Luận án Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục haematococcus pluvialis flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

mmals. US 6054491A, United States patente WO97/35491 84. Linden H (1999) Carotenoid hydroxylase from Haematococcus pluvialis: cDNA sequence, regulation and functional complementation. Biochim Biophys Acta 1446(3): 203-212 85. Lopez MC, Garcıa-Malea, Sanchez E, Del Rıo, Lopez JL, Casas, Fernandez FGA, Fernandez JM, Sevilla, Rivas J, Guerrero MG, Molina EG (2006) Comparative analysis of the outdoor culture of Haematococcus pluvialis in tubular and bubble column photobioreactors. J Biotechnol 123(3): 329-342 86. Lorenz RT (1999) A Technical Review of Haematococcus Algae, NatuRose™ Technical Bulletin #060, Cyanotech Corporation: Kailua-Kona, HI, USA, pp 1-12 87. Lorenz RT, Cysewski GR (2000) Commercial potential for Haematococcus microalgae as natural source of astaxanthin. Trends Biotechnol 18(4): 160 – 167 88. Lovatelli A, Chen J (2009) Use of environmental friendly feed additives and probiotics in Chinese aquaculture. FAO Aquaculture Newsletter 42: 32 – 35 89. Lowry RN, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275 90. Lu Y, Jiang P, Liu S, Gan Q, Cui H, Qin S (2010) Methyl jasmonate- or gibberellins A3-induced astaxanthin accumulation is associated with up-regulation of transcription of beta-carotene ketolase genes (bkts) in microalga Haematococcus pluvialis. Bioresour Technol 101: 6468-6474 91. Mata TM, Martins AA, Caetano NS (2010) Microalgae for biodiesel production and other applications. A review. Renew Sust Energ Rev 14(1): 217-232 92. Mengelt C, Prezelin BB (2005) UV-A enhancement of carbon fixation and resilience to UV inhibition in the genus Pseudo-nitzachia may provide a competitive advantage in high UV surface waters. Mar Ecol Prog Ser 301: 81-93 146 93. Miao F, Lu D, Li Y, Zeng M (2006) Characterization of astaxanthin esters in Haematococcus pluvialis by liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Anal Biochem 352(2): 176-181 94. Miki WW, Hosoda K, Kondo K, Itakura H (1998) Astaxanthin-containing drink. Patent application number 10155459. Japanese Patent Office. Publication date 16 June 1998 95. Molina E, Fernández J, Acién FG, Chisti Y (2001) Tubular photobioreactor design for algal cultures. J Biotechnol 92(2): 113-131 96. Negre-Sadargues G, Castillo R, Petit H, Sonces S, Martenez RG, Milicua JCG, Choubert G, Trilles JB (1993) Unilization of synthetic carotenoids by the prawn Penaeus japonicus reared under laboratory condition. Aquaculture 110(2): 151-159 97. Newsome R (1986) Food colors - A scientific status summary by the institute of Food Technologist expert panel on food satify and nutrition. Institute of Food technologist Chicago, USA 98. Ngô Thị Hoài Thu (2015) Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản. Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam 99. Nihat Y, Muammer E (2011) Effects of oleoresin paprika (Capsicum annum) and synthetic carotenoids (canthaxantin and astaxanthin) on pigmentation levels and growth in rainbow trout Oncorhynchus mykiss W. J Anim Vet Adv 10(14): 1875-1882 100. Nishikawa Y, Minenaka Y, Ichimura M, Tatsumi K, Nadamoto T, Urabe K (2005) Effects of astaxanthin and vitamin C on the prevention of gastric ulcerations in stressed rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 51(3): 135- 141 101. Olaizola M (2000) Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreactors. J Appl Phycol 12(3): 499-506 102. Olguin EJ, Giuliano G, Porro D, Tuberosa R, Salamin F (2012) Biotechnology for a more sustainable world. Biotechnol Adv 30 (5): 931-932 103. Orosa M, Franqueira D, Cid A, Abalde J (2001) Carotenoid accumulation in Haematococcus pluvialis in mixotrophic growth. Biotechnol Lett 23(5): 373-378 104. Panis G (2015) Commercial Astaxanthin Production Derived by Green Alga Haematococcus pluvialis: A Microalgae Process Model and a Techno-Economic Assessment All Through Production Line. Master Thesis (45 EC), Utrecht University, Netherlands 105. Palozza P, Torelli C, Boninsegna A, Simone R, Catalano A, Mele AC, Picci N (2009) Growth-inhibitory effects of the astaxanthin-rich alga Haematococcus pluvialis in human colon cancer cells. Cancer lett 283(1): 108- 117 106. Pang and Chen (2017) Effects of C5 organic carbon and light on growth and cell activity of Haematococcus pluvialis under mixotrophic conditions. Algal Research 21: 227–235 107. Parisenti J, Beirao LH, Maraschin M, Mourino JL, Nascimento Viera F, Do Nascimento Vieira F, Bedin LH (2011) Pigmentation and carotenoid content of shrimp fed with Haematococcus pluvialis and soy lecithin. Aquacult Nutr 17:530–535 108. Park JC, Choi SP, Hong ME, Sim SJ (2014) Enhanced astaxanthin production from microalga, Haematococcus pluvialis by two-stage perfusion culture with stepwise light irradiation. Bioprocess Biosyst Eng 37(10): 2039-2047 147 109. Pasini AC, Carranza VM, Abdala R, Korbee N, Figueroa FL (2011) Effect of nitrate concentration and UVR on photosynthesis, respiration, nitrate reductase activity and phenolic compounds in Ulva rigida (Chlorophyta). J Appl Phycol 23(3):363-369 110. Pham MA, Byun HG, Kim KD, Lee SM (2014) Effects of dietary carotenoid source and level on growth, skin pigmentation, antioxidant activity and chemical composition of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture 431: 65– 72 111. Pocock MA (1961) Haematococcus in southern Africa. Trans Royal Soc South Africa 36(1): 5-59 112. Pocock MA (1937) Studies in South African Volvocales. 1. A new Sphaerella (Haematococcus). Proc Linn Soc London 149: 55-58 113. Pringsheim EG (1966) Nutritional requirements of Haematococcus pluvialis and related species. J Phycol 2(1): 1-7 114. Proctor VW (1957) Some controlling factors in the distribution of Haematococcus pluvialis. Ecology 38(3): 457-462 115. Radakovits R, Jinkerson RE, Darzins A, Posewitz MC (2010) Genetic engineering of algae for enhanced biofuel production. Eukaryot Cell 9(4): 486-501 116. Raman V, Ravi S (2010) Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on antioxidant systems of Haematococcus pluvialis. Acta Physiol Plant 33(3): 1043– 1049 117. Ranjbar R, Inoue R, Shiraishi H, Katsuda T, Katoh S (2008a) Hight efficiency production of astaxanthin by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis in a bubble column photobioreactor. Biochem Eng J 39(3): 575-580 118. Ranjbar R, Inoue R, Katsuda T, Yamaji H, Katoh S (2008b) High efficiency production of astaxanthin in an airlift photobioreactor. J Biosci Bioeng 106(2): 204-207 119. Rao AR, Sindhuja HN, Dharmesh SM, Sankar KU, Sarada R, Ravishankar GA (2013) Effective inhibition of skin cancer, tyrosinase, and antioxidative properties by astaxanthin and astaxanthin esters from the green alga Haematococcus pluvialis. J Agric Food Chem 61(16): 3842–3851 120. Rüttimann A (1999) Dienolether condensation - a powerful tool in carotenoid synthesis. Pure Appl Chem 71(12): 2285-2293 121. Saha SK, McHugh E, Hayes J, Moane S, Walsh D, Murray P (2013) Effect of various stressregulatory factors on biomass and lipid production in microalga Haematococcus pluvialis. Bioresour Technol 128: 118-124 122. Salguero A, Leon R, Mariotti A, dela Morena B, Vega JM, Vilchez C (2005) UV-A mediated induction of carotenoid accumulation in Dunaliella bardawil with retention of cell viability. Appl Microbiol Biotechnol 66(5): 506-511 123. Sarada R, Tripayhi U, Ravishankar GA (2002) Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions. Process Biochem 37(6): 623-627 124. Schmidt I, Schewe H, Gassel S, Jin C, Buckingham J, Hu¨mbelin M, Sandmann G, Schrader J (2011) Biotechnological production of astaxanthin with Phaffia rhodozyma/Xanthophyllomyces dendrorhous. Appl Microbiol Biotechnol 89(3): 555-571 125. Schloemer GC, Davis JL (2001) Preparation of astaxanthin. International Patent WO0181301 148 126. Schoefs B, Rmiki N, Rachadi J, Lemoine Y (2001) Astaxanthin accumulation in Haematococcus requires a cytochrome P450 hydroxylase and an active synthesis of fatty acids. FEBS Lett 500(3): 125-128 127. Selvakumar V (2008) Ultraviolet-B radiation (280-315 nm) invoked antioxidant defence systems in Vigna unguiculata (L.) Walp and Crotalaria juncea L. Photosynthetica 46(1): 98-106 128. Shah M, Liang Y, Cheng J, Daroch M (2016) Astaxanthin producing green microalgae Haematococcus pluvialis: From single cell to high value commercial products. Front Plant Sci 7: 531-559 129. Shang M, Ding W, Zhao Y, Xu JW, Zhao P, Li T, Ma H, Yu X (2016) Enhanced astaxanthin production from Haematococcus pluvialis using butylated hydroxyanisole. J Biotechnol 236: 199 – 207 130. Sheikhzadeh N, Panchah IK, Asadpour R, Tayefi-Nasrabadi H, Mahmoudi H (2012a) Effects of Haematococcus pluvialis in maternal diet on reproductive performance and egg quality in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Anim Reprod Sci 130(1-2): 119–123 131. Sheikhzadeh N, Tayefi-Nasrabadi H, Oushani AK and Najafi Enferadi MH (2012b) Effects of Haematococcus pluvialis supplementation on antioxidant system and metabolism in rain - bow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Physiol Biochem 38(2): 413-419 132. Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A (2006) Commercial applications of microalage. J Biocien Bioeng 101 (2): 87-96 133. Storebakken T, No HK (1992) Pigmentation of rainbow trout. Aquaculture, 100(1- 3): 209-229 134. Strickland JDH, Parsons TR (1972) A practical hanbook of seawater analysis. 2nd ed. Bull Fish Res Bd Can 125, 310 pp 135. Stross RG (1963) Nitrate preference in Haematococcus as controlled by strain, age of inoculum, and pH of the medium. Can J Microbiol 9(1): 33-40 136. Suseela MR, Toppo K (2006) Haematococcus pluvialis- a green alga, richest natural source of astaxanthin. Curr Sci India 90(12): 1602–1603 137. Tjahjono AE, Kakizono T, Hayama Y, Nishio N, Nagai S (1994) Isolation of resistant mutants against carotenoid biosynthesis inhibitors for a green alga Haematococcus pluvialis, and their hybrid formation by protoplast fusion for breeding of higher astaxanthin producers. J Ferment Bioeng 77(4): 352-357 138. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool. Nucleic Acids Res 25(24):4876-4882 139. Tocquin P, Fratamico A, Franck F (2011) Screening for a low - cost Haematococcus pluvialis medium reveals an unexpected impact of a low N: P ratio on vegetative growth. J Appl Phycol 24(3): 265-273 140. Tolasa S, Cakli S, Ostermeyer U (2005) Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid. Eur Food Res Technol 221(6): 787–791 141. Torrissen OJ, Hardy RW, Shearer KD (1989) Pigmentation of salmonids - carotenoid deposition and metabolism. Aquat Sci 1(2): 209-225 149 142. Torrissen OJ, Hardy RW, Shearer KD, Scott TM, Stone FE (1990) Effects of dietary canthaxanthin level and lipid level on apparent digestibility coefficients for canthaxanthin in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 88(3-4): 351- 362 143. Tripathi U, Sarada R, Ravishankar GA (2002) Effect of culture conditions on growth of green alga Haematococcus pluvialis and astaxanthin production. Acta physiol plant 24(3): 323-329 144. Turner A (1965). Screening methods in pharmacology. Academic Press, New Yorkand London, pp. 60 - 68. 145. Vass I, Kirilovsky D, Perewoska I, Mate Z, Nagy F, Etienne A (2000) UV-B radiation induced exchange of the D1 reaction centre subunits produced from the psbA2 and psbA3 genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Eur J Biochem 267(9): 2640-2648 146. Vega-Estrada J, Montes-Horcasitas JMC, Dominguez-Bocanegra AR, Canizares- Villanueva RO (2005) Haematococcus pluvialis cultivation in split-cylinder internal- loop airlift photobioreactor under aeration conditions avoiding cell damage. Appl Microbiol Biotechnol 68(1): 31- 35 147. Vidhyavathi (2008) Molecular an biochemical studies of astaxanthin in Haematococcus pluvialis. PhD dissertation. University of Mysore, India 148. Vinegla B, Segovia M, Figueroa F (2006) Effect of artificial UV radiation on carbon and nitrogen metabolism in the macroalgae Fucus spiralis L. and Ulva olivascens Dangeard. Hydrobiologia 560(1): 31-42 149. Wan M, Hou D, Li Y, Fan J, Huang J, Liang S, Wang W, Pan R, Wang J, Li S (2014b) The effective photoinduction of Haematococcus pluvialis for accumulating astaxanthin with attached cultivation. Bioresour Technol 163: 26–32 150. Wan M, Zhang J, Hou D, Fan J, Li Y, Huang J, Wang J (2014a) The effect of temperature on cell growth and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis during a light-dark cyclic cultivation. Bioresour Technol 167:276-283 151. Wan M, Zhang Z, Wang J, Huang J, Fam J, Yu A, Wang W (2015) Sequential heterotrophy dilution - photoinduction cultivation of Haematococcus pluvialis for efficient production of astaxanthin. Bioresour Technol 198: 557–563 152. Wang SB, Chen F, Sommerfeld M, Hu Q (2005) Isolation and proteomic analysis [corrected] of cell wall-deficient Haematococcus pluvialis mutants. Proteomics 5(18):4839-4851 153. Wang JF, Han DX, Sommerfeld MR, Lu CM and Hu Q (2013) Effect of initial biomass density on growth and astaxanthin production of Haematococcus pluvialis in an outdoor photobioreactor. J Appl Phycol 25: 253–260 154. Wang N, Guan B, Kong Q, Sun H, Geng Z, Duan L (2016) Enhancement of astaxanthin production from Haematococcus pluvialis mutants by three-stage mutagenesis breeding. J Biotechnol 236: 71-77 155. Wen Z, Liu Z, Hou Y, Liu C, Gao F, Zheng Y, Chen F (2015) Ethanol induced astaxanthin accumulation and transcriptional expression of carotenogenic genes in Haematococcus pluvialis. Enzyme Microb Technol 78: 10-17 156. Yang Y, Kim B, Lee JY (2013) Astaxanthin structure, metabolism, and health benefits. J Hum Nutr Food Sci 1(1003):1–11 150 157. Yin S, Wang J, Chen L, Liu T (2015) The water footprint of biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis is greatly decreased by using sealed narrow chambers combined with slow aeration rate. Biotechnol Lett 37(9): 1819–1827 158. Yoo JJ, Choi SP, Kim BW, Sim SJ (2012) Optimal design of scalable photobioreactor for phototropic culturing of Haematococcus pluvialis. Bioprocess Biosyst Eng 35(1-2): 309-315 159. Yu X, Chen L, Zhang W (2015) Chemicals to enhance microalgal growth and accumulation of high-value bioproduct. Front Microbiol 6: 56 160. Yuan JP, Chen F (2000) Purification of trans-astaxanthin from a high-yielding astaxanthin ester-producing strain of the microalga Haematococcus pluvialis. Food Chem 68(4): 443–448 161. Yuan JP, Peng , Yin K, Wang JH (2011) Potential health promoting effects of astaxanthin: A high-value carotenoid mostly from microalgae. Mol Nutr Food Res 55(1):150–165 162. Zhang XW, Gong XD, Chen F (1999) Kinetic models for astaxanthin production by high cell density mixotrophic culture of the microalga Haematococcus pluvialis. J Ind Microbiol Biotechnol 23(1):691–696 163. Zhang W, Wang J, Wang J, Liu T (2014) Attached cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production. Bioresour Technol 158: 329–335 164. Zhekisheva M, Zarka A, Khozin-Goldberg I, Cohen Z, Boussiba S (2005) Inhibition of astaxanthin synthesis under high irradiance does not abolish triacylglycerol accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae). J Phycol 41:819–826 165. Zhekisheva M, Boussiba S, Khozin-Goldberg I, Zarka A, Cohen Z (2002) Accumulation of oleic acid in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated with that of astaxanthin esters. J Phycol 38: 325–331 166. Zheng KJ, Hu ZL, Li SF, Lei AP, Wang CG (2007) Cloning and sequencing of β- carotene hydroxylase gene from Haematococcus pluvialis. Acta Hydrobiol Sin 31(5): 666- 670 167. Zhu C, Naqvi S, Capell T, Christou P (2008) Metabolic engieering of ketocarotenoid biosynthesis in higher plants. Arch Biochem Biophys 483(2): 182 – 190 168. khan/6446.html 169. 170. methods-a-review 171. https://www.google.com.vn/search?q=photobioreactor+for+haematococcus&sourc e=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwj8he72h7bQAhWJUrwKHfqJCp4Q_AUIC CgB&biw=1041&bih=531 1 PHỤ LỤC 1/ Phụ lục 1 Bảng phụ 1. Thành phần dinh dưỡng của các môi trường C, BG11, OHM và RM được sử dụng trong nghiên cứu (Andersen, 2005; Imamoglu và cs., 2007) Thành phần môi trường Môi trường (mg/L) C BG-11 cải tiến OHM RM NaNO3 - 1500 - 300 K2HPO4 - 320 - 80 KH2PO4 - - - 20 Ca (NO3)2 150 - - - KNO3 100 - 410 - Na2HPO4 - - 30 - β-Na2glycerolphosphate 50 - - - MgSO4.7 H2O 40 200 246 10 CaCl2. 2 H2O - 36 110 58,5 Axit Citric - 6 - - Ammonium ferric citrate - 6 - - EDTA-Na2 2,71 1 - - EDTA - - - 7,5 Na2CO3 - 100 - - NaCl - - - 20 Vitamin B12 0,0001 - 0,0150 - Biotin 0,0001 - 0,025 - Thiamine-HCl 0,01 - - - Thiamine - - 0,0175 - H3BO3 - 2,86 - 0,3 MnCl2.4H2O 0,108 1,81 0,98 - MnSO4.H2O - - - 1,5 ZnSO4. 7 H2O 0,066 0,22 - 0,1 Na2MoO4. 2 H2O 0,0075 0,39 0,12 - (NH4)6Mo7O24. 4H2O - - - 0,3 CuSO4.5 H2O - 0,08 0,012 0,08 Co(NO3)2.6 H2O - 0,05 - 0,26 FeCl3.6 H2O 5,888 - - 17 CoCl.6H2O 0,012 - 0,011 - Trisaminomethane 500 - - - Fe (III)citrate H2O - - 2,62 - Cr2O3 - - 0,075 - SeO2 - - 0,005 - Ghi chú: - không có 2 2/ Phụ lục 2 Bảng phụ 2. Mã số đăng ký trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Haematococcus và nhóm ngoại được công bố trên Ngân hàng gen đã được sử dụng trong nghiên cứu STT Loài Chủng Mã số đăng ký Nguồn 1 Haematococcus pluvialis UTEX 2505 U70590 Chekanov et al., 2014 2 Haematococcus pluvialis SAG_34- lb AF159369 Chekanov et al., 2014 3 Haematococcus pluvialis SAG_34- le KC196724 Chekanov et al., 2014 4 Haematococcus zimbabwiensis UTEX LB 1758 U70797 Chekanov et al., 2014 5 Haematococcus lacustris AB360747 Chekanov et al., 2014 6 Haematococcus zimbabwiensis SAG 2696 AB360748 Chekanov et al., 2014 7 Mantoniella squamata X73999 Hepperle et al., 1998 8 Nephroselmis olivacea X74754 Hepperle et al., 1998 9 Chlorella fusca var. rubescensa X74002 Hepperle et al., 1998 10 Chlorella vulgaris X13688 Hepperle et al., 1998 3/ Phụ lục 3 Phương pháp xác định sinh khối khô Xác định SKK của tảo Haematococcus sp. HB theo phương pháp sấy khô mẫu ở 80oC và dựa vào MĐTB Cách 1. SKK tảo (g/L) được tính theo phương pháp sấy khô mẫu ở 800C (Elliott (1934)) Bước 1: Sấy cốc cân ở 1050C trong 3 giờ. Lấy cốc ra để nguội trong silicator (trong 30 phút). Cân khối lượng cốc và lặp lại cho đến khối lượng cốc không đổi, được m1 (g). 3 Bước 2: Lấy 10 mL dịch tảo cho vào cốc đã sấy ở bước 1 và sấy ở 800C trong 24 giờ. Lấy ra để nguội trong silicator (30 phút), cân khối lượng cốc và sinh khối. Lặp lại quá trình sấy đến khối lượng không đổi được m2 (g). Tiến hành tương tự với 10 mL môi trường nuôi (không có tảo) được m3 (g). Bước 3: Tính SKK của tảo theo công thức sau: SKK (g/L) = [(m2 – m1) - (m3 – m1)]x 100 Trong đó: (m2 – m1) là khối lượng khô của (sinh khối tảo + môi trường); (m3 – m1) là khối lượng khô của môi trường. Cách 2. Xác định SKK dựa vào MĐTB theo công thức (Imamuglu và cs, 2007) Cb (g/L) = 0,0668 x Cc + 0,1304 Trong đó: Cb là SKK; Cc là MĐTB (105 TB/mL) 4/ Phụ lục 4 Phương pháp xác định hàm lượng protein Định lượng protein của sinh khối tảo theo phương pháp Lowry (1951). Tách chiết protein Lọc 10 ml dịch tảo bằng giấy lọc GF/C, cho vào lọ penicilin, cất trong ngăn đá tủ lạnh. Dùng panh gắp giấy lọc có sinh khối tảo vào cối sứ đặt trong hộp đá, thêm cát thuỷ tinh, nghiền bằng chày cho đến khi sinh khối thấy mịn, thêm 1 mL dung dịch NaCl 1 M, nghiền tiếp, chuyển vào lọ penicilin. Tráng chày cối bằng 3 mL dung dịch NaCl 1 M, chia làm 3 lần đến khi dịch tráng không còn màu xanh để thu sinh khối 1 cách tối đa. Ủ trong lạnh 2 giờ, ly tâm 12000 vòng/5 phút, thu lấy phần dịch trên cho sang lọ penicilin khác. Thêm 2V acetone, ủ lạnh qua đêm, ly tâm 12000 rpm/10 phút, thu tủa, làm khô tủa trong 10 phút, hoà tan tủa trong 100 µL dung dịch NaCl 0,01 M. Ly tâm 10000 rpm trong 20 phút, thu lấy phần dịch trong phía trên để tiến hành làm phản ứng Lowry - Phản ứng Lowry • Dung dịch A: 2% Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1N • Dung dịch B: 0,5% CuSO4 trong dung dịch 1% natri kalitactrat 4 • Dung dịch C: 49A: 1B • Thuốc thử Folin Tiến hành: • Hút 300 µL dung dịch C cho vào ống mẫu; • Thêm 30 µL mẫu tách protein, lắc đều, để trong 10 phút; • Thêm 15 µL thuốc thử Folin, lắc đều, để trong 30 phút, thêm 1655 µL nước cất. • Đo OD ở bước sóng 720 nm. - Xây dựng đường chuẩn: Tiến hành với 9 nồng độ protein chuẩn (albumin) từ 5– 100 µg, blank là mẫu 0 µg và kết quả đo được với protein chuẩn ở các nồng độ khác nhau (Bảng phụ 3; Hình phụ 1). Bảng phụ 3. Kết quả đo OD trong phương pháp xây dựng đường chuẩn Protein STT Hàm luợng protein (µg) V dd C (µL) V Folin (µL) V H2O (µL) OD720 0 300 15 1685 0,000 1 5 300 15 1680 0,006 2 10 300 15 1675 0,013 3 20 300 15 1665 0,026 4 30 300 15 1655 0,041 5 40 300 15 1645 0,045 6 50 300 15 1635 0,064 7 60 300 15 1625 0,088 8 80 300 15 1605 0,097 9 100 300 15 1585 0,111 5 Từ kết quả thu được nêu trên, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn xác định hàm lượng protein (µg) theo giá trị OD đo ở bước sóng 720 nm với giá trị OD nằm trong khoảng [0; 0,110] theo phương trình: Y = 835,56 X – 1,6958. Trong đó, Y: hàm lượng protein (µg); X: giá trị OD720 5/ Phụ lục 5 Tách chiết lipit Tách chiết lipít từ sinh khối vi tảo được tiến hành theo phương pháp Bligh & Dyer (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Cân 0,1 g sinh khối tảo khô cho vào cối chày sứ, bổ sung thêm 0,2 g Na2SO4 và nghiền hỗn hợp này thành bột mịn. Sau đó bổ sung thêm 10 mL hỗn hợp dung môi chloroform: methanol (tỷ lệ 2:1, v/v) và ngâm trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc Whatman số 1 và thu dịch trong. Bã sinh khối được tiếp tục chiết với chloroform từ 2 - 3 lần để thu tối đa lipít trong sinh khối tảo. Dịch chiết được trộn đều và chuyển sang phễu chiết. Sau đó, bổ sung thêm 10 mL Hình P1. Đường chuẩn protein được xác lập giữa hàm lượng protein (µg) và giá trị OD ở bước sóng 720nm 6 dung dịch NaCl 0,9% và để tĩnh ở nhiệt độ phòng qua đêm. Lớp dung môi hữu cơ phía dưới chứa các thành phần lipít được thu nhận. Sau đó, dung môi được bay hơi ở 60oC và làm khô trong desiccator. Sản phẩm được hòa tan trong n - hexan, lọc bỏ cặn và làm bay hơi n - hexan để thu hồi lipít. Lượng lipít thu được là sự chênh lệch về trọng lượng của cốc thủy tinh ban đầu và trọng lượng của cốc thủy tinh chứa lipít. Hàm lượng lipít tổng số được tính bằng số gam lipít thu được trên số gam tảo khô. Giá trị phần trăm lipít trong sinh khối tảo được xác định từ giá trị trung bình của hàm lượng lipít của 3 lần lặp lại thí nghiệm. 6/ Phụ lục 6: Thí nghiệm với cá Koi Nhật Bản Xác định lượng tảo khô cho 1 kg thức ăn công nghiệp như sau: Khối lượng cá của 1 giai x 0,1 (10% thức ăn/ngày) x 30 ngày = 54 kg (thức ăn công nghiệp cho cá thí nghiệm). Tảo có hàm lượng astaxanthin 4% SKK hay 1 kg tảo khô tương đương 40.000 mg astaxanthin. Trộn thức ăn các hàm lượng astaxanthin theo các thí nghiệm là: 100 mg/ kg, 150 mg/ kg, và 200 mg/ kg thức ăn, khi đó lượng tảo khô được phối trộn như trong Bảng phụ 4. Bảng phụ 4. Công thức ăn được lặp lại ở các giai thí nghiệm theo các tháng khác nhau Thí nghiệm Công thức thức ăn (mg astaxanthin/kg thức ăn) Lượng tảo bổ sung/kg thức ăn (g) TN 1 100 2,5 TN 2 150 3,75 TN 3 200 5 Phương pháp phối trộn sinh khối tảo chủng HB vào thức ăn công nghiệp Tảo khô được ngâm với aceton sau đó được đông lạnh ở nhiệt độ âm 15oC trong thời gian 12 giờ rồi giã đông và làm khô bằng quạt gió. Sau khi làm khô, tảo được trộn với dầu gan mực với nồng độ 30 mL dầu /150 gram tảo khô. Sử dụng máy quay sinh tố với tốc độ 600 v/phút để vừa trộn vừa làm các tế bào tảo vỡ ra. Thời gian trộn đều là 15 phút/mẻ. Dung dịch sau trộn gồm tảo và dầu được trộn với thức ăn. Phương pháp trộn đều bằng máy xay sinh tố (Hình Phụ 2a, b, c). 7 7/Phụ lục 7 Thí nghiệm với cá Hồi Vân Hình P2.b. Trộn Tảo với dầu trước (trái) sau đó trộn hỗn hợp dầu-tảo với thức ăn công nghiệp (phải) Hình P2.a. Hình ảnh minh họa các giai thí nghiệm có kích thước 2 x 2 x 1 m; mắt lưới 2A = 1 mm. Mỗi giai thả 30 con cá Koi Nhật. Định kì thay giai 3 tuần /lần Hình P2.c.Thức ăn và tảo H. pluvialis HB (A) và Thức ăn trộn tảo H.pluvialis HB (B) B A A B C Hình P3. Ảnh chụp các bể nuôi cá Hồi được ăn thức ăn khác nhau A- ăn cám Pháp; B- ăn cám Việt Nam; C- ăn cám Việt Nam có phối trộn với sinh khối tảo H. pluvialisHB với hàm lượng 61 mg astaxanthin/ 1kg thức ăn 8 8/ Phụ lục 8 Thức ăn cho cá hồi Vân 9/ Phụ lục 9 Bảng phụ 5. Thành phần dinh dưỡng của các loại thức ăn cho cá hồi Vân sử dụng trong nghiên cứu Thông số Cám Pháp Cám Việt Nam Cám Việt Nam bổ sung tảo H. pluvialis Protein thô (min %) 41,5 28 18 Chất béo thô (min %) 21,5 7 5 Xơ thô (max %) 2,9 6 7 Tro (max %) 5,5 10 10 Ca (max %) KCTT 2 2 P (min %) KCTT 1 1 NaCl (max %) KCTT 2 2 Độ ẩm (%) KCTT 11 11 Chú ý: KCTT: không có thông tin A B C D E F Hình P4. Ảnh chụp 3 loại cám cá hồi ở 3 lô thí nghiệm (hàng trên) và dưới kính hiển vi quang học (hàng dưới, x 400 lần) (A, B, C: Viên cám thí nghiệm; D- thức ăn cám Pháp; E- cám Việt Nam; F- Cám Việt Nam có phồi trộn thêm 61 mg astaxanthin/ 1kg thức ăn 9 10/ Phụ lục 10 Trình tự gen mã hóa enzyme carotenoid hydroxylase (gen chy) tách từ vi tảo lục H. pluvialis HB (kích thước 897 bp) 11/ Phụ lục 11 Trình tự amino acid dịch mã của gen chy Hình P6. Trình tự amino acid của đoạn gen chy của vi tảo H. pluvialis HB CTGCAGTCAATCAGCGTCAAGGCCCCGCCGCCGTTGAACTAAGTCCCGCGACATCACGCGGCCCCAA AAGTCTGCCTGCATGCTACAGCGGTGCTCGTTAGTTCGGCTGCGAGTGGCAGCACCACAGACAGAGG AGGCGGTGGGAACCGTGCAGGCTGCCGGCGCGGGCGATGAGCACAGCGCCGATGTAGCACTCCAG CAGCTTGACCGGGCTATCGCAGAGCGTCGTGCCCGGCGCAAACGGGAGCAGCTGTCATACCAGGCT GCCGCCATTGCAGCATCAATTGGCGTGTCAGGCATTGCCATCTTCGCCACCTACCTGAGATTTGCCAT GCACATGACCGTGGGCGGCGCAGTGCCATGGGGTGAAGTGGCTGGCACTCTCCTCTTGGTGGTTGG TGGCGCGCTCGGCATGGAGATGTATGCCCGCTATGCACACAAAGCCATCTGGCATGAGTCGCCTCTG GGCTGGCTGCTGCACAAGAGCCACCACACACCTCGCACTGGACCCTTTGAAGCCAACGACTTGTTTGC AATCATCAATGGACTGCCCGCCATGCTCCTGTGTACCTTTGGCTTCTGGCTGCCCAACGTCCTGGGGG CGGCCTGCTTTGGCGCGGGGCTGGGCATCACGCTATACGGCATGGCATATATGTTTGTACACGATGG CCTGGTGCACAGGCGCTTTCCCACCGGGCCCATCGCTGGCCTGCCCTACATGAAGCGCCTGACAGTG GCCCACCAGCTTCACCACAGCGGCAAGTACGGTGGCGCGCCCTGGGGCATGTTCTTGGGGCCACAG GAGCTGCAGCACATTCCAGGTGCGGCGGAGGAGGTGGAGCGACTGGTCCTGGAACTGGACTGGTCC AAGCGGTAGGGTGCGGAACCAGGCACGCT     Hình P5. Trình tự gen mã hóa cho enzyme carotenoid hydroxylase 10 12/ Phụ lục 12 Vòng đời của chủng HB ở bình tam giác 250 mL trong môi trường RM 13/ Phụ lục 13 Vòng đời của chủng HB ở bình tam giác 500 mL trong môi trường RM Hình P7. Một số hình ảnh đặc trưng của các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis HB nuôi ở bình tam giác 250 mL trên môi trường RM. Hình P8. Một số hình ảnh đặc trưng của các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis HB nuôi ở bình tam giác 500 mL trên môi trường RM 11 14/ Phụ lục 14 Vòng đời của chủng HB ở bình tam giác 1000 mL trong môi trường RM 15/ Phụ lục 15 Vòng đời của chủng HB ở bình nhựa 1,5 lít trong môi trường RM Hình P10. Một số hình ảnh đặc trưng của các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis HB nuôi ở bình tam giác 1,5 lít trên môi trường RM Hình P9. Một số hình ảnh đặc trưng của các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis HB nuôi ở bình tam giác 1000 mL trên môi trường RM 12 16/ Phụ lục 16 Vòng đời của chủng HB ở bình nhựa 10 lít trong môi trường RM 17/ Phụ lục 17 Nuôi trồng VTL H. pluvialis HB ở các qui mô nuôi cấy khác nhau Hình P11. Một số hình ảnh đặc trưng của các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis HB nuôi ở bình tam giác 10 lít trên môi trường RM Hình P12. Nuôi trồng H. pluvialis HB trong các môi trường dinh dưỡng quy mô khác nhau: bình tam giác 250 (A), 500 mL (B), 1,5 L (C) và 10 L (D). A   B   C   D   13 18/ Phụ lục 18 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng HB 19/ Phụ lục 19 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của chủng HB Hình P13. Hình ảnh minh họa tảo ở các công thức nhiệt độ sau 30 ngày thí nghiệm Hình P14. Ảnh hưởng của môi trường RM có pH khác nhau lên sinh trưởng của chủng HB sau 7 ngày (A) và 30 ngày (B) thí nghiệm A B 14 20/ Phụ lục 20 Nuôi chủng HB trong hệ thống nuôi kín 26 L 21/ Phụ lục 21: Nuôi chủng HB trong hệ thống kín 50 và 100 L Hình P15. Hình ảnh minh họa quá trình nuôi chủng HB ở hệ thống kín 26 L được chiếu ánh sáng cao kết hợp với UV Hình P16. Hình ảnh minh họa cho việc nuôi thành công chủng HB ở hệ thống 50 và 100 L. A- hệ thống 50 L; B- hệ thống 100 L 1 N 2 N 3 N A B 15 22/ Phụ lục 22 Ảnh minh họa thí nghiệm chuyển đỏ vi tảo lục H. pluvialis HB trong các hệ thống kín 26, 50 và 100 L Hình P17. Ảnh chụp các hệ thống kín 26, 50 và 100 L vi tảo lục H. pluvialis HB đã chuyển trạng thái tích lũy cao astaxanthin 26 L 100 L 50 L 50 L 16 23/ Phụ lục 23: Nghiên cứu độc tính của sinh khối tảo H. pluvialis HB trên mô hình động vật thực nghiệm Địa điểm: Thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn của sinh khối tảo H. pluvialis HB được tiến hành tại Phòng Dược học và Các hợp chất tự nhiên, phần xét nghiệm huyết học và hóa sinh được tiến hành tại Phòng nghiên cứu ứng dụng lâm sàng (Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Y Dược học, Học viện Quân y), phần đánh giá mô bệnh học được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh (Bệnh viện 103, Học viện Quân y). Phương pháp: Phương pháp xác định độc tính cấp: theo phương pháp của Abrham (1978) và Turner (1965); quy định của Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 1993) về nghiên cứu độc tính của thuốc y học cổ truyền. Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng: Chuột được chia ngẫu nhiên làm 09 nhóm, mỗi nhóm 10 con. Từng nhóm chuột được cho uống bột tảo với các mức liều 400 mg, 600 mg, 800 mg, 1000 mg, 1200 mg, 1400 mg, 1600 mg, 1800 mg và 2000 mg/kg thể trọng cơ thể-TLCT. Sau khi uống, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi liên tục trong 72 giờ. Đánh giá sự thay đổi tập tính và tỷ lệ chuột chết theo từng nhóm thí nghiệm. Liều cao nhất không gây chết một con chuột nào và liều thấp nhất gây chết toàn bộ chuột được sử dụng để tính LD50. Thiết kế thí nghiệm trên thỏ: Thỏ thí nghiệm được phân chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm, mỗi nhóm có 10 con. Nhóm 1 (nhóm chứng): được cho uống nước cất liều 5 mL/kg thể trọng/24h liên tục trong 42 ngày. Nhóm 2: được cho uống sinh khối tảo với liều 200 mg/kg thể trọng /24h (mức liều 1) liên tục trong 42 ngày. Nhóm 3: được cho uống sinh khối tảo với liều 400 mg /kg thể trọng/24 h (mức liều 2) liên tục trong 42 ngày. Các chỉ tiêu đánh giá: Sinh lý - dược lý (tình trạng chung, hoạt động, ăn uống, trọng lượng cơ thể, điện tim). Huyết học (số lượng hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu và tiểu cầu). Hóa sinh (aspartate amino transferase (AST), alanin amino transferase (ALT), ure và creatinin). Mô bệnh học gan, lách và thận thỏ (vào ngày thứ 42, giết thỏ, làm xét nghiệm mô bệnh học gan, lách và thận thỏ thực nghiệm). Thời điểm xét nghiệm: Tại 3 thời điểm: xuất phát điểm (trước khi uống sinh khối tảo), sau 3 tuần (ngày thứ 21) và sau 6 tuần (ngày thứ 42) uống sinh khối tảo. Theo dõi diễn biến thỏ thí nghiệm liên tục trong thời gian 42 ngày. 17 Kết quả: Nghiên cứu xác định LD50 Kết quả nghiên cứu xác định liều chết 50% (LD50) chuột nhắt trắng của bột tảo H. pluvialis HB được trình bày trên bảng 3.20. Bảng phụ 6. Số chuột nhắt trắng chết trong thời gian 72 giờ sau khi uống bột tảo H. pluvialis HB STT Lô nghiên cứu (n=10) mg/kg KLCT/24 h Số chuột chết Số chuột 1 1 400 0 10 2 2 600 0 10 3 3 800 0 10 4 4 1.000 0 10 5 5 1.200 0 10 6 6 1.400 0 10 7 7 1.600 0 10 8 8 1.800 0 10 9 9 2.000 0 10 Ghi chú: KLCT- Khối lượng cơ thể; n- số chuột trong một lô thí nghiệm Sau khi dùng bột tảo theo đường uống đến mức liều cao nhất có thể cho chuột uống là 2000 mg bột tảo/kg khối lượng cơ thể (KLCT)/24 h, tất cả chuột thí nghiệm ở các lô đều ăn uống bình thường; tình trạng phân, nước tiểu bình thường; quan sát hoạt động của chuột thấy bình thường. Theo dõi sau 6 ngày, không có chuột thí nghiệm bị chết, phẫu thuật chuột thấy các cơ quan bình thường. Như vậy, chưa tìm thấy LD50 của bột tảo H. pluvialis HB theo đường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong 24 h là 2000 mg bột tảo /10 g KLCT/24 h tức là 20 g/kg KLCT chuột nhắt trắng/24 h. Các kết quả nghiên cứu thu được nêu trên cho thấy bột tảo Haematococcus pluvialis HB là không độc. Xác định độc tính bán trường diễn Sự thay đổi khối lượng cơ thể và điện tim (đạo trình DII) Kết quả nghiên cứu sự thay đổi khối lượng cơ thể thỏ và điện tim của thỏ được trình bày ở bảng phụ 7 và 8. Bảng phụ 7. Sự thay đổi khối lượng cơ thể thỏ thí nghiệm (n = 10) Thời điểm xét nghiệm Khối lượng cơ thể thỏ (kg) Lô chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) T0 1,98 ± 0,11 1,96 ± 0,12 1,96 ± 0,10 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 2,20 ± 0,17 2,17 ± 0,14 2,16 ± 0,15 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 2,29 ± 0,19 2,31 ± 0,20 2,32 ± 0,17 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 18 P p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 p3-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 p6-3 < 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần ; KLCT: khối lượng cơ thể Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra ở Bảng phụ 7 đã cho thấy: - Khối lượng cơ thể thỏ ở các lô nghiên cứu trong cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. - Khối lượng cơ thể thỏ ở các thời điểm sau so với thời điểm trước trong cùng một lô nghiên cứu tăng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Như vậy, bột tảo H. pluvialis HB không làm ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của thỏ nghiên cứu. Bảng phụ 8. Sự thay đổi điện tim thỏ thí nghiệm (đạo trình DII) Chỉ tiêu điện tim Thời điểm xét nghiệm Điện tim của thỏ ở các nhóm (± SD), n = 10 p Đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT/24 h (liều 2) (c) Chu kỳ (lần /phút) T0 235,40 ± 33,56 251,00 ± 37,97 249,80 ± 32,72 > 0,05 T3 245,60 ± 33,74 239,80 ± 29,74 240,60 ± 33,05 T6 238,40 ± 32,71 244,20 ± 33,06 252,80± 32,73 P > 0,05 > 0,05 > 0,05 Biên độ sóng QRS (mV) T0 0,375± 0,052 0,38 ± 0,052 0,377± 0,066 > 0,05 T3 0,373± 0,049 0,380 ± 0,057 0,367 ± 0,065 T6 0,372 ± 0,050 0,383 ± 0,051 0,378 ± 0,065 P > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sóng bất thường Không Không Không - Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên Bảng phụ 8 đã cho thấy bột tảo H. pluvialis HB không ảnh hưởng lên điện tim thỏ thí nghiệm (đạo trình DII). Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB đến một số chỉ tiêu huyết học của thỏ Kết quả nghiên cứu sự thay đổi một số chỉ tiêu về huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu và bạch cầu) của thỏ được trình bày trên Bảng phụ 9, 10, 11 và 12. Bảng phụ 9. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB đến số lượng hồng cầu thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm Số lượng hồng cầu (T/l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24h (liều 2) (c) 19 T0 5,56 ± 0,82 5,69 ± 0,92 6,07 ± 0,89 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 5,81 ± 1,07 5,98 ± 1,12 6,10 ± 1,34 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 5,61 ± 0,43 5,43 ± 0,64 5,88 ± 0,97 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú : T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT : khối lượng cơ thể Từ kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên Bảng phụ 9 đã cho thấy: Khi so sánh ở cùng một thời điểm xét nghiệm thì số lượng hồng cầu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05); khi so sánh ở các thời điểm sau so với thời điểm trước ở cùng một lô nghiên cứu thì số lượng hồng cầu không thay đổi với p > 0,05. Bảng phụ 10. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên số lượng bạch cầu thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm Số lượng bạch cầu (G /l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) T0 5,18 ± 1,51 4,94 ± 1,43 5,10 ± 1,62 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 5,02 ± 1,55 5,21 ± 1,52 4,93 ± 1,31 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 4,89 ± 1,62 4,95 ± 1,87 5,12 ± 1,67 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú : T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT : khối lượng cơ thể Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên Bảng phụ 10 đã cho thấy: Số lượng bạch cầu của thỏ ở các lô nghiên cứu trong cùng một thời điểm xét nghiệm không thay đổi với p > 0,05. Số lượng bạch cầu của thỏ ở các thời điểm sau so với thời điểm trước trong cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Bảng phụ 11. Ảnh hưởng của bột H. pluvialis HB lên số lượng tiểu cầu thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm Số lượng tiểu cầu (G/l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24h (liều 2) (c) T0 258,40 ± 47,54 301,40 ± 68,09 281,50 ± 62,27 20 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 267,50 ± 32,25 275,00 ± 52,23 272,10 ± 40,83 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 277,50 ± 25,31 289,50 ± 48,90 290,70 ± 35,75 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú : T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT : khối lượng cơ thể Qua kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng phụ 11 cho thấy so với lô chứng, số lượng tiểu cầu của thỏ ở các lô uống bột tảo H. pluvialis HB ở cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Số lượng tiểu cầu trong cùng một lô thỏ nghiên cứu ở các thời điểm sau so với thời điểm trước thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Bảng phụ 12. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên lượng huyết sắc tố thỏ thí nghiệm Thời điểm xét nghiệm Hàm lượng huyết sắc tố (G/l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT/24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT/24 h (liều 2) (c) T0 116,90 ±13,40 130,90 ± 18,02 124,90 ± 16,43 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 115,70 ± 12,10 126,90 ± 20,91 121,70 ± 15,49 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 123,70 ± 10,78 135,70 ± 20,37 131,80 ± 16,52 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú : T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT: khối lượng cơ thể Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra trên bảng phụ 12 đã cho thấy: - Hàm lượng huyết sắc tố của thỏ ở các lô nghiên cứu ở cùng một thời điểm xét nghiệm là không thay đổi với p > 0,05. - Hàm lượng huyết sắc tố của thỏ ở các thời điểm sau so với thời điểm trước trong cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên một số chỉ tiêu hóa sinh của thỏ Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên một số chỉ tiêu về chức năng thận (urê, creatinin), chức năng gan (AST, ALT) được trình bày ở Bảng phụ 13, 14, 15 và 16 Bảng phụ 13. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên nồng độ ure máu thỏ 21 Thời điểm xét nghiệm Nồng độ urê máu thỏ (mmol/l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT/24 h (liều 2) (c) T0 3,80 ± 1,48 4,19 ± 1,42 3,74 ± 1,49 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 4,05 ± 1,68 3,86 ± 1,54 4,29 ± 1,48 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 4,11 ± 1,69 3,90 ± 1,47 4,00 ± 1,54 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú : T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT: khối lượng cơ thể Từ kết quả được chỉ ra ở Bảng phụ 13 cho thấy: Nồng độ urê máu của thỏ ở các lô nghiên cứu trong cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Nồng độ urê máu thỏ ở các thời điểm xét nghiệm sau so với thời điểm xét nghiệm trước trong cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Bảng phụ 14. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên nồng độ creatinin máu thỏ Thời điểm xét nghiệm Nồng độ creatinin máu thỏ (µ) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) T0 57,50 ± 8,26 54,50 ± 10,11 61,30 ± 12,17 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 56,00 ± 5,42 53,10 ± 9,72 54,60 ± 12,70 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 53,30 ± 10,49 56,50 ± 12,09 58,10 ± 11,25 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT: khối lượng cơ thể Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra trên Bảng phụ 14 cho thấy so sánh giá trị nồng độ creatinin máu thỏ của các lô thí nghiệm so với lô chứng sinh học ở cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Nồng độ creatinin máu của thỏ ở các thời điểm xét nghiệm sau so với thời điểm xét nghiệm trước của cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Bảng phụ 15. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên hoạt độ AST máu thỏ 22 Thời điểm xét nghiệm Hoạt độ AST máu thỏ (UI/l) Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) T0 60,15 ± 21,81 55,92 ± 18,04 59,38 ± 21,41 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 58,29 ± 16,87 62,88 ± 17,15 56,31 ± 16,93 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 58,32 ± 18,70 64,67 ± 18,52 61,48 ± 20,48 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT: khối lượng cơ thể; AST: Aspartate transaminase Từ kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng phụ 15 cho thấy: - Hoạt độ AST của thỏ ở các lô nghiên cứu trong cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. - Hoạt độ AST của thỏ ở các thời điểm sau so với thời điểm trước trong cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Như vậy, bột H. pluvialis HB không làm ảnh hưởng đến hoạt độ AST của thỏ nghiên cứu. Bảng phụ 16. Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên hoạt độ ALT máu thỏ Thời điểm xét nghiệm Hoạt độ ALT máu thỏ Lô đối chứng (a) Bột tảo 200 mg /kg KLCT /24 h (liều 1) (b) Bột tảo 400 mg /kg KLCT /24 h (liều 2) (c) T0 108,90 ± 17,32 110,90 ± 14,69 120,40 ± 24,96 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T3 119,50 ± 20,38 109,80 ± 14,85 115,80 ± 17,03 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 T6 114,30 ± 19,89 118,60 ± 25,41 110,20 ± 22,12 pb-a > 0,05; pc-a > 0,05; pc-b > 0,05 P p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 p3-0 > 0,05 p6-0 > 0,05 p6-3 > 0,05 Ghi chú: T0: xuất phát điểm, T3: sau 3 tuần, T6: sau 6 tuần; KLCT: khối lượng cơ thể; ALT: Alanine transaminase Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở Bảng phụ 16 cho thấy so với lô chứng sinh lý, hoạt độ ALT của thỏ ở các lô uống bột H. pluvialis HB ở cùng một thời điểm xét nghiệm thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Hoạt độ ALT của thỏ ở các thời điểm sau so với thời điểm trước trong cùng một lô nghiên cứu thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. 23 Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên một số chỉ tiêu mô bệnh học của thỏ Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên sự thay đổi mô bệnh học của gan ở 3 nhóm nghiên cứu Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy các tế bào gan xung quanh có bào tương dạng hạt mịn màu hồng nhạt. Các tế bào gần tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ sáng. Các mẫu gan có cấu trúc mô học bình thường. Các tiểu thuỳ rõ. Khoảng cửa có các động mạch và tĩnh mạch gan, các ống mật được lót biểu mô khối vuông, mô đệm là các sợi tạo keo mảnh. Các tế bào hình đa diện xếp thành các bè nằm cạnh các mao mạch nan hoa, hướng về tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy. Tế bào gan có nhân tròn, chất màu mịn, sáng nhạt, thường có một hạt nhân nhỏ. Bào tương tế bào gan dạng hạt mịn, bắt màu hồng nhạt. Rải rác ở thành các mao mạch có các tế bào Kuffer với nhân nhỏ hình thoi dài. Một số mao mạch chứa hồng cầu (Hình phụ 18). Như vậy, mô bệnh học các tạng gan của các lô thỏ nghiên cứu ở thời điểm 42 ngày sau khi uống bột vi tảo lục H. pluvialis HB không bị biến đổi. * Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên sự thay đổi mô bệnh học của lách ở 3 nhóm nghiên cứu Cấu trúc tuỷ trắng và tuỷ đỏ rõ. Tuỷ trắng tập trung nhiều tế bào lympho thành các ổ hay các nang lympho với động mạch trung tâm có thành dầy. Tủy đỏ với các xoang lách chứa nhiều hồng cầu, một số ít đại thực bào. Như vậy, mô bệnh học của thận ở các lô thỏ nghiên cứu ở thời điểm 42 ngày sau khi uống bột vi tảo lục H. pluvialis HB không bị biến đổi (Hình phụ 19). * Ảnh hưởng của bột tảo H. pluvialis HB lên sự thay đổi mô bệnh học của thận ở 3 nhóm nghiên cứu Thận có cấu trúc vùng vỏ và vùng tuỷ. Vùng vỏ có nhiều tiểu cầu thận với cuộn mạch nằm trong khoang Bowman. Vùng tuỷ với các ống thận được lót biểu mô khối vuông hay trụ, bờ tế bào rõ, bào tương mịn và bắt màu hồng nhạt. Như vậy, mô bệnh học các lách thận của các lô thỏ nghiên cứu ở thời điểm 42 ngày sau khi uống bột vi tảo lục H. pluvialis HB không bị biến đổi (Hình phụ 20). Kết luận: Từ những kết quả nghiên cứu nêu ở phần trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: - Không xác định được LD50 của bột vi tảo lục H. pluvialis HB theo đường uống trên chuột nhắt trắng, mặc dù đã cho chuột uống với mức liều cao nhất có thể đưa vào dạ dày chuột là: 20 g/kg KLCT. Đây là mức liều rất cao so với liều dùng thông thường trên người nên bột H. pluvialis HB có mức độ độc thấp. - Bột vi tảo lục H. pluvialis HB có độ an toàn cao khi cho động vật nghiên cứu uống liên tục trong thời gian 42 ngày với mức liều 200 và 400 mg/kg KLCT và không làm ảnh hưởng đến sự phát triển trọng lượng cơ thể và điện tim của thỏ; không làm 24 thay đổi các chỉ số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu và bạch cầu). Các chỉ số nồng độ urê và creatinin máu ở mức bình thường. Mô bệnh học các tạng gan lách và thận của các lô thỏ nghiên cứu ở thời điểm 42 ngày sau khi uống bột vi tảo lục H. pluvialis HB không bị biến đổi. 1                                                                                    2                                                                        3   1   2   3   Hình P18. Hình ảnh mô bệnh học gan thỏ của các nhóm nghiên cứu (1: Lô đối chứng; 2: Uống bột H. pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột H. pluvialis HB liều 2) Hình P19. Hình ảnh mô bệnh học lách thỏ của các nhóm nghiên cứu (1: Lô đối chứng; 2: Uống bột H. pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột H. pluvialis HB liều 2) 1   2   3   Hình P20. Hình ảnh mô bệnh học thận thỏ của các nhóm nghiên cứu (1: Lô đối chứng; 2: Uống bột tảo H. pluvialis HB liều 1; 3: Uống bột tảo H. pluvialis HB liều 2) 25 24/ Phụ lục 24 Phổ sắc ký đồ thành phần axit béo của thịt cá hồi Vân ở các lô thí nghiệm khác nhau sau 55 ngày nuôi A B C Hình P21. Sắc ký đồ axit béo của thịt cá hồi Vân ở các lô thí nghiệm khác nhau (A: Cá ăn cám Pháp; B: Cá ăn cám Việt Nam; C: Cá ăn cám Việt Nam có bổ sung sinh khối vi tảo lục H. pluvialis HB (61 mg astaxanthin/ kg thức ăn))