượng, hàm lượng các kim loại nặng như Cd, Pd, As và Hg đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam, (2002). Ngoài ra, các quan sát cảm quan cũng cho thấy màu sắc của sinh khối tảo thu hoạch được theo hai phương pháp ly tâm trực tiếp dịch nuôi tảo hoặc kết bông và ly tâm sau khi rửa 2 lần bằng HCl 0,1 N và 3 lần rửa bằng nước cất đều có màu xanh đặc trưng và không có sự khác biệt. 3.2.3.2. Nghiên cứu quy trình chế biến và bảo quản vi tảo N. oculata QN1 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thu hoạch vi tảo biển N. oculata QN1 Sinh khối tảo N. oculata QN1 có thể sấy bằng sấy phun là phương pháp có thể thu sinh khối chủng QN1 có chất lượng tốt, chi phí phù hợp và có thể áp dụng cho việc sản xuất sinh khối tảo ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp. Ngoài ra, có thể sử dụng sấy phun với điều kiện thích hợp là hàm lượng chất khô trong dịch tảo trước sấy khoảng 20 %, nhiệt độ không khí đầu vào là 200 °C, áp lực khí nén là 4,00 bar và tốc độ bơm nhập liệu là 20 mL/phút với hiệu suất thu hồi đạt trên 65 %, độ ẩm sản phẩm dao động khoảng 3,5 %. Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối tảo N. oculata QN1 thu hoạch được ở các điều kiện khác nhau bao gồm nhiệt độ phòng, 4 – 10 °C và -20 °C trong thời gian từ 1 tuần đến 1 năm đã được tiến hành. Kết quả về điều kiện bảo quản được đánh giá thông qua sự thay đổi về hàm lượng lipit, protein, cacbohydrate, chlorophyll a trong sinh khối tảo tươi của chủng QN1. Điều kiện bảo quản sinh khối tảo tươi N. oculata QN1 phù hợp nhất ở -20 °C với thời gian bảo quản lên tới 1 năm. Sự thay đổi về thành phần và hàm lượng axit béo của N. oculata QN1 sau thời gian bảo quản 1 năm được trình bày ở Bảng Dịch nuôi cấy N. oculata QN1 Cô đặc các tế bào tảo bằng chất kết bông hoặc lọc qua lưới lọc (kích thước lỗ >10 µm và < 5 µm) Nước, KAl (SO4)2.12H2O KAl (SO4)2.12H2O 0,04% - MĐTB 80-100 x triệu TB/mL ở bình tam giác - 160-245 x triệu TB/mL ở HTNK - 40-60 x triệu TB/mL ở HTNH Dịch tảo cô đặc (5-10% thể tích dịch ban đầu), sục ozon (2-3 phút) Tảo khô Ly tâm loại nước và rửa lại bằng HCl 0,1N và nước cất 3-5 lần (tỷ lệ 1:5, w/v) Nước, KAl (SO4)2.12H2O Ly tâm 3000 v/p, 10 phút hoặc ly tâm vắt 1500 v/p, 20 phút Sấy khô (1) (2) (3) (4) Bảng 3.1: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo của N. oculata QN1 sau thời gian bảo quản 1 năm ở -200C Thành phần axit béo (% so với tổng số axit béo) Tên SK tƣơi trƣớc bảo quản SK có độ ẩm 100% SK có độ ẩm 60- 80% SK có độ ẩm 20- 40% SK có độ ẩm 0-5% C14:0 Tetradecanoic acid 0,62 0,58 0,53 0,60 0,61 C16:0 Hexadecanoic acid 20,15 20,10 20,19 20,12 20,16 C16:1n-7 9- Hexadecanoic acid 3,52 3,30 3,57 3,24 3,46 C18:1n-9 9- Octadecenoic acid 8,46 8,00 6,71 7,21 7,12 C18:2n-6 9,12- Octadecenoic acid 9,18 8,30 9,03 9,25 9,13 C18:3n-3 9,12,15- Octadecatrienoic acid 17,82 17,70 17,01 16,35 17,21 C20:0 Eicosanoic acid 5,26 5,90 5,98 5,68 6,08 C20:4n-6 5, 8, 11, 4- Eicosatetraenoic acid 0,83 0,60 0,74 0,85 0,79 C20:5n-3 (EPA) 5, 8, 11, 14, 17- Eicosapentaenoic acid 26,03 24,70 25,20 23,21 24,22 Loại khác 8,13 10,82 11,04 13,49 11,22 Hàm lượng, thành phần các axit béo trong sinh khối tảo N. oculata QN1 với độ ẩm khác nhau sau thời gian bảo quản 1 năm ở -20 0C là không thay đổi nhiều so với thời điểm ban đầu. Các axit béo chính chứa trong sinh khối tảo bao gồm EPA, axit  -linolenic, axit palmitic, axit oleic, axit linoleic. Trong đó, hàm lượng EPA trong sinh khối tảo có độ ẩm khác nhau dao động từ 23,21 – 26,03 % SKK sau 1 năm bảo quản ở -20 0C. Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong quá trình chế biến Tính ổn định của sinh khối tảo N. oculata QN1 sau quá trình sấy khô theo các phương pháp khác nhau (phơi nắng, sấy khô bằng tủ sấy nhiệt, sấy phun và sấy đông khô) đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy hàm lượng, thành phần các axit béo trong sinh khối tảo N. oculata QN1 khi được sấy đông khô là không thay đổi nhiều so với thời điểm ban đầu. Hàm lượng EPA giữ ổn định ở mức 35,03 – 35,08 % so với tổng số axit béo (TFA). Hàm lượng EPA trong sinh khối tảo được sấy khô trong lò sấy và sấy phun giảm xuống còn 26,98 % và 28,68 % so với TFA, tương ứng. Trong khi đó, quá trình sấy khô sinh khối tảo bằng cách phơi nắng làm giảm đáng kể hàm lượng EPA (giảm từ 35,03 xuống 19,9 % so với TFA) (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo trong sinh khối N. oculata QN1 sau quá trình sấy khô khác nhau Thành phần axit béo (% so với tổng số axit béo) Tên khoa học Trƣớc sấy Phơi nắng Sấy trong tủ sấy Sấy phun Sấy đông khô C12:0 Dodecanoic acid 0,61 6,58 0,96 2,60 0,61 C14:0 Tetradecanoic acid 5,31 15,10 8,19 10,12 5,16 C16:0 Hexadecanoic acid 13,56 13,98 13,17 14,24 13,46 C16:1(n-7) 9- Hexadecanoic acid 20,16 23,00 16,71 18,21 18,12 C18:1(n-9) 9- Octadecenoic acid 4,54 2,30 3,03 3,25 4,13 C18:2(n-6) 9.12- Octadecenoic acid 4,16 2,70 3,01 3,35 4,21 C20:5(n-3) 5.8.11.14.17- Eicosapentaenoic acid 35,03 19,90 26,98 28,68 35,08 Loại khác 16,63 16,44 27,95 19,55 19,23 Hàm lượng protein, carbonhydrate, chlorophyll a, carotenoit trong sinh khối tảo thu được bằng phương pháp sấy đông khô hầu như không có sự thay đổi về chất lượng. Tuy nhiên, phương pháp sấy nhiệt và sấy phun cũng cho sinh khối tảo có chất lượng tốt với chi phí hợp lý và có thể áp dụng để sấy một lượng lớn sinh khối tảo. Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong quá trình bảo quản Nghiên cứu xác định tính ổn định của sinh khối vi tảo thu được (bằng cách sấy nhiệt, sấy phun và sấy đông khô) sau thời gian bảo quản ở -20°C từ 0 ngày đến 1 năm đã được tiến hành. Hàm lượng lipit, EPA, protein, carbonhydrate, và chlorophyll a trong sinh khối tảo được bảo quản ở -20°C thì chất lượng sinh khối tảo khô vẫn được đảm bảo sau thời gian 1 năm. Ngoài ra, ở tất cả các điều kiện bảo quản, mức độ giảm hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate và chlorophyll a trong sinh khối tảo được sấy đông khô cũng thấp hơn so với sinh khối tảo được sấy nhiệt và sấy phun. 3.3. Đánh giá tác động sinh học của sinh khối tảo N. oculata QN1 sử dụng làm thực phẩm chức năng 3.3.1. Đánh giá tác động sinh học của sinh khối tảo N. oculata QN1 sử dụng làm thực phẩm chức năng 3.3.1.1. Đánh giá độc tính cấp *Ảnh hưởng của mẫu thử đến trạng thái, hoạt động của chuột thử nghiệm Các nhóm chuột thử nghiệm được cho uống mẫu thử dựa theo liều đã tính (0; 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT chuột). Sau khi uống, chuột được phân chia vào lồng, nuôi theo nhóm. Kết quả quan sát trạng thái và các biểu hiện bất thường của chuột được tóm tắt trong Bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả theo dõi các biểu hiện bất thƣờng sau khi uống của chuột Nhóm Liều (g/kg KLCT chuột) Các biểu hiện ngộ độc (hoảng loạn, thở gấp, mệt mỏi, tím tái chết) Số chuột chết Tình trạng tiêu thụ thức ăn, nƣớc uống, bài tiết 1 0 Không có Không có Bình thường 2 15,0 Không có Không có Bình thường 3 20,0 Không có Không có Bình thường 4 25,0 Không có Không có Bình thường 5 30,0 Không có Không có Bình thường Ghi chú: KLCT – khối lượng cơ thể Kết quả nghiên cứu thu được trên Bảng 3.3 đã cho thấy chuột ở nhóm chứng và bốn nhóm thử đều không có bất kỳ biểu hiện bất thường nào. Tất cả các chuột đều khỏe mạnh, hoạt động bình thường. Không có chuột bị chết trong thời gian theo dõi 7 ngày. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp đã cho thấy chuột uống sinh khối vi tảo N. oculata QN1 ở các liều nghiên cứu là 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT không có con nào bị chết, chuột vẫn di chuyển và ăn uống bình thường. Như vậy, sinh khối vi tảo N. oculata QN1 không gây độc tính cấp do không xác định được giá trị LD50. Hay nói cách khác, sinh khối vi tảo an toàn và không gây chết động vật thí nghiệm trong thử nghiệm gây độc cấp tính. Theo phân loại độc tính của Hệ thống phân loại hóa chất và hợp chất toàn cầu GHS (Globally Harmonised System for Classification of Chemical substances and Mixtures) dựa trên giá trị LD50, những chất có giá trị độc tính cấp LD50 trong khoảng > 5000 mg/kg KLCT, được coi là chất không độc. Như vậy, sản phẩm N. oculata là chế phẩm không độc (non-toxic). *Ảnh hưởng của mẫu thử đến khối lượng cơ thể chuột Ngoài các biểu hiện của chuột, chúng tôi cũng theo dõi sự thay đổi về KLCT chuột thí nghiệm. Sau 7 ngày thử nghiệm, khối lượng trung bình của cơ thể chuột lần lượt là (25,5 ± 1,0), (25,8 ± 0,9), (26,1 ± 0,8), (25,3 ± 0,8) và (26,0 ± 0,9) g tương ứng với các nồng độ thử nghiệm bột tảo khô là 0; 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT. Kết quả thu được này cho thấy bột tảo khô không ảnh hưởng đến KLCT của chuột (Bảng 3.4). Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của sinh khối VTB N. oculata QN1 lên KLCT của chuột thử nghiệm Nhóm Liều (g/kg chuột) Kết quả cân nặng (gam) Giá trị P Trƣớc thí nghiệm (gam) Sau thí nghiệm (gam) Tỷ lệ tăng (%) 1 Đối chứng 19,4 ± 0,4 25,5 ± 1,0 31,4 Ptrước-sau << 0,05* 2 15,0 19,5 ± 0,5 25,8 ± 0,9 32,3 Ptrước-sau << 0,05 Ptrước (C-T)= 0,46 Psau (C-T)= 0,46 3 20,0 19,6 ± 0,4 26,1 ± 0,8 33,2 Ptrước-sau << 0,05 Ptrước (C-T)= 0,31 Psau (C-T)= 0,22 4 25,0 19,5 ± 0,6 25,3 ± 0,8 29,7 Ptrước-sau << 0,05 Ptrước (C-T)= 0,67 Psau (C-T)= 0,58 5 30,0 19,7 ± 0,5 26.0 ± 0,9 32,0 Ptrước-sau << 0,05 Ptrước (C-T)= 0,25 Psau (C-T)= 0,34 Ghi chú: - Dấu ký hiệu << 0,05 biểu thị giá trị tính được của P nhỏ hơn rất nhiều so với 0,05. - Ptrước-sau: Khi so sánh KLCT của chuột tại thời điểm trước và sau uống 7 ngày trong mỗi nhóm. - Ptrước (C-T): Khi so sánh KLCT của chuột giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm trước uống. - Psau (C-T): Khi so sánh KLCT của chuột giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm sau uống 7 ngày. Ngoài ra, chúng tôi cũng cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sinh khối tảo đến KLCT của chuột thử nghiệm theo giống (đực/cái) dựa trên tỷ lệ tăng KLCT trung bình của chuột sau thử nghiệm so với trước khi cho chúng uống mẫu thử giữa 2 giống chuột tại từng liều nghiên cứu (Bảng 3.5). Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ tăng KLCT của 2 phân nhóm chuột đực và cái trong từng nhóm thử và nhóm đối chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê sinh học (P>0,05). Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy sinh khối vi tảo N. oculata QN1 không ảnh hưởng đặc biệt lên mức tăng KLCT của giống chuột (đực/cái). Ngoài ra, mức độ tăng KLCT của 2 phân nhóm chuột đực và cái trong từng nhóm thử và nhóm đối chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê sinh học (P>0,05). Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy sinh khối vi tảo N. oculata QN1 không ảnh hưởng đặc biệt lên mức tăng KLCT của giống chuột (đực/cái). Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của sinh khối N. oculata QN1 đến mức tăng KLCT của chuột thử nghiệm theo giống (đực/cái) Nhóm Liều (gam/kg KLCT chuột) Tỷ lệ tăng (%) Pnhóm Chuột đực Chuột cái 1 0,0 32,0±0,8 29,7±1,0 0,41 (>0,05) 2 15,0 31,8±0,7 32,5±0,8 0,47 (>0,05) 3 20,0 30,7±0,8 33,1±0,7 0,45 (>0,05) 4 25,0 29,6±0,7 28,9±0,8 0,27 (>0,05) 5 30,0 31,3±1.1 32,4±1,1 0,66 (>0,05) TB 31,1±0,9 31,3±1,7 Ptổng 0,81 (> 0,05) Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.4 và 3.5 đã cho thấy chuột nhắt trắng được uống với mức liều từ 15,0 – 30,0 g sinh khối vi tảo N. oculata QN1/kg khối lượng cơ thể của chuột đã không ảnh hưởng đến thể trạng, hoạt động của chuột. Chuột thử nghiệm khỏe mạnh, tăng cân. Như vậy, trong đều kiện thí nghiệm của chúng tôi đã không phát hiện thấy giá trị LD50 và sinh khối vi tảo N. oculata được cho chuột uống đến liều 30 g/kg KLCT chuột là hoàn toàn an toàn, không gây chết động vật thí nghiệm trong thử nghiệm gây độc cấp tính. Theo phân loại độc tính của Hệ thống phân loại hóa chất và hợp chất toàn cầu GHS (Globally Harmonised System for Classification of Chemical substances and Mixtures), những chất có LD50 >5g/kg khối lượng cơ thể được coi là chất không độc. Điều này cho thấy bột tảo khô N. oculata QN1 với liều uống đến 30g/kg khối lượng cơ thể chuột là sản phẩm không độc. 3.3.1.2. Kết quả đánh giá độc tính bán trƣờng diễn *Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến tình trạng chung và khối lượng cơ thể của thỏ Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy sinh khối chủng QN1 ở cả 2 mức liều nghiên cứu 1,2 và 3,0 g/kg KLCT của thỏ/ngày không gây ảnh hưởng tới thể trạng của thỏ thí nghiệm sau khi uống liên tục trong 28 ngày. Bảng 3.6. Kết quả theo dõi khối lƣợng cơ thể của thỏ trƣớc và sau khi uống sinh khối N. oculata QN1 Nhóm (n=7) Kết quả cân nặng (kg) P Trƣớc TN (m0) Sau 1 tuần (m1) Sau 2 tuần (m2) Sau 3 tuần(m3) Sau 4 tuần (m4) Đối chứng (C) 2,09±0,11 2,13±0,16 2,16±0,16 2,16±0,14 2,24±0,15 Ptrước-sau=0,044 % so với trước thử nghiệm 1,91% 3,34% 3,34% 7,18% Thử nghiệm 1 – 1,2 g/kg thỏ (T1) 2,10±0,13 2,16±0,14 2,19±0,15 2,23±0,14 2,27±0,15 Ptrước-sau=0,026 Ptrước (T1-C)=0,408 Psau (T1-C)=0,606 % so với trước thử nghiệm 2,86% 4,29% 6,19% 8,09% Thử nghiệm 2 – 3,0 g/kg thỏ (T2) 2,12±0,12 2,13±0,10 2,18±0,13 2,20±0,13 2,28±0,13 Ptrước-sau=0,045 Ptrước (T2-C)=0,644 Psau (T2-C)=0,501 % so với trước thử nghiệm 0,47% 2,83% 3,77% 7,55% Ghi chú: Ptrước-sau: So sánh KLCT của thỏ tại thời điểm trước và sau uống 28 ngày trong mỗi nhóm. Ptrước (C-T): Khi so sánh KLCT của thỏ giữa nhóm chứng và nhóm thử tại thời điểm trước uống. Psau (C-T): Khi so sánh KLCT của thỏ giữa nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm tại thời điểm sau uống 28 ngày. *Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng tạo máu của thỏ Kết quả phân tích các chỉ số huyết học của thỏ thử nghiệm tại 3 thời điểm sau khi được uống sinh khối vi tảo N. oculata QN1 ở nhóm đối chứng và nhóm thử T1 và T2 được trình bày ở Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học ở các thông số về huyết học trước (t0) và sau 14 (t1) và 28 (t2) ngày thử nghiệm ở cả 2 nhóm uống chế phẩm T1 và T2. Nếu so sánh ở cùng thời điểm xét nghiệm (t1 và t2) giữa nhóm đối chứng và 2 nhóm thử nghiệm, kết quả thu được cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học của các chỉ số huyết học của thỏ (PC-T1, PC-T2 thời điểm t1, t2 > 0,05). Bảng 3.7. Kết quả phân tích các chỉ số huyết học của thỏ thử nghiệm tại 3 thời điểm t0, t1, và t2 Chỉ tiêu n Thời điểm Nhóm đối chứng Nhóm thử T1 PC- T1 Nhóm thử T2 PC-T2 Hồng cầu (x 1012/ Lit) 7 t0 6,1 ± 0,3 6,0 ± 0,6 >0,05 5,9± 0,4 >0,05 t1 5,9 ± 0,6 6,2 ± 0,3 6,0± 0,8 t2 5,8 ± 0,5 5,9± 0,7 6,1 ± 0,7 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Bạch cầu (x 10 9 / Lit) 7 t0 9,1 ± 1,3 8,6 ± 1,4 9,0 ± 0,9 t1 8.7 ± 1,4 9,0 ± 1,5 9,4 ± 1,1 t2 9,2 ± 1,4 9,1 ± 2,3 9,5 ± 1,1 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Tiểu cầu (x 109/ Lit) 7 t0 391,7 ± 76,9 439,4 ± 88,7 444,9 ± 73,9 t1 430,1± 68,6 427,0 ± 54,3 468 ± 78,1 t2 426,1± 55,2 432,4± 63,2 453,5 ± 77,5 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Hematocrit (%) 7 t0 36,3 ± 2,5 37,7 ± 1,5 37,3 ± 2,1 t1 34,9± 2,4 35,3 ± 3,5 35,6 ± 3,7 t2 35,1± 2,8 36,5 ± 2,7 34,6± 3,1 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Hemoglobi n 7 t0 11,3 ± 0,9 10,6 ± 1,4 11,2 ± 0,4 t1 10,9 ± 0,8 11,0 ± 0,3 10,3± 0,8 (g/dL) t2 10,4 ± 0,8 10,0 ± 1,1 10,7 ± 0,6 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại cùng thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg KLCT; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg KLCT Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra trên Bảng 3.7 đã cho thấy ngay ở mức liều cao 3,0 g sinh khối vi tảo N. oculata QN1/kg khối lượng cơ thể của thỏ cũng không gây ảnh hưởng đến chức năng tạo máu của thỏ. *Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng gan thỏ thí nghiệm Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 lên chức năng gan thỏ được trình bày ở Bảng 3.8. Kết quả trước thí nghiệm thu được cho thấy, các chỉ số sinh hóa của thỏ ở nhóm thử (T1 và T2) và nhóm đối chứng không có sự khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê sinh học (PC-T1, PC-T2, thời điểm t0 > 0,05). Sau 14 và 28 ngày thí nghiệm cũng không nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học giữa nhóm đối chứng và 2 nhóm thử T1 và T2 về các chỉ số sinh hóa này (PC-T1, PC-T2 , thời điểm t1, t2 > 0,05). Ngoài ra, chúng tôi cũng không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học khi so sánh các thông số này trong mỗi nhóm thử ở thời điểm xét nghiệm so với trước khi uống (P > 0,05). Bảng 3.8. Kết quả phân tích một số chỉ số sinh hóa liên quan đến chức năng gan của thỏ tại 3 thời điểm t0, t1, và t2 Chỉ tiêu n Thời điểm Nhóm đối chứng Nhóm T1 PC-T1 Nhóm T2 PC-T2 SGOT (U/ Lit) 7 t0 20,9 ± 3,4 22,1 ± 3,1 > 0,05 20,3 ± 2,0 > 0,05 t1 22,7 ± 5,6 20,9 ± 4,2 19,4 ± 6,5 t2 22,0 ± 4,6 23,7 ± 2,8 21,6 ± 1,7 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 SGPT (IU/ Lit) 7 t0 38,3 ± 4,8 40,0 ± 4,3 40,7 ± 2,0 t1 40,4 ± 4,0 42,6 ± 3,6 43,7 ± 5,1 t2 39,9 ± 2,4 41,1 ± 3,9 40,1 ± 4,4 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Bilirubin toàn phần 7 t0 16,9 ± 1,3 17,2 ± 1,6 17,9 ± 0,8 t1 17,6 ± 1,9 18,4 ± 1,7 19,2 ± 1,2 (μmol/Lit) t2 18,6 ± 1,8 17,9 ± 1,6 19,1 ± 0,9 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Protein toàn phần (g/L) 7 t0 60,7 ± 3,1 59,7 ± 4,3 60,7 ± 2,2 t1 59,0 ± 2,0 61,3 ± 3,8 62,7 ± 4,4 t2 60,4 ± 2,1 60,1 ± 1,6 59,9 ± 1,2 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại cùng thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng cơ thể Như vậy, có thể khẳng định mức liều 3,0 g sinh khối vi tảo N. oculata QN1/kg khối lượng cơ thể của thỏ/ngày trong nghiên cứu này đã không ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ được thử nghiệm. Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 đến chức năng thận của thỏ thử nghiệm Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata đến chức năng thận của thỏ thử nghiệm được trình bày ở Bảng 3.9. Kết quả trình bày ở Bảng 3.9 đã cho thấy hầu như không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về các chỉ số creatinin và urea huyết giữa nhóm đối chứng và 2 nhóm uống sinh khối tảo ở nhóm thử T1 và T2 ở tất cả các thời điểm nghiên cứu và giữa các nhóm thử (P> 0,05). Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số chỉ số sinh hóa liên quan đến chức năng thận của thỏ tại 3 thời điểm t0, t1 và t2 Chỉ tiêu n Nhóm đối chứng Nhóm T1 PC-T1 Nhóm T2 PC-T2 Creatinin (μmol/Lit) 7 t0 102,4 ± 9,9 95,6 ± 7,3 > 0,05 96,4 ± 11,7 > 0,05 t1 98,1 ± 8,9 97,3 ± 8,6 100,7 ± 11,3 t2 97,1 ± 10,5 94,9 ± 8,2 97,7 ± 13,6 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Urea (mmol/Lit) 7 t0 6,2 ± 0,9 5,9 ± 0,7 6,1 ± 0,5 t1 6,0 ± 1,1 6,1 ± 0,6 6,2± 1,3 t2 6,4 ± 1,4 6,0 ± 1,0 6,1 ± 0,8 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Ghi chú: T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng cơ thể; t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử tại cùng thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc và sau thử nghiệm của mỗi nhóm Như vậy, với mức liều uống 3,0 g sinh khối tảo/kg khối lượng cơ thể của thỏ/ngày đã không gây ảnh hưởng đến chức năng thận của thỏ được sử dụng trong thí nghiệm của chúng tôi. Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 tới sự thay đổi mô bệnh học gan, thận của thỏ thí nghiệm Ảnh hưởng của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 lên sự thay đổi mô bệnh học gan, thận của thỏ thí nghiệm được xác định nhờ giải phẫu mô bệnh và quan sát tổng quát đại thể và vi thể tổ chức mô dưới kính hiển vi. Sau khi kết thúc thời gian cho thỏ uống sinh khối vi tảo với 2 mức liều 1,2 và 3,0 g/kg KLCT thỏ/ngày (kéo dài liên tục trong 28 ngày), lấy ngẫu nhiên mẫu gan và thận của 3 thỏ trên mỗi nhóm để làm tiêu bản, và quan sát đại và vi thể tại Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.6. Như vậy, sinh khối vi tảo biển N. oculata QN1 h ng g độc tính cấp d thử ở mức liều cao tối đa so với thể tích dạ dà chuột 3 g g hối lượng cơ thể chuột) trên chuột thực nghiệm. Chúng tôi không phát hiện thấy giá trị LD50 ở tất cả các liều 15, 20, 25 và 30 g/kg khối lượng cơ thể chuột đã nghiên cứu. Điều này cho thấy bột tảo khô N. oculata QN1 với liều uống đến 30 g/kg khối lượng cơ thể chuột là sản phẩm h ng độc. Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn của sinh khối vi tảo N. oculata QN1 ở mức liều uống 1,2 và 3,0 g/kg khối lượng cơ thể thỏ/ngày trong 28 ngày liên tục đã cho thấy sinh khối tảo đã h ng ảnh hưởng đến thể trạng; hoạt động của thỏ được thử nghiệm; không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu; chức năng và mô học của gan và thận của thỏ thử nghiệm so với l đối chứng. Sinh khối vi tảo N. oculata QN1 là hoàn toàn an toàn khi sử dụng cho động vật. Lô đối chứng (C1) Lô thí nghiệm 1 (T1) Lô thí nghiệm 2 (T2) Gan thỏ C1.1: Nhu mô gan xung huyết nhẹ. Nhuộm HE x 100 Gan thỏ T1.1: Các tế bào gan thoái hóa nhẹ. HE x 400. Gan thỏ T2.1: Tế bào gan thoái hóa nhẹ. Nhuộm HE x 400. Thận thỏ C1.1: Nhu mô thận xung huyết nhẹ. Nhuộm HE x 100 Thận thỏ T1.1: Cầu thận sung huyết nhẹ. HE x 100 Thận thỏ T2.1: Các ống thận sung huyết nhẹ. HE x 100 Ghi chú : Lô thử nghiệm T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng cơ thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0g/kg khối lượng cơ thể Hình 3.6. Ảnh sinh thiết tế bào gan, thận của lô thỏ đối chứng và các lô thỏ thí nghiệm 3.3.1.3. Nghiên cứu đánh giá hành vi của chuột thực nghiệm khi sử dụng sinh khối tảo N. oculata QN1 Kết quả nghiên cứu trong môi trường mở Kết quả về các chỉ số của chuột trong bài tập môi trường mở được thể hiện ở Hình 3.7, 3.8 và 3.9. Hình 3.7: Quãng đƣờng chuột vận động trong môi trƣờng mở Hình 3.8: Tốc độ trung bình chuột vận động trong môi trƣờng mở Hình 3.9: Quãng đƣờng chuột vận động trong môi trƣờng mở Chúng tôi nhận thấy các chỉ số về quãng đường vận động, tốc độ vận động trung bình và thời gian ở vùng trung tâm của chuột ở cả 3 nhóm không có sự khác biệt. Điều đó chứng tỏ uống dung dịch vi tảo N. oculata QN1 (liều 4,8 g và 12 g/kg KLCT chuột) không ảnh hưởng đến chức năng vận động và khả năng khám phá của chuột. Nghiên cứu trong bài tập nhận thức đồ vật Kết quả về thời gian và tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống nhau trong ngày thứ 2 của bài tập được thể hiện ở Hình 3.10 và 3.11. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.10 và 3.11 đã cho thấy thời gian và tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống hệt nhau trong ngày tập thứ hai của bài tập là không có sự khác biệt giữa vật A và vật B trong từng nhóm. Đồng thời khi so sánh về thời gian và tần suất khám phá hai đồ vật trên cả 3 nhóm (nhóm chứng, nhóm 4,8 g/kg và 12 g/kg) cũng không thấy có sự khác biệt. Kết quả này cho thấy chuột uống dung dịch NaCl 0,9% và vi tảo ở hai liều khác nhau (4,8 g/kg và 12 g/kg) có kết quả tương tự nhau ở ngày tập thứ 2 của bài tập. Hình 3.10: Thời gian chuột phám phá hai đồ vật giống nhau (giây ) (lần) Hình 3.11. Tần suất chuột phám phá hai đồ vật giống nhau Hình 3.12. Thời gian chuột phám phá đồ vật cũ (vật A) và đồ vật mới (vật B) Hình 3.13. Tần suất chuột phám phá đồ vật cũ (vật A) và đồ vật mới (vật B) Kết quả về thời gian và tần suất chuột khám phá đồ vật cũ (vật A) và vật mới (vật B) trong ngày thứ 3 của bài tập được thể hiện ở Hình 3.12 và 3.13. Kết quả cho thấy thời gian và tần suất chuột khám phá vật cũ (vật A) và vật mới (vật B) là có sự khác biệt giữa hai đồ vật trong từng nhóm. Ở cả 3 nhóm chuột thí nghiệm đều có xu hướng sử dụng nhiều thời gian và tần suất khám phá vật mới hơn là khám phá vật đã quen thuộc (vật cũ). Đồng thời khi so sánh thời gian và tần suất khám phá hai đồ vật trên 3 nhóm (nhóm chứng, nhóm 4,8 và 12 g/kg) cho thấy giữa hai nhóm chứng và nhóm 4,8 g/kg hầu như không thấy có sự khác biệt. Tuy nhiên chuột ở nhóm 12 g/kg có xu hướng khám phá vật mới nhiều hơn (cả về thời gian và tần suất) so với 2 nhóm còn lại. Kết quả này cho thấy chuột uống dung dịch NaCl 0,9 % và tảo ở liều 4,8 g/kg có kết quả tương tự nhau, trong khi chuột uống tảo ở liều 12 g/kg có xu hướng khám phá vật mới nhiều hơn so với 2 nhóm còn lại ở ngày tập thứ 3 của bài tập. Các kết quả nghiên cứu thu được của chúng tôi đã cho thấy trong giai đoạn luyện tập, không có sự khác biệt đáng kể về tổng thời gian dành khám phá hai đồ vật giống hệt nhau ở tất cả các nhóm, như vậy, khả năng nhận thức của các đối tượng thuộc các nhóm khác nhau là tương đương nhau. Trong giai đoạn kiểm tra, chuột ở cả 3 nhóm đều giành nhiều thời gian khám phá các đồ vật mới hơn so với vật cũ, trong đó chuột thuộc nhóm 12 g/kg có thời gian dài hơn so với hai nhóm còn lại. Kết quả này đã cho thấy uống dung dịch tảo (liều 12 g/kg) trong 4 tuần đã làm tăng cường trí nhớ ở chuột, trong khi ở liều uống 4 g/kg thì không thấy sự khác biệt so với nhóm chứng. Hiện nay, một số nhóm nghiên cũng sử dụng các phương pháp nghiên cứu tương tự để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của một số dược liệu như Ptychopetalum olacoides (Götz và Ittner, 2008), Acanthopanax (Bartolini và cs., 2006) và Trifoliatus, Lycium barbarum (Chang và So, 2008). Kết quả nghiên cứu trong mê lộ chữ Y Kết quả nghiên cứu về các chỉ số của chuột trong bài tập mê lộ chữ Y được thể hiện trong Hình 3.14 và 3.15. Kết quả được cho thấy phần trăm luân phiên chuột đi vào 3 cánh liên tiếp của mê lộ có tổng số lần chuột ra vào các cánh của mê lộ chữ Y là tương đương nhau ở cả 3 nhóm chuột thí nghiệm. Hình 3.15. Phần trăm luân phiên chuột đi vào 3 cánh liên tiếp của mê lộ Hình 3.14. Tổng số lần chuột ra vào các cánh của mê lộ (lần) (%) Các kết quả nghiên cứu về vận động, khả năng nhận thức và trí nhớ của chuột khi sử dụng dung dịch vi tảo N. oculata QN1 cho thấy ở liều uống 4,8 và 12g/kg khối lượng cơ thể đã không ảnh hưởng đến chức năng vận động nhưng tăng khả năng khám phá và giúp tăng cường trí nhớ ở chuột được uống với liều 12 g sinh khối vi tảo/kg khối lượng cơ thể chuột sau 4 tuần. 3.3.2. Nghiên cứu xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N. oculata đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức năng 3.3.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N. oculata QN1 dạng lỏng đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức năng Các phương pháp đề xuất để phân tích các chỉ tiêu của mẫu sinh khối vi tảo tươi N. oculata QN1 đều đạt yêu cầu phân tích theo AOAC và có thể được sử dụng để kiểm tra/kiểm soát chất lượng các mẫu sinh khối vi tảo tươi N. oculata. QN1. Các kết quả phân tích cho thấy mẫu vi tảo tươi được dùng thử nghiệm đạt yêu cầu về chỉ tiêu lý hóa, chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng, chỉ tiêu vi sinh theo yêu cầu chỉ tiêu chất lượng dự kiến. Nguyên liệu này đã được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn cho tảo tươi số 13781/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 18/7/2013. 3.3.2.2. Xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N. oculata QN1 dạng h đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức năng Các phương pháp đề xuất đều đạt yêu cầu phân tích và có thể sử dụng để kiểm tra/kiểm soát chất lượng của sản phẩm sinh khối tảo khô N. oculata QN1. Các kết quả phân tích mẫu vi tảo khô N. oculata QN1 cho thấy mẫu vi tảo khô đạt yêu cầu về chỉ tiêu lý hóa, chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng, chỉ tiêu vi sinh theo đúng yêu cầu theo dự kiến. Nguyên liệu này đã được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn cho bột tảo khô 12553/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 05/7/2013. 3.3.2.3. Nghiên cứu bào chế và sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa vi tảo N. oculata QN1 Nghiên cứu công thức bào chế viên nén hoặc viên nang chứa thành phẩm vi tảo khô N. oculata QN1 đạt tiêu chuẩn thực phẩm chức năng Để tăng cường chức năng tác dụng và hiệu quả sử dụng của vi tảo N. oculata QN1, chúng tôi đã nghiên cứu và bổ sung thêm một số thành phần hoạt chất và vi chất dinh dưỡng phù hợp hỗ trợ cho tác dụng của tảo N. oculata QN1 bao gồm: Nhàu, Hoàng kỳ, Taurin, Immune gamma, Vitamin B1, Vitamin B5, Vitamin B6, vitamin B3, Axit Folic. Dựa trên các công dụng của các dược liệu và vitamin trên, chúng tôi đề xuất công thức của sản phẩm viên tảo N. oculata QN1 (Bảng 3.10) như sau: Bảng 3.10: Công thức của sản phẩm viên tảo N. oculata QN1 Thành phần Hàm lƣợng Vi tảo Nannochloropsis oculata QN1 50mg Cao Hoàng kỳ (Radix Astragali) 50mg Cao quả nhàu (Fructus Morindae citrifoliae) 50mg Taurine 50mg ImmuneGamma 50mg Vitamin PP 5,0mg Vitamin B5 2,0mg Vitamin B1 0,5mg Vitamin B6 0,5mg Axít Folic 0,15mg 3.3.2.4. X dựng tiêu chuẩn chất lượng viên nang thành phẩm Các kết quả phân tích mẫu viên nang tảo cho thấy mẫu viên tảo đạt yêu cầu về chỉ tiêu lý hóa, chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng, chỉ tiêu định tính, định lương và chỉ tiêu vi sinh theo đúng yêu cầu của tiêu chuẩn cơ sở đã công bố (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Kết quả phân tích các tiêu chuẩn cơ sở của viên nang thành phẩm STT Tên chỉ tiêu Kết quả đánh giá Mức độ đạt yêu cầu 1 Hình thức Viên nang cứng, màu xanh tảo. Cốm trong nang màu nâu vàng, có mùi đặc trưng Đạt 2 Độ đồng đều khối lượng 613mg – 693mg/viên Đạt 3 Độ rã 12 – 15 phút, đạt Đạt 4 Định tính N.oculata QN1 Vi tảo ở dạng đơn bào, màu xanh lục, tế bào dạng hình cầu và hình trứng đặc trưng Đạt 5 Định tính Nhàu Dương tính Đạt 6 Định tính Hoàng kỳ Dương tính Đạt 7 Định tính Immune Gamma Đặc hiệu Immune Gamma Đạt 8 Định lượng vitamin B1 0,46 ± 0,005mg/viên Đạt 9 Định lượng vitamin B6 0,46 ± 0,008mg/viên Đạt 10 Định lượng vitamin PP 4,57 ± 0,058mg/viên Đạt 11 Định lượng vitamin B5 1,93 ± 0.014mg/viên Đạt 12 Định lượng axit Folic 0,145 ± 0,003mg/viên Đạt 13 Định lượng Taurin 47 ± 0,382mg/viên Đạt 14 Tổng số VKHK 3,0 x 102CFU/g Đạt 15 Coliforms < 3 MPN/g Đạt 16 E. coli KPH/g Đạt 17 C. perfringens < 3MPN/g Đạt 18 B. cereus < 10CFU/g Đạt 19 S. aureus KPH/g Đạt 20 Salmonella KPH/25g Đạt 21 Tổng số nấm men, nấm mốc <10CFU/g Đạt 22 Chì 1,132ppm Đạt 23 Cadimi 0,031ppm Đạt 24 Thủy ngân 0,067ppm Đạt 25 Asen 0,051ppm Đạt KPH- Không phát hiện Các kết quả nghiên cứu cho thấy các phương pháp được dùng sản xuất đảm bảo các yêu cầu phân tích, phù hợp để kiểm tra chất lượng thành phẩm viên nang cứng vi tảo N. oculata QN1. Dựa trên các kết quả nêu trên, tiêu chuẩn cơ sở của thực phẩm chức năng Viên nang cứng vi tảo N. oculata QN1 đã được xây dựng và được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn số 12552/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 05/7/2013. Chúng tôi đã nghiên cứu và bào chế thành công Viên nang cứng chứa bột vi tảo N. oculata QN1 và thành phần hoạt chất có công dụng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư, bổ sung các vitamin và khoáng chất, làm đẹp da, chống lão hóa, giúp chống suy nhược, tăng cường sức đề kháng cho người già, bệnh nhân sau phẫu thuật, vận động viên, trẻ biếng ăn. Kết quả phân tích thành phẩm viên nang cho phép đưa ra các tiêu chuẩn gồm các chỉ tiêu và phương pháp cho phép kiểm tra, kiểm soát chất lượng sản phẩm. Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm viên nang này. Ngoài ra, độ ổn định của các thành phần trong quá trình bào chế và bảo quản cũng đã được nghiên cứu. Các kết quả thu được cho thấy không có hoạt chất nào bị ảnh hưởng trong quá trình bào chế và bảo quản. Sản phẩm đã được Cục An toàn Thực phẩm –Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn số 12552/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 05/7/2013. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đã tuyển chọn được 6 chủng Nannochloropsis spp. ở vùng biển Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hòa. Định tên khoa học chính xác chủng Nannochloropsis sp. QN1 phân lập được từ vùng biển Quảng Ninh thuộc về loài Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981. Trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA của chủng nêu trên đã được đăng ký trên Genbank với mã số KU 342 038. Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng N. oculata QN1 ở điều kiện phòng thí nghiệm: môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30 ‰, nhiệt độ 25-30 C, cường độ ánh sáng là 100 μmol/m2/s, pH 7, sục khí CO2 có nồng độ 2 (v/v) với tốc độ 0,25 L/phút, mật độ tế bào ban đầu để nhân nuôi đạt 11 triệu TB/mL. 2. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng N. oculata QN1 trong hệ thống nuôi kín 20, 50-100 L: môi trường dinh dưỡng Walne; nồng độ muối 30 ‰; nhiệt độ 25-28 ºC; ánh sáng với cường độ 100 µmol/m2/s; pH 7; sục không khí có bổ sung CO2 ở nồng độ 2 % (v/v) với tốc độ sục khí 0,25-0,5 L/phút; mật độ tế bào ban đầu tối ưu cho nhân nuôi trong hệ thống nuôi kín là 15-20 triệu TB/mL. Mật độ tế bào trong các hệ thống nuôi kín 50-100L đạt giá trị trung bình cao nhất là 245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 x 106 TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy. 3. Đã xác định được điều kiện thu hoạch sinh khối vi tảo hiệu quả khi ly tâm 6000 v/p trong 10 phút (dịch không xử lý kết bông) với hiệu quả lắng đạt 95 % và 3000 v/p trong 10 phút (dịch xử lý chất kết bông) với hiệu quả lắng đạt 100%. Hàm lượng, thành phần lipit và axit béo trong sinh khối tảo thu hoạch được từ hai điều kiện ly tâm nêu trên là tương đương nhau (hàm lượng lipit tổng số đạt 16,21±1,88 đến 16,72±0,88 % sinh khối khô, hàm lượng EPA đạt 24,73±2,17 đến 26,03±2,12 % so với tổng số axit béo). Sinh khối tảo N. oculata QN1 cũng rất giàu các khoáng đa và vi lượng, hàm lượng các kim loại nặng như Cd, Pd, As và Hg đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam, (2002). Sinh khối tảo có thể sấy phun cho chất lượng tốt, chi phí phù hợp, có thể áp dụng cho việc sản xuất ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp. Tính ổn định về hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit của sinh khối tảo khô N. oculata QN1 trong quá trình bảo quản ở - 20 oC đã được xác định và có chất lượng đảm bảo sau thời gian 1 năm. 4. Sinh khối vi tảo biển N. oculata QN1 không gây độc tính cấp (dù thử ở mức liều cao tối đa so với thể tích dạ dày chuột 30 g/kg khối lượng cơ thể chuột) trên chuột thực nghiệm được coi là sản phẩm không độc. Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn cho thấy sinh khối vi tảo N. oculata QN1 là hoàn toàn an toàn khi sử dụng cho động vật vì đã không ảnh hưởng đến thể trạng; hoạt động của thỏ được thử nghiệm; không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu; chức năng và mô học của gan và thận của thỏ thử nghiệm so với lô đối chứng; không ảnh hưởng đến chức năng vận động nhưng lại tăng khả năng khám phá và giúp tăng cường trí nhớ ở chuột được uống với liều 12 g sinh khối vi tảo/kg khối lượng cơ thể chuột sau 4 tuần. 5. Đã xây dựng thành công tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu là sinh khối tảo N.oculata QN1 tươi (được cấp giấy phép số 13781/2013/ATTP–XNCB); bột tảo khô (được cấp giấy phép số 12553/2013/ATTP–XNCB). Đã nghiên cứu bào chế thành công viên nang cứng thực phẩm chức năng chứa bột vi tảo N. oculata QN1 đạt tiêu chuẩn cơ sở đề ra và được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp giấy phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn số 12552/2013/ATTP–XNCB. KIẾN NGHỊ - Cần nghiên cứu, hoàn thiện quy trình nhân nuôi sinh khối tảo N. oculata QN1 trong hệ thống nuôi kín 100 L để nâng cao năng suất và chất lượng sinh khối tảo, giảm giá thành của sản phẩm để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng. - Cần tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm đánh giá tác dụng dược lý của Viên nang cứng có chứa bột vi tảo N. oculata ở người bệnh. - Tiếp tục nghiên cứu các quy trình sản xuất, dạng bào chế khác nhau phục vụ nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng như dạng nước uống, bột pha hòa tan DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phạm Đức Thuận, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng (2015) Nuôi trồng vi tảo biển Nannochloropsis oculata trong hệ thống nuôi kín dạng ống. Tạp chí Công nghệ sinh học - Hội nghị Bio-Đà Nẵng. 13 (2A): 545-549. 2. Phạm Đức Thuận, Đặng Diễm Hồng, Phan Quốc Kinh, Nguyễn Thị Thuận (2015) Đánh giá tác động sinh học của nguyên liệu sinh khối vi tảo Nannochloropsis oculata làm thực phẩm chức năng. Tạp Chí Công nghệ sinh học. 13 (2): 259-267 3. Phạm Đức Thuận, Đặng Diễm Hồng, Phan Quốc Kinh (2014) Sử dụng sinh khối vi tảo Nannochloropsis oculata làm thực phẩm chức năng. Tạp Chí Công nghệ sinh học. 12 (3): 455-465. 4. Lê Thị Thơm, Hoàng Thị Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Nguyễn Cẩm Hà, Lương Hồng Hạnh, Dương Trung Kiên, Mai Văn Quang, Trịnh Xuân Thành, Nguyễn Thị Hồng Vân, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng, Đặng Đình Kim, Phạm Đức Thuận (2013) Lựa chọn một số loài vi tảo giàu dinh dưỡng có khả năng sử dụng tốt khí CO2 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Báo cáo toàn văn tại Hội nghị khoa học công nghệ sinh học Toàn Quốc, Hà Nội, tháng 9 năm 2 13. Tập 2: 552 – 556. 5. Phạm Đức Thuận, Ngô Hoài Thu, Đặng Đình Kim, Đặng Diễm Hồng (2013) Nuôi trồng và thu hoạch sinh khối tảo Nannochloropsis oculata làm thực phẩm chức năng. Báo cáo toàn văn tại Hội nghị khoa học công nghệ sinh học Toàn Quốc, Hà Nội, tháng 9 năm 2 13. Tập 1: 733-738.