Luận án Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây amorphophallus konjac k. koch ở lâm đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết

Temperature X2 = D: E/S Actual Factors B: Time = 6 C: pH = 7 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 30 35 40 45 50 50 100 150 200 250 Y ( m p a. s) A: Temperature (oC)D: E/S b) Tỷ lệ E/S và nhiệt độDesign-Expert® SoftwareFactor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 250.15 X1 = A: Temperature X2 = B: Time Actual Factors C: pH = 7 D: E/S = 0.4 4 5 6 7 8 30 35 40 45 50 50 100 150 200 250 300 Y (m p a. s) A: Temperature (oC)B: Time (h) c) Thời gian phản ứng và nhiệt độ Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 250.15 X1 = B: Time X2 = C: pH Actual Factors A: Temperature = 40 D: E/S = 0.4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 50 100 150 200 250 300 Y (m pa .s ) B: Time (h)C: pH d) Thời gian phản ứng và độ pH Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 248 X1 = B: Time X2 = C: pH Actual Factors A: Temperature = 40 D: E/S = 0.4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 50 100 150 200 250 Y (m p a. s) B: Time (h)C: pH e) pH và thời gian Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 248 X1 = C: pH X2 = D: E/S Actual Factors A: Temperature = 40 B: Time = 6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 5 6 7 8 9 50 100 150 200 250 Y (m p a. s) C: pHD: E/S f) E/S và pH Hình 3.21. Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng 96 3.3.2.3. Tìm chế độ thủy phân tối ưu Sử dụng kế hoạch bậc 2 Box – Behnken ta đã nhận được phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố là nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ E/S đến thông số tối ưu hóa là độ nhớt của sản phẩm cho quá trình thủy phân glucomannan. Độ nhớt càng nhỏ thì sự cắt mạch càng tốt nghĩa là nhận được oligoglucomannan có khối lượng nhỏ hơn. Bài toán tối ưu hóa ở đây được đặt ra là tìm các điều kiện của các biến nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ E/S sao cho hàm độ nhớt đạt giá trị cực tiểu. Bài toán tối ưu hóa được thể hiện như sau: Min (Y = 62,21 – 12,63X1 – 6,85X2 – 24,85X3–14.95 X4 + 20.02 X1X2 + 7,47X1X3 – 10.02 X1X4 + 3,78 X2X3 + 3,72 X2X4 – 17,32 X3X4 + 46,76 X12 + 27,29 X22 + 94,12 X32+ 38,54 X42) với các điều kiện ràng buộc: -1 ≤ x1 ≤ +1 -1 ≤ x3 ≤ +1 -1 ≤ x2 ≤ +1 -1 ≤ x4 ≤ +1 Phần mềm Design Expert cũng cho phép tìm điều kiện tối ưu và nhận được kết quả được trình bày ởquả bảng 3.22. Bảng 3.22. Kết tính tìm điều kiện tối ưu Giá trị ban đầu Số thí nghiệm theo mô hình Điều kiện tối ưu ŷ1(min) 30 ≤ T ≤ 50 4≤ t ≤ 8 5 ≤ pH ≤ 9 0,1 ≤ E/S ≤ 0,7 100 T(opt) = 42,376; t(opt)=5,681 pH(opt) = 7,241 E/S(opt) = 0,536 57,51 Giá trị Ymin = 57,51 Ở điều kiện: X1(opt) = 0,14; X2(opt) = 0,05; X3(opt) = 0,15; X4(opt) = 0,24 97 Với hệ số mong muốn rất cao bằng 0,987 gần xấp xỉ bằng 1. Để kiểm tra điều kiện tối ưu của phản ứng, chúng tôi đã sử dụng chương trình tính FLEXI viết bằng ngôn ngữ thuật toán FORTRAN. Đây là chương trình tối ưu hóa rất hiệu quả của quy hoạch phi tuyến tính thích hợp cho nhiều lớp bài toán thông dụng. Kết quả nhận được giá trị Ymin = 57,514 ở điều kiện tối ưu: X1opt = 0,139; X2opt = 0,048; X3opt = 0,148; X4opt = 0,243. Như vậy hai kết quả khá trùng hợp Điều kiện tối ưu của phản ứng với các biến thực là:ŷ(opt) = 57,51 cP, ở nhiệt độ: T= 42,376oC; thời gian t = 5,681 giờ; pH = 7,241; tỉ lệ E/S = 0,536% Kết quả thu được cũng phù hợp với tác giả Junfan Chen và cộng sự [20] khi dùng enzym thương mại để thuỷ phân glucomannan ở nhiệt độ 41oC; độ pH = 7,1; tỷ lệ E/S = 0,49 và thời gian phản ứng là 3,4 giờ. Kiểm tra lại bằng thực nghiệm ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian, pH và tỉ lệ E/S tối ưu trên cho kết quả Y = 60,5 cPs. Hiệu suất thu hồi sản phẩm %100 bđ sp m m H = 75,8% Với msp là khối lượng sản phẩm sau thủy phân thu được mbđ là khối lượng chất gốc glucomannan ban đầu. 3.3.3. Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E 3.3.3.1. Phổ IR của LKGM-E. Sản phẩm LKGM-E sau được tiến hành ghi phổ hồng ngoại trên thiết bị FTIR IMPAC-410 trong vùng bước sóng từ 4000-400cm-1. Kết quả phân tích được trình bày ở hình 3.22. 98 Hình 3.22. Phổ IR của LKGM-E. Từ hình 3.22, các pic phổ đặc trưng có thể quy kết như sau: vùng 3000- 3500cm-1pic có cường độ mạnh, chân rộng đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm hydroxyl (-OH); liên kết cộng hóa trị (C-H) có dao động hóa trị tại pic 2932cm-1và dao động biến dạng tại pic 1413 cm-1 và 1316 cm-1. Đặc biệt, tại phổ IR của LKGM-E vẫn xuất hiện pic tại 1720 với cường độ khá mạnh đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (-C=O); 1650cm-1 đặc trưng cho sự có mặt của phân tử nước hấp thụ; 1150 cm-1đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết ete C- O-C của liên kết glycosid giữa các mắt xích trong phân tử polysaccarit; 1071cm-1 và 1029cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-O trong nhóm C-OH. Các pic trong vùng 884÷818 cm-1 đặc trưng cho vòng pyranose của glucose và mannose. Thông qua phổ FTIR, sản phẩm thủy phân có các đặc điểm cấu trúc tương tự với glucomannan gốc của nó. Pic ở 1720 cm-1 (nhóm acetyl) không biến mất trong quang phổ của LKGM-E. Điều này có thể là do β-1,4-mannanase đã cắt chọn lọc các liên kết glycosid bên trong chuỗi polyme của glucomannan, do đó sản phẩm thủy phân giữ lại các đặc điểm cấu trúc của các nhóm chức glucomannan ban đầu. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của Xuegang Luo và cộng sự [18]. 99 3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E Kết quả ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; 13C-NMR và 1H-13C- NMR-HSQC của mẫu LKGM-E thủy phân trong D2O ở 80oC được thể hiện lần lượt trên các hình 3.23; 3.24 và 3.25 tương ứng dưới đây: Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong phân tử glucomannan thủy phân bằng enzym (LKGM-E) được quy kết như ở bảng 3.23 Bảng 3.23. 1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E Proton Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) H1 5,26 5,03;5,02 H2 4,41 3,87 H3 4,30 4,22 H4 4,32 4,16 H5 4,01 4,08 H6 4,28; 4,20 4,49 H của CH3CO- 2,70 100 Tỷ lệ mannose/glucose của LKGM-E có thể được tính bằng cách sử dụng các tích phân của H1 trong phổ 1H NMR. Theo phương pháp này, tỷ lệ mol mannose/glucose là: = 1−ܯ 1−ܩ = 6⺁ 1 = 12 Như thể hiện trong hình 3.27, tín hiệu proton của nhóm acetyl được phân tách tốt, do đó giá trị của hàm lượng axetyl thu được có thể khá chính xác, sử dụng phổ dữ liệu 1HNMR, mức độ axetyl hóa LKGM-E được ước tính từ công thức: DA = (ICH3 × 100%) / 3IΣH1 = (2,70 × 100%) / 3] / (6,48 + 5,41)= 7,56%, Kết quả một lần nữa khẳng định rằng β-mannanase chỉ có thể tấn công các liên kết glycosid bên trong của mạch đại phân tử glucomannan, giải phóng-1,4- glucomanno-oligosacarit và một lượng nhỏ đơn vị manose, do đó tỷ lệ RM/G của LKGM-E thấp hơn một chút so với glucomannan ban đầu. Giá trị của DA là 7,56 chứng tỏ rằng endo-1,4-mannanase không thủy phân các nhóm axetyl trong mạch glucomannan. Điều này cho thấy phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác enzym có độ chọn lọc rất cao. Phản ứng chỉ cắt liên kết β-glycosid mà không cắt liên kết nhóm axetyl. Hình 3.24: Phổ 13C-NMR của LKGM-E ở 80 oC trong D2O 101 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) trên phổ 13C NMR trong phân tử LKGM-E được quy kết như ở bảng 3.24 Bảng 3.24. Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) C1 102,15;101,99 104,45 C2 72,52;72,18 75,35;75,11 C3 73,63; 73,15 76,19 C4 77,79÷78,90 80,86 C5 77,26 76,97;76,83 C6 62,92;62,78 62,57;62,45 C của CH3CO- 22,17; 176,80 β-Man(14)-β-Glc 71,77 β-Man(14)-β-Man 71,56 Hình 3.25. Phổ 1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80 oC trong D2O Trên phổ 1H-13C-HSQC-NMR, mỗi tương tác C/H được đặc trưng bằng một tín hiệu: tín hiệu đặc trưng cho tương tác C/H của nhóm axetyl (CH3CO-) xuất hiện tại 22,38/2,69 ppm; các tương tác đặc trưng cho vòng pyranose các tín hiệu được quy cho các nguyên tử hydro liên kết với C2 đến C6 của cả hai đơn vị glucose và 102 mannose không được phân tách tốt. Trong khi đó, các tín hiệu được quy cho hydro- H1 liên kết với carbon-C1 của cả đơn vị glucose (5,03; 5,02 ppm) và đơn vị mannose (5,30; 5,60 ppm) được phân tách tốt. Đây là đặc trưng chung cho các phổ polysacarit. Từ phổ hai chiều HSQC các tương tác đặc trưng cho vòng pyranose được quy kết chính xác như sau: Mannose: C1/H1 (102,15; 101,99/5,26), C2/H2 (72,52; 72,18/4,41), C3/H3 (73,63; 73,15/4,30), C4/H4 (77,79;78,90/4,32), C5/H5 (77,26/4,01), C6/H6 (62,92; 62,78/4,28; 4,20). Glucose: C1/H1 (104,45/5,03; 5,02), C2/H2 (75,35; 75,11/3,87), C3/H3 (76,19/4,22), C4/H4 (80,86/4,16), C5/H5 (76,97; 76,83/4,08), C6/H6 (62,57; 62,45/4,49). Qua các phương pháp phổ cho thấy KGM-E có cấu trúc không thay đổi nhiều so với glucomannan ban đầu. Phản ứng xảy ra chọn lọc ở liên kết β-glycosid. 3.3.3.3. Tính chất nhiệt của LKGM-E Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E được trình bày trên hình 3.26 Hình 3.26. Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E. Độ bền nhiệt độ của sản phẩm thủy phân glucomannan LKGM-E được thể hiện trên Bảng 3.25. 103 Bảng 3.25. Kết quả phân tích TGA của LKGM-E Mẫu vật liệu Nhiệt độ bắt đầu phân hủy (oC) Nhiệt độ phân hủy mạnh thứ nhất (oC) Tổn hao khối lượng đến 800oC (%) LKGM-E 150,01 282,70 93,85 Từ hình 3.26 cho thấy, quá trình phân hủy nhiệt của glucomannan thủy phân bằng enzym xảy ra ở 3 vùng nhiệt độ rõ rệt: vùng 33÷150oC ứng với mất nước nội và ngoại phân tử, khối lượng mẫu mất 7,527% tương ứng với độ ẩm của mẫu là 7,53%. Nhiệt độ phân hủy mạnh nhất ở 282,7oC, thấp hơn nhiệt độ phân hủy mạnh nhất của glucomanan 35,3oC (nhiệt độ phân hủy mạnh nhất của glucomannan là 318oC). Điều này chứng tỏ sản phẩm thủy phân có độ bền nhiệt kém hơn so với glucomannan ban đầu. Sự giảm khối lượng mẫu ở vùng từ 150÷ 400 oC là 62,22%, trong khoảng nhiệt độ này xảy ra sự phân hủy các liên kết glycosid trong mạch đại phân tử hình thành các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn. Đến 800oC mẫu phân hủy hoàn toàn. 3.3.3.4. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân Xác định khối lượng phân tử trung bình của hỗn hợp sản phẩm sau thủy phân bằng phương pháp áp suất thẩm thấu. Giá trị CC  lim 0 được ngoại suy từ phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa C và π/C (hình 3.29). Kết quả đo áp suất thẩm thấu của LKGM-E được thể hiện ở bảng 3.26 Bảng 3.26. Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym C(g/100ml) Π Π/C 0,025 2,82 112,8 0,05 9,02 180,4 0,1 32,6 326 0,2 103,2 516 0,3 210,5 701,6 0,4 341,2 853 0,5 452,5 905 104 Hình 3.27. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E Khối lượng phân tử trung bình của LKGM-E được tính theo công thức 2.7. Da d C KT M C n 28,2051 )(848 lim 0     c Kết quả thực nghiệm cho thấy, sản phẩm thủy phân LKGM-E có khối lượng phân tử thấp hơn nhiều so với glucomannan ban đầu. Khối lượng phân tử của KGM giảm từ 1.598 kDa xuống còn 2.051,28 Da. Điều kiện tối ưu cho phản ứng thuỷ phân tương tự như kết quả của Cheng- YU Chen và cộng sự [23], tuy nhiên hiệu quả của quá trình thuỷ phân theo mô hình thực nghiệm của chúng tôi thu được sản phẩm oligo-glucomannan có khối lượng nhỏ hơn. 3.3.3.5. Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E Konjac glucomannan có khả năng hòa tan trong nước (độ tan đạt 30%). Tuy nhiên khi tan trong nước Konjac glucomannan có độ trương nở lớn tạo hỗn dịch có độ nhớt cao vì vậy hạn chế nhiều ứng dụng của glucomannan. Độ tan theo quy trình trong phần thực nghiệm là 92,5%, hiệu suất thu hồi 75,6%. Độ tan và các tính chất của konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân được thể hiện ở bảng 3.27 . 105 Bảng 3.27. Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân Loại mẫu (kDa) Độ tan (%) RM / G DA Konjac glucomannan (KGM) 1.598 32 1,6 8 Konjac glucomannan thủy phân bằng axit kết hợp siêu âm (LKGM-1) 88,561 82,6 1,51 7,03 Konjac glucomannan thủy phân bằng enzym (LKGM-E) 2,051 92,5 1,2 7,56 Như vậy, với điều kiện phản ứng tối ưu trên, phản ứng thủy phân glucomannan với xúc tác enzym đã xảy ra, cắt đứt chọn lọc các liên kết glycosid thu được sản phẩm oligo glucomannan có khối lượng không quá nhỏ (thu hồi được 75,6%). Kết quả thực nghiệm cho thấy sản phẩm thủy phân konjac glucomannan có độ tan lớn hơn nhiều so với chất gốc ban đầu. Điều này có ý nghĩa trong việc ứng dụng glucomannan trong các lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm. Giả thiết cơ chế thủy phân glucomanann được đề xuất như sau: Sơ đồ: 3.2. Giả thiết cơ chế thủy phân glucomannan bằng endo-1,4-mannanase 106 Kết luận 3: Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm loại kế hoạch bậc hai Box-Behnken đã tìm được chế độ thủy phân tối ưu ở: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681 giờ, pH = 7,241, tỉ lệ E/S = 0,536 LKGM-E được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, có khối lượng phân tử trung bình 2051,28 Da với hiệu suất thu hồi 75,6%. Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ tan 92,5%. 3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E 3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro Để tìm hiểu về cơ chế làm hạ đường huyết của glucomannan thủy phân chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng hoạt hóa của glucomannan và glucomannan thủy phân đối với enzym AMPK. AMPK là một enzym quan trọng điều hòa năng lượng của tế bào và được coi như một yếu tố chính tham gia điều hòa chuyển hóa glucose và lipit ở nhiều cơ quan đặc biệt là cơ vân và gan [6]. Cơ vân là nơi tiêu thụ glucose chủ yếu trong cơ thể. Trên chuyển hóa glucose, AMPK tác dụng lên sự dung nạp glucose của cơ vân thông qua cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc insulin (làm tăng biểu hiện của gen mã hóa chất vận chuyển glucose vào tế bào cơ (GLUT-4) và hexokinase II, kích thích tổng hợp glycogen trong cơ bằng cách hoạt hóa dị lập thể glucose–6– phosphatase, hoạt hóa 2 enzym chính của chu trình axit citric là citrat synthase và succinat dehydrogenase ) AMPK có liên quan đến rất nhiều yếu tố khác tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrat và lipit trong cơ thể. Nhờ vậy, hoạt hóa AMPK làm giảm tổng hợp axit béo tự do và làm tăng quá trình oxy hóa trong ty thể do đó làm giảm nồng độ axit béo tự do và cải thiện sự kháng insulin. Để đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của mẫu thử, các thí nghiệm thường được thực hiện trên nguyên tắc đánh giá mức độ biểu hiện của pAMPK (AMPK đã được phosphoryl hóa ở vị trí threonin 172) trên lô tế bào ủ với mẫu thử và so sánh với lô chứng (không ủ với mẫu thử). Đây là một trong những phương pháp có độ 107 nhạy cao để đánh giá biểu hiện của một protein cụ thể trong tế bào được áp dụng khá rộng rãi trong các nghiên cứu được công bố. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tác dụng hoạt hóa AMPK của glucomannan thủy phân được tiến hành đánh giá trên tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát (C2C12) sau khi đã được biệt hóa thành tế bào trưởng thành bằng phương pháp Western blot. Phương pháp Western blot (còn gọi l phương pháp thẩm tách miễn dịch – immunobloting) là phương pháp định tính, định lượng protein dựa trên nguyên tắc miễn dịch. Để xác định sự có mặt cũng như định lượng protein cụ thể trong mẫu trước hết cần tiến hành điện di nhằm phân tách các protein thành các băng protein trên bản gel. Các băng protein này được chuyển sang màng lai sau đó xác định các protein dựa trên nguyên tắc miễn dịch. Đây là phương pháp hiện đại có độ nhạy cao, phát hiện protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể tương ứng nên cho kết quả có độ tin cậy cao. Tỷ lệ tăng biểu hiện p-AMPK so với beta-actin của lô tế bào ủ glucomannan so với lô chứng được thể hiện ở bảng 3.28. Bảng 3.28: Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin Lô Mẫu Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ mẫu thử so với lô chứng Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB SD P Chứng 1 1 1 1 1 AICAR AICAR 1,28 1,38 1,33 1,33 0,020 <0,01 m100 LKGM 100μg/ml 1,57 1,37 1,47 1,70 0,043 <0,05 m50 LKGM 50μg/ml 1,64 1,99 1,81 1,81 0,043 <0,05 m25 LKGM 25μg/ml 1,18 2,38 1,78 1,78 0,326 >0,05 m12,5 LKGM 12,5μg/ml 1,02 2,16 1,59 1,59 0,471 >0,05 p: so sánh với lô chứng tại cùng thời điểm 108 Hình 3.28: Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng (Phần đánh dấu * là mẫu có khác biệt thống kê so với lô chứng) So sánh tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô tế bào có ủ mẫu thử với lô chứng (tế bào ủ với dung môi đã dùng để pha các mẫu thử: DMSO) để đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của mẫu thử. Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ mẫu thử so với lô chứng được tính bằng tỷ số giữa tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô tế bào có ủ mẫu thử và tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô chứng. Chất đối chiếu được sử dụng là Aicar.Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Hình ảnh mức độ biểu hiện p- AMPK và actin thu được bằng kỹ thuật Western blot. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin thu được bằng kỹ thuật Western blot được thể hiện trên hình 3.29. chứng Aicar m100 m50 m25 m12,5 m6,25 actin p-AMPK Hình 3.29. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin 109 Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở cùng nồng độ mẫu thử 100 g/ml: tỷ lệ mức độ biểu hiện của p-AMPK so với β-actin của mẫu thử LKGM-E và chất đối chiếu là AICAR đều tăng cao hơn rõ rệt so với lô chứng (tế bào ủ với dung môi đã dùng để pha mẫu thử là DMSO). Ở mẫu ủ với LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P<0,05). Ở các nồng độ thấp hơn 25μg/ml và nồng độ 12,5μg/ml không có sự khác biệt thống kê so với lô chứng (P>0,05). Điều đó chứng tỏ LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng hoạt hóa enzym AMPK. Ở các nồng độ thấp hơn sự hoạt hóa enzym AMPK là không rõ ràng. Kết luận 4: LKGM-E ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50 μg/ml làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện của p-AMPK (lần lượt là 1,47 lần và 1,81 lần so với lô chứng, p<0,05). LKGM-E ở nồng độ thấp hơn 25 g/ml, 12,5 g/ml và 6,25 g/ml không làm tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK so với lô chứng. Điều đó chứng tỏ LKGM-E nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng hoạt hóa enzym AMPK. 3.4.2. Tác dụng ức chế dung nạp glucose của LKGM-E trên mô hình in vivo Từ kết quả in vitro cho thấy LKGM-E có khả năng hoạt hóa enzym AMPK. Để đánh giá khả năng kích thích sự dung nạp và hấp thu glucose ở chuột nhắt trắng của glucomannan thủy phân, chúng tôi đánh giá quá trình hấp thu và dung nạp glucose của chuột nhắt trắng bằng nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống. Thử khả năng dung nạp glucose là một nghiệm pháp thường được dùng trong các nghiên cứu gần đây ở Việt Nam và trên thế giới. Trong nghiên cứu này tập trung vào khả năng dung nạp glucose của chuột nhắt trắng, một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tác dụng của thuốc điều trị tiểu đường. Tác dụng giảm dung nạp glucose của LKGM-E Ảnh hưởng của sản phẩm LKGM-E đến khả năng dung nạp glucose được thể hiện thông qua sự biến đổi nồng độ glucose huyết của chuột ở thời điểm 30 phút, 60 phút, 90 phút sau khi uống glucose liều 2g/kg thể trọng. Glucose huyết trung bình ở các thời điểm trước và sau cho uống glucose được trình bày trong bảng 3.29. 110 Bảng 3.29. Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose Tên lô Ban đầu Thời điểm sau uống glucose t = 0 t = 30 phút t = 60 phút t = 120 phút Lô 1 (ĐC) 4,51 ± 0,51 3,98 ± 0,44 5,32 ± 0,14 5,02 ±0.25 4,12 ± 0,25 Lô2 LKGM-E (3g/kg) 4,42 ± 0,51 3,53 ± 0,34 P>0,05 5,58 ± 0,24 P>0,05 5,17 ± 0,31 p>0,05 4,04 ± 0,41 p>0,05 Lô3 LKGM-E (6g/kg) 4,28 ± 0,59 3,22 ± 0,43 P>0,05 5,35 ± 0,55 P<0,05 5,05 ± 0,43 P<0,05 4,18 ± 0,55 P>0,05 Lô 4 Glucomannan (6g/kg) 4,38 ± 0,28 3,58 ± 1,14 P>0,05 5,55 ± 0,32 P>0,05 5,12 ± 0,23 P<0,05 4,10 ± 0,23 p>0,05 Lô 5 Glyclazid (10 mg/kg) 4,4 ± 0,62 3,17 ± 0,51 P<0,01 4,06 ± 0,11 P<0,01 3,74 ± 0,29 P<0,01 3,17 ± 0,66 P<0,01 p: so sánh với lô chứng tại cùng thời điểm Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết tại thời điểm uống glucose và sau khi uống glucose 30 phút so với thời điểm ban đầu được trình bày trong hình 3.30 Hình 3.30. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau 30 phút cho uống glucose so với thời điểm ban đầu (Phần đánh dấu * là mẫu có khác biệt thống kê so với lô chứng) 111 Từ kết quả bảng 3.29 và đồ thị hình 3.30 cho thấy, tại thời điểm mới cho uống glucose, do đã được uống chế phẩm trước 2 giờ và để nhịn đói nên tất cả các lô đều có hàm lượng glucose giảm. Lô uống gliclazide có độ hạ glucose huyết mạnh hơn rõ rệt so với lô chứng (P<0,01) vì đây là thuốc hạ glucose huyết theo cơ chế: kích thích tế bào beta đảo tụy tăng tiết insulin thông qua việc làm tăng độ nhạy cảm của các tế bào này với glucose. Tác dụng hạ glucose của các lô cho uống chế phẩm glucomannan và glucomannan thủy phân không khác biệt so với lô chứng. Thời điểm 30 phút sau khi cho uống glucose, vì đã uống glucose được 30 phút (2g/kg thể trọng) nên tỷ lệ ％ glucose huyết tăng ở tất cả các lô. Điều này là phù hợp với sự hấp thu glucose của cơ thể. Sau khi uống glucose được hấp thụ qua thành ruột vào máu rất nhanh nên hàm lượng glucose trong máu tăng dần và đạt nồng độ cao nhất trong máu sau khi uống 30 phút ở tất cả các mẫu thử nghiệm. Ở thời điểm này các lô thứ 3 thứ 4 và thứ 5 có tỷ lệ ％ tăng glucose huyết thấp hơn so với lô 1 (lô đối chứng), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤ 0,05). Điều này có thể thấy các chế phẩm glucomannan thủy phân với liều 6g/kg cân nặng có khả năng giảm dung nạp glucose ở ruột. Điều này được giải thích do glucomannan là chất xơ hòa tan có độ nhớt cao, khả năng trương nở lớn làm tăng cảm giác no và làm giảm hấp thu đường huyết giúp ổn định đường huyết. Kết quả nghiên cứu cho phép giải thích ứng dụng chủ yếu của glucomannan tại các nước phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ và các nước Châu Âu đã sử dụng glucomannan như một loại thực phẩm ăn kiêng cho những người mắc bệnh về chuyển hóa như tiểu đường, mỡ máu và béo phì. Ảnh hưởng của LKGM-E trên khả năng dung nạp glucose Sau khi uống glucose được hấp thụ trực tiếp vào máu qua thành ruột. Hàm lượng glucose huyết tăng dần sau khi uống. Sau đó glucose được chuyển hóa một phần dự trữ trong gan dưới dạng glycogen, một phần vận chuyển vào các tế bào để chuyển hóa glucose tạo năng lượng cho hoạt động của tế bào theo ba con đường: con đường đường phân biến glucose thành pyruvat, con đường hexose monophotphat và con đường tạo axit glucuronic và axit ascorbic. Hàm lượng glucose huyết giảm dần, tốc độ giảm phụ thuộc vào quá trình thoái hóa glucose. Để 112 hạ glucose huyết ngoài việc giảm hấp thu còn một biện pháp khác là tăng khả năng dung nạp glucose ở tế bào. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của KGM và LKGM-E đến khả năng dung nạp glucose được trình bày ở và hình 3.31. Hình 3.31. Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM Thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, ở tất cả các lô hàm lượng glucose máu đều giảm so với ban đầu. Điều này là phù hợp với quá trình chuyển hoá glucose, sau khi đi vào máu glucose được chuyển hóa một phần thành glycogen dự trữ ở gan, một phần chuyển đến các tế bào để chuyển hóa thành năng lượng vì vậy hàm lượng glucose máu đều giảm. Ở lô thứ 5, chuột được cho uống thuốc glyclazide là thuốc hạ đường huyết nên tỷ lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất. Các lô thứ 3,4, được cho uống chế phẩm glucomannan và glucomannan thủy phân hàm lượng 6g/kg có tỷ lệ % hạ glucose huyết lớn hơn so với lô 1, khác biệt có ý nghĩa P<0,05. Điều này chứng tỏ các chế phẩm từ glucomannan với liều 6g/kg ngoài việc có tác dụng làm giảm sự dung nạp glucose ở ruột còn có khả năng kích thích sự chuyển hóa tiêu thụ glucose. Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose tỷ lệ % hạ glucose huyết ở lô uống glucomannan thủy phân với liều 3g/kg thể trọng không khác biệt so với lô chứng (P>0,05%), điều đó chứng tỏ khả năng kích thích sự dung nạp glucose ở liều 3g/kg thể trọng của glucomannan thủy phân không hiệu quả. 113 Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, tỷ lệ hạ glucose huyết ở lô uống glucomannan thủy phân cao hơn so với lô uống glucomannan cùng liều lượng 6g/kg cân nặng. Khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Điều này chứng tỏ sản phẩm thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với glucomannan ban đầu. Kết quả này phù hợp với kết quả thực nghiệm trên in vivo. Vì LKGM-E có khả năng hoạt hóa enzym AMPK là enzym hoạt hóa kích thích các quá trình sinh ra năng lượng như: tăng quá trình photphoryl hóa [84]–[88. Chính vì vậy lượng glucose khi hấp thu vào máu được vận chuyển nhiều vào tế bào và chuyển hóa thành Glucose-6-phosphat được đốt cháy tạo năng lượng cung cấp cho các hoạt động của tế bào. Bên cạnh đó, các nghiên cứu còn chỉ ra rằng, việc hoạt hóa enzym AMPK có khả năng thúc đẩy quá trình tạo glycogen ở gan. Vì vậy, glucomannan thủy phân có khả năng hoạt hóa enzym AMPK nên khi glucose được hấp thu vào máu, hàm lượng glucose tham gia vào quá trình tạo glycogen dự trữ ở gan tăng lên làm lượng glucose đi vào máu giảm làm giảm glucose huyết. Ngoài ra glucomannan còn có tiềm năng trong việc hạ cholesterol máu. Điều này có ý nghĩa trong việc tạo ra các chế phẩm cho người mắc các bệnh về chuyển hóa. Kết luận 5: Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của glucomannan và glucomannan thủy phân đến khả năng hấp thụ và dung nạp glucose trên chuột nhắt trắng. Glucomannan và glucomannan thủy phân được sử dụng với liều 3g/kg cân nặng và 6g/kg cân nặng. Kết quả cho thấy ở lô chuột uống glucomannan và glucomannan thủy phân với liều 3g/kg cân nặng khả năng hấp thụ và dung nạp glucose đều không có khác biệt so với lô chứng. Nồng độ glucose ở lô uống Glucomannan thủy phân với liều 6g/kg cân nặng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Điều đó cho thấy glucomannan thủy phân có khả năng làm giảm sự hấp thu glucose ở ruột. Trong đó glucomannan thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với glucomannan, khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P<0,05). 114 KẾT LUẬN CHUNG Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra các kết luận chung sau: 1. Đã tách, tinh chế và xác định được cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ nưa A.konjac ( Amorphophallus Konjac K.Koch): - Hàm lượng glucomannan trong củ A.konjac K.Koch tại Lâm Đồng, Việt Nam là 12,26% trong củ tươi. Bột KGM đạt độ sạch 92%, hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%, hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm. - Glucomannan tách từ cây A.konjac có cấu trúc vô định hình, được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, phân nhánh tại vị trí C6, tỷ lệ manose/glucose là 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%, độ tan 32%, khối lượng phân tử 1.598 kDa. 2. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác axit và xác định được cấu trúc tính chất của sản phẩm LKGM-1: - Phản ứng thủy phân glucomannan bằng hỗn hợp axit thực hiện ở điều kiện: tỷ lệ KGM/dd axit: 1/10 (g/ml); [HCl] 0,15M; CH3COOH 10%; nhiệt độ phản ứng 50oC; thời gian phản ứng 6 giờ khi không kết hợp sóng siêu âm và trong 4 giờ khi có kết hợp sóng siêu âm. - LKGM-1 có khối lượng phân trung bình 88,561 kDa, độ tan trong nước 82,6%. LKGM-1 cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid , tỷ lệ M/G là 1,51, DA của LKGM-1 là 7,03%. 3. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác enzym β-mannanase và xác định được cấu trúc tính chất của sản phẩm LKGM-E. - Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm loại kế hoạch bậc hai Box- Behnken đã tìm được chế độ thủy phân tối ưu ở: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681 giờ, pH = 7,241, tỉ lệ E/S = 0,536. 115 - LKGM-E được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, có khối lượng phân tử trung bình 2051,28 Da với hiệu suất thu hồi 75,6%. Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ tan 92,5%. 4. Đã nghiên cứu được khả năng hoạt hóa enzym AMPK của LKGM-E: LKGM-E ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng hoạt hóa enzym AMPK. Mức độ biểu hiện của p-AMPK ở nồng độ 100μg/ml là 1,47 lần và ở nồng độ 50μg/ml là 1,81 lần so với lô chứng (p<0,05) 5. Đã đánh giá được ảnh hưởng của KGM và LKGM-E đến khả năng dung nạp glucose của chuột nhắt trắng. LKGM-E với liều 6g/kg cân nặng có khả năng làm giảm sự hấp thu glucose ở ruột (p<0,05). Glucomannan thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với glucomannan (p<0,05). Với các kết quả nhận được của nghiên cứu cho thấy glucomannan từ cây Amorphophallus konjac K.Koch và sản phẩm thủy phân của nó có nhiều tiềm năng ứng dụng, đặc biệt là trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 1. Do Truong Thien, Tran Thi Nu, Nguyen Hong Vinh, “Preparation of Low Molecular Weight Glucomannan from A. Konjac K. Koch in Vietnam by Enzyme Catalyzed Hydrolysis Reaction and its Prospective use to Lower Blood Sugar Levels”, Academic journal of polymer science, Volume 2 - issue 2- January 2019. 2. Tran Thi Nu, Tran Thi Y Nhi, Do Truong Thien, “Chemical structure of Konjac glucomannano oligosaccharides prepared by endo-1-4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.291-295, 2019. 3. Tran Thi Y Nhi, Tran Thi Nu, Do Truong Thien, Lai Thi Thuy, Le Thi Thanh Ha, Pham Thi Bich Hanh, Le Quang Tuan, Trinh Duc Cong, “Response surface methodology for hydorolysis parameter optimization of Konjac glucomannan using endo-1,4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.296-300, 2019. 4. Trần Thị Nữ, Trần Thị Ý Nhi, Đỗ Trường Thiện, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu phản ứng thủy phân glucomannan bằng axit kết hợp sử dụng sóng siêu âm và khảo sát cấu trúc của sản phẩm”, Tạp chí Hóa học, 54 (6e1), trang 61-66, 2016 5. Nguyen Van Minh Khoi, Do Truong Thien, Le Minh Ha, Tran Van Thanh, Le Ngoc Hung, Tran Thi Nu, “New lab-scale process for producing glucomannan flour from Amorphophallus plant in Viet Nam and their characterization, part 2”, proceedings of scientific workshop on progress and trends in science and technology, p.225-232, 2016. 6. Trần Thị Ý Nhi, Trần Thị Nữ, Lại Thị Thúy, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Dư, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu cấu trúc hóa học của glucomannan từ củ cây Nưa Amorphophallus konjac K. Koch thu tại Hà Giang Việt Nam”, Tạp chí Hóa học 52(6A), p.228-232, 2014 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO [[1] K. Katsuraya, K. Okuyama, K. Hatanaka, R. Oshima, T. Sato, and K. Matsuzaki, “Constitution of konjac glucomannan: Chemical analysis and 13C NMR spectroscopy” Carbohydr. Polym., vol. 53, no. 2, pp. 183–189, 2003. [2] S. S. Behera and R. C. Ray, “Konjac glucomannan, a promising polysaccharide of Amorphophallus konjac K. Koch in health care” Int. J. Biol. Macromol., vol. 92, pp. 942–956, 2016. [3] M. Alonso-Sande, D. Teijeiro-Osorio, M. J. Alonso, “Glucomannan, a promising polysaccharide for biopharmaceutical purposes” Eur. J. Pharm. Biopharm., vol. 72, no. 2, pp. 453–462, 2009. [4] M. Chua, T. C. Baldwin, T. J. Hocking, and K. Chan, “Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K. Koch ex N.E.Br.” J. Ethnopharmacol., vol. 128, no. 2, pp. 268–278, 2010. [5] C. Zhang, J. Da Chen, and F. Q. Yang, “Konjac glucomannan, a promising polysaccharide for OCDDS” Carbohydr. Polym., vol. 104, no. 1, pp. 175–181, 2014. [6] N. V. Dư, “Nghiên cứu trồng và phát triển cây Nưa konjac (Amorphoph-allus) và một số loài khác trong chi Nưa (họ Ráy – Araceae) ở Việt Nam hướng tới việc lấy củ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc điều trị bệnh tiểu đường, mỡ máu và béo phì” Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2012. [7] V. Dave, M. Sheth, S. P. Mccarthy, J. Ann, and D. L. Kaplan, “Liquid crystalline, rheological and thermal properties of konjac glucomannan” vol. 39, no. 5, pp. 1139–1148, 1998. [8] J. Liu et al., “Preparation, composition analysis and antioxidant activities of konjac oligo-glucomannan” Carbohydr. Polym., vol. 130, pp. 398–404, 2015. [9] R. F. Tester and F. H. Al-Ghazzewi, “Beneficial health characteristics of native and hydrolysed konjac (Amorphophallus konjac) glucomannan” J. Sci. Food Agric., vol. 96, no. 10, pp. 3283–3291, 2016. [10] M. Jiang, H. Li, J.-S. Shi, and Z.-H. Xu, “Depolymerized konjac glucomannan: preparation and application in health care *” J Zhejiang Univ- Sci B (Biomed Biotechnol), vol. 19, no. 7, pp. 505–514, 2018. [11] L. John and A. Jeffery, “Beneficial effects of viscous dietary fiber from Konjac-mannan in Subjects With the Insulin Resistance Syndrome” vol. 23, no. 1, pp. 9–14, 2000. [12] J. Liu, Y. Zhang, Y. Yin, F. Peng, P. Cai, and S. Yang, “Controlled acid hydrolysis and acetylation of glucomannans as drug carriers with designed pharmacokinetic behaviors” J. Control. Release, vol. 152, no. 2011, pp. e61– e62, 2011. [13] C. T. Bishop, “Enzymic hydrolysis of a glucomannan from Jack Pine (Pinus banksiana Lamb)’ For personal use only. The constitutions of glucomannans 118 from a variety of softwoods have been studied extensively during the past 10 years and much of this work has been summa” vol. 39, no. 6205, 1961. [14] K. Kato and K. Matsuda, “Studies on the Chemical Structure of Konjac Mannan: Part I. Isolation and Characterization of Oligosaccharides from the Partial Acid Hydrolyzate of the Mannan” Agric. Biol. Chem., vol. 33, no. 10, pp. 1446–1453, 1969. [15] P. Cescutti, C. Campa, F. Delben, and R. Rizzo, “Structure of the oligomers obtained by enzymatic hydrolysis of the glucomannan produced by the plant Amorphophallus konjac” Carbohydr. Res., vol. 337, no. 24, pp. 2505–2511, 2002. [16] G. Li, L. Qi, A. Li, R. Ding, and M. Zong, “Study on the kinetics for enzymatic degradation of a natural polysaccharide, Konjac glucomannan” Macromol. Symp., vol. 216, pp. 165–178, 2004. [17] S. Albrecht, M. G. C. J. van, J. Xu, H. A. Schols, A. G. J. Voragen, and H. Gruppen, “Enzymatic production and characterization of konjac glucomannan oligosaccharides” J. Agric. Food Chem., vol. 59, no. Copyright (C) 2012 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved., pp. 12658–12666, 2011. [18] X. Luo, X. Yao, C. Zhang, X. Lin, and B. Han, “Preparation of mid-to-high molecular weight konjac glucomannan (MHKGM) using controllable enzyme-catalyzed degradation and investigation of MHKGM properties” J. Polym. Res., vol. 19, no. 4, 2012. [19] F. H. Al-Ghazzewi and R. F. Tester, “Efficacy of cellulase and mannanase hydrolysates of konjac glucomannan to promote the growth of lactic acid bacteria” J. Sci. Food Agric., vol. 92, no. 11, pp. 2394–2396, 2012. [20] J. Chen, D. Liu, B. Shi, H. Wang, Y. Cheng, and W. Zhang, “Optimization of hydrolysis conditions for the production of glucomanno-oligosaccharides from konjac using β-mannanase by response surface methodology” Carbohydr. Polym., vol. 93, no. 1, pp. 81–88, 2013. [21] J. Liu, N. Li, P. Cai, and S. Yang, “Kinetics of the enzymatic hydrolysis of glucomannan from Bletilla striata by β-mannanase” J. Control. Release, vol. 172, no. 1, p. e40, 2013. [22] A. Mikkelson, H. Maaheimo, and T. K. Hakala, “Hydrolysis of konjac glucomannan by Trichoderma reesei mannanase and endoglucanases Cel7B and Cel5A for the production of glucomannooligosaccharides” Carbohydr. Res., vol. 372, pp. 60–68, 2013. [23] C. Y. Chen, Y. C. Huang, T. Y. Yang, J. Y. Jian, W. L. Chen, and C. H. Yang, “Degradation of konjac glucomannan by Thermobifida fusca thermostable β- mannanase from yeast transformant” Int. J. Biol. Macromol., vol. 82, pp. 1–6, 2016. [24] W. Jian et al., “Study on preparation and separation of Konjac oligosaccharides” Carbohydr. Polym., vol. 92, no. 2, pp. 1218–1224, 2013. 119 [25] H. L. Chen, Y. H. Fan, M. E. Chen, and Y. Chan, “Unhydrolyzed and hydrolyzed konjac glucomannans modulated cecal and fecal microflora in Balb/c mice” Nutrition, vol. 21, no. 10, pp. 1059–1064, 2005. [26] L. H. Cheng, H. Nur Halawiah, B. N. Lai, H. M. Yong, and S. L. Ang, “Ultrasound mediated acid hydrolysis of konjac glucomannan” Int. Food Res. J., vol. 17, no. 4, pp. 1043–1050, 2010. [27] W. Jin et al., “Degraded konjac glucomannan by ??-ray irradiation assisted with ethanol: Preparation and characterization” Food Hydrocoll., vol. 36, pp. 85–92, 2014. [28] W. Jin et al., “Synergistic degradation of konjac glucomannan by alkaline and thermal method” Carbohydr. Polym., vol. 99, pp. 270–277, 2014. [29] R. P. Millane and T. L. Hendrixson, “Crystal structures of mannan and glucomannans” Carbohydr. Polym., vol. 25, no. 4, pp. 245–251, 1994. [30] L. Huang, R. Takahashi, S. Kobayashi, T. Kawase, and K. Nishinari, “Gelation behavior of native and acetylated konjac glucomannan” Biomacromolecules, vol. 3, no. 6, pp. 1296–1303, 2002. [31] J. Y. Liu, H. C. Wang, Y. Yin, N. Li, P. L. Cai, and S. L. Yang, “Controlled acetylation of water-soluble glucomannan from Bletilla striata” Carbohydr. Polym., vol. 89, no. 1, pp. 158–162, 2012. [32] B. Herranz, A. J. Borderias, B. Solo-de-Zald??var, M. T. Solas, and C. A. Tovar, “Thermostability analyses of glucomannan gels. Concentration influence” Food Hydrocoll., vol. 29, no. 1, pp. 85–92, 2012. [33] B. Herranz, C. A. Tovar, B. Solo-de-Zaldívar, and A. J. Borderias, “Influence of alkali and temperature on glucomannan gels at high concentration” LWT - Food Sci. Technol., vol. 51, no. 2, pp. 500–506, 2013. [34] X. Du, J. Li, J. Chen, and B. Li, “Effect of degree of deacetylation on physicochemical and gelation properties of konjac glucomannan” Food Res. Int., vol. 46, no. 1, pp. 270–278, 2012. [35] C. Wang, M. Xu, W. Lv, P. Qiu, Y. Gong, and D. Li, “Study on Rheological Behavior of Konjac Glucomannan” 2012 Int. Conf. Med. Phys. Biomed. Eng., vol. 33, pp. 25–30, 2012. [36] B. Herranz, C. A. Tovar, B. Solo-de-Zaldívar, and A. J. Borderias, “Effect of alkalis on konjac glucomannan gels for use as potential gelling agents in restructured seafood products” Food Hydrocoll., vol. 27, no. 1, pp. 145–153, 2012. [37] J. Wang, C. Liu, Y. Shuai, X. Cui, and L. Nie, “Controlled release of anticancer drug using graphene oxide as a drug-binding effector in konjac glucomannan/sodium alginate hydrogels” Colloids Surfaces B Biointerfaces, vol. 113, pp. 223–229, 2014. [38] K. Wang and Z. He, “Alginate-konjac glucomannan-chitosan beads as controlled release matrix” Int. J. Pharm., vol. 244, no. 1–2, pp. 117–126, 2002. 120 [39] S. Gao, J. Guo, and K. Nishinari, “Thermoreversible konjac glucomannan gel crosslinked by borax” Carbohydr. Polym., vol. 72, no. 2, pp. 315–325, 2008. [40] M. Xu et al., “Comparative study on molecular weight of konjac glucomannan by gel permeation chromatography-laser light scattering- refractive index and laser light-scattering methods” J. Spectrosc., vol. 1, no. 1, pp. 2–6, 2013. [41] B. Li and B. J. Xie, “Single molecular chain geometry of konjac glucomannan as a high quality dietary fiber in East Asia” Food Res. Int., vol. 39, no. 2, pp. 127–132, 2006. [42] F. Liu, X. Luo, and X. Lin, “Adsorption of tannin from aqueous solution by deacetylated konjac glucomannan” J. Hazard. Mater., vol. 178, no. 1–3, pp. 844–850, 2010. [43] F. Liu et al., “Removal of copper(II) using deacetylated konjac glucomannan conjugated soy protein isolate” Int. J. Biol. Macromol., vol. 86, pp. 338–344, 2016. [44] B. Solo-de-Zaldívar, C. A. Tovar, A. J. Borderías, and B. Herranz, “Effect of deacetylation on the glucomannan gelation process for making restructured seafood products” Food Hydrocoll., vol. 35, pp. 59–68, 2014. [45] X. Lin, Q. Wu, X. Luo, F. Liu, X. Luo, and P. He, “Effect of degree of acetylation on thermoplastic and melt rheological properties of acetylated konjac glucomannan” Carbohydr. Polym., vol. 82, no. 1, pp. 167–172, 2010. [46] C. Niu, W. Wu, Z. Wang, S. Li, and J. Wang, “Adsorption of heavy metal ions from aqueous solution by crosslinked carboxymethyl konjac glucomannan” J. Hazard. Mater., vol. 141, no. 1, pp. 209–214, 2007. [47] L. G. Chen, Z. L. Liu, and R. X. Zhuo, “Synthesis and properties of degradable hydrogels of konjac glucomannan grafted acrylic acid for colon- specific drug delivery” Polymer (Guildf)., vol. 46, no. 16, pp. 6274–6281, 2005. [48] J. L. Slavin, “Dietary fiber and body weight” Nutrition, vol. 21, no. 3, pp. 411–418, 2005. [49] C. D. Jensen, W. Haskell, and J. H. Whittam, “Long-term effects of water- soluble dietary fiber in the management of hypercholesterolemia in healthy men and women” Am. J. Cardiol., vol. 79, no. 1, pp. 34–7, 1997. [50] S. Chearskul et al., “Immediate and long-term effects of glucomannan on total ghrelin and leptin in type 2 diabetes mellitus” Diabetes Res. Clin. Pract., vol. 83, no. 2, pp. 2008–2010, 2009. [51] H.-L. Chen, W. H.-H. Sheu, T.-S. Tai, Y.-P. Liaw, and Y.-C. Chen, “Konjac supplement alleviated hypercholesterolemia and hyperglycemia in type 2 diabetic subjects--a randomized double-blind trial” J. Am. Coll. Nutr., vol. 22, no. 1, pp. 36–42, 2003. [52] B. Li et al., “Health benefits of konjac glucomannan with special focus on diabetes” Bioact. Carbohydrates Diet. Fibre, vol. 5, no. 2, pp. 179–187, 2015. 121 [53] B. M. Zalewski, A. Chmielewska, and H. Szajewska, “The effect of glucomannan on body weight in overweight or obese children and adults: A systematic review of randomized controlled trials” Nutrition, vol. 31, no. 3, pp. 437–442, 2015. [54] M. F. Mccarty, “Glucomannan minimizes the postprandial insulin surge: a potential adjuvant for hepatothermic therapy” Scand. J. Gastroenterol. Suppl., vol. 58, pp. 487–490, 2002. [55] N. Sood, W. L. Baker, and C. I. Coleman, “Effect of glucomannan on plasma lipid and glucose concentrations, body weight, and blood pressure: systematic review and meta-analysis” Am. J. Clin. Nutr., vol. 88, no. 4, pp. 1167–1175, 2008. [56] I. Peter et al., “Compositions containing alginate and gums to improve bioadhesive properties for treatment of disorders of the esophagus” vol. 1, no. 12, 2003. [57] Y. Q. Zhang, B. J. Xie, and X. Gan, “Advance in the applications of konjac glucomannan and its derivatives” Carbohydrate Polymers. 2005. [58] Trần Thị Ý Nhi, “Nghiên cứu quy trình tách chiết, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của glucomannan từ cây Nưa-Amorphophallus sp. (họ ráy - Araceae)”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2014. [59] W. Xu et al., “A simple and feasible approach to purify konjac glucomannan from konjac flour - Temperature effect” Food Chem., vol. 158, pp. 171–176, 2014. [60] W. Fang and P. Wu, “Variations of Konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus konjac and its refined powder in China” Food Hydrocoll., vol. 18, no. 1, pp. 167–170, 2004. [61] F. Zhu, “Modifications of konjac glucomannan for diverse applications” Food Chem., vol. 256, no. September 2017, pp. 419–426, 2018. [62] M. Chua, K. Chan, T. J. Hocking, P. A. Williams, C. J. Perry, and T. C. Baldwin, “Methodologies for the extraction and analysis of konjac glucomannan from corms of Amorphophallus konjac K. Koch” Carbohydr. Polym., vol. 87, no. 3, pp. 2202–2210, 2012. [63] J. Zhao, D. Zhang, G. Srzednicki, S. Kanlayanarat, and C. Borompichaichartkul, “Development of a low-cost two-stage technique for production of low-sulphur purified konjac flour” Int. Food Res. J., vol. 17, no. 4, pp. 1113–1124, 2010. [64] The Ministry of the People’s Republic of China, “Professional standard of the People”, Republic of China for konjac flour, 2002. [65] S. L. Yeh, M. S. Lin, and H. L. Chen, “Partial hydrolysis enhances the inhibitory effects of konjac glucomannan from Amorphophallus konjac C. Koch on DNA damage induced by fecal water in Caco-2 cells” Food Chem., vol. 119, no. 2, pp. 614–618, 2010. 122 [66] T. Pan et al., “Synergetic degradation of konjac glucomannan by γ-ray irradiation and hydrogen peroxide” Carbohydr. Polym., vol. 93, no. 2, pp. 761–767, 2013. [67] Y. H. Mao, A. X. Song, Z. P. Yao, and J. Y. Wu, “Protective effects of natural and partially degraded konjac glucomannan on Bifidobacteria against antibiotic damage” Carbohydr. Polym., vol. 181, no. August 2017, pp. 368– 375, 2018. [68] Y. Ni, D. Liu, J. Pang, W. Lin, C. Wu, and L. Wang, “Physicochemical properties of degraded konjac glucomannan prepared by laser assisted with hydrogen peroxide”, vol. 129. Elsevier B.V, 2019. [69] Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, “Động học các quá trình xúc tác sinh học”, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2016, Hà Nội.pdf.. [70] Nguyễn Hữu Chấn, “Enzym và xúc tác sinh học”, Nxb Y học, 1983. [71] S. Dhawan and J. Kaur, “Microbial mannanases: An overview of production and applications” Crit. Rev. Biotechnol., vol. 27, no. 4, pp. 197–216, 2007. [72] P. S. Chauhan, N. Puri, P. Sharma, and N. Gupta, “Mannanases: Microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 93, no. 5, pp. 1817–1830, 2012. [73] S. G. Withers, “Mechanisms of glycosyl transferases and hydrolases” Carbohydr. Polym., vol. 44, no. 4, pp. 325–337, 2001. [74] P. S. Chauhan and N. Gupta, “Insight into microbial mannosidases: a review” Crit. Rev. Biotechnol., vol. 37, no. 2, pp. 190–201, 2017. [75] W. Xia et al., “A novel glycoside hydrolase family 113 endo-β-1,4- mannanase from Alicyclobacillus sp. strain A4 and insight into the substrate recognition and catalytic mechanism of this family” Appl. Environ. Microbiol., vol. 82, no. 9, pp. 2718–2727, 2016. [76] P. K. Srivastava and M. Kapoor, “Production, properties, and applications of endo-beta-mannanases” Biotechnol Adv, vol. 35, no. 1, pp. 1–19, 2016. [77] W. H. van Zyl, S. H. Rose, K. Trollope, “Fungal β-mannanases: Mannan hydrolysis, heterologous production and biotechnological applications” Process Biochem., vol. 45, no. 8, pp. 1203–1213, 2010. [78] M. N. Domingues et al., “Structural basis of exo--mannanase activity in the GH2 family” J. Biol. Chem., vol. 293, no. 35, pp. 13636–13649, 2018. [79] Y. Nakatani, S. M. Cutfield, N. P. Cowieson, and J. F. Cutfield, “Structure and activity of exo-1,3/1,4-β-glucanase from marine bacterium Pseudoalteromonas sp. BB1 showing a novel C-terminal domain” FEBS J., vol. 279, no. 3, pp. 464–478, 2012. [80] M. Jiang et al., “Subchronic toxicity and genotoxicity assessment of low molecular mass konjac mannan oligosaccharide in vitro and in vivo” Prog. Biochem. Biophys., vol. 43, no. 3, pp. 271–280, 2016. [81] Nguyễn Nghiêm Luật, “Hóa sinh- sách đào tạo Bac sỹ đa khoa”, NXB Y Học, 123 2012, Hà Nội. [82] Tạ Thành Văn, “Hóa sinh lâm sàng- sách đào tạo đại học Y”, NXB Y học, 2013, Hà Nội. [83] H. M. O’Neill, “AMPK and exercise: Glucose uptake and insulin sensitivity” Diabetes Metab. J., vol. 37, no. 1, pp. 1–21, 2013. [84] N. Musi, T. Hayashi, N. Fujii, M. F. Hirshman, L. A. Witters, and L. J. Goodyear, “AMP-activated protein kinase activity and glucose uptake in rat skeletal muscle” Am. J. Physiol. Metab., vol. 280, no. 5, pp. E677–E684, 2017. [85] T. L. Scheffler, “AMP-activated Protein Kinase and Muscle Metabolism” vol. 1, pp. 337–345, 2012. [86] A. Gruzman, G. Babai, and S. Sasson, “Adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) as a new target for antidiabetic drugs: A review on metabolic, pharmacological and chemical considerations” Rev. Diabet. Stud., vol. 6, no. 1, pp. 13–36, 2009. [87] E. A. Richter and N. B. Ruderman, “AMPK and the biochemistry of exercise: Implications for human health and disease” Biochem. J., vol. 418, no. 2, pp. 261–275, 2009. [88] S. B. Jørgensen et al., “Role of AMPKα2 in basal, training-, and AICAR- induced GLUT4, hexokinase II, and mitochondrial protein expression in mouse muscle” Am. J. Physiol. - Endocrinol. Metab., vol. 292, no. 1, pp. 331– 339, 2007. [89] Trần Thị Thùy Linh, “Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân C2C12”, Luận văn Thạc sỹ Dược học, 2013. [90] M. Foretz, B. Guigas, L. Bertrand, M. Pollak, and B. Viollet, “Metformin: From mechanisms of action to therapies” Cell Metab., vol. 20, no. 6, pp. 953– 966, 2014. [91] N. K. LeBrasseur et al., “Thiazolidinediones can rapidly activate AMP- activated protein kinase in mammalian tissues” Am. J. Physiol. - Endocrinol. Metab., vol. 291, no. 1, 2006. [92] Nguyễn Tiến An, “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan từ cử một số loài nưa (Amorphophallus SP Araceae) ở Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ, Viện Hóa học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, 2012. [93] Lê Ngọc Hùng, “Nghiên cứu kỹ thuật trồng, phát triển một số loài thuộc chi Nưa (Amorphophallus Blume Ex Decne) và quy trình công nghệ chế biến glucomannan tại Tây Nguyên”, Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài, Chương trình Tây Nguyên 3, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ, 2016. [94] A. Einbu, H. Grasdalen, and K. M. Vårum, “Kinetics of hydrolysis of chitin/chitosan oligomers in concentrated hydrochloric acid” Carbohydr. Res., vol. 342, no. 8, pp. 1055–1062, 2007. 124 [95] Gonotec, “OSMOMAT 090 User Guide Version1.0” GSG-Hof Reuchlinstr. 10-11 10553, Berlin Germany pp. 1055–1062, 2007. [96] Kamesh R Ayasolla, Shailendra Giri, Avtar K Singh and Inderjit Singh*, "5- aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranoside (AICAR) attenuates the expression of LPS- and Aβ peptide-induced inflammatory mediators in astroglia", Journal of Neuroinflammation, 2:21 doi:10.1186/1742-2094-2-21, 2005